2 281 973(13) C2

реклама
ÐÎÑÑÈÉÑÊÀß ÔÅÄÅÐÀÖÈß
RU
(19)
(11)
2 281 973
(13)
C2
(51) ÌÏÊ
C12N
C12N
C07K
A61K
9/16 (2006.01)
15/55 (2006.01)
16/40 (2006.01)
38/46 (2006.01)
ÔÅÄÅÐÀËÜÍÀß ÑËÓÆÁÀ
ÏÎ ÈÍÒÅËËÅÊÒÓÀËÜÍÎÉ ÑÎÁÑÒÂÅÍÍÎÑÒÈ,
ÏÀÒÅÍÒÀÌ È ÒÎÂÀÐÍÛÌ ÇÍÀÊÀÌ
(12)
ÎÏÈÑÀÍÈÅ ÈÇÎÁÐÅÒÅÍÈß Ê ÏÀÒÅÍÒÓ
(21), (22) Çà âêà: 2001126572/13, 02.03.2000
(72) Àâòîð(û):
Çóçàííå ÊËÓÌÏÏ (DE),
Ðîëàíä ÊÅËËÜÍÅÐ (DE)
(24) Äàòà íà÷àëà îòñ÷åòà ñðîêà äåéñòâè ïàòåíòà:
02.03.2000
(73) Ïàòåíòîîáëàäàòåëü(è):
ÌÅÐÊ ÏÀÒÅÍÒ ÃÌÁÕ (DE)
R U
(30) Êîíâåíöèîííûé ïðèîðèòåò:
04.03.1999 DE 19909388.1
(43) Äàòà ïóáëèêàöèè çà âêè: 27.07.2003
(45) Îïóáëèêîâàíî: 20.08.2006 Áþë. ¹ 23
2 2 8 1 9 7 3
2 2 8 1 9 7 3
R U
(85) Äàòà ïåðåâîäà çà âêè PCT íà íàöèîíàëüíóþ ôàçó:
04.10.2001
C 2
C 2
(56) Ñïèñîê äîêóìåíòîâ, öèòèðîâàííûõ â îò÷åòå î
ïîèñêå: HILLER L. È ÄÐ.: "zx64gll.rl Soares
total fetus Nb2HF8 9w Homo sapiens cDNA
clone", áàçà äàííûõ EMBL; èíâåíòàðíûé íîìåð
ÀÀ461149, 13.06.1997, õð002141076. MATTHEWS
HARRY R È ÄÐ.: "Protein histidine phosphatase
activity in rat liver and spinach leaves."
FEBS LETTERS, òîì 364, ¹1, 1995, ñ.51-54,
ISSN: 0014-5793.
(86) Çà âêà PCT:
EP 00/01774 (02.03.2000)
(87) Ïóáëèêàöè PCT:
WO 00/52175 (08.09.2000)
Àäðåñ äë ïåðåïèñêè:
101000, Ìîñêâà, Ìàëûé Çëàòîóñòèíñêèé ïåð.,
10, êâ.15, "ÅÂÐÎÌÀÐÊÏÀÒ", ïàò.ïîâ.
Í.Â.Êóçåíêîâîé
(54) ÃÈÑÒÈÄÈÍ-ÏÐÎÒÅÈÍ-ÔÎÑÔÀÒÀÇÀ
(57) Ðåôåðàò:
Èçîáðåòåíèå
îòíîñèòñ ê
îáëàñòè
áèîòåõíîëîãèè è ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíî â
ìåäèöèíå è ôàðìàöåâòèêå. Ïîëó÷åí ïîëèïåïòèä,
îáëàäàþùèé áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ ãèñòèäèíïðîòåèí-ôîñôàòàçû, à òàêæå êîäèðóþùèé åãî
ïîëèíóêëåîòèä. Íà îñíîâå ïîëèïåïòèäà ïîëó÷åí
ôàðìàöåâòè÷åñêèé ïðåïàðàò, ïðèìåí åìûé ïðè
ïàòîëîãè÷åñêèõ ñîñòî íè õ, ñâ çàííûõ ñ
íàðóøåíèåì
ôóíêöèè
ãèñòèäèí-ïðîòåèí-
ôîñôàòàçû.
Òàêæå
ïîëó÷åíû
àíòèòåëà,
ñïåöèôè÷íûå ê ó÷àñòêàì óêàçàííîãî ïîëèïåïòèäà.
Ïðèìåíåíèå èçîáðåòåíè ïîçâîë åò èçó÷àòü
ïðîöåññ N-ôîñôîëèðîâàíè , äèàãíîñòèðîâàòü
ïàòîëîãèè êëåòî÷íîé ðåãóë öèè è ðîñòà êëåòîê, à
òàêæå ðåãóëèðîâàòü ïàòîëîãè÷åñêèå ñîñòî íè ,
ñâ çàííûå ñ íàðóøåíèåì ôóíêöèè ãèñòèäèíïðîòåèí-ôîñôàòàçû. 7 í. è 4 ç.ï. ô-ëû, 8 èë., 3
òàáë.
Ñòðàíèöà: 1
RU
RUSSIAN FEDERATION
RU
(19)
(11)
2 281 973
(13)
C2
(51) Int. Cl.
C12N
C12N
C07K
A61K
9/16 (2006.01)
15/55 (2006.01)
16/40 (2006.01)
38/46 (2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY,
PATENTS AND TRADEMARKS
(12)
ABSTRACT OF INVENTION
(21), (22) Application: 2001126572/13, 02.03.2000
(24) Effective date for property rights: 02.03.2000
(72) Inventor(s):
Zuzanne KLUMPP (DE),
Roland KELL'NER (DE)
(30) Priority:
04.03.1999 DE 19909388.1
(73) Proprietor(s):
MERK PATENT GMBKh (DE)
R U
(43) Application published: 27.07.2003
(45) Date of publication: 20.08.2006 Bull. 23
2 2 8 1 9 7 3
(85) Commencement of national phase: 04.10.2001
(86) PCT application:
EP 00/01774 (02.03.2000)
(87) PCT publication:
WO 00/52175 (08.09.2000)
(57) Abstract:
FIELD: biotechnology, biochemistry, enzymes.
SUBSTANCE: invention reports about preparing a
polypeptide
possessing
with
the
biological
activity of enzyme protein-histidine-phosphatase
and a polynucleotide encoding this enzyme also.
Based on the polypeptide a pharmaceutical
preparation is prepared using in pathological
states associated with disturbance function of
protein-histidine-phosphatase.
Also,
antibodies
showing
specificity
to
sites
of
indicated
polypeptide are prepared. The use of the
invention provides study of the N-phosphorylation
process, carrying out the diagnosis of pathology
of cellular regulation and growth cells and to
regulate
pathological
states
associated
with
disturbance
in
function
of
protein-histidinephosphatase. Invention can be used in medicine
and pharmacy.
EFFECT: valuable medicinal properties of
enzyme, improved preparing method.
11 cl, 3 tbl, 10 dwg
R U
2 2 8 1 9 7 3
(54) PROTEIN-HISTIDINE-PHOSPHATASE
Ñòðàíèöà: 2
EN
C 2
C 2
Mail address:
101000, Moskva, Malyj Zlatoustinskij per.,
10, kv.15, "EVROMARKPAT", pat.pov.
N.V.Kuzenkovoj
RU 2 281 973 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Íàñòî ùåå èçîáðåòåíèå îòíîñèòñ ê íîâîìó ôåðìåíòó, ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçå,
êîòîðûé ïîëó÷àþò èç ìëåêîïèòàþùèõ, è åãî ãîìîëîãè÷åñêèì âàðèàöè ì. Êðîìå òîãî, äàííîå
èçîáðåòåíèå îòíîñèòñ ê ïîñëåäîâàòåëüíîñò ì ÄÍÊ, êîäèðóþùèì óïîì íóòûå ïðîòåèíû,
ñïîñîáó ïîëó÷åíè ïîñëåäíèõ è àíòèòåëàì ê íèì. Íîâóþ ôîñôàòàçó ìîæíî ïðèìåí òü äë äèàãíîñòèêè ïàòîëîãèé êëåòî÷íîé ðåãóë öèè è ðîñòà êëåòîê, à òàêæå â êà÷åñòâå
ôàðìàöåâòè÷åñêîãî ïðåïàðàòà, êîòîðûé ìîæåò ïðèìåí òüñ ïðè ïàòîëîãè÷åñêèõ
ñîñòî íè õ, ñâ çàííûõ ñ íàðóøåíè ìè ôóíêöèé óêàçàííîãî ôåðìåíòà. Áîëåå ïîäðîáíî,
íàñòî ùåå èçîáðåòåíèå îòíîñèòñ ê ïðèìåíåíèþ óïîì íóòîãî ôåðìåíòà â äèàãíîñòèêå è
ëå÷åíèè çàáîëåâàíèé, ïðèìåíåíèþ àãîíèñòîâ è àíòàãîíèñòîâ ïðè èäåíòèôèêàöèè ôàêòîðîâ
ôîñôîðèëèðîâàíè ãèñòèäèíà, à òàêæå àãîíèñòàì è àíòàãîíèñòàì, êîòîðûå ìîæíî
ïðèìåí òü â òåðàïèè.
