Министерство образования и напуки РФ

На правах рукописи
Русинова Татьяна Витальевна
Разработка технологии биосинтеза фермента лакказы базидиальными грибами
рода Trametes
Cпециальность 03.00.23 – биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата технических наук
Москва − 2007
1
Работа выполнена в Московском Государственном Университете
инженерной экологии
Научный руководитель
кандидат биологических наук
Е.С. Горшина
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор
А.П. Синицын
доктор технических наук, профессор
С.Е. Строгов
Ведущая организация:
ОАО ГосНИИ биосинтеза белковых веществ, Москва
Защита состоится « 29» мая 2007 г в
часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.204.13 в РХТУ им. Д. И. Менделеева
(125047 Москва, Миусская пл., д. 9) в ауд.
С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре
РХТУ имени Д.И. Менделеева.
Автореферат диссертации разослан _______________ 2007 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
ДМ 212.204.13
Шакир И.В.
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Лакказа (п-дифенол:кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2) относится к классу оксидаз, восстанавливающих молекулярный
кислород непосредственно до воды без образования в качестве промежуточного
продукта перекиси водорода или каких либо других кислородных интермедиатов. Лакказы из базидиальных грибов отличаются высоким окислительновосстановительным потенциалом и широкой субстратной специфичностью, что
делает возможным их широкое, совместно с медиаторами, являющимися одновременно их первичными субстратами, использование в промышленности, например, при производстве современных экологически чистых древесноволокнистых плит (в качестве биосвязующего агента, заменяющего фенолформальдегидные смолы); тонком органическом синтезе (например, синтезе
электропроводящих полимеров); текстильной промышленности (экологически
чистое отбеливание тканей); пищевой промышленности (удаление следов кислорода в продуктах питания для увеличения срока хранения); для биодеградации ксенобиотиков, в том числе отравляющих веществ; синтезе лекарственных
препаратов (например, антибиотиков); в биосенсорах, иммуноферментном анализе и других областях.
В настоящее время промышленная технология лакказы в РФ отсутствует.
В связи с этим работа по созданию технологии производства лакказы является
актуальной.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было создание
технологии биосинтеза фермента лакказы грибами рода Trametes Fr.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Провести скрининг коллекционных штаммов грибов рода Trametes в глубинной культуре и на агаризованных средах и выбрать наиболее перспективный в качестве продуцента лакказы штамм;
2. Изучить влияние компонентов полусинтетической питательной среды на оксидазную активность (ОА);
3. Сравнить ОА штамма на комплексных средах из числа возобновляемого
сельскохозяйственного сырья и подобрать дополнительные компоненты питательной среды. Изучить влияние индукторов на ОА штамма-продуцента;
4. Оптимизировать по ОА в качестве критерия оптимизации состав питательной
среды с применением математических методов планирования эксперимента;
5. В условиях культивирования в ферментационном аппарате изучить влияние
на синтез оксидаз рН, температуры, перемешивания и аэрации и определить оптимальные режимы культивирования;
6. На основании полученных результатов разработать технологический процесс
стадии культивирования процесса производства лакказы.
3
Научная новизна работы.
• На агаризованой среде и в условиях глубинного культивирования впервые
проведен скрининг 20 штаммов грибов рода Trametes – потенциальных продуцентов высокопотенциальных лакказ, относящихся к 4 видам: T.versicolor,
T.pubescens, T.ochracea, T.hirsuta. Показано, что штаммовая вариабельность
ОА в рамках одного вида рода Trametes превышает видовые различия по этому показателю. Диапазон ОА составил 0,00 – 0,90 ЕОА. Показано, что результаты первичного отбора штаммов, проведенного на основании реакции Бавендамма, зависят от состава питательной среды и субстрата фермента и не совпадают с результатами, полученными в глубинной культуре.
• Показано, что наиболее эффективными для синтеза оксидаз являются сахароза, глюкоза, фруктоза и мальтоза. Продуктивность по ОА существенно повышается в присутствии кукурузного экстракта и дрожжевого автолизата. Источники азота и фосфора в меньшей степени влияют на ОА. Установлено, что
содержание 0,03 мМ Cu2+ в пересчете на CuSO4 в среде достаточно для максимального синтеза лакказы штаммом. Определено сельскохозяйственное возобновляемое сырье, обеспечивающее высокую ОА (пшеничная мука).
• Определен режим рН-статирования (4,0) для достижения максимальной активности и продуктивности по оксидазам. Показано, что оптимальная температура для достижения высокой ОА (32 оС) не соответствует наиболее благоприятной для роста и накопления биомассы (28-30 оС). Подобран режим перемешивания и аэрации, обеспечивающий достаточную массопередачу кислорода при отсутствии травмирования мицелия и определен соответствующий
объемный коэффициент массопередачи кислорода. Установлена критическая
линейная скорость мешалки (3,0-3,2 м·с-1), при превышении которой происходит механическое воздействие на мицелий гриба, приводящее к снижению
ОА.
• Показано, что основным ферментом, продуцируемым штаммом T.hirsuta 56
на разработанной среде является высокопотенциальная (780±20 мВ) лакказа.
Практическая ценность работы. На основании проведенных исследований выбран штамм T. hirsuta 56 для промышленного использования в качестве продуцента лакказы. Проведено более 70 ферментаций в аппарате объемом
30 л. ОА штамма-продуцента за счет оптимизации среды и условий культивирования повышена более, чем в 40 раз. Разработана технология глубинного
культивирования штамма-продуцента с получением высокоактивной культуральной жидкости, на основании которой создан проект опытнопромышленного регламента на производство технического препарата лакказы.
Проведены технологические испытания на производственной базе ООО «Фирма «Макофарм»» (п. Лотошино), показавшие практическую реализуемость и
эффективность разработанной технологии. Проведены испытания наработанных образцов и опытной партии технического ферментного препарата в качест4
ве биосвязующего в производстве древесно-волокнистых плит (ЗАО
ВНИИДРЕВ) и в тонком органическом синтезе (Институте биохимии им А.Н.
