ÐÎÑÑÈÉÑÊÀß ÔÅÄÅÐÀÖÈß RU (19) (11) 2 281 973 (13) C2 (51) ÌÏÊ C12N C12N C07K A61K 9/16 (2006.01) 15/55 (2006.01) 16/40 (2006.01) 38/46 (2006.01) ÔÅÄÅÐÀËÜÍÀß ÑËÓÆÁÀ ÏÎ ÈÍÒÅËËÅÊÒÓÀËÜÍÎÉ ÑÎÁÑÒÂÅÍÍÎÑÒÈ, ÏÀÒÅÍÒÀÌ È ÒÎÂÀÐÍÛÌ ÇÍÀÊÀÌ (12) ÎÏÈÑÀÍÈÅ ÈÇÎÁÐÅÒÅÍÈß Ê ÏÀÒÅÍÒÓ (21), (22) Çà âêà: 2001126572/13, 02.03.2000 (72) Àâòîð(û): Çóçàííå ÊËÓÌÏÏ (DE), Ðîëàíä ÊÅËËÜÍÅÐ (DE) (24) Äàòà íà÷àëà îòñ÷åòà ñðîêà äåéñòâè ïàòåíòà: 02.03.2000 (73) Ïàòåíòîîáëàäàòåëü(è): ÌÅÐÊ ÏÀÒÅÍÒ ÃÌÁÕ (DE) R U (30) Êîíâåíöèîííûé ïðèîðèòåò: 04.03.1999 DE 19909388.1 (43) Äàòà ïóáëèêàöèè çà âêè: 27.07.2003 (45) Îïóáëèêîâàíî: 20.08.2006 Áþë. ¹ 23 2 2 8 1 9 7 3 2 2 8 1 9 7 3 R U (85) Äàòà ïåðåâîäà çà âêè PCT íà íàöèîíàëüíóþ ôàçó: 04.10.2001 C 2 C 2 (56) Ñïèñîê äîêóìåíòîâ, öèòèðîâàííûõ â îò÷åòå î ïîèñêå: HILLER L. È ÄÐ.: "zx64gll.rl Soares total fetus Nb2HF8 9w Homo sapiens cDNA clone", áàçà äàííûõ EMBL; èíâåíòàðíûé íîìåð ÀÀ461149, 13.06.1997, õð002141076. MATTHEWS HARRY R È ÄÐ.: "Protein histidine phosphatase activity in rat liver and spinach leaves." FEBS LETTERS, òîì 364, ¹1, 1995, ñ.51-54, ISSN: 0014-5793. (86) Çà âêà PCT: EP 00/01774 (02.03.2000) (87) Ïóáëèêàöè PCT: WO 00/52175 (08.09.2000) Àäðåñ äë ïåðåïèñêè: 101000, Ìîñêâà, Ìàëûé Çëàòîóñòèíñêèé ïåð., 10, êâ.15, "ÅÂÐÎÌÀÐÊÏÀÒ", ïàò.ïîâ. Í.Â.Êóçåíêîâîé (54) ÃÈÑÒÈÄÈÍ-ÏÐÎÒÅÈÍ-ÔÎÑÔÀÒÀÇÀ (57) Ðåôåðàò: Èçîáðåòåíèå îòíîñèòñ ê îáëàñòè áèîòåõíîëîãèè è ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíî â ìåäèöèíå è ôàðìàöåâòèêå. Ïîëó÷åí ïîëèïåïòèä, îáëàäàþùèé áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ ãèñòèäèíïðîòåèí-ôîñôàòàçû, à òàêæå êîäèðóþùèé åãî ïîëèíóêëåîòèä. Íà îñíîâå ïîëèïåïòèäà ïîëó÷åí ôàðìàöåâòè÷åñêèé ïðåïàðàò, ïðèìåí åìûé ïðè ïàòîëîãè÷åñêèõ ñîñòî íè õ, ñâ çàííûõ ñ íàðóøåíèåì ôóíêöèè ãèñòèäèí-ïðîòåèí- ôîñôàòàçû. Òàêæå ïîëó÷åíû àíòèòåëà, ñïåöèôè÷íûå ê ó÷àñòêàì óêàçàííîãî ïîëèïåïòèäà. Ïðèìåíåíèå èçîáðåòåíè ïîçâîë åò èçó÷àòü ïðîöåññ N-ôîñôîëèðîâàíè , äèàãíîñòèðîâàòü ïàòîëîãèè êëåòî÷íîé ðåãóë öèè è ðîñòà êëåòîê, à òàêæå ðåãóëèðîâàòü ïàòîëîãè÷åñêèå ñîñòî íè , ñâ çàííûå ñ íàðóøåíèåì ôóíêöèè ãèñòèäèíïðîòåèí-ôîñôàòàçû. 7 í. è 4 ç.ï. ô-ëû, 8 èë., 3 òàáë. Ñòðàíèöà: 1 RU RUSSIAN FEDERATION RU (19) (11) 2 281 973 (13) C2 (51) Int. Cl. C12N C12N C07K A61K 9/16 (2006.01) 15/55 (2006.01) 16/40 (2006.01) 38/46 (2006.01) FEDERAL SERVICE FOR INTELLECTUAL PROPERTY, PATENTS AND TRADEMARKS (12) ABSTRACT OF INVENTION (21), (22) Application: 2001126572/13, 02.03.2000 (24) Effective date for property rights: 02.03.2000 (72) Inventor(s): Zuzanne KLUMPP (DE), Roland KELL'NER (DE) (30) Priority: 04.03.1999 DE 19909388.1 (73) Proprietor(s): MERK PATENT GMBKh (DE) R U (43) Application published: 27.07.2003 (45) Date of publication: 20.08.2006 Bull. 23 2 2 8 1 9 7 3 (85) Commencement of national phase: 04.10.2001 (86) PCT application: EP 00/01774 (02.03.2000) (87) PCT publication: WO 00/52175 (08.09.2000) (57) Abstract: FIELD: biotechnology, biochemistry, enzymes. SUBSTANCE: invention reports about preparing a polypeptide possessing with the biological activity of enzyme protein-histidine-phosphatase and a polynucleotide encoding this enzyme also. Based on the polypeptide a pharmaceutical preparation is prepared using in pathological states associated with disturbance function of protein-histidine-phosphatase. Also, antibodies showing specificity to sites of indicated polypeptide are prepared. The use of the invention provides study of the N-phosphorylation process, carrying out the diagnosis of pathology of cellular regulation and growth cells and to regulate pathological states associated with disturbance in function of protein-histidinephosphatase. Invention can be used in medicine and pharmacy. EFFECT: valuable medicinal properties of enzyme, improved preparing method. 11 cl, 3 tbl, 10 dwg R U 2 2 8 1 9 7 3 (54) PROTEIN-HISTIDINE-PHOSPHATASE Ñòðàíèöà: 2 EN C 2 C 2 Mail address: 101000, Moskva, Malyj Zlatoustinskij per., 10, kv.15, "EVROMARKPAT", pat.pov. N.V.Kuzenkovoj RU 2 281 973 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Íàñòî ùåå èçîáðåòåíèå îòíîñèòñ ê íîâîìó ôåðìåíòó, ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçå, êîòîðûé ïîëó÷àþò èç ìëåêîïèòàþùèõ, è åãî ãîìîëîãè÷åñêèì âàðèàöè ì. Êðîìå òîãî, äàííîå èçîáðåòåíèå îòíîñèòñ ê ïîñëåäîâàòåëüíîñò ì ÄÍÊ, êîäèðóþùèì óïîì íóòûå ïðîòåèíû, ñïîñîáó ïîëó÷åíè ïîñëåäíèõ è àíòèòåëàì ê íèì. Íîâóþ ôîñôàòàçó ìîæíî ïðèìåí òü äë äèàãíîñòèêè ïàòîëîãèé êëåòî÷íîé ðåãóë öèè è ðîñòà êëåòîê, à òàêæå â êà÷åñòâå ôàðìàöåâòè÷åñêîãî ïðåïàðàòà, êîòîðûé ìîæåò ïðèìåí òüñ ïðè ïàòîëîãè÷åñêèõ ñîñòî íè õ, ñâ çàííûõ ñ íàðóøåíè ìè ôóíêöèé óêàçàííîãî ôåðìåíòà. Áîëåå ïîäðîáíî, íàñòî ùåå èçîáðåòåíèå îòíîñèòñ ê ïðèìåíåíèþ óïîì íóòîãî ôåðìåíòà â äèàãíîñòèêå è ëå÷åíèè çàáîëåâàíèé, ïðèìåíåíèþ àãîíèñòîâ è àíòàãîíèñòîâ ïðè èäåíòèôèêàöèè ôàêòîðîâ ôîñôîðèëèðîâàíè ãèñòèäèíà, à òàêæå àãîíèñòàì è àíòàãîíèñòàì, êîòîðûå ìîæíî ïðèìåí òü â òåðàïèè. Ïðåäïîñûëêè ñîçäàíè èçîáðåòåíè Ôîñôîðèëèðîâàíèå ïðîòåèíîâ ïðåäñòàâë åò ñîáîé âàæíåéøèé áèîëîãè÷åñêèé ïðîöåññ, íåðåäêî èãðàþùèé êëþ÷åâóþ ðîëü â òðàíñäóêöèè ñèãíàëîâ è ðåãóë öèè àêòèâíîñòè ïðîòåèíîâ. Ôîñôîðèëèðîâàíèå ñåðèíà, òðåîíèíà è òèðîçèíà - îáû÷íîå âëåíèå íà ïóò õ ýóêàðèîòíîé òðàíñäóêöèè ñèãíàëà. Ñóùåñòâóåò îãðîìíîå êîëè÷åñòâî ëèòåðàòóðû, ïîñâ ùåííîé áèîõèìè÷åñêèì ìåòîäàì âû âëåíè ôîñôîðèëèðîâàíè ñåðèíà, òðåîíèíà è òèðîçèíà íåèçâåñòíûõ ïðîòåèíîâ. Íàïðèìåð, êîãäà âûðàùåííûå êëåòêè ìëåêîïèòàþùèõ îáðàáàòûâàþòñ ôàêòîðàìè ðîñòà, öèòîêèíàìè, ëåêàðñòâåííûìè âåùåñòâàìè, ïåïòèäàìè èëè äðóãèìè ñòèìóëèðóþùèìè ìîëåêóëàìè, òàêèìè êàê ôàêòîð ðîñòà, âûäåëåííûé èç òðîìáîöèòîâ, ôàêòîð ðîñòà íåðâîâ, IL-2 (èíòåðëåéöèí-2) è ò.ä., ôîñôîðèëèðîâàíèå ïðîòåèíîâ â ñåðèíå, òðåîíèíå è òèðîçèíå ìîæíî ëåãêî âû âèòü ïóòåì êóëüòèâèðîâàíè êëåòîê ñ ìå÷åíûì ðàäèîèçîòîïîì ôîñôàòîì, âûäåëåíè ïðîòåèíîâ ïîñëå îáðàáîòêè ôàêòîðîì ðîñòà è ò.