Ïðåäïîñûëêè ñîçäàíè èçîáðåòåíè Ôîñôîðèëèðîâàíèå ïðîòåèíîâ ïðåäñòàâë åò ñîáîé âàæíåéøèé áèîëîãè÷åñêèé ïðîöåññ,
íåðåäêî èãðàþùèé êëþ÷åâóþ ðîëü â òðàíñäóêöèè ñèãíàëîâ è ðåãóë öèè àêòèâíîñòè
ïðîòåèíîâ. Ôîñôîðèëèðîâàíèå ñåðèíà, òðåîíèíà è òèðîçèíà - îáû÷íîå âëåíèå íà ïóò õ
ýóêàðèîòíîé òðàíñäóêöèè ñèãíàëà. Ñóùåñòâóåò îãðîìíîå êîëè÷åñòâî ëèòåðàòóðû,
ïîñâ ùåííîé áèîõèìè÷åñêèì ìåòîäàì âû âëåíè ôîñôîðèëèðîâàíè ñåðèíà, òðåîíèíà è
òèðîçèíà íåèçâåñòíûõ ïðîòåèíîâ. Íàïðèìåð, êîãäà âûðàùåííûå êëåòêè ìëåêîïèòàþùèõ
îáðàáàòûâàþòñ ôàêòîðàìè ðîñòà, öèòîêèíàìè, ëåêàðñòâåííûìè âåùåñòâàìè, ïåïòèäàìè
èëè äðóãèìè ñòèìóëèðóþùèìè ìîëåêóëàìè, òàêèìè êàê ôàêòîð ðîñòà, âûäåëåííûé èç
òðîìáîöèòîâ, ôàêòîð ðîñòà íåðâîâ, IL-2 (èíòåðëåéöèí-2) è ò.ä., ôîñôîðèëèðîâàíèå
ïðîòåèíîâ â ñåðèíå, òðåîíèíå è òèðîçèíå ìîæíî ëåãêî âû âèòü ïóòåì êóëüòèâèðîâàíè êëåòîê ñ ìå÷åíûì ðàäèîèçîòîïîì ôîñôàòîì, âûäåëåíè ïðîòåèíîâ ïîñëå îáðàáîòêè
ôàêòîðîì ðîñòà è ò.ä. è ðàçäåëåíè èõ ìåòîäîì ýëåêòðîôîðåçà â ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå
äîäåöèëñóëüôàòîì íàòðè , ñâ çûâàíè ãåë è ïðîâåäåíè àâòîðàäèîãðàôèè, ïîçâîë þùåé
èäåíòèôèöèðîâàòü ïîëîñû ïðîòåèíîâ, ñîäåðæàùèå ìå÷åíûé ôîñôàò.  êà÷åñòâå
àëüòåðíàòèâû ïðîòåèíû èç îáðàáîòàííûõ è íåîáðàáîòàííûõ êëåòîê ìîæíî ðàçäåëèòü ñ
èñïîëüçîâàíèåì äâóõìåðíîé ñèñòåìû, ñðàâíèâà ïîëîæåíè ï òåí ïðîòåèíîâ. ßâíîå
ïåðåìåùåíèå ï òíà ãîâîðèò îá èçìåíåíèè â ìîäèôèêàöèè, ïîëó÷åííîé â ðåçóëüòàòå
îáðàáîòêè. Â åùå îäíîì âàðèàíòå ïðåäóñìàòðèâàåòñ ïðîâåäåíèå êèñëîòíîãî ãèäðîëèçà
ïðîòåèíîâ ñ ïîëó÷åíèåì àìèíîêèñëîò, ñ êîòîðûìè çàòåì ïðîâîä ò òîíêîñëîéíóþ
õðîìàòîãðàôèþ è èññëåäóþò íà íàëè÷èå ìå÷åíîãî ðàäèîèçîòîïîì ôîñôîðà.
Îäíàêî ýòè ìåòîäû áåëêîâîé õèìèè îñóùåñòâë þòñ â óñëîâè õ, ïðè êîòîðûõ
ôîñôîðèëèðîâàííûé ãèñòèäèí, ëèçèí èëè àðãèíèí íåñòàáèëüíû.  ÷àñòíîñòè, ïðè íèçêîì
ðÍ ôîñôîãèñòèäèí ñïîíòàííî ðàñïàäàåòñ ÷åðåç ïðèáëèçèòåëüíî 5-100 ìèíóò, òîãäà êàê
ïðè ñðåäíåì ðÍ ïåðèîä åãî ïîëóðàñïàäà ñîñòàâë åò îò íåñêîëüêèõ äíåé äî íåñêîëüêèõ
íåäåëü (Matthews, Í. R. [1995] Pharmac. Ther. 67:323-350). Íàïðèìåð, ïîñëå ïðîâåäåíè ýëåêòðîôîðåçà ïîëèàêðèëàìèäíûå ãåëè, èñïîëüçóåìûå äë ðàçäåëåíè ïðîòåèíîâ,
ñâ çûâàþò â êèñëîòíûõ óñëîâè õ. Ê ðàñïàäó ôîñôîãèñòèäèíà òàêæå ïðèâîäèò
èñïîëüçîâàíèå êèñëîòíûõ óñëîâèé ïðè ãèäðîëèçå àìèíîêèñëîòû.
Áûëî óñòàíîâëåíî, ÷òî ôîñôîðèëèðîâàííûé ãèñòèäèí èãðàåò êëþ÷åâóþ ðîëü â
òðàíñäóêöèè ñèãíàëîâ â áàêòåðè õ. Ïóòè òðàíñäóêöèè ðåãóëèðóþò öåëûé ð ä ïðîöåññîâ
áàêòåðèàëüíîãî ìåòàáîëèçìà. Íàïðèìåð, ñèñòåìà ArcA/ArcB óïðàâë åò àýðîáíûì è
àíàýðîáíûì ìåòàáîëèçìîì â Å. coli (luchi S, Weiner L. J Biochem (Òîêèî) [1996] 120:
1055-63). OmpR è OmpF îòâå÷àþò çà ðåàêöèè íà ðàçëè÷íûå îñìîòè÷åñêèå óñëîâè (Pratt
LA., Hsing W., Gibson K.E, Silhavy T.J. Mol Microbiol [1996] 20:911-7). CheA è CheZ
ïðèíèìàþò ó÷àñòèå â õåìîòàêñèñå (Alon U. Nature [1999] 397:168-171). Âïåðâûå âñå ýòè
ïðîòåèíû áûëè èäåíòèôèöèðîâàíû ãåíåòè÷åñêè: â ðåçóëüòàòå ìóòàöèé â ñîîòâåòñòâóþùèõ
ãåíàõ îáðàçóþòñ òðåáóåìûå ôåíîòèïû, è ïîñëå êëîíèðîâàíè äàííûõ ãåíîâ ïðîâîä ò
èäåíòèôèêàöèþ ïîëó÷åííûõ ïðîòåèíîâ.
Òàêæå íåäàâíî áûëî îáíàðóæåíî, ÷òî ýóêàðèîòû S. cerevisiae è Arabidopsis thaliana
èìåþò ñèñòåìû òðàíñäóêöèè ñèãíàëîâ ñ ïðîòåèíàìè, â êîòîðûõ ïðîèñõîäèò
ôîñôîðèëèðîâàíèå ãèñòèäèíà (Loomis è äð., [1997] J. Cell Science 110:1141-1145).
Ñòðàíèöà: 3
DE
RU 2 281 973 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Íàïðèìåð, ïðîòåèí Sln1 îáëàäàåò âíåêëåòî÷íûì ñåíñîðíûì äîìåíîì, öèòîïëàçìàòè÷åñêèì
äîìåíîì ãèñòèäèí-êèíàçû è äîìåíîì òðàíñë öèè àñïàðòàòà. ETR1 âèäà Arabidopsis
thaliana èç ñåìåéñòâà ãîð÷è÷íûõ áûë òàêæå èäåíòèôèöèðîâàí ìóòàíòàìè, íå ðåàãèðóþùèìè
íà ýòèëåí. Ãåí ETR1 çàòåì êëîíèðîâàëè è ïðîâîäèëè èññëåäîâàíèå ïðîòåèíà, â ðåçóëüòàòå
êîòîðîãî áûëî îáíàðóæåíî, ÷òî ïîñëåäíèé ïðåäñòàâë åò ñîáîé ãèñòèäèí-êèíàçó. S.
cerevisiae è Arabidopsis thaliana âë þòñ ãåíåòè÷åñêè ìîäèôèöèðóåìûìè îðãàíèçìàìè, è
èõ ïðîòåèíû, ïðèíèìàþùèå ó÷àñòèå â ôîñôîðèëèðîâàíèè ãèñòèäèíà, òàêèå êàê Sln1 è Etr1,
êàê ïðàâèëî, èäåíòèôèöèðóþò ãåíåòè÷åñêè.
Ñóùåñòâóþùèå ìåòîäèêè âêëþ÷àþò ðàçäåëåíèå ïî ðàçìåðàì ëèáî ïðîòåèíîâ, ëèáî
ôîñôîàìèíîêèñëîò.
N-ôîñôîðèëèðîâàíèå â êëåòêàõ ìëåêîïèòàþùèõ âë åòñ âàæíûì ïðîöåññîì â
ýíåðãåòè÷åñêîì îáìåíå è èçìåí åòñ ïðè ðàçâèòèè ðàçëè÷íûõ òèïîâ ðàêà. Íàïðèìåð,
ïðîòåèí Nm23 ïðåäñòàâë åò ñîáîé íóêëåîçèä-äèôîñôàò-êèíàçó, êîòîðà ìîæåò ïåðåâîäèòü
íóêëåîçèä- è äåîêñèíóêëåîçèääèôîñôàòû â òðèôîñôàòû, èñïîëüçó äë ýòîãî ÀÒÔ,
îáðàçóåìûé â ðåçóëüòàòå ãëèêîëèçà è îêèñëèòåëüíîãî ôîñôîðèëèðîâàíè . Nm23
ôîñôîðèëèðóåòñ â Ãèñòèäèíå 118 íà ïðîìåæóòî÷íîé ñòàäèè ïèíã-ïîíãîâîãî ìåõàíèçìà åãî
ðåàêöèè. Nm23 òàêæå ñïîñîáåí ïåðåäàâàòü ñâîþ ôîñôàòíóþ ãðóïïó ãèñòèäèíîâûì îñòàòêàì
â ÀÒÔ-öèòðàò-ëèàçå è ñóêöèíèë-ÑîÀ-ñèíòåòàçå. Òàêèì îáðàçîì, ôîñôîðèëèðîâàíèå
ãèñòèäèíà èãðàåò âàæíóþ ðîëü â ýíåðãåòè÷åñêîì îáìåíå â êëåòêàõ.
 îðãàíèçìå ÷åëîâåêà èìååòñ íåñêîëüêî ïðîòåèíîâ Nm23. Ïðè ðàêîâûõ çàáîëåâàíè õ ñ
âûñîêèì ìåòàñòàçîì ýòè ïðîòåèíû Nm23 íåðåäêî ýêñïðåññèðóþòñ íà íèçêèõ óðîâí õ.
Èñõîä èç ýòîãî, ïîëàãàþò, ÷òî Nm 23 âë åòñ àíòèîíêîãåíîì. Êðîìå òîãî, ïðè
íåêîòîðûõ ðàêîâûõ çàáîëåâàíè õ â îòäåëüíûõ ïðîòåèíàõ Nm23 íàáëþäàþòñ ìóòàöèè. Â
ðåçóëüòàòå ýòèõ ìóòàöèé íåðåäêî èçìåí åòñ ñêîðîñòü ôîñôîðèëèðîâàíè èëè
äåôîñôîðèëèðîâàíè Nm23.