Баха РАН), которые подтвердили соответствие полученных препаратов необходимым для производства требованиям. Предварительная техникоэкономическая оценка с учетом стадии концентрирования показала, что при годовом объеме производства культуральной среды 4400 м3, что составляет потребность одного предприятия при переводе всего производства древесноволокнистых плит на использование биосвязующих, себестоимость получаемой
продукции будет составлять 1339,2 рубля за 1 кг или 13,39 рубля за 1000 МЕ.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на 1-м (14-18 октября 2002 г.) и 2-м (10-14 ноября 2003 г.) Международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва;
VI (20-24 мая 2002 г.) и VII (14-18 апреля 2003 г.) Междунар. симпозиумах
«Техника и технология экологически чистых производств», Москва; 7-ой (14-18
апреля 2003 г.) и 8-ой (17-21 мая 2004 г.) Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биотехнология – наука XXI века», Пущино; V междунар. конфер. «Инженерная защита окружающей среды», Москва, 14 – 15 апреля 2003 г.;
2 Междунар. конфер. «Наука-Бизнес-Образование», 10-13 мая 2005, Пущино.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных
работ и подано 3 заявки на патенты РФ.
Структура и объем работы. Диссертационная работа включает: введение, обзор литературы, описание объектов, материалов и методов исследования, 5 глав, в которых изложены результаты экспериментов и их обсуждение,
выводы, заключение, список цитируемой литературы, содержащий наименований и 8 приложений. Материал изложен на страницах, содержи рисунков
и таблиц.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность темы, сформулирована цель исследования, научная новизна и практическая ценность полученных результатов,
указан личный вклад соискателя.
1. Обзор литературы. В обзоре рассмотрены возможные природные источники лакказы и показано, что промышленно значимыми высокопотенциальными лакказами являются лакказы ксилотрофных базидиомицетов, преимущественно принадлежащих к грибам белой гнили. Показано, что наиболее перспективными для обнаружения промышленного штамма-продуцента лакказы
являются базидиальные грибы рода Trametes Fr, и приведены данные об особенностях культивирования грибов этого рода. Проанализированы работы по
влиянию на биосинтез лакказы различных компонентов питательных сред и условий культивирования. На основании анализа научной и патентной литературы показаны известные способы получения лакказ и области их применения.
5
2. Объекты и методы исследования
В работе использовали 4 вида грибов (20 коллекционных штаммов) рода
Trametes Fr., традиционно относимых [А.С. Бондарцев, 1953] к семейству
Polyporaceae, порядку Aphyllophorales,
классу Basidiomycetes: T.hirsuta
(Wulfen) Pilát - 3 штамма, T.ochracea (Pers.)Gib. & Ryvarden – 6 штаммов,
T.pubescens (Schumach.) – 6 штаммов, T.versicolor (L.) C.G.Loyd– 5 штаммов.
Чистые культуры в разные годы были получены из коллекций Ботанического
института им. В.Л. Комарова РАН; Сенежской лаборатории защиты древесины
ЦНИИ механической обработки древесины; Института микробиологии АН Белоруссии; Института зоологии и ботаники АН Эстонии; Сельскохозяйственного
института им. В. Коларова (Болгария); ГосНИИ биосинтеза белковых веществ
и поддерживались на агаризованном сусле при температуре +4 оС с пересевами
каждые 6 месяцев.
Штаммы выращивали на агаризованном сусле в чашках Петри диаметром 90 мм и методом глубинного культивирования в колбах Эрленмейера объемом 750 мл с объемом среды 150 мл на круговой качалке при скорости вращения 200 об/мин, температуре 28 оС и исходном рН среды 5,8 - 6,0. Питательные среды инокулировали блоками (d-8 мм), вырезанными из зоны роста колонии соответствующего штамма на агаризованном сусле (1 блок на чашку
Петри, 10 блоков на колбу), или глубинной культурой 2-3 пассажей в количестве 10 об%.
Влияние источников углерода, азота и фосфора изучали, внося их в количествах, эквивалентных по соответствующему элементу.
Индукторы вносили при засеве в 3 мл 96 % этанола в концентрациях: таниновая кислота 0,2 мМ, сирингалдазин 0,11 мкМ, кофейная кислота 0,2 мМ,
3,4-диметоксибензиловый спирт 0,2 мМ, 2,6-диметоксифенол 5 мкМ, этанол
20 г/л; и в 3 мл воды: лигнин дубовый 2 г/л, стружки древесные 2 г/л, лузга
подсолнечная 2 г/л, гребни виноградные 2 г/л.
Культивирование проводили на средах следующего состава:
1. Глюкозо-пептонная среда (Koroleva-Skorobogat`ko et al., 1998), г/л: глюкоза
-10,0; пептон – 3,0; KH2PO4 – 0,6; K2HPO4 – 0,4; MgSO4 – 0,5; CuSO4 –250 мг;
MnSO4 – 50 мг; ZnSO4 –1 мг; FeSO4 – 0,5 мг; вода водопроводная.
2. Глюкозо-аммонийная среда с кукурузным экстрактом, г/л: глюкоза – 20,0;
(NH4)2SO4 – 2,5; мочевина – 0,7; KH2PO4 – 1,2; кукурузный экстракт – 10,0; пропинол Б-400 – 0,5; вода водопроводная.
3. Глюкозо-аммонийная среда с кукурузным экстрактом, г/л: глюкоза – 20,0;
NH4NO3 – 4,0; мочевина – 0,7; KH2PO4 – 0,6; K2HPO4 – 0,6; MgSO4 – 0,5; MnSO4
– 50 мг; CuSO4 – 50 мг; ZnSO4 – 1 мг; FeSO4 – 0,5 мг; кукурузный экстракт –
10,0; вода водопроводная.
4. Среда с мукой, г/л: мука пшеничная – 20,0; NH4NO3 – 4,0; мочевина – 0,7;
KH2PO4 – 0,6; K2HPO4 – 0,6; MgSO4 – 0,5; MnSO4 – 50 мг; CuSO4 –50 мг; ZnSO4
6
– 1 мг; FeSO4 – 0,5 мг; кукурузный экстракт –10,0; вода водопроводная.