ä. è ðàçäåëåíè èõ ìåòîäîì ýëåêòðîôîðåçà â ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå äîäåöèëñóëüôàòîì íàòðè , ñâ çûâàíè ãåë è ïðîâåäåíè àâòîðàäèîãðàôèè, ïîçâîë þùåé èäåíòèôèöèðîâàòü ïîëîñû ïðîòåèíîâ, ñîäåðæàùèå ìå÷åíûé ôîñôàò.  êà÷åñòâå àëüòåðíàòèâû ïðîòåèíû èç îáðàáîòàííûõ è íåîáðàáîòàííûõ êëåòîê ìîæíî ðàçäåëèòü ñ èñïîëüçîâàíèåì äâóõìåðíîé ñèñòåìû, ñðàâíèâà ïîëîæåíè ï òåí ïðîòåèíîâ. ßâíîå ïåðåìåùåíèå ï òíà ãîâîðèò îá èçìåíåíèè â ìîäèôèêàöèè, ïîëó÷åííîé â ðåçóëüòàòå îáðàáîòêè.  åùå îäíîì âàðèàíòå ïðåäóñìàòðèâàåòñ ïðîâåäåíèå êèñëîòíîãî ãèäðîëèçà ïðîòåèíîâ ñ ïîëó÷åíèåì àìèíîêèñëîò, ñ êîòîðûìè çàòåì ïðîâîä ò òîíêîñëîéíóþ õðîìàòîãðàôèþ è èññëåäóþò íà íàëè÷èå ìå÷åíîãî ðàäèîèçîòîïîì ôîñôîðà. Îäíàêî ýòè ìåòîäû áåëêîâîé õèìèè îñóùåñòâë þòñ â óñëîâè õ, ïðè êîòîðûõ ôîñôîðèëèðîâàííûé ãèñòèäèí, ëèçèí èëè àðãèíèí íåñòàáèëüíû.  ÷àñòíîñòè, ïðè íèçêîì ðÍ ôîñôîãèñòèäèí ñïîíòàííî ðàñïàäàåòñ ÷åðåç ïðèáëèçèòåëüíî 5-100 ìèíóò, òîãäà êàê ïðè ñðåäíåì ðÍ ïåðèîä åãî ïîëóðàñïàäà ñîñòàâë åò îò íåñêîëüêèõ äíåé äî íåñêîëüêèõ íåäåëü (Matthews, Í. R. [1995] Pharmac. Ther. 67:323-350). Íàïðèìåð, ïîñëå ïðîâåäåíè ýëåêòðîôîðåçà ïîëèàêðèëàìèäíûå ãåëè, èñïîëüçóåìûå äë ðàçäåëåíè ïðîòåèíîâ, ñâ çûâàþò â êèñëîòíûõ óñëîâè õ. Ê ðàñïàäó ôîñôîãèñòèäèíà òàêæå ïðèâîäèò èñïîëüçîâàíèå êèñëîòíûõ óñëîâèé ïðè ãèäðîëèçå àìèíîêèñëîòû. Áûëî óñòàíîâëåíî, ÷òî ôîñôîðèëèðîâàííûé ãèñòèäèí èãðàåò êëþ÷åâóþ ðîëü â òðàíñäóêöèè ñèãíàëîâ â áàêòåðè õ. Ïóòè òðàíñäóêöèè ðåãóëèðóþò öåëûé ð ä ïðîöåññîâ áàêòåðèàëüíîãî ìåòàáîëèçìà. Íàïðèìåð, ñèñòåìà ArcA/ArcB óïðàâë åò àýðîáíûì è àíàýðîáíûì ìåòàáîëèçìîì â Å. coli (luchi S, Weiner L. J Biochem (Òîêèî) [1996] 120: 1055-63). OmpR è OmpF îòâå÷àþò çà ðåàêöèè íà ðàçëè÷íûå îñìîòè÷åñêèå óñëîâè (Pratt LA., Hsing W., Gibson K.E, Silhavy T.J. Mol Microbiol [1996] 20:911-7). CheA è CheZ ïðèíèìàþò ó÷àñòèå â õåìîòàêñèñå (Alon U. Nature [1999] 397:168-171). Âïåðâûå âñå ýòè ïðîòåèíû áûëè èäåíòèôèöèðîâàíû ãåíåòè÷åñêè: â ðåçóëüòàòå ìóòàöèé â ñîîòâåòñòâóþùèõ ãåíàõ îáðàçóþòñ òðåáóåìûå ôåíîòèïû, è ïîñëå êëîíèðîâàíè äàííûõ ãåíîâ ïðîâîä ò èäåíòèôèêàöèþ ïîëó÷åííûõ ïðîòåèíîâ. Òàêæå íåäàâíî áûëî îáíàðóæåíî, ÷òî ýóêàðèîòû S. cerevisiae è Arabidopsis thaliana èìåþò ñèñòåìû òðàíñäóêöèè ñèãíàëîâ ñ ïðîòåèíàìè, â êîòîðûõ ïðîèñõîäèò ôîñôîðèëèðîâàíèå ãèñòèäèíà (Loomis è äð., [1997] J. Cell Science 110:1141-1145). Ñòðàíèöà: 3 DE RU 2 281 973 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Íàïðèìåð, ïðîòåèí Sln1 îáëàäàåò âíåêëåòî÷íûì ñåíñîðíûì äîìåíîì, öèòîïëàçìàòè÷åñêèì äîìåíîì ãèñòèäèí-êèíàçû è äîìåíîì òðàíñë öèè àñïàðòàòà. ETR1 âèäà Arabidopsis thaliana èç ñåìåéñòâà ãîð÷è÷íûõ áûë òàêæå èäåíòèôèöèðîâàí ìóòàíòàìè, íå ðåàãèðóþùèìè íà ýòèëåí. Ãåí ETR1 çàòåì êëîíèðîâàëè è ïðîâîäèëè èññëåäîâàíèå ïðîòåèíà, â ðåçóëüòàòå êîòîðîãî áûëî îáíàðóæåíî, ÷òî