Åñëè îáîáùèòü âñå âûøåóêàçàííîå, ñòàíîâèòñ î÷åâèäíûì, ÷òî N-ôîñôîðèëèðîâàíèå
èãðàåò âàæíóþ ðîëü â ýíåðãåòè÷åñêîì îáìåíå è ïðîöåññàõ, ïðîèñõîä ùèõ ïðè ðàçâèòèè
ðàêà. Òàêèì îáðàçîì, ïðîòåèíû èëè ëåêàðñòâà, ìîäóëèðóþùèå N-ôîñôîðèëèðîâàíèå èëè
äåôîñôîðèëèðîâàíèå, ìîãóò îêàçàòüñ âåñüìà ïîëåçíûìè ïðè ëå÷åíèè ðàêà èëè
ðàññòðîéñòâ îáìåíà âåùåñòâ, òàêèõ êàê îæèðåíèå, àíîðåêñè , èçìîæäåííîñòü êàê
ñëåäñòâèå ðàêà, ÂÈ× èëè äðóãèå çàáîëåâàíè è ò.ä. Êðîìå òîãî, ïîñêîëüêó Nôîñôîðèëèðîâàíèå èãðàåò îïðåäåëåííóþ ðîëü â öåëîì ð äå áèîëîãè÷åñêèõ âëåíèé,
èìåþùèõ ìåñòî â äðóãèõ îðãàíèçìàõ, âïîëíå âîçìîæíî, ÷òî îíî òàêæå òàê èëè èíà÷å
âîçäåéñòâóåò íà ðàçâèòèå èíûõ áîëåçíåé è ðàññòðîéñòâ ìëåêîïèòàþùèõ, òàêèõ êàê
èììóííûå ðàññòðîéñòâà, âèðóñíûå èíôåêöèè, ãåíåòè÷åñêèå ðàññòðîéñòâà, ïîðîê ñåðäöà è
ò.ä.
Ê ñîæàëåíèþ, ìëåêîïèòàþùèå ðàñòóò íàìíîãî ìåäëåííåå áàêòåðèé (S. cerevisiae è
Arabidopsis thaliana). Òàêèì îáðàçîì, èäåíòèôèöèðîâàòü ïðîòåèíû, ïðèíèìàþùèå ó÷àñòèå
â ôîñôîðèëèðîâàíèè ãèñòèäèíà, ëèçèíà èëè àðãèíèíà, ïîëüçó ñü ïðè ýòîì òåìè æå
ãåíåòè÷åñêèìè ìåòîäàìè, ê êîòîðûì ïðèáåãàþò ïðè ðàáîòå ñ áîëåå ïðîñòûìè îðãàíèçìàìè,
äîâîëüíî ñëîæíî. Ê òîìó æå áèîõèìè÷åñêèå ìåòîäèêè èäåíòèôèêàöèè ïðîòåèíîâ,
ôîñôîðèëèðóåìûõ â ñåðèíå, òðåîíèíå è òèðîçèíå, íå ñîâñåì ïðèìåíèìû äë èäåíòèôèêàöèè ïðîòåèíîâ, êîòîðûå ôîñôîðèëèðóþòñ â ãèñòèäèíå, ëèçèíå è àðãèíèíå.
Òàêèì îáðàçîì, â äàííîé îáëàñòè òåõíèêè èìååòñ ïîòðåáíîñòü â ìåòîäèêàõ è
áèîõèìè÷åñêèõ ðåàãåíòàõ, êîòîðûå ìîæíî áûëî áû ïðèìåí òü äë èçó÷åíè ïðîöåññà Nôîñôîðèëèðîâàíè .
Ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû è ãèñòèäèí-êèíàçû - ýòî ôåðìåíòû, äåéñòâóþùèå â
ïðîòèâîïîëîæíûõ íàïðàâëåíè õ. Ãèñòèäèí-êèíàçà èíèöèèðóåò ôîñôîðèëèðîâàíèå
îïðåäåëåííûõ ãèñòèäèíîâûõ îñòàòêîâ â ïðîòåèíàõ, òîãäà êàê ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû
îáðàùàþò ýòîò ïðîöåññ. Âåðî òíî, îáà ôåðìåíòà èãðàþò íå ïîñëåäíþþ ðîëü â òðàíñäóêöèè
ñèãíàëîâ, àïîïòîçå, ðåãóë öèè ðîñòà êëåòîê è äèôôåðåíöèàöèè êëåòîê. Èçâåñòíî, ÷òî îíè
ìîãóò âûçûâàòü çàáîëåâàíè , ñâ çàííûå ñ íàðóøåíè ìè ýòèõ êëåòî÷íûõ ôóíêöèé. Òàêèì
îáðàçîì, öåëü íàñòî ùåãî èçîáðåòåíè -ýòî ïîëó÷åíèå àãåíòà, êîòîðûé ìîæíî áûëî áû
Ñòðàíèöà: 4
RU 2 281 973 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ïðèìåí òü äë èññëåäîâàíè ïðè÷èí ïàòîôèçèîëîãè÷åñêèõ íàðóøåíèé è, êîãäà ýòî
âîçìîæíî, óñòðàíåíè ïîñëåäíèõ.
Ãîðìîíû èëè ïåïòèäû ñòèìóëèðóþò ðåöåïòîðû, ðàñïîëàãàþùèåñ íà ïîâåðõíîñòè
êëåòêè, è, çàäåéñòâó ïóòü òðàíñäóêöèè ñèãíàëà, èíäóöèðóþò âëåíè , èìåþùèå ìåñòî â
êëåòêå. Îáðàòèìîå ôîñôîðèëèðîâàíèå ñïåöèôè÷åñêèõ ïðîòåèíîâûõ ïîäëîæåê
ðåãóë òîðíûìè ïðîòåèíêèíàçàìè è ôîñôàòàçàìè èãðàåò ñóùåñòâåííóþ ðîëü âî
âíóòðèêëåòî÷íîé ïåðåäà÷å ñèãíàëà. Ðåöåïòîðñâ çàííûå, ìåìáðàíîñâ çàííûå è
âíóòðèêëåòî÷íûå ïðîòåèíêèíàçû è ôîñôàòàçû ðåãóëèðóþò ïðîöåññû ïðîëèôåðàöèè è
äèôôåðåíöèàöèè êëåòîê, à òàêæå óïðàâë þò èììóííîé ñèñòåìîé. Íàðóøåíè ôóíêöèé ýòèõ
ðåãóë òîðîâ èãðàåò ðåøàþùóþ ðîëü â ð äå ïàòîôèçèîëîãè÷åñêèõ âëåíèé. Òàêèì îáðàçîì,
ïðè ðàçðàáîòêå ëåêàðñòâà äîëæíû ðåøàòüñ çàäà÷è ïîëó÷åíè ñîåäèíåíèé, äåéñòâóþùèõ
ïîäîáíî ïðîòåèíêèíàçàì è ôîñôàòàçàì, à òàêæå ìîäåëèðîâàíè ïóòè òðàíñäóêöèè ñèãíàëà,
â êîòîðîì îíè ïðèíèìàþò ó÷àñòèå.
Òðàíñäóêöè ñèãíàëà â ìëåêîïèòàþùèõ âêëþ÷àåò îáðàòèìîå ôîñôîðèëèðîâàíèå
Ser/Thr/Tyr. Õîò è èçâåñòíî, ÷òî ãèñòèäèíôîñôàò ïðèñóòñòâóåò â êëåòêàõ ìëåêîïèòàþùèõ
(Crovello C.S., Furie B.C., Furie Â. (1995) Cell 82:279-286), äî ñèõ ïîð íå óäàëîñü
èäåíòèôèöèðîâàòü íè ñîîòâåòñòâóþùèå êèíàçû, íè ïîäõîä ùèå ôîñôàòàçû. Îäíà èç
ïðîáëåì çàêëþ÷àåòñ â òîì, ÷òî ãèñòèäèíôîñôàò íåñòàáèëåí ïðè ãèäðîëèçå è íå
îáíàðóæèâàåòñ ìåòîäîì ñòàíäàðòíîãî àíàëèçà ñ èñïîëüçîâàíèåì ôîñôîàìèíîêèñëîòû.
Ôóíêöèè His-êèíàç è His-ôîñôàòàç â áàêòåðè õ èññëåäîâàíû âåñüìà îñíîâàòåëüíî. Èõ
ó÷àñòèå â ïðîöåññàõ õåìîòàêñèñà è àäàïòàöèè ïîçâîë åò ãîâîðèòü î ðåçóëüòàòèâíîì
ëå÷åíèè çàáîëåâàíèé, âûçûâàåìûõ áàêòåðè ìè, ïóòåì âîçäåéñòâè íà ýòè ñîåäèíåíè .
Êðàòêîå èçëîæåíèå ñóùíîñòè èçîáðåòåíè Íàñòî ùåå èçîáðåòåíèå îòíîñèòñ ê ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçå, â ÷àñòíîñòè
ïîëèïåïòèäàì è ïîëèíóêëåîòèäàì ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû, ðåêîìáèíàíòíûì
ìàòåðèàëàì è ñïîñîáàì èõ ïîëó÷åíè . Ïîäîáíûå ïîëèïåïòèäû è ïîëèíóêëåîòèäû
ðàññìàòðèâàþòñ ñ òî÷êè çðåíè ëå÷åíè îïðåäåëåííûõ áîëåçíåé, ê ÷èñëó êîòîðûõ
îòíîñ òñ , ñðåäè ïðî÷åãî, ðàê è ðàññòðîéñòâà îáìåíà âåùåñòâ, ñåðäå÷íî-ñîñóäèñòûå
çàáîëåâàíè è ðàññòðîéñòâà öåíòðàëüíîé íåðâíîé ñèñòåìû, äàëåå "çàáîëåâàíè ïî
äàííîìó èçîáðåòåíèþ". Êðîìå òîãî, íàñòî ùåå èçîáðåòåíèå îòíîñèòñ ê ñïîñîáàì
èäåíòèôèêàöèè àãîíèñòîâ è àíòàãîíèñòîâ (íàïð., èíãèáèòîðîâ) ñ èñïîëüçîâàíèåì
ìàòåðèàëîâ ïî äàííîìó èçîáðåòåíèþ, à òàêæå ñí òèþ ñ ïîìîùüþ èäåíòèôèöèðîâàííûõ
ñîåäèíåíèé ñîñòî íèé, ñâ çàííûõ ñ íàðóøåíèåì áàëàíñà N-ôîñôîðèëèðîâàíè . Ïîìèìî
ýòîãî äàííîå èçîáðåòåíèå îòíîñèòñ ê ìåòîäàì äèàãíîñòèêè çàáîëåâàíèé, ñâ çàííûõ ñ
íàðóøåíè ìè àêòèâíîñòè ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû èëè óðîâí åå ñîäåðæàíè â
êëåòêàõ.
Íàñòî ùåå èçîáðåòåíèå òàêæå âêëþ÷àåò ñîîòâåòñòâóþùèå âàðèàíòû èëè ìóòàíòû,
ïîëó÷àåìûå, íàïðèìåð, ìåòîäàìè ñëó÷àéíîãî èëè íàïðàâëåííîãî çàìåùåíè , ñïëàéñèíãà
ðàçëè÷íûõ êîíñòðóêöèé, äåëåöèè ëèáî ïóòåì äîáàâëåíè îäíîãî èëè íåñêîëüêèõ
íóêëåîòèäîâ ëèáî àìèíîêèñëîò ñ ñîõðàíåíèåì, â îñíîâíîì, áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòè.