5. Среда c мукой, г/л: мука пшеничная – 20,0; NH4NO3 – 2,8; KH2PO4 – 1,2; кукурузный экстракт – 10,0; пропинол Б-400 – 0,5.
6. Оптимизированная среда с мукой, г/л: мука пшеничная – 29,0; кукурузный
экстракт – 6,4; NH4NO3 – 2,0; KH2PO4 – 1,2; вода водопроводная.
7. Среда с глюкозой высокопродуктивная, г/л: глюкоза – 29,0; кукурузный экстракт – 6,4; NH4NO3 – 2,0; KH2PO4 – 1,2; вода водопроводная.
Глубинное культивирование проводили также в ферментационном аппарате «Marubishi» (Япония) объемом 30 л, с рабочим объемом 20 л, в условиях
(если не указано иначе) исходного рН 6,0; при температуре 26-28 оС; аэрации
1,0 л/л⋅мин с механическим перемешиванием 250 об·мин-1 двухъярусной турбинной мешалкой открытого типа (нижний ярус – d = 120 мм, 6 лопастей; верхний ярус – d =100 мм, 4 лопасти).
Концентрацию биомассы определяли весовым способом в пробах по 50
мл в трех повторностях по воздушно сухой массе (ВСМ) и в пересчете на абсолютно сухую массу (АСМ).
Концентрацию растворенного кислорода (парциальное давление) определяли с использованием кислородного датчика типа Кларка в процентах от насыщения питательной среды.
Объемный коэффициент массопередачи кислорода KLa определяли сульфитным методом.
Редуцирующие вещества (РВ) в культуральном фильтрате определяли
методом Бертрана [Плевако, Бакушинская, 1964].
ОА штаммов по методу Бавендамма определяли в чашках Петри на агаризованном сусле с галловой кислотой (0,4%) [Метод. экспер. микол., 1982] и
на агаризованной глюкозо-аммонийной среде с пирокатехином (0,12 %) – модифицированный нами метод Бавендамма.
Определение экстрацеллюлярной ОА в глубинной культуре проводили в
фильтрате культуральной жидкости спектрофотометрически при 410 нм с использованием пирокатехина (10-2 М) в качестве субстрата в 0,1 М цитратнофосфатном буфере (рН 4,5). При проведении скрининга штаммов определение
проводили на спектрофотометре СФ-26 (Ломо, Россия), в дальнейшей работе на
Shimadzu UVmini 1240 (Япония). За единицу оксидазной активности (ЕОА) принимали изменение оптической плотности реакционной смеси за 1 мин в пересчете на 1 мл культурального фильтрата.
Коэффициент выхода фермента рассчитывали по формуле ypx = ОА /
ВСМ, где ОА – общая оксидазная активность в ЕОА, ВСМ – воздушно сухая
масса в мг/мл.
Для статистической оценки результатов использовали усредненный по
большому массиву экспериментов расчет дисперсии воспроизводимости относительного значения величины (Бирюков, 2004).
7
3. Выбор штамма-продуцента
3.1. Определение фенолоксидазной активности методом Бавендамма
На агаризованном сусле с галловой кислотой (метод Бавендамма) все
штаммы за исключением T.versicolor 188 давали положительную реакцию на
экстрацеллюлярные фенолоксидазы. Наибольшие диаметры окрашенной зоны
(более 60 мм на 4 сутки роста) отмечены у T.hirsuta 86-43, T.versicolor 80-1,
86-59 и М 78, T.ochracea М 103, М 106 и у всех штаммов T.pubescens (таблица
1). Однако на агаризованной глюкозо-аммонийной среде с пирокатехином
(модифицированный нами метод Бавендамма) наибольшие диаметры окрашенных зон наблюдали у других штаммов: T.hirsuta 56, T.pubescens 923-3,
T.pubescens 115, T.923-1, T.pubescens 78-12.
3.2. Сравнение ОА штаммов в глубинной культуре
Активность экстрацеллюлярных оксидаз в условиях глубинного культивирования определяли на жидкой глюкозо-аммонийной среде № 3 (таблица 1).
Опыт показал наличие у всех видов значительной штаммовой вариабельности по этому признаку. Все изученные штаммы вида T. versicolor обладали низкой ОА, вплоть до нулевой. Наиболее активными были штаммы видов T. hirsuta
и T. pubescens. Активность различных штаммов T. pubescens отличалась в 9, а
T. hirsuta – в 11 раз. Наиболее высокую оксидазную активность имели (в порядке убывания): T.hirsuta 56, T.pubescens 78-12, T.hirsuta НРБ-2, T.ochracea 92-78,
T.ochracea 92-83, T.ochracea 239. T.pubescens 923-8. Расчет показал, что по продуктивности эти штаммы также являются лучшими.
Существенной разницы в накоплении биомассы наиболее и наименее продуктивными штаммами, а также штаммами, практически не обладающими ОА,
не выявлено, что подтверждает, что низкая ОА не связана со слабым ростом
культуры. Расчет коэффициента выхода фермента показал, что у высокопродуктивных штаммов этот показатель выше.
3.3. Сравнение отобранных штаммов в условиях глубинного культивирования в ферментационном аппарате. Выбор штамма-продуцента
Культивирование 5 штаммов, проведенное в ферментационном аппарате
на глюкозо-пептонной среде № 1, показало, что в этих условиях наиболее продуктивным штаммом так же является T.hirsuta 56 (ОА – 0,73 ЕОА).
Исследование лакказ, выделенных из культуральных фильтратов, полученных в
результате культивирования штаммов в ферментационном аппарате, проведенное совместно с Институтом биохимии им А.Н. Баха РАН, показало, что основные биохимические параметры данных лакказ соответствуют характеристикам
лакказ других базидиальных грибов (Baldrian, 2006). Выход гомогенного фермента по данным градиентного электрофореза составлял 25–35 мг с литра культуральной жидкости для T.hirsuta 56 и 5-7 мг с литра для T. ochracea 92-78.
При выборе штамма-продуцента учитывали максимальную ОА, продуктивность, стабильность в культуре, а также преимущественный синтез лакказы
штаммом, редокс потенциал получаемого фермента и количество образуемых
8
пигментов в процессе культивирования. По результирующим показателям для
дальнейшей работы был выбран штамм T. hirsuta 56.