ïîñëåäíèé ïðåäñòàâë åò ñîáîé ãèñòèäèí-êèíàçó. S. cerevisiae è Arabidopsis thaliana âë þòñ ãåíåòè÷åñêè ìîäèôèöèðóåìûìè îðãàíèçìàìè, è èõ ïðîòåèíû, ïðèíèìàþùèå ó÷àñòèå â ôîñôîðèëèðîâàíèè ãèñòèäèíà, òàêèå êàê Sln1 è Etr1, êàê ïðàâèëî, èäåíòèôèöèðóþò ãåíåòè÷åñêè. Ñóùåñòâóþùèå ìåòîäèêè âêëþ÷àþò ðàçäåëåíèå ïî ðàçìåðàì ëèáî ïðîòåèíîâ, ëèáî ôîñôîàìèíîêèñëîò. N-ôîñôîðèëèðîâàíèå â êëåòêàõ ìëåêîïèòàþùèõ âë åòñ âàæíûì ïðîöåññîì â ýíåðãåòè÷åñêîì îáìåíå è èçìåí åòñ ïðè ðàçâèòèè ðàçëè÷íûõ òèïîâ ðàêà. Íàïðèìåð, ïðîòåèí Nm23 ïðåäñòàâë åò ñîáîé íóêëåîçèä-äèôîñôàò-êèíàçó, êîòîðà ìîæåò ïåðåâîäèòü íóêëåîçèä- è äåîêñèíóêëåîçèääèôîñôàòû â òðèôîñôàòû, èñïîëüçó äë ýòîãî ÀÒÔ, îáðàçóåìûé â ðåçóëüòàòå ãëèêîëèçà è îêèñëèòåëüíîãî ôîñôîðèëèðîâàíè . Nm23 ôîñôîðèëèðóåòñ â Ãèñòèäèíå 118 íà ïðîìåæóòî÷íîé ñòàäèè ïèíã-ïîíãîâîãî ìåõàíèçìà åãî ðåàêöèè. Nm23 òàêæå ñïîñîáåí ïåðåäàâàòü ñâîþ ôîñôàòíóþ ãðóïïó ãèñòèäèíîâûì îñòàòêàì â ÀÒÔ-öèòðàò-ëèàçå è ñóêöèíèë-ÑîÀ-ñèíòåòàçå. Òàêèì îáðàçîì, ôîñôîðèëèðîâàíèå ãèñòèäèíà èãðàåò âàæíóþ ðîëü â ýíåðãåòè÷åñêîì îáìåíå â êëåòêàõ.  îðãàíèçìå ÷åëîâåêà èìååòñ íåñêîëüêî ïðîòåèíîâ Nm23. Ïðè ðàêîâûõ çàáîëåâàíè õ ñ âûñîêèì ìåòàñòàçîì ýòè ïðîòåèíû Nm23 íåðåäêî ýêñïðåññèðóþòñ íà íèçêèõ óðîâí õ. Èñõîä èç ýòîãî, ïîëàãàþò, ÷òî Nm 23 âë åòñ àíòèîíêîãåíîì. Êðîìå òîãî, ïðè íåêîòîðûõ ðàêîâûõ çàáîëåâàíè õ â îòäåëüíûõ ïðîòåèíàõ Nm23 íàáëþäàþòñ ìóòàöèè.  ðåçóëüòàòå ýòèõ ìóòàöèé íåðåäêî èçìåí åòñ ñêîðîñòü ôîñôîðèëèðîâàíè èëè äåôîñôîðèëèðîâàíè Nm23. Åñëè îáîáùèòü âñå âûøåóêàçàííîå, ñòàíîâèòñ î÷åâèäíûì, ÷òî N-ôîñôîðèëèðîâàíèå èãðàåò âàæíóþ ðîëü â ýíåðãåòè÷åñêîì îáìåíå è ïðîöåññàõ, ïðîèñõîä ùèõ ïðè ðàçâèòèè ðàêà. Òàêèì îáðàçîì, ïðîòåèíû èëè ëåêàðñòâà, ìîäóëèðóþùèå N-ôîñôîðèëèðîâàíèå èëè äåôîñôîðèëèðîâàíèå, ìîãóò îêàçàòüñ âåñüìà ïîëåçíûìè ïðè ëå÷åíèè ðàêà èëè ðàññòðîéñòâ îáìåíà âåùåñòâ, òàêèõ êàê îæèðåíèå, àíîðåêñè , èçìîæäåííîñòü êàê ñëåäñòâèå ðàêà, ÂÈ× èëè äðóãèå çàáîëåâàíè è ò.ä. Êðîìå òîãî, ïîñêîëüêó Nôîñôîðèëèðîâàíèå èãðàåò îïðåäåëåííóþ ðîëü â öåëîì ð äå áèîëîãè÷åñêèõ âëåíèé, èìåþùèõ ìåñòî â äðóãèõ îðãàíèçìàõ, âïîëíå âîçìîæíî, ÷òî îíî òàêæå òàê èëè èíà÷å âîçäåéñòâóåò íà ðàçâèòèå èíûõ áîëåçíåé è ðàññòðîéñòâ ìëåêîïèòàþùèõ, òàêèõ êàê èììóííûå ðàññòðîéñòâà, âèðóñíûå èíôåêöèè, ãåíåòè÷åñêèå ðàññòðîéñòâà, ïîðîê ñåðäöà è ò.ä. Ê ñîæàëåíèþ, ìëåêîïèòàþùèå ðàñòóò íàìíîãî ìåäëåííåå áàêòåðèé (S. cerevisiae è Arabidopsis thaliana). Òàêèì îáðàçîì, èäåíòèôèöèðîâàòü ïðîòåèíû, ïðèíèìàþùèå ó÷àñòèå â ôîñôîðèëèðîâàíèè ãèñòèäèíà, ëèçèíà èëè àðãèíèíà, ïîëüçó ñü ïðè ýòîì òåìè æå ãåíåòè÷åñêèìè ìåòîäàìè, ê êîòîðûì ïðèáåãàþò ïðè ðàáîòå ñ áîëåå ïðîñòûìè îðãàíèçìàìè, äîâîëüíî ñëîæíî. Ê òîìó æå áèîõèìè÷åñêèå ìåòîäèêè èäåíòèôèêàöèè ïðîòåèíîâ, ôîñôîðèëèðóåìûõ â ñåðèíå, òðåîíèíå è òèðîçèíå, íå ñîâñåì ïðèìåíèìû äë èäåíòèôèêàöèè ïðîòåèíîâ, êîòîðûå ôîñôîðèëèðóþòñ â ãèñòèäèíå, ëèçèíå è àðãèíèíå. Òàêèì îáðàçîì, â äàííîé îáëàñòè òåõíèêè èìååòñ ïîòðåáíîñòü â ìåòîäèêàõ è áèîõèìè÷åñêèõ ðåàãåíòàõ, êîòîðûå ìîæíî áûëî áû ïðèìåí òü äë èçó÷åíè ïðîöåññà Nôîñôîðèëèðîâàíè . Ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû è ãèñòèäèí-êèíàçû - ýòî ôåðìåíòû, äåéñòâóþùèå â ïðîòèâîïîëîæíûõ íàïðàâëåíè õ. Ãèñòèäèí-êèíàçà èíèöèèðóåò ôîñôîðèëèðîâàíèå îïðåäåëåííûõ ãèñòèäèíîâûõ îñòàòêîâ â ïðîòåèíàõ, òîãäà êàê ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû îáðàùàþò ýòîò ïðîöåññ. Âåðî òíî, îáà ôåðìåíòà èãðàþò íå ïîñëåäíþþ ðîëü â òðàíñäóêöèè ñèãíàëîâ, àïîïòîçå, ðåãóë öèè ðîñòà êëåòîê è äèôôåðåíöèàöèè êëåòîê. Èçâåñòíî, ÷òî îíè ìîãóò âûçûâàòü çàáîëåâàíè , ñâ çàííûå ñ íàðóøåíè ìè ýòèõ êëåòî÷íûõ ôóíêöèé. Òàêèì îáðàçîì, öåëü íàñòî ùåãî èçîáðåòåíè -ýòî ïîëó÷åíèå àãåíòà, êîòîðûé ìîæíî áûëî áû Ñòðàíèöà: 4 RU 2 281 973 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 ïðèìåí òü äë èññëåäîâàíè ïðè÷èí ïàòîôèçèîëîãè÷åñêèõ íàðóøåíèé è, êîãäà ýòî âîçìîæíî, óñòðàíåíè ïîñëåäíèõ. Ãîðìîíû èëè ïåïòèäû ñòèìóëèðóþò ðåöåïòîðû, ðàñïîëàãàþùèåñ íà ïîâåðõíîñòè êëåòêè, è, çàäåéñòâó ïóòü òðàíñäóêöèè ñèãíàëà, èíäóöèðóþò âëåíè , èìåþùèå ìåñòî â êëåòêå. Îáðàòèìîå ôîñôîðèëèðîâàíèå ñïåöèôè÷åñêèõ ïðîòåèíîâûõ ïîäëîæåê ðåãóë òîðíûìè ïðîòåèíêèíàçàìè è ôîñôàòàçàìè èãðàåò ñóùåñòâåííóþ ðîëü âî âíóòðèêëåòî÷íîé ïåðåäà÷å ñèãíàëà. Ðåöåïòîðñâ çàííûå, ìåìáðàíîñâ çàííûå è âíóòðèêëåòî÷íûå ïðîòåèíêèíàçû è ôîñôàòàçû ðåãóëèðóþò ïðîöåññû ïðîëèôåðàöèè è äèôôåðåíöèàöèè êëåòîê, à òàêæå óïðàâë þò èììóííîé ñèñòåìîé. Íàðóøåíè ôóíêöèé ýòèõ ðåãóë òîðîâ èãðàåò ðåøàþùóþ ðîëü â ð äå ïàòîôèçèîëîãè÷åñêèõ âëåíèé. Òàêèì îáðàçîì, ïðè ðàçðàáîòêå ëåêàðñòâà äîëæíû ðåøàòüñ çàäà÷è ïîëó÷åíè ñîåäèíåíèé, äåéñòâóþùèõ ïîäîáíî ïðîòåèíêèíàçàì è ôîñôàòàçàì, à òàêæå ìîäåëèðîâàíè ïóòè òðàíñäóêöèè ñèãíàëà, â êîòîðîì îíè ïðèíèìàþò ó÷àñòèå. Òðàíñäóêöè ñèãíàëà â ìëåêîïèòàþùèõ âêëþ÷àåò îáðàòèìîå ôîñôîðèëèðîâàíèå Ser/Thr/Tyr. Õîò è èçâåñòíî, ÷òî ãèñòèäèíôîñôàò ïðèñóòñòâóåò â êëåòêàõ ìëåêîïèòàþùèõ (Crovello C.S., Furie B.C., Furie Â. (1995) Cell 82:279-286), äî ñèõ ïîð íå óäàëîñü èäåíòèôèöèðîâàòü íè ñîîòâåòñòâóþùèå êèíàçû, íè ïîäõîä ùèå ôîñôàòàçû. Îäíà èç ïðîáëåì çàêëþ÷àåòñ â òîì, ÷òî ãèñòèäèíôîñôàò íåñòàáèëåí ïðè ãèäðîëèçå è íå îáíàðóæèâàåòñ ìåòîäîì ñòàíäàðòíîãî àíàëèçà ñ èñïîëüçîâàíèåì ôîñôîàìèíîêèñëîòû. Ôóíêöèè His-êèíàç è His-ôîñôàòàç â áàêòåðè õ èññëåäîâàíû âåñüìà îñíîâàòåëüíî. Èõ ó÷àñòèå â ïðîöåññàõ õåìîòàêñèñà è àäàïòàöèè ïîçâîë åò ãîâîðèòü î ðåçóëüòàòèâíîì ëå÷åíèè çàáîëåâàíèé, âûçûâàåìûõ áàêòåðè ìè, ïóòåì âîçäåéñòâè íà ýòè ñîåäèíåíè . Êðàòêîå èçëîæåíèå ñóùíîñòè èçîáðåòåíè Íàñòî ùåå èçîáðåòåíèå îòíîñèòñ ê ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçå, â ÷àñòíîñòè ïîëèïåïòèäàì è ïîëèíóêëåîòèäàì ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû, ðåêîìáèíàíòíûì ìàòåðèàëàì è ñïîñîáàì èõ ïîëó÷åíè . Ïîäîáíûå ïîëèïåïòèäû è ïîëèíóêëåîòèäû ðàññìàòðèâàþòñ ñ òî÷êè çðåíè ëå÷åíè îïðåäåëåííûõ áîëåçíåé, ê ÷èñëó êîòîðûõ îòíîñ òñ , ñðåäè ïðî÷åãî, ðàê è ðàññòðîéñòâà îáìåíà âåùåñòâ, ñåðäå÷íî-ñîñóäèñòûå çàáîëåâàíè è ðàññòðîéñòâà öåíòðàëüíîé íåðâíîé ñèñòåìû, äàëåå "çàáîëåâàíè ïî äàííîìó èçîáðåòåíèþ". Êðîìå òîãî, íàñòî ùåå èçîáðåòåíèå îòíîñèòñ ê ñïîñîáàì èäåíòèôèêàöèè àãîíèñòîâ è àíòàãîíèñòîâ (íàïð., èíãèáèòîðîâ) ñ èñïîëüçîâàíèåì ìàòåðèàëîâ ïî äàííîìó èçîáðåòåíèþ, à òàêæå ñí òèþ ñ ïîìîùüþ èäåíòèôèöèðîâàííûõ ñîåäèíåíèé ñîñòî íèé, ñâ çàííûõ ñ íàðóøåíèåì áàëàíñà N-ôîñôîðèëèðîâàíè . Ïîìèìî ýòîãî äàííîå èçîáðåòåíèå îòíîñèòñ ê ìåòîäàì äèàãíîñòèêè çàáîëåâàíèé, ñâ çàííûõ ñ íàðóøåíè ìè àêòèâíîñòè ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû èëè óðîâí åå ñîäåðæàíè â êëåòêàõ. Íàñòî ùåå èçîáðåòåíèå òàêæå âêëþ÷àåò ñîîòâåòñòâóþùèå âàðèàíòû èëè ìóòàíòû, ïîëó÷àåìûå, íàïðèìåð, ìåòîäàìè ñëó÷àéíîãî èëè íàïðàâëåííîãî çàìåùåíè , ñïëàéñèíãà ðàçëè÷íûõ êîíñòðóêöèé, äåëåöèè ëèáî ïóòåì äîáàâëåíè îäíîãî èëè íåñêîëüêèõ íóêëåîòèäîâ ëèáî àìèíîêèñëîò ñ ñîõðàíåíèåì, â îñíîâíîì, áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòè. Òàêèì îáðàçîì, öåëüþ íàñòî ùåãî èçîáðåòåíè âë åòñ ïîëó÷åíèå ïîëèïåïòèäà, êîòîðûé îáëàäàë áû áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû, îòëè÷àþùåéñ âûñîêîé ñïåöèôè÷íîñòüþ ê ôîñôîãèñòèäèíó è èìåþùåé ìîëåêóë ðíóþ ìàññó 13,00015,000. Ïîäîáíûé ïîëèïåïòèä ìîæíî âûäåëèòü èç òêàíè ìëåêîïèòàþùåãî ñïîñîáîì, âêëþ÷àþùèì êàê ìèíèìóì îäíó ñòàäèþ àíèîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè, îäíó îïåðàöèþ ãåëü-ôèëüòðàöèè è îäíó ñòàäèþ àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè.  ïðåäïî÷òèòåëüíîì âàðèàíòå òêàíü èçâëåêàþò èç ñåðäöà, ïî÷åê, ïå÷åíè, ïîäæåëóäî÷íîé æåëåçû, ñêåëåòíûõ ìûøö è è÷åê ìëåêîïèòàþùåãî. Ïðåäïî÷òèòåëüíûìè ìëåêîïèòàþùèìè âë þòñ ÷åëîâåê, êðîëèê, êðûñà. Ïîëèïåïòèä ïî äàííîìó èçîáðåòåíèþ ñîäåðæèò ïî ìåíüøåé ìåðå îñíîâíîé ôðàãìåíò àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè (SEQ. No. 3) DCECLGGGRISHQSQD.  äðóãîì âàðèàíòå îñóùåñòâëåíè íàñòî ùåãî èçîáðåòåíè ïîëèïåïòèä ñîäåðæèò êàê Ñòðàíèöà: 5 RU 2 281 973 C2 ìèíèìóì îñíîâíîé ôðàãìåíò àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè (SEQ.¹4) 5 10 15 20 25 30 â êîòîðîì X 1=Ê èëè R, X 2=À ëèáî G, è X 3=Ð èëè R.  ñëåäóþùåì âàðèàíòå îñóùåñòâëåíè äàííîãî èçîáðåòåíè ïîëèïåïòèä ñîäåðæèò êàê ìèíèìóì îñíîâíîé ôðàãìåíò àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè (SEQ. ¹5)  ñîñòàâå àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ôåðìåíòà âñå ýòè íåïîëíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè îòëè÷àþòñ âûñîêîé êîíñåðâàòèâíîñòüþ è, êàê ïîëàãàþò, èãðàþò îïðåäåëåííóþ ðîëü â àêòèâíîì öåíòðå óïîì íóòîãî ôåðìåíòà ëèáî îáëàäàþò èíûìè áèîëîãè÷åñêèìè èëè ôàðìàöåâòè÷åñêèìè ñâîéñòâàìè, êîòîðûå îíè ïðî âë þò â õîäå ïðîöåññîâ, ïðîèñõîä ùèõ â êëåòêàõ ìëåêîïèòàþùèõ.  