Òàêèì îáðàçîì, öåëüþ íàñòî ùåãî èçîáðåòåíè âë åòñ ïîëó÷åíèå ïîëèïåïòèäà,
êîòîðûé îáëàäàë áû áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû, îòëè÷àþùåéñ âûñîêîé ñïåöèôè÷íîñòüþ ê ôîñôîãèñòèäèíó è èìåþùåé ìîëåêóë ðíóþ ìàññó 13,00015,000. Ïîäîáíûé ïîëèïåïòèä ìîæíî âûäåëèòü èç òêàíè ìëåêîïèòàþùåãî ñïîñîáîì,
âêëþ÷àþùèì êàê ìèíèìóì îäíó ñòàäèþ àíèîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè, îäíó îïåðàöèþ
ãåëü-ôèëüòðàöèè è îäíó ñòàäèþ àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè. Â ïðåäïî÷òèòåëüíîì âàðèàíòå
òêàíü èçâëåêàþò èç ñåðäöà, ïî÷åê, ïå÷åíè, ïîäæåëóäî÷íîé æåëåçû, ñêåëåòíûõ ìûøö è
è÷åê ìëåêîïèòàþùåãî. Ïðåäïî÷òèòåëüíûìè ìëåêîïèòàþùèìè âë þòñ ÷åëîâåê, êðîëèê,
êðûñà.
Ïîëèïåïòèä ïî äàííîìó èçîáðåòåíèþ ñîäåðæèò ïî ìåíüøåé ìåðå îñíîâíîé ôðàãìåíò
àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè (SEQ. No. 3)
DCECLGGGRISHQSQD.
 äðóãîì âàðèàíòå îñóùåñòâëåíè íàñòî ùåãî èçîáðåòåíè ïîëèïåïòèä ñîäåðæèò êàê
Ñòðàíèöà: 5
RU 2 281 973 C2
ìèíèìóì îñíîâíîé ôðàãìåíò àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè (SEQ.¹4)
5
10
15
20
25
30
â êîòîðîì X 1=Ê èëè R, X 2=À ëèáî G, è X 3=Ð èëè R.
 ñëåäóþùåì âàðèàíòå îñóùåñòâëåíè äàííîãî èçîáðåòåíè ïîëèïåïòèä ñîäåðæèò êàê
ìèíèìóì îñíîâíîé ôðàãìåíò àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè (SEQ. ¹5)
 ñîñòàâå àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ôåðìåíòà âñå ýòè íåïîëíûå
ïîñëåäîâàòåëüíîñòè îòëè÷àþòñ âûñîêîé êîíñåðâàòèâíîñòüþ è, êàê ïîëàãàþò, èãðàþò
îïðåäåëåííóþ ðîëü â àêòèâíîì öåíòðå óïîì íóòîãî ôåðìåíòà ëèáî îáëàäàþò èíûìè
áèîëîãè÷åñêèìè èëè ôàðìàöåâòè÷åñêèìè ñâîéñòâàìè, êîòîðûå îíè ïðî âë þò â õîäå
ïðîöåññîâ, ïðîèñõîä ùèõ â êëåòêàõ ìëåêîïèòàþùèõ.
 ïðåäïî÷òèòåëüíîì âàðèàíòå îñóùåñòâëåíè íàñòî ùåãî èçîáðåòåíè ïîëèïåïòèä
îáëàäàåò áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû, îòëè÷àþùåéñ âûñîêîé
ñïåöèôè÷íîñòüþ ê ôîñôîãèñòèäèíó è èìåþùåé ìîëåêóë ðíóþ ìàññó 13,000-15,000, è
ñîäåðæèò ñëåäóþùóþ àìèíîêèñëîòíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü (SEQ. ¹2):
Íàëè÷èå ìåòèîíèíîâîãî îñòàòêà íà N-êîíöå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè íåîá çàòåëüíî.
Âûøåóêàçàííà àìèíîêèñëîòíà ïîñëåäîâàòåëüíîñòü èçâëå÷åíà èç êëåòêè ÷åëîâåêà.
Îäíàêî â äàííîì èçîáðåòåíèè òàêæå ðàñêðûâàþòñ îñîáî ãîìîëîãè÷åñêèå âàðèàöèè
óïîì íóòûõ ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé. Òàêèì îáðàçîì, åùå îäíîé öåëüþ íàñòî ùåãî
èçîáðåòåíè âë åòñ ïîëó÷åíèå ïîëèïåïòèäà, êîòîðûé îáëàäàë áû áèîëîãè÷åñêîé
àêòèâíîñòüþ ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû, îòëè÷àþùåéñ âûñîêîé ñïåöèôè÷íîñòüþ ê
ôîñôîãèñòèäèíó è èìåþùåé ìîëåêóë ðíóþ ìàññó 13,000-15,000, àìèíîêèñëîòíà ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êîòîðîãî áûëà áû íà 64-99%, ïðåäïî÷òèòåëüíî 75-99%, ãîìîëîãè÷íîé
ïîñëåäîâàòåëüíîñòè, îïèñàííîé âûøå. Â äàííîì èçîáðåòåíèè ðàñêðûâàåòñ öåëûé ð ä
äðóãèõ ãîìîëîãè÷íûõ ïîëèïåïòèäîâ, îáëàäàþùèõ áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ ãèñòèäèíïðîòåèí-ôîñôàòàçû, ÷òî ñòàíîâèòñ î÷åâèäíûì èç ïðèâåäåííîãî íèæå.
Ñëåäóþùåé öåëüþ íàñòî ùåãî èçîáðåòåíè ñòàëî ïîëó÷åíèå ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé ÄÍÊ,
êîòîðûå áû êîäèðîâàëè óïîìèíàåìûé âûøå è ïðèâîäèìûé íèæå ïî òåêñòó ïîëèïåïòèä. Â
îñíîâíîì äàííîå èçîáðåòåíèå îòíîñèòñ ê óïîì íóòîé ÄÍÊ, ñîäåðæàùåé ñëåäóþùóþ
íóêëåîòèäíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü (SEQ. ¹1):
35
40
45
50
Íàñòî ùåå èçîáðåòåíèå òàêæå îòíîñèòñ ê àíòèòåëàì, ïðåäïî÷òèòåëüíî
ìîíîêëîíàëüíûì àíòèòåëàì, ê ïîëèïåïòèäàì ïî äàííîìó èçîáðåòåíèþ.
Íàêîíåö, öåëüþ íàñòî ùåãî èçîáðåòåíè âë åòñ èçãîòîâëåíèå ôàðìàöåâòè÷åñêîãî
ïðåïàðàòà, ñîäåðæàùåãî óïîìèíàåìûå âûøå è ïðèâîäèìûå íèæå ïî òåêñòó ïîëèïåïòèäû â
êîìáèíàöèè, åñëè ýòî öåëåñîîáðàçíî, ñ ñîîòâåòñòâóþùèìè ýêñöèïèåíòàìè, íîñèòåë ìè è
äðóãèìè àêòèâíûìè êîìïîíåíòàìè.
Ïîäðîáíîå îïèñàíèå
(À) ÂÛÄÅËÅÍÈÅ È Î×ÈÑÒÊÀ
Ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçà áûëà âûäåëåíà èç ïå÷åíè êðîëèêà.
Ñïåðâà 110 ã ïå÷åíè ðàçðåçàþò íå ìåëêèå êóñî÷êè. Çàòåì ìàòåðèàë ñìåøèâàþò ñ
áóôåðîì äë ãîìîãåíèçàöèè (220 ìë 30 ìÌ-òðèýòàíîëàìèí/ñîë íîé êèñëîòû ñ ðÍ 7,5, 1 ìÌýòèëåíäèàìèíòåòðàóêñóñíîé êèñëîòû, 300 ìÌ-ñàõàðîçû, 0,1 ìÌ-áåíçàìèäèíà ñ 0,1% 2Ñòðàíèöà: 6
RU 2 281 973 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ìåðêàïòîýòàíîëà) è èçìåëü÷àþò â ãîìîãåíèçàòîðå ñ îõëàæäåíèåì ëüäîì. Ïî çàâåðøåíèè
ïåðâîãî ýòàïà öåíòðèôóãèðîâàíè (10 ìèí, 3800 ã, 4°Ñ), íàäîñàäî÷íóþ æèäêîñòü
öåíòðèôóãèðóþò ïîâòîðíî (1 ÷, 48,000 ã, 4°Ñ). Ïîñëåäíþþ ôèëüòðóþò ÷åðåç ìàðëþ è
çàìîðàæèâàþò ïðè -80°Ñ â êîëè÷åñòâàõ, êðàòíûõ ïðèáëèçèòåëüíî 20 ìë.
Ìåòîäû õðîìàòîãðàôè÷åñêîãî ðàçäåëåíè íà êîëîíêàõ
Ãèñòèäèí-ôîñôàòàçó âûäåë ëè ïîñðåäñòâîì îñóùåñòâëåíè òðåõ ñòàäèé î÷èñòêè (Ôèã.1).
1. Àíèîíîîáìåííà õðîìàòîãðàôè Íåî÷èùåííûé ýêñòðàêò ïå÷åíè âíîâü îäèí ðàç öåíòðèôóãèðóþò (30 ìèí, 48,000 ã).
Íàäîñàäî÷íóþ æèäêîñòü çàãðóæàþò â êîëîíêó Source Q30 (ôèðìà Pharmacia, Ôðàéáóðã),
óðàâíîâåøåííóþ áóôåðîì À (20 ìÌ-òðèýòàíîëàìèí/ñîë íà êèñëîòà ñ ðÍ 8,0, 1 ìÌ
ýòèëåíäèàìèíòåòðàóêñóñíà êèñëîòà ñ 0,1% 2-ìåðêàïòîýòàíîëà è 0,02% àçîòèñòîêèñëîãî
íàòðè ).
Ýëþèðîâàíèå îñóùåñòâë þò 200 ìÌ-õëîðèñòûì íàòðèåì â áóôåðå À ñî ñêîðîñòüþ
ïîòîêà 1 ìë/ìèí.
2. Ãåëü-ôèëüòðàöè Àêòèâíóþ ôðàêöèþ (ñì. îïðåäåëåíèå àêòèâíîñòè) ïåðåìåøèâàþò è îõëàæäàþò, äîáàâë ïðè ýòîì òâåðäûé ñåðíîêèñëûé àììîíèé (11,2 ã íà 17 ìë). Êàïëþ îñàäêà, îáðàçîâàííóþ â
ðåçóëüòàòå öåíòðèôóãèðîâàíè (20 ìèí, 48,000 ã, 4°Ñ), ïîâòîðíî ñóñïåíäèðóþò â áóôåðå À
è çàãðóæàþò â êîëîíêó Superdex 75 26/60 1,6×60 ñì (ôèðìà Pharmacia, Ôðàéáóðã). Ãåëüôèëüòðàöèþ ïðîâîä ò, êàæäóþ ìèíóòó äîáàâë â áóôåð À 1 ìë 50 ìÌ-õëîðèñòîãî íàòðè .
3. Àôôèííà õðîìàòîãðàôè Àêòèâíóþ ôðàêöèþ, ïîëó÷åííóþ â ðåçóëüòàòå ãåëü-ôèëüòðàöèè, â ñîîòíîøåíèè 1:3
ðàñòâîð þò â áóôåðå  (20 ìÌ-òðèýòàíîëàìèí/ñîë íà êèñëîòà ñ ðÍ 8,0, 0,1 ìÌýòèëåíäèàìèíòåòðàóêñóñíà êèñëîòà ñ 0,1% 2-ìåðêàïòîýòàíîëà è 0,02% àçîòèñòîêèñëîãî
íàòðè ) è ñòàáèëèçèðóþò íà îòìåòêå 10 ìÌ â õëîðèñòîì ìàãíèè. Îáðàçåö çàãðóæàþò â
êîëîíêó Blue Sepharose 6 25×510 ìì (ôèðìà Pharmacia, Ôðàéáóðã). Ýëþèðîâàíèå
îñóùåñòâë þò ñ èñïîëüçîâàíèåì áóôåðà Â, ñîäåðæàùåãî 200 ìÌ-õëîðèñòûé íàòðèé, ñî
ñêîðîñòüþ ïîòîêà 1 ìë/ìèí.
(Á) ÎÁÍÀÐÓÆÅÍÈÅ ÑÏÅÖÈÔÈ×ÅÑÊÎÉ ÀÊÒÈÂÍÎÑÒÈ
Àêòèâíîñòü ðàñòâîðèìîé ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû îïðåäåë þò ïî äåôîñôîðèëèðîâàíèþ
ìå÷åíîãî 32P ôîñôîðèëèðîâàííîãî â ãèñòèäèíå ïðîòåèíà (CheA), âûïîëí þùåãî ôóíêöèþ
ïîäëîæêè. CheA ïðåäñòàâë åò ñîáîé ðåêîìáèíàíòíóþ áàêòåðèàëüíóþ ãèñòèäèí-àóòîêèíàçó
(Bilwes A.M., Alex L.A., Crane B.R., Simon M.I. (1999) Cell 96:131-141); äîìåí êèíàçû
íà Ñ-êîíöå ôîñôîðèëèðóåò N-êîíöåâîé His48. Â ðåçóëüòàòå ðåàêöèè îáðàçóåòñ ñâîáîäíûé
ôîñôàò, èäåíòèôèöèðóåìûé ìåòîäîì òîíêîñëîéíîé õðîìàòîãðàôèè (ïëàíøåòû èç
ïîëèýòèëåíèìèííîé öåëëþëîçû, 0,5 Ì-õëîðèñòûé ëèòèé â êà÷åñòâå ïîäâèæíîé ôàçû).
Îáíàðóæåíèå, ñ îäíîé ñòîðîíû, ñ èñïîëüçîâàíèåì ìîëèáäåíîâîêèñëîãî àììîíè , à ñ
äðóãîé - ìåòîäîì àâòîðàäèîãðàôèè (Ôèã.2).  õîäå ðåàêöèè íå ïðîèñõîäèëî íè ïåðåäà÷è
ôîñôàòà äðóãèì ïðîòåèíàì, íè ðàñùåïëåíè ïîäëîæêè íà ïåïòèäíûå ôðàãìåíòû. Ïðè ýòîì
ïîëó÷àþò ôîñôàò, èíûìè ñëîâàìè, â ðåàêöèè ïðèíèìàåò ó÷àñòèå ôîñôîãèñòèäèí-ïðîòåèíôîñôàòàçà.
Î÷èùåííûé ïðîòåèí îáëàäàåò ñïîñîáíîñòüþ äåôîñôîðèëèðîâàòü ìå÷åíûé 32Ð
ôîñôîðèëèðîâàííûé CheA â ãèñòèäèíå. Âûõîä çàâèñèò îò âðåìåíè, òåìïåðàòóðû, ðÍ è
ïðîòåèíà (Ôèã.3).
Óñòîé÷èâîñòü
Óñòîé÷èâîñòü î÷èùåííîãî ïðîòåèíà ïðè õðàíåíèè îáåñïå÷èâàåòñ ïðè èñïîëüçîâàíèè
ñûðîãî ãîìîãåíàòà è ÷àñòè÷íî î÷èùåííûõ ôðàêöèé.
Ôåðìåíòíûé îáðàçåö
Ïðèãîòîâëåíèå ïîäëîæêè: (ìå÷åíèå CheA 32Ð)
Ðåêîìáèíàíòíûé CheA (5 ìêë) ñìåøèâàþò ñ 0,5 ìêë 100 ìÌôåíèëìåòèëñóëüôîíèëôòîðèäà â äèìåòèëñóëüôîêñèäå è 5 ìêë 500 ìÌ-HEPES ñ ðÍ 8,0, 1
ìÌ-õëîðèñòûé ìàãíèé. Äîáàâèâ 108 ìèêðîêþðè 32Ð-g-àäåíîçèíòðèôîñôîðíîé êèñëîòû, 5
Ñòðàíèöà: 7
RU 2 281 973 C2
5
10
15
ìêë 10 ìêÌ-àäåíîçèíòðèôîñôîðíîé êèñëîòû è 50 ìêë âîäû, ïðè 37°Ñ â òå÷åíèå 3 ÷
ïðîâîä ò èíêóáèðîâàíèå.
Îïðåäåëåíèå àêòèâíîñòè
Ïîäëîæêó (10 ìêë 32P-CheA) ñìåøèâàþò ñ 10 ìêë áóôåðà äë êîëè÷åñòâåííîãî àíàëèçà
(100 ìÌ-òðèýòàíîëàìèí/ñîë íà êèñëîòà ñ ðÍ 8,0 ñ 0,1% 2-ìåðêàïòîýòàíîëà è 0,02%
àçîòèñòîêèñëîãî íàòðè ) è ôåðìåíòíûì ðàñòâîðîì. Ðåàêöèþ îñóùåñòâë þò ïðè 37°Ñ â
òå÷åíèå 30 ìèí. Çàòåì äîáàâë þò 2 ìêë 500 ìÌ-ýòèëåíäèàìèíòåòðàóêñóñíîé êèñëîòû è 126
ìêë ðàñòâîðà ìåòàíîë/àöåòîí â ñîîòíîøåíèè 1:1. Ïî çàâåðøåíèè öåíòðèôóãèðîâàíè (5
ìèí, 15,800 ã) îòäåë þò íàäîñàäî÷íóþ æèäêîñòü, â êîòîðîé çàòåì ñ ïîìîùüþ
ñöèíòèëë öèîííîãî ñ÷åò÷èêà ïðîâîä ò âñå íåîáõîäèìûå èçìåðåíè .
Òàêèì îáðàçîì, îïèñàííóþ ôîñôàòàçó îòëè÷àþò îò äðóãèõ ïðîòåèí-ôîñôàòàç, èñõîä èç
1) ñïåöèôè÷íîñòè ê ôîñôîãèñòèäèíó (Òàáëèöà 1), ãèñòèäèí-ôîñôàòàçà íå
ãèäðîëèçîâàëà, íàïð., ð-íèòðîôåíèëôîñôàò;
2) ñîõðàíåíè àêòèâíîñòè, íåñìîòð íà âîçäåéñòâèå îêàäàåâîé êèñëîòû èëè âàíàäàòà,
èíãèáèðóþùèõ àêòèâíîñòü îñòàëüíûõ ôîñôàòàç (Òàáëèöà 2);
3) çíà÷èòåëüíî áîëåå íèçêîé ìîëåêóë ðíîé ìàññû.
Òàáëèöà 1
Ãèäðîëèç íîâîé ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçîé
20
Àçîêîëë
-
[γ- 32P] ÀÒÔ
-
ð-íèòðîôåíèëôîñôàò
-
[γ 32-P]Ser/Thr-êàçåèí
-
Tyr-õõõ
-
[γ- 32P] His-íóêëåîçèä-äèôîñôàò-êèíàçà
-
[γ- 32P] His-cheA
+
25
Òàáëèöà 2
Ðåàãåíòû, âîçäåéñòâóþùèå íà àêòèâíîñòü ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû
30
35
40
Ðåàãåíò
Êîíöåíòðàöè Àêòèâíîñòü (%)
Ôîñôàò
10 ìÌ
0
Îêàäàåâà êèñëîòà
10 ìêÌ
108
Ìèêðîöèñòèí
5 íÌ
110
Òàóòîìèöèí
0,5 íÌ
90
Èíãèáèòîðíûé ïðîòåèí I1
1 íÌ
120
Ìîëèáäàò
10 ìêÌ
71
Âàíàäàò
10 ìêÌ
62
Ôòîðèä
5 ìÌ
105
ÝÄÒÓ
5 ìÌ
108
ÝÃÒÓ
5 ìÌ
91
Mg 2+
1 ìÌ
142
Mg 2+
10 ìÌ
226
Ñà 2+
1 ìÌ
165
Ñà 2+
10 ìÌ
240
100%=xxx íìîëü/ìèí õ ìã -1
45
50
(Â) ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈÅ ÃÈÑÒÈÄÈÍ-ÏÐÎÒÅÈÍ-ÔÎÑÔÀÒÀÇÛ
Ñ ïîìîùüþ àíàëèçà ìåòîäîì ýëåêòðîôîðåçà â ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå
äîäåöèëñóëüôàòîì íàòðè â î÷èùåííîé áåëêîâîé ôðàêöèè áûëà îáíàðóæåíà ÷åòêà ïîëîñà ñ ìîëåêóë ðíîé ìàññîé âíî 14,000 (Ôèã.4). Ïðîâåä àíàëèç ìàññ, ïîëó÷èëè
ïðîòåèí ñ ìîëåêóë ðíîé ìàññîé 13,768 (Ôèã.5). Ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçà íà N-êîíöå
áëîêèðóåòñ àöåòèëüíîé ãðóïïîé. Òàêèì îáðàçîì, ìåòîäîì ðàñùåïëåíè ïî Ýäìàíó äîñòóï
ê èíôîðìàöèè, ñîäåðæàùåéñ â ïîñëåäîâàòåëüíîñòè, ïîëó÷èòü íåëüç . Èññëåäîâàòü
ïðîòåèí ìîæíî òîëüêî â òîì ñëó÷àå, åñëè ïðîèñõîäèò ïðîòåîëèòè÷åñêèé ðàñïàä.