Таблица 1 – Распределение штаммов по величине ОА и накоплению биомассы
в глубинной культуре и диаметру окрашенной зоны (реакция Бавендамма)
Глюкозо-аммонийная среда,
Сусло,
пирокатехин
галловая к-та
Глубинная культура
Агаризованная среда
Штаммы
Накопле- Диаметр
ОА в
Диаметр окрание био- окрашенглубинной
шенной зоны
культуре*
массы
ной зоны
T.hirsuta НРБ-2
15
3
14
T.hirsuta 86-43
11
13
5
8
T.hirsuta 56
1
1
1
16
T.pubescens 115
10
14
3
2
T.pubescens 78-12
4
2
6
10
T.pubescens НРБ-1
8
8
4
4
T.pubescens 923-2
6
18
8
3
T.pubescens 923-3
2
11
2
5
T.pubescens 923-8
3
7
7
1
T.versicolor 237
9
17
11
13
T.versicolor 188
14
19
20
20
T.versicolor 80-1
7
20
20
12
T.versicolor 86-59
17
10
4
7
T.versicolor М 78
19
9
9
11
T.ochracea 92-78
16
6
17
T.ochracea 92-83
13
4
19
T.ochracea 117
12
15
18
T.ochracea М 103
5
12
6
T.ochracea M 106
18
16
10
9
T.ochracea 239
5
20
15
*
на основании данных по максимальной оксидазной активности в ЕОА.
4.
Подбор компонентов и оптимизация состава полусинтетической питательной среды
4.1. Изучение влияния источников углерода на ОА
На среде № 3 определено влияние на ОА источников углерода (глюкоза,
9
сахароза, мальтоза, фруктоза, лактоза, галактоза, манит, сорбит, этанол, глицерин, уксусная кислота, лимонная кислота). Диапазон ОА на средах с разными
источниками углерода составил 0,16 – 1,34 ЕОА. Наиболее высокой ОА штамм
достигал на средах с сахарозой, глюкозой, фруктозой и мальтозой. Продуктивность по ОА составляла на этих субстратах 0,18; 0,19; 0,16; 0,15 ЕОА·сут-1
соответственно на 7-е сутки культивирования.
4.2. Изучение влияния источников азота и фосфора на ОА
Определено влияние источников азота и фосфора на ОА штамма T.hirsuta
56 на среде № 3, содержащей в качестве источника углерода сахарозу. Диапазон ОА на средах с разными источниками азота составил 0,18 – 1,4 ЕОА. Наиболее высокой ОА штамм достигал на средах с пептоном, мочевиной, сульфатом
аммония и нитратом аммония на 4 сутки роста (продуктивность по ОА на этих
источниках – 0,36; 0,35; 0,33; 0,26 ЕОА·сут-1 соответственно). Из калийнофосфорных солей, обычно применяемых в микробиологической промышленности, максимальную ОА наблюдали на средах с фосфатом калия двузамещенным. Однако окончательный подбор источника фосфора следует проводить в
условиях рН-статирования.
5. Подбор компонентов и оптимизация состава комплексной питательной среды
5.1. Изучение влияния основного сырья на ОА
Влияние комплексных субстратов из числа возобновляемого сельскохозяйственного сырья на ОА изучали на среде № 3. Показано, что диапазон ОА на
средах с разными источниками углерода составил 0,3 – 1,4 ЕОА. Максимальную
ОА наблюдали на средах с крахмалом, мелассой, пшеничной мукой, пивным
суслом. Продуктивность штамма на этих субстратах составляла: 0,19; 0,19;
0,17; 0,29 ЕОА·сут-1 соответственно.
Использование глюкозы, сахарозы, пивного сусла и крахмала ограничено
их высокой ценой, а использование мелассы – нестабильностью качества и содержанием пигментированных веществ, которые затрудняют последующую
очистку фермента. В то же время пшеничная мука как сырье относительно дешева, и ее использование вписывается в общую схему переработки зерна, что
удешевляет процесс производства. Поэтому для дальнейших исследований в
качестве основного сырья была выбрана пшеничная мука.
5.2.
Изучение влияния источников азота и фосфора на ОА
На среде № 4 с пшеничной мукой и кукурузным экстрактом определено
влияние различных форм азотного питания ((NH4)2SO4, NH4NO3, (NH4)2HPO4,
KNO3, пептон, мочевина) на ОА. Для дальнейших исследований в качестве источника азота отобран нитрат аммония. ОА на среде с широко распространенным в средах для получения лакказы пептоне оказалась даже несколько ниже,
чем на средах с аммонийным азотом (1,3 и 1,1 ЕОА соответственно). Сочетание
аммонийных солей с мочевиной не оказало положительного влияния на ОА. В
10
результате проведенных опытов по изучению влияния на ОА источника фосфора (KH2PO4, (NH4)2PO4, K2HPO4, NaH2PO4, Na2HPO4) для дальнейших исследований был выбран 1-замещенный фосфат калия как эффективный и дешевый.
5.3. Изучение влияния ростовых факторов на ОА
Определено влияние внесения в состав среды № 4 природных компонентов, содержащих ростовые факторы и микроэлементы, в том числе медь. Кукурузный экстракт и дрожжевой автолизат были испытаны в концентрациях 0,25,
0,5 и 0,75 % по сухим веществам. Показано, что внесение в среду ростовых
факторов приводит к существенному увеличению ОА (с 0,14 до 0,67 ЕОА для
0,25 % дрожжевого автолизата и 0,47 ЕОА для 0,25-0,5 % кукурузного экстракта). Для использования в составе промышленной среды выбран кукурузный
экстракт как более дешевый и менее дефицитный продукт.
5.4.