ïðåäïî÷òèòåëüíîì âàðèàíòå îñóùåñòâëåíè íàñòî ùåãî èçîáðåòåíè ïîëèïåïòèä îáëàäàåò áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû, îòëè÷àþùåéñ âûñîêîé ñïåöèôè÷íîñòüþ ê ôîñôîãèñòèäèíó è èìåþùåé ìîëåêóë ðíóþ ìàññó 13,000-15,000, è ñîäåðæèò ñëåäóþùóþ àìèíîêèñëîòíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü (SEQ. ¹2): Íàëè÷èå ìåòèîíèíîâîãî îñòàòêà íà N-êîíöå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè íåîá çàòåëüíî. Âûøåóêàçàííà àìèíîêèñëîòíà ïîñëåäîâàòåëüíîñòü èçâëå÷åíà èç êëåòêè ÷åëîâåêà. Îäíàêî â äàííîì èçîáðåòåíèè òàêæå ðàñêðûâàþòñ îñîáî ãîìîëîãè÷åñêèå âàðèàöèè óïîì íóòûõ ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé. Òàêèì îáðàçîì, åùå îäíîé öåëüþ íàñòî ùåãî èçîáðåòåíè âë åòñ ïîëó÷åíèå ïîëèïåïòèäà, êîòîðûé îáëàäàë áû áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû, îòëè÷àþùåéñ âûñîêîé ñïåöèôè÷íîñòüþ ê ôîñôîãèñòèäèíó è èìåþùåé ìîëåêóë ðíóþ ìàññó 13,000-15,000, àìèíîêèñëîòíà ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êîòîðîãî áûëà áû íà 64-99%, ïðåäïî÷òèòåëüíî 75-99%, ãîìîëîãè÷íîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè, îïèñàííîé âûøå.  äàííîì èçîáðåòåíèè ðàñêðûâàåòñ öåëûé ð ä äðóãèõ ãîìîëîãè÷íûõ ïîëèïåïòèäîâ, îáëàäàþùèõ áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ ãèñòèäèíïðîòåèí-ôîñôàòàçû, ÷òî ñòàíîâèòñ î÷åâèäíûì èç ïðèâåäåííîãî íèæå. Ñëåäóþùåé öåëüþ íàñòî ùåãî èçîáðåòåíè ñòàëî ïîëó÷åíèå ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé ÄÍÊ, êîòîðûå áû êîäèðîâàëè óïîìèíàåìûé âûøå è ïðèâîäèìûé íèæå ïî òåêñòó ïîëèïåïòèä.  îñíîâíîì äàííîå èçîáðåòåíèå îòíîñèòñ ê óïîì íóòîé ÄÍÊ, ñîäåðæàùåé ñëåäóþùóþ íóêëåîòèäíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü (SEQ. ¹1): 35 40 45 50 Íàñòî ùåå èçîáðåòåíèå òàêæå îòíîñèòñ ê àíòèòåëàì, ïðåäïî÷òèòåëüíî ìîíîêëîíàëüíûì àíòèòåëàì, ê ïîëèïåïòèäàì ïî äàííîìó èçîáðåòåíèþ. Íàêîíåö, öåëüþ íàñòî ùåãî èçîáðåòåíè âë åòñ èçãîòîâëåíèå ôàðìàöåâòè÷åñêîãî ïðåïàðàòà, ñîäåðæàùåãî óïîìèíàåìûå âûøå è ïðèâîäèìûå íèæå ïî òåêñòó ïîëèïåïòèäû â êîìáèíàöèè, åñëè ýòî öåëåñîîáðàçíî, ñ ñîîòâåòñòâóþùèìè ýêñöèïèåíòàìè, íîñèòåë ìè è äðóãèìè àêòèâíûìè êîìïîíåíòàìè. Ïîäðîáíîå îïèñàíèå (À) ÂÛÄÅËÅÍÈÅ È Î×ÈÑÒÊÀ Ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçà áûëà âûäåëåíà èç ïå÷åíè êðîëèêà. Ñïåðâà 110 ã ïå÷åíè ðàçðåçàþò íå ìåëêèå êóñî÷êè. Çàòåì ìàòåðèàë ñìåøèâàþò ñ áóôåðîì äë ãîìîãåíèçàöèè (220 ìë 30 ìÌ-òðèýòàíîëàìèí/ñîë íîé êèñëîòû ñ ðÍ 7,5, 1 ìÌýòèëåíäèàìèíòåòðàóêñóñíîé êèñëîòû, 300 ìÌ-ñàõàðîçû, 0,1 ìÌ-áåíçàìèäèíà ñ 0,1% 2Ñòðàíèöà: 6 RU 2 281 973 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 ìåðêàïòîýòàíîëà) è èçìåëü÷àþò â ãîìîãåíèçàòîðå ñ îõëàæäåíèåì ëüäîì. Ïî çàâåðøåíèè ïåðâîãî ýòàïà öåíòðèôóãèðîâàíè (10 ìèí, 3800 ã, 4°Ñ), íàäîñàäî÷íóþ æèäêîñòü öåíòðèôóãèðóþò ïîâòîðíî (1 ÷, 48,000 ã, 4°Ñ). Ïîñëåäíþþ ôèëüòðóþò ÷åðåç ìàðëþ è çàìîðàæèâàþò ïðè -80°Ñ â êîëè÷åñòâàõ, êðàòíûõ ïðèáëèçèòåëüíî 20 ìë. Ìåòîäû õðîìàòîãðàôè÷åñêîãî ðàçäåëåíè íà êîëîíêàõ Ãèñòèäèí-ôîñôàòàçó âûäåë ëè ïîñðåäñòâîì îñóùåñòâëåíè òðåõ ñòàäèé î÷èñòêè (Ôèã.1). 