(Ã) ÀÍÀËÈÒÈ×ÅÑÊÎÅ ÎÏÐÅÄÅËÅÍÈÅ ÏÐÎÒÅÈÍÀ
Àêòèâíóþ ôðàêöèþ (Ôèã.4), ñ öåëüþ îïðåäåëåíè àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè,
ïîäâåðãëè ôåðìåíòàòèâíîìó ðàñùåïëåíèþ. Ïîëó÷åííûå ïåïòèäíûå ôðàãìåíòû
ñåêâåíèðîâàëè, ïðèìåí ðàñùåïëåíèå ïî Ýäìàíó è ìàññ-ñïåêòðîìåòðèþ (Kellner R.,
Ñòðàíèöà: 8
RU 2 281 973 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Lottspeich F., Meyer Í.Å. (1999) Microcharacterization of Proteins, Wiley-VCH).
Ôåðìåíòàòèâíîå ðàñùåïëåíèå
Ñ ïîìîùüþ ñêàëüïåë îòðåçàëè ïîëîñêó ãåë , êîòîðóþ ïîìåùàëè â òðóáêó Ýïïåíäîðôà.
Ïðîöåññ ôåðìåíòàòèâíîãî ðàñùåïëåíè íà÷èíàëñ ïîñëå äîáàâëåíè òðèïñèíà â êà÷åñòâå
ïðîòåàçû (1 ìêã òðèïñèíà, 100 ìêë 0,5 Ì-êèñëîãî óãëåêèñëîãî àììîíè , 37°Ñ, 12 ÷).
Ïîëó÷åííûå ïåïòèäíûå ôðàãìåíòû ýêñòðàãèðîâàëè (50% òðèôòîðóêñóñíîé êèñëîòû, 50%
àöåòîíèòðèëà). Ýêñòðàêò êîíöåíòðèðîâàëè â âàêóóìíîé öåíòðèôóãå.
Õðîìàòîãðàôè÷åñêîå ðàçäåëåíèå ïåïòèäíûõ ôðàãìåíòîâ
Ïåïòèäíûå ôðàãìåíòû ðàñòâîð ëè â ýëþåíòå À (0,1% òðèôòîðóêñóñíîé êèñëîòû â âîäå)
è ðàçäåë ëè ìåòîäîì õðîìàòîãðàôèè ñ îáðàùåííîé ôàçîé (ýëþåíò Â: 20% 0,1%-íîé
òðèôòîðóêñóñíîé êèñëîòû â âîäå, 80% àöåòîíèòðèëà). Â ðåçóëüòàòå ôðàêöèîíèðîâàíè ñ
îïðåäåëåíèåì ïðè ïîìîùè óëüòðàôèîëåòîâîãî èçëó÷åíè (äëèíà âîëíû 214 íì) (ñì. Ôèã.6)
ðàçäåëåííûå ïåïòèäíûå ôðàãìåíòû ðàñòâîð ëèñü è îïðåäåë ëèñü ñ ïîìîùüþ
ñåêâåíèðîâàíè ïî Ýäìàíó è ìàññ-ñïåêòðîìåòðèè.
Îïðåäåëåíèå ìåòîäàìè ñåêâåíèðîâàíè ïî Ýäìàíó è ìàññ-ñïåêòðîìåòðèè
Ïî çàâåðøåíèè õðîìàòîãðàôè÷åñêîãî ðàçäåëåíè ñ 90% æèäêèõ ôðàêöèé ïðîâåëè
ñåêâåíèðîâàíèå ïî Ýäìàíó (ñòàíäàðòíûå óñëîâè , ïðèáîð: ìîäåëü 494, PE-Applied
Biosystems, Âàéòåðøòàäò). Îñòàëüíûå ôðàêöèè ïðîøëè àíàëèç ìàññ (MALDI-MS), (ïðèáîð:
Voyager STR, Perseptive Biosystems, Âèñáàäåí).
Èäåíòèôèöèðîâàííûå ïåïòèäíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè
Áûëè îïðåäåëåíû ñëåäóþùèå ïåïòèäíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè (êðîëèê):
AAAGLAQIPD VDIDSDGVFK
YVLIR
VHAAPPSEAPGGESK
DIVR
WAEYHADIYDK
VSGELQK
ISHQSQDR
KIHVYGYSMGYGR
YPDYEVTWADDGY
Ýòè ïåïòèäû ñîñòàâë þò ïåïòèä ôåðìåíòà êðîëèêà (SEQ. ¹6):
(Ä) Ñåêâåíèðîâàíèå íóêëåîòèäà
Ñ ïîìîùüþ ïðàéìåðîâ, êîòîðûå âûáèðàëè èç ïîëó÷åííîé àìèíîêèñëîòíîé
ïîñëåäîâàòåëüíîñòè äë íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû,
ïðîâåëè ñêðèíèíã áèáëèîòåêè ÄÍÊ êðîëèêà. Â ðåçóëüòàòå êëîíèðîâàíè è ñåêâåíèðîâàíè áûëà èäåíòèôèöèðîâàíà íóêëåîòèäíà ïîñëåäîâàòåëüíîñòü, ïðèâåäåííà íà Ôèã.7à. 327
îñíîâ ñîîòâåòñòâóþò ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ïðîòåèíà ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû,
íà÷èíàþùåéñ â ïîëîæåíèè 11-119 (Ôèã.7á).
Ïîèñê â áàçå äàííûõ
Ïîèñê â áàçå äàííûõ îñóùåñòâë ëè, èñïîëüçó àëãîðèòì BLAST. Ïðîòåèíû â áàçàõ
äàííûõ ïðîòåèíîâ èäåíòèôèöèðîâàëè èç C.elegans, Drosophila melanogaster, Drosophila
pseudoobscura.
Ïóòè ÝÒÑ (ýóêàðèîòíîé òðàíñäóêöèè ñèãíàëà) â áàçàõ äàííûõ íóêëåîòèäîâ
èäåíòèôèöèðîâàëè â ÷åëîâåêå, êðûñå è ìûøè. ×åëîâå÷åñêèé ãîìîëîã ïîêà íå îïóáëèêîâàí.
Èñõîä èç ñòðóêòóðû ýòèõ ïóòåé ÝÒÑ, ïðîòåèí ÷åëîâåêà ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçà èìååò
ñëåäóþùóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü (SEQ. No 2 áåç ìåòèîíèíîâîãî îñòàòêà):
50
Ãîìîëîã êðûñû åùå íå îïóáëèêîâàí. Èñõîä èç ñòðóêòóðû ýòèõ ïóòåé ÝÒÑ, ïðîòåèí
êðûñû ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçà èìååò ñëåäóþùóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü (SEQ. ¹7):
Ñòðàíèöà: 9
RU 2 281 973 C2
5
Ãîìîëîã ìûøè åùå íå îïóáëèêîâàí. Èñõîä èç ñòðóêòóðû ýòèõ ïóòåé ÝÒÑ, ïðîòåèí ìûøè
ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçà èìååò ñëåäóþùóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü (SEQ. ¹8):
Òàáëèöà 3
Ãîìîëîãè ïîñëåäîâàòåëüíîñòè äë ïðîòåèíà ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû èç ðàçëè÷íûõ áèîëîãè÷åñêèõ âèäîâ, âûðàæåííà â % èäåíòè÷íîñòè
10
1 ÷åëîâåê
2 êðîëèê
3 ìûøü
1
2
3
4
5
6
7
100
84,0
65,3
64,3
68,2
38,0
40,3
100
72,4
71,4
71,0
36,0
42,0
100
67,3
52,7
32,7
33,3
4 êðûñà
100
5 ïîëîñàòûé äàíèî
15
6 c.elegans
7 äðîçîôèëà
20
25
30
35
40
45
50
51,6
30,8
29,5
100
33,7
42,1
100
39,7
100
(Å) ËÎÊÀËÈÇÀÖÈß ÏÐÎÒÅÈÍÎÂ è èõ ðàñïðåäåëåíèå â òêàíè
Ãåí ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû ÷åëîâåêà ëîêàëèçóþò â õðîìîñîìå 9 (9q33-Tel, ìàðêåð
sts-N90764, èíòåðâàë D9S159-qTEL).
 êà÷åñòâå èñòî÷íèêîâ ýêñïðåññèè êÄÍÊ èñïîëüçîâàëè:
ãîëîâíîé ìîçã, ãðóäíóþ æåëåçó, öåíòðàëüíóþ íåðâíóþ ñèñòåìó, òîëñòóþ êèøêó, êðàéíþþ
ïëîòü, çàðîäûøåâóþ êëåòêó, ñåðäöå, ïî÷êó, ïå÷åíü, ëåãêîå, ìûøöó, ïîäæåëóäî÷íóþ
æåëåçó, îêîëîùèòîâèäíóþ æåëåçó, pooled, ïðîñòàòó, ñåëåçåíêó, è÷êî, ùèòîâèäíóþ
æåëåçó, ìèíäàëåâèäíóþ æåëåçó, ìàòêó, âåñü çàðîäûø.
Ïðîâåä àíàëèç ðàñïðåäåëåíè ìÐÍÊ ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû, íàèáîëüøèé åå
óðîâåíü îáíàðóæèëè â íîðìàëüíûõ òêàí õ, òàêèõ êàê ñåðäöå, ïî÷êà, ïå÷åíü,
ïîäæåëóäî÷íà æåëåçà, ñêåëåòíà ìûøöà è è÷êî (Ôèã.9à, á).
(Æ) Àíòèòåëà ê ãèñòèäèí-ôîñôàòàçå
Àíòèòåëà ê ãèñòèäèí-ôîñôàòàçå äîëæíû îáåçâðåæèâàòü òðè îòäåëüíûå çîíû ýòîãî
ïðîòåèíà, à èìåííî n-êîíöåâîé, ñðåäíèé è ñ-êîíöåâîé ôðàãìåíòû ìîëåêóëû.  êà÷åñòâå
òàêèõ çîí èçáðàëè òðè ïåïòèäíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè:
ïåïòèä 1 - QIPDVDIDSD GVFKYV (16àà, SEQ. ¹9);
ïåïòèä 2 - CLGGGRISHQ SQDK (14aa, SEQ. ¹10);
ïåïòèä 3 - CTEKIKAKYP DYEV (14aa, SEQ. ¹11).
Ýòè ïåïòèäû ñèíòåçèðîâàëè, èñïîëüçó ñòàíäàðòíóþ õèìèþ ÔÌÎÊ. Ñ öåëüþ
èììóíèçàöèè êàæäûé èç ïåïòèäîâ âïðûñêèâàëè (4 èíúåêöèè) äâóì êðîëèêàì. Äåëàëè
÷åòûðå àíàëèçà êðîâè (â ïîñëåäíèé ðàç ÷åðåç ïðèáëèçèòåëüíî 3 ìåñ öà). Îáðàçîâàâøèåñ àíòèòåëà ñïîñîáíû âû âë òü è ëîêàëèçîâàòü ãèñòèäèí-ôîñôàòàçó.