Оптимизация состава промышленной питательной среды
Оптимизацию состава питательной среды проводили по методу БоксаУилсона на пятикомпонентной среде: мука пшеничная, NH4NO3, мочевина,
KH2PO4, кукурузный экстракт. В качестве базового было взято соотношение
основных компонентов среды № 4. Дробный факторный эксперимент проводили по двухуровневому плану. На основе рассчитанных коэффициентов регрессии определяли программу крутого восхождения. Полученные результаты позволили выбрать наиболее близкий к оптимальному состав питательной среды
(среда № 6). Максимальная ОА на оптимизированной среде к 7 суткам составляет 5,4 ЕОА и превышает максимальную ОА на базовой среде в 2,7 раза. Соотношение С:N (при учете крахмала муки в качестве источника углерода и аминного азота кукурузного экстракта и аммонийного азота нитрата аммония) в оптимизированной среде составило 11:1.
5.5.
Изучение влияния количества сульфата меди на ОА
Пшеничная мука и кукурузный экстракт, входящие в состав питательной
среды № 6, содержат медь в своем составе (0,82 мкМ и 0,01 мкМ в пересчете на
CuSO4 соответственно). Однако основное количество сульфата меди (31 мкМ)
попадает в питательную среду с посевным материалом. Показано, что внесение
CuSO4 в концентрации 1-250 мг/л (6,2 мкМ–1,57 мМ) не оказывает ингибирующего действия на рост штамма-продуцента, но и не увеличивает ОА, как
при внесении при посеве, так и при внесении на 3 сутки роста. Таким образом,
показано, что концентрация меди 0,03 мМ в среде является достаточной для
получения максимальной ОА.
5.6. Изучение влияния индукторов на ОА
На среде оптимизированного состава изучена возможность дополнительного увеличения ОА за счет введения в состав среды веществ, известных как
индукторы синтеза лакказы. Как видно из таблицы 2, максимум ОА наблюдается на среде с древесными стружками и составляет 7,3 ЕОА, что превышает ОА в
контрольной среде в 1,5 раза. Близкий результат дают и виноградные гребни
11
(7,1 ЕОА)
Таблица 2 – Влияние индукторов на ОА
Продолжительность культивирования, сут
Индукторы
3
5
7
10
Таниновая кислота
4,4
6,9
6,3
2,0
Сирингалдазин
3,4
6,9
6,4
3,0
Кофейная кислота
5,4
7,0
5,5
1,9
Вератриловый спирт
4,7
5,0
1,2
7,3
2,6-диметоксифенол
2,9
4,5
4,8
2,5
Лигнин дубовый
5,9
6,2
4,1
2,9
Стружки древесные
6,6
3,5
1,5
7,3
Этанол
3,7
6,5
2,3
7,2
Лузга подсолнечная
6,0
6,6
4,2
2,4
Гребни виноградные
6,2
4,1
1,6
7,1
Контроль
4,9
4,5
3,1
1,5
Доверительный интервал ±10,2%
Продуктивность по ОА на среде с древесными стружками составляет 2,4
ЕОА·сут-1, тогда как на среде с этанолом только 1,4 ЕОА·сут-1. ОА на среде с вератриловым спиртом, кофейной кислотой, сирингалдазином и таниновой кислотой (6,9 ЕОА) не превышает ОА на среде с этанолом, однако, учитывая, что
эти компоненты вводились в том же количестве этанола, что и в варианте, где
этанол был в качестве индуктора, можно сделать вывод, что внесение указанных веществ в количествах и условиях нашего опыта не приводит к увеличению ОА.
6. Изучение влияния условий культивирования на ОА T.hirsuta 56 и
оптимизация режимных параметров процесса ферментации
Важнейшими параметрами, оказывающими влияние на ферментативную
активность, являются рН, температура культивирования и коэффициент массопередачи кислорода, а для механолабильных культур, к которым относятся базидиальные грибы, при использовании аппаратов с механическим перемешиванием ограничивающим фактором является также критическая линейная окружная скорость мешалки, при превышении которой происходит травмирование гиф гриба.
6.1. Влияние рН на ОА штамма-продуцента
Влияние рН изучали в ферментационном аппарате в режиме автоматического поддержания рН (рН-статирования) при температуре 26оС на глюкозоаммонийной среде № 2 и среде с мукой № 5 при 32 оС.
12
ОА, ЕОА
ОА, ЕОА
Биомасса, г/л; 0,1рО2,%
На глюкозо-аммонийной среде показано, что максимальной ОА штамм
достигает при рН=4,0. По сравнению с процессом при нерегулируемом рН активность повысилась в 1,5 раза. рН 4,0 оказывается лучшим как по абсолютному значению ОА (2,0 ЕОА), так и по продуктивности (0,03 ЕОА·ч-1). Коэффициент выхода фермента в
12
2,5
точке максимума ОА составляет 0,31 ЕОА·мг-1. рН
10
2
4,0 обеспечивает также и
8
1,5
наиболее высокую ско6
1
рость роста культуры.
4
Как видно из рисун0,5
2
ка 1, при оптимальном рН
0
0
ОА достигает максимума
0
Время, час
при исчерпании редуциКонцентрация биомассы, г/л
рующих сахаров в среде и
Концентрация растворенного кислорода 0,1рО2,%
переходе культуры в стаОксидазная активность, ОА, Е ОА
ционарную фазу и фазу
Редуцирующие вещества, %
отмирания. Этому соотРисунок 1 – Динамика параметров синтеза окси- ветствует и увеличение
доредуктаз в ферментационном аппарате в усло- концентрации растворенвиях рН-статирования при оптимальном значении ного кислорода в среде,
рН (4,0) на глюкозо-аммонийной среде
свидетельствующее
о
снижении его потребления
затухающей культурой. Сходные зависимости получены и на среде с мукой.
На рисунке 2 приве2,5
рН
дены сводные графики
свободный
процессов на среде с пше2
рН = 4.0
ничной мукой № 5 в диапа1,5
рН = 3.5
зоне рН-статирования 3,5 –
5,5. Максимальная ОА на1
рН = 4.5
блюдалась так же как и на
0,5
рН = 5.5
глюкозо-аммонийной среде
при рН=4,0. Близкие зна0
рН = 5,0
0
20
40
60
80
100
чения ОА дает проведение
Время ,ч
процесса ферментации при
рН=3,5.
Рисунок 2 – ОА в процессах с различными значениями рН-статирования и при нерегулируемом
рН на среде с мукой
13
6.2. Влияние температуры на ОА
Влияние температуры изучали в ферментационном аппарате при рН 4,0
на оптимизированной среде с мукой № 6. На рисунке 3 приведены сводные
данные по максимальной ОА в ферментациях при разных температурах. Показано, что максимальной
ОА (5,8 ЕОА) штамм достигает при температуре 32 оС
(продуктивность
0,085
-1
ЕОА·ч ). Максимальная ОА
в изученном диапазоне
температур различалась в
1,8 раза, коэффициент выхода фермента в 3 раза.
27оС
30оС
32оС
34оС
36оС
Отмечено, что температура
для максимальной продукРисунок 3 – Максимальная ОА при культивиро- тивности по биомассе невании при разных температурах в ферментацион- сколько ниже, чем для синном аппарате на оптимизированной среде с му- теза оксидоредуктаз, а
кой
именно 28-30 оС.
6.3. Влияние интенсивности перемешивания на ОА
Определено влияние скорости перемешивания на ОА штамма. Серия
ферментаций, проведенных на глюкозо-аммонийной среде №2 при рН=4,0,
температуре 26 оС и аэрации 1 л·л-1·мин-1 показала, что максимальной ОА
штамм достигает при 250 об·мин-1 (2,0 ЕОА), что в 1,2 раза выше, чем при 450
об·мин-1. Продуктивность по
биомассе была наибольшей
при 350-450 об·мин-1. Накопление биомассы было наибольшим при 550 об·мин-1
(9,2 г/л), но при этом происходило частичное диспергирование биомассы. Коэффи0
20
40
60
80
100
циент выхода фермента при
Продолжительность культивирования,ч
250 об·мин-1 составлял 0,26
350 об/ мин
250 об/мин
200 об/мин
ЕОА·мг-1, что в 1,9 раза преРисунок 4 – Динамика ОА в процессах при раз- вышает выход фермента при
личной интенсивности перемешивания в фер- 550 об·мин-1 .
ментационном аппарате на среде с мукой
Уточняющие эксперименты по влиянию перемешивания, проведенные на среде с мукой № 5, показали (рисунок 4), что режим
перемешивания 250 об·мин-1 и на этой среде является оптимальным. Продук7
ОА, Е ОА
6
5
4
3
2
1
0
2,5
ОА, Е ОА
2
1,5
1
0,5
0
14
ОА, Е ОА
тивность при этом режиме в 1,5 раза выше, чем при 200 и 350 об/мин. Таким
образом, максимально допустимой скоростью перемешивания в использованном аппарате является скорость 450-550 об·мин-1, чему соответствует критическая линейная окружная скорость мешалки 2,8–3,5 м·с-1. Оптимальному режиму
перемешивания (250 об·мин-1 ) при аэрации 1 л·л-1·мин-1 соответствует КLa 175
ч-1.
6.4. Влияние аэрации на рост и ОА штамма-продуцента
При оптимальном значении рН и скорости перемешивания (250 об·мин-1)
на оптимизированной сре7
де с мукой № 6 проведены
6
ферментации с различными
5
условиями аэрации. Как
4
видно из рисунка 5, значе3
-1
-1
·мин
ние
аэрации
1
л·л
2
0.8/1
является оптимальным для
1
максимального накопления
1/1
0
фермента в культуральной
0
10
20
30
40
50
60
70
80
1.2/1
Время, ч
жидкости. Продуктивность
при этом режиме составляРисунок 5 – Динамика ОА при различной инла 0,09 ЕОА·ч-1, что в 1,2-1,6
тенсивности аэрации в ферментационном аппарараза больше, чем при рете с перемешиванием 250 об·мин-1
жимах 0,8 и 1,2 об·мин-1.
При
проведении
ферментаций в отсутствие механического перемешивания увеличение уровня
аэрации приводит к увеличению ОА. Так, при аэрации 1,5 л·л-1·мин-1 максимальная ОА составляет 4,4 ЕОА, что в 1,7 раза превышает ОА при аэрации
1,0 л·л-1·мин-1. Таким образом, аэрация без перемешивания в недостаточной
степени обеспечивает условия для достижения высокой ОА.
В условиях используемого аппарата оптимальным режимом следует считать аэрацию 1,0 л·л-1·мин-1 при перемешивании 250 об·мин-1, что соответствует КLa 175 ч-1.
6.5. Изучение ОА T.hirsuta 56 при проведении многоциклических
процессов
На оптимизированной среде с мукой № 6 в оптимизированных условиях
культивирования проведены две серии многоциклических процессов. После
достижения максимума ОА культуральную среду сливали, оставляя 10 % в качестве посевного материала, и добавляли стерильную питательную среду до
исходного объема. Показана принципиальная возможность получения высокой
ОА в таких процессах. Время достижения максимума ОА составляло 42-68 часов.
15
6.6. Сравнение ОА T.hirsuta 56 в исходных и оптимизированных средах
и условиях культивирования
ОА, Е ОА
На рисунке 6 приведены графики ОА при культивировании штаммапродуцента в ферментационном аппарате, отражающие этапы работы. Показана ОА штамма в исходных условиях (глюкозо-пептонная среда №1, условия
культивирования не оптимизированы); в процес7
се
работы:
глюкозо№1
6
аммонийная среда №2,
условия не оптимизиро5
№2
ванные; среда с мукой №
4
5, условия оптимизирова№5
3
ны; глюкозо-аммонийная
среда № 7 в оптимизиро2
№6
ванных условиях; опти1
мизированная среда с му0
№7
кой № 6 в оптимизиро0
20
40
60
80
100
ванных условиях. В реВремя,час
зультате проведенной раРисунок 6 – Сравнение динамики ОА в ферменботы достигнуто повытациях, проведенных на исходной среде и на разшение ОА более, чем в
работанных средах и условиях культивирования
40 раз (0,13 ЕОА до 5,77
ЕОА). Продуктивность по
-1
-1
ОА увеличилась с 0,002 ЕОА·ч до 0,085 ЕОА·ч . Максимальная ОА, однократно достигнутая в ферментационном аппарате составляла 17,6 ЕОА.