Êðîìå òîãî, èìååòñ âîçìîæíîñòü èññëåäîâàíè ðàçëè÷íûõ çîí ìîëåêóëû ïî
îòäåëüíîñòè.  ÷àñòíîñòè, ïðåäïîëàãàåòñ , ÷òî öåíòðàëüíûé ôðàãìåíò ãèñòèäèíôîñôàòàçû, îòëè÷àþùèéñ âûñîêîé êîíñåðâàòèâíîñòüþ è ñîäåðæàùèé ñëåäóþùóþ
àìèíîêèñëîòíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü:
DCECLGGGRISHQSQD (SEQ. ¹3),
âêëþ÷àåò àêòèâíûé öåíòð, îòâåòñòâåííûé çà ôóíêöèè ïðîòåèíîâ in vivo. Àíòèòåëî ê
ïåïòèäó äîëæíî îáåçâðåæèâàòü ýòó çîíó, èíãèáèðó è íåéòðàëèçó åå.
Âîò âêðàòöå õàðàêòåðèñòèêè ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû:
1. Àìèíîêèñëîòíà ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû ÷åëîâåêà
ñîäåðæèò îêîëî 124 àìèíîêèñëîò.
2. Àìèíîêèñëîòíà ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû õàðàêòåðèçóåòñ âûñîêîé ãîìîëîãèåé â Ñ-êîíöåâîì ôðàãìåíòå â îòëè÷èå îò òàêîâîãî N-êîíöà, ãäå
ãîìîëîãè âåñüìà ñëàáà.
3. Ìîëåêóë ðíà ìàññà ñîñòàâë åò 13,800 +/-100 (Ôèã.5).
Ñòðàíèöà: 10
RU 2 281 973 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
4. Â N-êîíöå ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçà áëîêèðóåòñ àöåòèëèðîâàíèåì.
Ôàðìàöåâòè÷åñêèå ïðåïàðàòû
Íàòèâíûé (-íûå), à òàêæå ðåêîìáèíàíòíûé (-íûå) ïðîòåèí (-íû), ìîæåò (-ãóò)
ïðèìåí òüñ â êà÷åñòâå ëåêàðñòâà, ïðèíèìàòü êîòîðîå ïàöèåíòû ìîãóò êàê òàêîâîå ëèáî â
ñîñòàâå ôàðìàöåâòè÷åñêèõ êîìïîçèöèé. Òàêèì îáðàçîì, î÷åðåäíîé öåëüþ íàñòî ùåãî
èçîáðåòåíè âë åòñ ïîëó÷åíèå îïèñàííîãî âûøå è ïðèâîäèìîãî íèæå ïî òåêñòó
ðåêîìáèíàíòíîãî èëè íàòèâíîãî ïðîòåèíà, êîòîðûé ìîæíî áûëî áû ïðèìåí òü â êà÷åñòâå
ëåêàðñòâà, è ïðèãîòîâëåíèå ñîîòâåòñòâóþùåé ôàðìàöåâòè÷åñêîé êîìïîçèöèè, ñîäåðæàùåé
óïîì íóòûé ïðîòåèí è åãî ôàðìàöåâòè÷åñêè ïðèåìëåìûé ðàñòâîðèòåëü, íîñèòåëü èëè
ýêñöèïèåíò.
 ñîñòàâ ôàðìàöåâòè÷åñêèõ êîìïîçèöèé ïî äàííîìó èçîáðåòåíèþ ìîæåò âõîäèòü öåëûé
ð ä äîïîëíèòåëüíûõ àêòèâíûõ ôàðìàöåâòè÷åñêèõ ñîåäèíåíèé.
Òåðìèí "ôàðìàöåâòè÷åñêè ïðèåìëåìûé íîñèòåëü" â êîíòåêñòå íàñòî ùåãî îïèñàíè îáîçíà÷àåò èíåðòíûé, íåòîêñè÷íûé òâåðäûé èëè æèäêèé íàïîëíèòåëü, ðàñòâîðèòåëü ëèáî
âåùåñòâî, îáðàçóþùåå îáîëî÷êó êàïñóëû, êîòîðîå íå ðåàãèðóåò ñ àêòèâíûì ñîåäèíåíèåì è
íå ìîæåò ïîâðåäèòü ïàöèåíòó. Ïîäõîä ùèå â ïðåäïî÷òèòåëüíîì âàðèàíòå æèäêèå íîñèòåëè
øèðîêî èçâåñòíû â äàííîé îáëàñòè. Òàêèìè íîñèòåë ìè ìîãóò ñëóæèòü ñòåðèëüíà âîäà,
ñîëü, âîäíà äåêñòðîçà, ñàõàðíûå ðàñòâîðû, ýòàíîë, ãëèêîëè è ìàñëà, âêëþ÷à òàêîâûå
æèâîòíîãî èëè ðàñòèòåëüíîãî ïðîèñõîæäåíè , ïîëó÷àåìûå â ðåçóëüòàòå ïåðåðàáîòêè íåôòè
ëèáî ñèíòåòè÷åñêèå, íàïðèìåð àðàõèñîâîå ìàñëî, ñîåâîå ìàñëî è ìèíåðàëüíîå ìàñëî.
Ñîåäèíåíè ïî íàñòî ùåìó èçîáðåòåíèþ ìîæíî ââîäèòü êàê ðàçîâûå äîçû, ñîäåðæàùèå
îáû÷íûå íåòîêñè÷íûå ôàðìàöåâòè÷åñêè ïðèåìëåìûå íîñèòåëè, ðàñòâîðèòåëè, àäúþâàíòû
è ñâ çóþùèå, òèïè÷íûå äë ïàðåíòåðàëüíîãî ïðèìåíåíè .
Ïîä òåðìèíîì "ïàðåíòåðàëüíûé" â êîíòåêñòå íàñòî ùåãî îïèñàíè ïîäðàçóìåâàþòñ ïîäêîæíà , âíóòðèâåííà , âíóòðèñóñòàâíà è âíóòðèòðàõåàëüíà èíúåêöèè, à òàêæå
âëèâàíè . Êðîìå òîãî, ïðèåìëåìû äðóãèå ñïîñîáû ïðèìåíåíè , òàêèå êàê îðàëüíîå è
ìåñòíîå. Êîìïîçèöèè è êîìáèíèðîâàííûå ïðåïàðàòû äë ïàðåíòåðàëüíîãî ïðèìåíåíè â
íàèáîëåå ïðåäïî÷òèòåëüíîì âàðèàíòå ââîä ò âíóòðèâåííî â ôîðìå áîëþñà èëè â êà÷åñòâå
ïîñòî ííûõ ôóçèé, ïîëüçó ñü ïðè ýòîì èçâåñòíûìè ìåòîäàìè. Òàáëåòêè è êàïñóëû,
ïðåäíàçíà÷åííûå äë îðàëüíîãî ââåäåíè , ñîäåðæàò îáû÷íûå ýêñöèïèåíòû, òàêèå êàê
ñâ çóþùèå âåùåñòâà, íàïîëíèòåëè, ðàñòâîðèòåëè, àãåíòû òàáëåòèðîâàíè , ñìàçî÷íûå
ìàòåðèàëû, âåùåñòâà, ñïîñîáñòâóþùèå îñâîáîæäåíèþ äåéñòâóþùåãî íà÷àëà, è
ïîâåðõíîñòíî-àêòèâíûå âåùåñòâà. Ñ ïîìîùüþ øèðîêî èçâåñòíûõ â äàííîé îáëàñòè
ìåòîäîâ òàáëåòêè ìîæíî ïîêðûâàòü îáîëî÷êîé. Æèäêèå ïðåïàðàòû äë îðàëüíîãî
ïðèìåíåíè ìîãóò èìåòü ôîðìó âîäíûõ èëè ìàñë íûõ ñóñïåíçèé, ðàñòâîðîâ, ýìóëüñèé,
ñèðîïîâ ëèáî ýëèêñèðîâ èëè âûïóñêàòüñ â êà÷åñòâå ñóõîãî ïðîäóêòà, êîòîðûé ïåðåä
ïðèìåíåíèåì ñëåäóåò äîâåñòè äî íåîáõîäèìîé êîíñèñòåíöèè, äîáàâèâ âîäó ëèáî èíîå
ïîäõîä ùåå ñâ çóþùåå. Ïîäîáíûå æèäêèå ïðåïàðàòû ìîãóò ñîäåðæàòü îáû÷íûå äîáàâêè,
òàêèå êàê ñóñïåíäèðóþùèå àãåíòû, ýìóëüãàòîðû, íåâîäíûå ñâ çóþùèå è ïðîòèâîñòàðèòåëè.
Ïðåïàðàòû äë ìåñòíîãî ïðèìåíåíè ìîãóò èìåòü ôîðìó âîäíûõ èëè ìàñë íûõ ñóñïåíçèé,
ðàñòâîðîâ, ýìóëüñèé, ãåëåé ëèáî, ÷òî âë åòñ ïðåäïî÷òèòåëüíûì, ýìóëüñèîííûõ ìàçåé.
Ðàçîâûå äîçû ïî íàñòî ùåìó èçîáðåòåíèþ ìîãóò ñîäåðæàòü äíåâíûå êîëè÷åñòâà
ïðîòåèíà ïî äàííîìó èçîáðåòåíèþ èëè åãî äîëüíûå åäèíèöû, ñîñòàâë þùèå íåîáõîäèìóþ
äîçó. Êàêà äîçèðîâêà áóäåò îïòèìàëüíîé äë òîãî èëè èíîãî ïàöèåíòà (ìëåêîïèòàþùèå, â
òîì ÷èñëå ÷åëîâåê), çàâèñèò îò öåëîãî ð äà ôàêòîðîâ, òàêèõ êàê àêòèâíîñòü
ïðèìåí åìîãî äåéñòâóþùåãî âåùåñòâà, âîçðàñò, ìàññà òåëà, îáùåå ñîñòî íèå çäîðîâü ,
ïîë, äèåòà, âðåì è ñïîñîá ââåäåíè , ñêîðîñòü âûâåäåíè , àêòèâíîñòü ôåðìåíòà
(åäèíèöû/ìã ïðîòåèíà), öåëü ïðèìåíåíè ïðåïàðàòà, ò.å. ïðåäíàçíà÷åí ëè îí äë òåðàïèè
ëèáî ïðîôèëàêòè÷åñêîãî ëå÷åíè , à òàêæå õàðàêòåð çàáîëåâàíè .