7. Разработка технологии производства лакказы, проведение опытнопромышленных испытаний и характеристика получаемого фермента
7.1. Определение критериев масштабирования, разработка промышленной технологии и опытно-промышленного регламента на производство ферментного препарата лакказы
Интенсивный процесс биосинтеза лакказы штаммом T.hirsuta 56, как показали наши исследования, происходит при обеспечении за счет аэрации и перемешивания КLa =175 ч-1. В то же время штамм-продуцент лакказы, как и все
базидиальные грибы, относится к числу механолабильных культур, клетки которого повреждаются вращающимися частями механической мешалки при превышении критической скорости, равной по нашим экспериментальным данным
3,0–3,2 м·с-1. Эти показатели могут служить критериями масштабирования процесса производства лакказы.
На основании проведенных исследований разработана промышленная
технология получения высокоактивной культуральной жидкости и стадия культивирования опытно-промышленного регламента на производство ферментного
16
препарата технической лакказы мощностью 20 т в год (ОПР № 02068798-0106).
7.2. Опытно-промышленные испытания технологического процесса
На производственной базе ООО «Фирма «Макофарм»» (п. Лотошино, Московской обл.) проведены испытания технологии производства ферментного
препарата лакказы. В ферментационных аппаратах вместимостью 0,25м3 получены 2 партии культуральной жидкости с активностью 12,1 и 12,3 МЕ. Биомассу отделяли на рамном пресс-фильтре с использованием капроновой фильтрующей ткани и сушили в полочной конвекционной сушилке при температуре
65-90 оС. Культуральный фильтрат подвергали концентрированию в 10 раз баромембранным методом. Опытно-промышленные испытания подтвердили реализуемость разработанной технологии.
Наработанную опытную партию ферментного препарата лакказы передали
ЗАО «ВНИИДРЕВ» для испытаний в процессе получения древесноволокнистых плит на биосвязующих и Институту биохимии им. А.Н.Баха РАН
для получения высокоочищенного препарата лакказы для ферментативного
синтеза полианилина.
7.3. Биохимические характеристики препарата лакказы
Работы, поведенные совместно с Институтом биохимии им. А.Н. Баха
РАН, подтвердили, что основным ферментом, продуцируемым штаммом
T.hirsuta 56 на разработанной среде является лакказа. Фермент содержит 4 иона
меди трех типов в активном центре и имеет высокий редокс потенциал (780±20
мВ). Молекулярная масса лакказы T.hirsuta 56 составляет 70±2 кДа, углеводная
часть – около 12 % от молекулярной массы холофермента. Изоэлектрическая
точка – 4,2±0,1, рН-оптимум – 4,5. Удельная активность гомогенного по данным
электрофореза препарата лакказы по пирокатехину – 220-240 МЕ/мг. Эффективность катализа (kкат /Км)·10-6 – 2,75 М-1с-1 по пирокатехину; 7,38 М-1с-1 по гидрохинону.
7.4. Технико-экономическая оценка
Технико-экономическую оценку проводили с учетом стадии концентрирования ферментного препарата при годовом объеме производства культуральной
среды 4400 м3, что составляет потребность одного предприятия при переводе
всего производства древесно-волокнистых плит на использование биосвязующих. Расчет проводили в сопоставлении c препаратом DeniLite II фирмы
Novozymes, содержащим лакказу в качестве основного компонента лакказамедиаторной системы (медиатор – пропионово кислый фенотиазин), стоимость
1000 ME лакказы которого по ориентировочной оценке составляет 142 рубля.
Стоимость 1000 МЕ нашего концентрированного ферментного препарата лакказы составляет 27 рублей.
Таким образом, концентрированный ферментный препарат лакказы, полученный по разработанной технологии стадии культивирования, в пересчете
17
на 1000 МЕ лакказы не уступает по стоимости препарату DeniLite II фирмы
Novozymes и содержит высокопотенциальную лакказу, что существенно расширяет область его применения.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
1. На агаризованой среде и в условиях глубинного культивирования проведен
скрининг 20 штаммов грибов рода Trametes Fr. – потенциальных продуцентов лакказы. Отобраны штаммы с высокой активностью экстрацеллюлярного оксидоредуктазного комплекса (T. hirsuta 56 и НРБ-2, T.pubescens 78-12,
T.ochracea 239). На основании продуктивности в условиях культивирования
в ферментационном аппарате и биохимических характеристик синтезируемой лакказы для дальнейших исследований отобран штамм-продуцент T.
hirsuta 56.
2. Для отобранного штамма установлено, что наиболее эффективными для синтеза оксидаз на полусинтетической среде являются: сахароза, глюкоза,
фруктоза и мальтоза в качестве источника углерода; пептон, мочевина и
(NH4)2SO4 в качестве источника азота; фосфат калия двузамещенный и однозамещенный в качестве источника фосфора.
3. Определено возобновляемое сельскохозяйственное сырье, обеспечивающее
высокую оксидазную активность штамма-продуцента (крахмал, меласса,
пшеничная мука, сусло). Подобраны компоненты питательной среды с пшеничной мукой в качестве основного сырья (NH4NO3, KH2PO4 и кукурузный
экстракт). Состав питательной среды оптимизирован с применением математических методов планирования эксперимента, что позволило увеличить ОА
в 2,7 раза. Показано, что наличие в составе питательной среды 0,03 мМ
CuSO4 достаточно для того, чтобы процесс синтеза лакказы не был лимитирован Cu2+. Показано, что добавление в состав среды древесных стружек,
виноградных гребней и этанола позволяет увеличить ОА в 1,5 раза.
4. Изучено влияние режимов культивирования на ОА штамма-продуцента. Определен оптимальный режим рН; температуры; перемешивания и аэрации.
Определены критерии масштабирования процесса биосинтеза лакказы –
критическая линейная окружная скорость перемешивания и оптимальное
значение КLа.
5. Экспериментально подтверждено стабильное увеличение ОА в результате
подбора и оптимизации состава питательной среды и условий культивирования более, чем в 40 раз (до среднего значения 5,8 ЕОА). Время достижения максимальной ОА сокращено до 68 часов.