Òàêèì îáðàçîì, ôàðìàöåâòè÷åñêè ýôôåêòèâíà äíåâíà äîçà ïðîòåèíà ïî íàñòî ùåìó
èçîáðåòåíèþ â êîìïîçèöè õ è êîìáèíèðîâàííûõ ïðåïàðàòàõ â îðãàíèçìå ïàöèåíòà (in vivo)
ñîñòàâë åò îêîëî 0,01-100 ìã/êã (èñõîä èç óäåëüíîé àêòèâíîñòè 100 êÅä/ìã),
ïðåäïî÷òèòåëüíî îò 0,1 äî 10 ìã/êã ìàññû òåëà. Â çàâèñèìîñòè îò ôîðìû ïðèìåíåíè îäíà
Ñòðàíèöà: 11
RU 2 281 973 C2
5
10
15
20
25
30
äîçà ìîæåò ñîäåðæàòü îò 0,5 äî 10 ìã ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû.
Êðàòêîå îïèñàíèå ôèãóð
Ôèã.1: Ñõåìà î÷èñòêè, èñïîëüçóåìà ñ öåëüþ âûäåëåíè ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû
Ôèã.2: Èäåíòèôèêàöè íåîðãàíè÷åñêîãî ôîñôàòà êàê ïðîäóêòà ðåàêöèè ðàñùåïëåíè ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû. Ïðèìåí åòñ ìåòîä òîíêîñëîéíîé õðîìàòîãðàôèè íà ïëàíøåòàõ
(ïîëèýòèëåíèìèííà öåëëþëîçà, 0,8 M-LiCl); ñëåâà: îáíàðóæåíèå ñ èñïîëüçîâàíèåì
ìîëèáäåíîâîêèñëîãî àììîíè ; ñïðàâà: îáíàðóæåíèå ìåòîäîì àâòîðàäèîãðàôèè; 1: [ 32P]
his-cheA, 2: ïðîäóêò ðåàêöèè, 3: ÀÒÔ, 1-3: ôîñôàò (NaH2PO4)
Ôèã.3: Äåôîñôîðèëèðîâàíèå ïîäëîæêè cheA, çàâèñ ùåå îò âðåìåíè è ïðîòåèíà; ñëåâà:
äåñòðóêöè ÷åðåç 0, 20 è 40 ìèí, ñïðàâà: âûõîä ìå÷åíîãî ðàäèîèçîòîïîì ôîñôàòà (ëåâà îñü ó: %, ïðàâà îñü ó: ðàäèîàêòèâíîñòü) äë ðàçëè÷íûõ êîëè÷åñòâ ïîäëîæêè (îñü õ: íã
ïðîòåèíà)
Ôèã.4: Àíàëèç ôðàêöèè ñ àêòèâíîé ãèñòèäèí-ôîñôàòàçîé (ýëåêòðîôîðåç â
ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå äîäåöèëñóëüôàòîì íàòðè ); ÀÔ: àêòèâíà ôðàêöè ; 1,2: BSA
(ñûâîðîòî÷íûé àëüáóìèí êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà) (1 ìêã, 0,5 ìêã), 3: ÀÔ; 4,5:
ìîëåêóë ðíûå ìàðêåðû
Ôèã.5: Àíàëèç ìàññ ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû. Îñü ó: îòñ÷åò, îñü õ: ìàññà (m/z)
Ôèã.6: Ðàçäåëåíèå ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû ìåòîäîì õðîìàòîãðàôèè ñ îáðàùåííîé ôàçîé
ïî çàâåðøåíèè ôåðìåíòàòèâíîãî ðàñùåïëåíè ; ýëþåíò À: 0,1%-íà òðèôòîðóêñóñíà êèñëîòà â âîäå è ýëþåíò Â: 20% 0,1%-íîé òðèôòîðóêñóñíîé êèñëîòû â âîäå, 80%
àöåòîíèòðèëà; îïðåäåëåíèå ïðè ïîìîùè óëüòðàôèîëåòîâîãî èçëó÷åíè , äëèíà âîëíû 214
íì
Ôèã.7à: (×àñòè÷íà ) íóêëåîòèäíà ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû
êðîëèêà
Ôèã.7á: Òðàíñëèðîâàííà ïîëíà àìèíîêèñëîòíà ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ãèñòèäèíïðîòåèí-ôîñôàòàçû êðîëèêà
Ôèã.8à: Ðàñïðåäåëåíèå ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû â ëèíèè îïóõîëåâûõ êëåòîê
Ôèã.8á: Ðàñïðåäåëåíèå ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû â îïóõîëåâîé òêàíè (î. ò. îïóõîëåâà òêàíü, â. ê. - âîñïàëèòåëüíûé êîíãëîìåðàò)
Ôèã.8â: Ðàñïðåäåëåíèå ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû â íîðìàëüíîé òêàíè
Ïåðå÷åíü ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé ïðèâåäåí â êîíöå îïèñàíè .
35
40
45
50
Ñòðàíèöà: 12
RU 2 281 973 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ñòðàíèöà: 13
RU 2 281 973 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ñòðàíèöà: 14
RU 2 281 973 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ñòðàíèöà: 15
RU 2 281 973 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ñòðàíèöà: 16
RU 2 281 973 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ñòðàíèöà: 17
RU 2 281 973 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ôîðìóëà èçîáðåòåíè 1. Âûäåëåííûé ïîëèïåïòèä, îáëàäàþùèé áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ ãèñòèäèíôîñôàòàçû, èìåþùèé ìîëåêóë ðíóþ ìàññó 13,800+/-100, îïðåäåëåííóþ ìàñññïåêòðîìåòðè÷åñêè, êîòîðûé ïîëó÷àþò ïóòåì îñóùåñòâëåíè ïîñëåäîâàòåëüíûõ ýòàïîâ
âûäåëåíè èç ëèçàòîâ òêàíè ìëåêîïèòàþùåãî, âêëþ÷àþùèõ àíèîíîîáìåííóþ
õðîìàòîãðàôèþ, ãåëü-ôèëüòðàöèþ è àôôèííóþ õðîìàòîãðàôèþ.
2. Ïîëèïåïòèä ïî ï.1, ñîäåðæàùèé, ïî ìåíüøåé ìåðå, îñíîâíîé ôðàãìåíò
àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè
DCECLGGGRISHQSQD.
3. Ïîëèïåïòèä ïî ï.1, ñîäåðæàùèé, ïî ìåíüøåé ìåðå, îñíîâíîé ôðàãìåíò
àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè
DCECLGGGRISHQSQDX 1KIHVYGYSMX 2YGX 3AQH,
â êîòîðîì Õ 1=Ê èëè R, Õ 2=À ëèáî G è Õ 3=Ð èëè R.
4. Ïîëèïåïòèä ïî ï.1, ñîäåðæàùèé, ïî ìåíüøåé ìåðå, îñíîâíîé ôðàãìåíò
àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè
YHADIYDKVSGDMQKQCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSM.
5. Ïîëèïåïòèä, îáëàäàþùèé áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû,
îòëè÷àþùèéñ âûñîêîé ñïåöèôè÷íîñòüþ ê ôîñôîãèñòèäèíó è èìåþùèé ìîëåêóë ðíóþ
ìàññó 13,000-15,000, è ñîäåðæàùèé ñëåäóþùóþ àìèíîêèñëîòíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü:
(M)AVADLALIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHSAPRSGAPAAESKEIVRGYKWAEYHADIYDKVSGD
MQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSMAYGPAQHAISTEKIKAKYPDYEVTWANDGY.
6. Ïîëèïåïòèä, îáëàäàþùèé áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû,
îòëè÷àþùèéñ âûñîêîé ñïåöèôè÷íîñòüþ ê ôîñôîãèñòèäèíó è èìåþùèé ìîëåêóë ðíóþ
ìàññó 13,000-15,000, àìèíîêèñëîòíà ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êîòîðîãî íà 64-99% ãîìîëîãè÷íà
ïîñëåäîâàòåëüíîñòè, ïðèâåäåííîé â ï.5.
7. Ïîëèïåïòèä ïî ï.6, ñîäåðæàùèé ñëåäóþùóþ àìèíîêèñëîòíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü:
AAAGLAQIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHAAPPSEAPGGESKDIVRGYKWAEYHADIYDKVSGEL
QKKGHDCECLGGGRISHQSQDRKIHVYGYSMGYGRAQHSVSTEKIRAKYPDYEVTWADDGY.
8. Ïîëèíóêëåîòèä, ïî ñóùåñòâó, õàðàêòåðèçóþùèéñ ïîëèíóêëåîòèäíîé
ïîñëåäîâàòåëüíîñòüþ, êîäèðóþùåé ïîëèïåïòèä ïî ï.7.
9. Ïîëèíóêëåîòèä, ïî ñóùåñòâó, õàðàêòåðèçóþùèéñ ïîëèíóêëåîòèäíîé
ïîñëåäîâàòåëüíîñòüþ, êîäèðóþùåé ÷åëîâå÷åñêèé ïîëèïåïòèä ïî ï.5.
10. Ôàðìàöåâòè÷åñêèé ïðåïàðàò, ïðèìåí åìûé ïðè ïàòîëîãè÷åñêèõ ñîñòî íè õ,
ñâ çàííûõ ñ íàðóøåíèåì ôóíêöèè ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû, ñîäåðæàùèé
ôàðìàöåâòè÷åñêè ýôôåêòèâíîå êîëè÷åñòâî ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû ïî ïï.1-7,
êîòîðîå ñîñòàâë åò îò 0,01 äî 100 ìã/êã ïîëèïåïòèäà íà âåñ òåëà.
11. Àíòèòåëî ê ïåïòèäó, êîòîðîå âûðàáàòûâàåòñ â ðåçóëüòàòå èììóíèçàöèè
ïîëèïåïòèäàìè, âûáðàííûìè èç ãðóïïû ïîëèïåïòèäîâ ñ ïîñëåäîâàòåëüíîñò ìè Seq. No 3,
9, 10 èëè 11.
Ïðèîðèòåò â ÷àñòè ïðèçíàêîâ ïï.3, 5-11 óñòàíîâëåí îò 04.03.1999, â ÷àñòè äðóãèõ
ïðèçíàêîâ îò 02.03.2000.
Ñòðàíèöà: 18
CL
RU 2 281 973 C2
Ñòðàíèöà: 19
DR
RU 2 281 973 C2
Ñòðàíèöà: 20
RU 2 281 973 C2
Ñòðàíèöà: 21
RU 2 281 973 C2
Ñòðàíèöà: 22
RU 2 281 973 C2
Ñòðàíèöà: 23
RU 2 281 973 C2
Ñòðàíèöà: 24
RU 2 281 973 C2
Ñòðàíèöà: 25
Скачать