6. Разработана и апробирована промышленная технология стадии культивирования, на основании которой создан опытно-промышленный регламент. Показано, что основным ферментом T.hirsuta 56, получаемым по разработанной
технологии, является высокопотенциальная лакказа.
18
Список публикаций
1. Горшина Е.С., Т.В. Русинова, В.В. Бирюков, С.В. Шлеев, А.И. Ярополов.
Изучение активности внеклеточных оксидоредуктаз дереворазрушающих грибов рода Coriolus Quel. // Биотехнология: состояние и перспективы развития:
Матер. 1-го Междунар. конгресса.– М.: ЗАО «ПИК «Максима», РХТУ им. Д.И.
Менделеева, 2002.– С. 448-449
2. Горшина Е.С., Русинова Т.В., Кулакова О.А., Бирюков В.В. Дереворазрушающие грибы рода Coriolus как продуценты оксидазного ферментативного
комплекса для биодеградации ксенобиотиков // Техника и технология экологически чистых производств: Матер. VI междунар. симп./ Под ред. Беренгартена
М.Г. и др. – М: МГУИЭ, 2002.– С. 52-54.
3. Русинова Т.В., Горшина Е.С. Бирюков В.В. Выбор штамма-продуцента для
биотехнологического получения лакказного ферментного комплекса // Биотехнология – наука XXI века: Тезисы 7-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых 14-18 апреля 2003 г.– Пущино, 2003.– С.127
4. Русинова Т.В. Горшина Е.С., Бирюков В.В. Получение оксидазного ферментативного комплекса культивированием дереворазрушающего гриба рода
Trametes для биодеградации ксенобиотиков. // Инженерная защита окружающей среды: Докл. V междунар. конфер./ под ред. Баранова Д.А., Николайкиной
Н.Е.– М.:МГУИЭ, 2003.–С. 172-173.
5. Русинова Т.В., Горшина Е.С., Бирюков В.В. Щеблыкин И.Н. Влияние состава среды и условий культивирования на оксидазную активность Trametes
hirsuta. // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Матер. II Московского междунар. Конгресса (Москва, 10-14 ноября 2003).– М.: ЗАО «ПИК
«Максима», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2003.– ч. II, С. 212
6. Русинова Т.В. Горшина Е.С., Бирюков В.В. Изучение возможности комплексного использования культуральной жидкости грибов рода Trametes для
выделения фермента и получения биодобавки.// Техника и технология экологически чистых производств: Материалы VII междунар. Симпозиума молодых
ученых, аспирантов и студентов.– М: 2003.– С. 87-89.
7. Русинова Т.В. Горшина Е.С., Бирюков В.В., Щеблыкин И.Н. Влияние состава среды и условий культивирования на оксидазную активность Trametes
hirsuta. // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Матер. II Московского междунар. Конгресса (Москва, 10-14 ноября 2003).– М.: ЗАО «ПИК
«Максима», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2003.– ч. II, С. 212
8. Русинова Т.В., Горшина Е.С. Крамм Э.А., Бирюков В.В., Ярополов А.И.,
Шлеев С.В., Щеблыкин И.Н. Изучение трофических потребностей и технологических характеристик продуцента лакказы Trametes hirsuta// Биотехнология –
наука XXI века: Тезисы 8-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых
17-21 мая 2004 г.– Пущино, 2004.– С.277-278
19
9. Халунина А.С., Шлеев С.В., Горшина Е.С., Русинова Т.В., Ярополов А.И.
Электрохимическое поведение «голубых» лакказ базидиомицетов на электродах из углеродных материалов // Биотехнология – наука XXI века: Тезисы 8-ой
Пущинской школы-конференции молодых ученых 17-21 мая 2004 г.– Пущино,
2004.– С.284.
10. К.И. Михайлова, Т.В. Русинова, Е.С. Горшина, В.В. Бирюков, А.И. Ярополов, И.Н. Щеблыкин. Опыт разработки технологии базидиальных лакказ //
Наука-Бизнес-Образование. Тезис. Докл 2 Междунар. Конфер. 10-13 мая.– Пущино.– 2005.– С. 31-32
11. Shleev S.V., O.V. Morozova, O.V. Nikitina, E.S. Gorshina, T.V. Rusinova,
S.A. Serezhenkov, D.S., Burbaev, I.G. Gazaryan, A.I. Yaropolov. Comparison of
physico-chemical characteristics of four laccase from different basidiomycetes //
Biochimie.– 2004.–v. Sep-Oct 86 (9-10):, p. 693-703
12. Никитина О.В., Шлеев С.В., Горшина Е.С. Русинова Т.В., Ярополов А.И.
Роль ионов двухвалентного марганца в функционировании лигнинолитических
ферментов базидиального гриба Trametes pubescens. (2005) Вестн. Моск. Ун-та,
Сер. 2. Химия. Т. 46, 4, с. 272-278.
13. Никитина О.В., С.В. Шлеев, Е.С. Горшина, Т.В. Русинова, В.А. Сереженков, Д.Ш. Бурбаев, Л.В., Беловолова, А.И. Ярополов. Выделение и очистка
ферментов лигнолитического комплекса базидиального гриба Trametes
pubescens (Schumach.)Pilat и исследование их свойств // Биохимия.– 2005.–том
70.–вып. 11.– С. 1548-1555
14. Горшина Е.С., Т.В. Русинова, В.В. Бирюков, О.В. Морозова, С.В. Шлеев,
А.И. Ярополов. Динамика оксидазной активности в процесе культивирования
базидиального гриба рода Trametes Fr. // Прикладная биохимия и микробиология.– 2006.–№ 6.–С.638-644
15. Е.С. Горшина, Т.В. Русинова, Н.С. Марьина, Н.А. Шкурина, В.В. Бирюков, И.Н. Щеблыкин, М.А. Горбачева, О.В. Морозова, С.В. Шлеев,
А.И.Ярополов. Биосинтез грибной лакказы – фермента для экологически безопасных производств/ Сборник трудов МГУИЭ, 2006, 116-123.
20