1. Àíèîíîîáìåííà õðîìàòîãðàôè Íåî÷èùåííûé ýêñòðàêò ïå÷åíè âíîâü îäèí ðàç öåíòðèôóãèðóþò (30 ìèí, 48,000 ã). Íàäîñàäî÷íóþ æèäêîñòü çàãðóæàþò â êîëîíêó Source Q30 (ôèðìà Pharmacia, Ôðàéáóðã), óðàâíîâåøåííóþ áóôåðîì À (20 ìÌ-òðèýòàíîëàìèí/ñîë íà êèñëîòà ñ ðÍ 8,0, 1 ìÌ ýòèëåíäèàìèíòåòðàóêñóñíà êèñëîòà ñ 0,1% 2-ìåðêàïòîýòàíîëà è 0,02% àçîòèñòîêèñëîãî íàòðè ). Ýëþèðîâàíèå îñóùåñòâë þò 200 ìÌ-õëîðèñòûì íàòðèåì â áóôåðå À ñî ñêîðîñòüþ ïîòîêà 1 ìë/ìèí. 2. Ãåëü-ôèëüòðàöè Àêòèâíóþ ôðàêöèþ (ñì. îïðåäåëåíèå àêòèâíîñòè) ïåðåìåøèâàþò è îõëàæäàþò, äîáàâë ïðè ýòîì òâåðäûé ñåðíîêèñëûé àììîíèé (11,2 ã íà 17 ìë). Êàïëþ îñàäêà, îáðàçîâàííóþ â ðåçóëüòàòå öåíòðèôóãèðîâàíè (20 ìèí, 48,000 ã, 4°Ñ), ïîâòîðíî ñóñïåíäèðóþò â áóôåðå À è çàãðóæàþò â êîëîíêó Superdex 75 26/60 1,6×60 ñì (ôèðìà Pharmacia, Ôðàéáóðã). Ãåëüôèëüòðàöèþ ïðîâîä ò, êàæäóþ ìèíóòó äîáàâë â áóôåð À 1 ìë 50 ìÌ-õëîðèñòîãî íàòðè . 3. Àôôèííà õðîìàòîãðàôè Àêòèâíóþ ôðàêöèþ, ïîëó÷åííóþ â ðåçóëüòàòå ãåëü-ôèëüòðàöèè, â ñîîòíîøåíèè 1:3 ðàñòâîð þò â áóôåðå  (20 ìÌ-òðèýòàíîëàìèí/ñîë íà êèñëîòà ñ ðÍ 8,0, 0,1 ìÌýòèëåíäèàìèíòåòðàóêñóñíà êèñëîòà ñ 0,1% 2-ìåðêàïòîýòàíîëà è 0,02% àçîòèñòîêèñëîãî íàòðè ) è ñòàáèëèçèðóþò íà îòìåòêå 10 ìÌ â õëîðèñòîì ìàãíèè. Îáðàçåö çàãðóæàþò â êîëîíêó Blue Sepharose 6 25×510 ìì (ôèðìà Pharmacia, Ôðàéáóðã). Ýëþèðîâàíèå îñóùåñòâë þò ñ èñïîëüçîâàíèåì áóôåðà Â, ñîäåðæàùåãî 200 ìÌ-õëîðèñòûé íàòðèé, ñî ñêîðîñòüþ ïîòîêà 1 ìë/ìèí. (Á) ÎÁÍÀÐÓÆÅÍÈÅ ÑÏÅÖÈÔÈ×ÅÑÊÎÉ ÀÊÒÈÂÍÎÑÒÈ Àêòèâíîñòü ðàñòâîðèìîé ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû îïðåäåë þò ïî äåôîñôîðèëèðîâàíèþ ìå÷åíîãî 32P ôîñôîðèëèðîâàííîãî â ãèñòèäèíå ïðîòåèíà (CheA), âûïîëí þùåãî ôóíêöèþ ïîäëîæêè. CheA ïðåäñòàâë åò ñîáîé ðåêîìáèíàíòíóþ áàêòåðèàëüíóþ ãèñòèäèí-àóòîêèíàçó (Bilwes A.M., Alex L.A., Crane B.R., Simon M.I. (1999) Cell 96:131-141); äîìåí êèíàçû íà Ñ-êîíöå ôîñôîðèëèðóåò N-êîíöåâîé His48.  ðåçóëüòàòå ðåàêöèè îáðàçóåòñ ñâîáîäíûé ôîñôàò, èäåíòèôèöèðóåìûé ìåòîäîì òîíêîñëîéíîé õðîìàòîãðàôèè (ïëàíøåòû èç ïîëèýòèëåíèìèííîé öåëëþëîçû, 0,5 Ì-õëîðèñòûé ëèòèé â êà÷åñòâå ïîäâèæíîé ôàçû). Îáíàðóæåíèå, ñ îäíîé ñòîðîíû, ñ èñïîëüçîâàíèåì ìîëèáäåíîâîêèñëîãî àììîíè , à ñ äðóãîé - ìåòîäîì àâòîðàäèîãðàôèè (Ôèã.2).  õîäå ðåàêöèè íå ïðîèñõîäèëî íè ïåðåäà÷è ôîñôàòà äðóãèì ïðîòåèíàì, íè ðàñùåïëåíè ïîäëîæêè íà ïåïòèäíûå ôðàãìåíòû. Ïðè ýòîì ïîëó÷àþò ôîñôàò, èíûìè ñëîâàìè, â ðåàêöèè ïðèíèìàåò ó÷àñòèå ôîñôîãèñòèäèí-ïðîòåèíôîñôàòàçà. Î÷èùåííûé ïðîòåèí îáëàäàåò ñïîñîáíîñòüþ äåôîñôîðèëèðîâàòü ìå÷åíûé 32Ð ôîñôîðèëèðîâàííûé CheA â ãèñòèäèíå. Âûõîä çàâèñèò îò âðåìåíè, òåìïåðàòóðû, ðÍ è ïðîòåèíà (Ôèã.3). Óñòîé÷èâîñòü Óñòîé÷èâîñòü î÷èùåííîãî ïðîòåèíà ïðè õðàíåíèè îáåñïå÷èâàåòñ ïðè èñïîëüçîâàíèè ñûðîãî ãîìîãåíàòà è ÷àñòè÷íî î÷èùåííûõ ôðàêöèé. Ôåðìåíòíûé îáðàçåö Ïðèãîòîâëåíèå ïîäëîæêè: (ìå÷åíèå CheA 32Ð) Ðåêîìáèíàíòíûé CheA (5 ìêë) ñìåøèâàþò ñ 0,5 ìêë 100 ìÌôåíèëìåòèëñóëüôîíèëôòîðèäà â äèìåòèëñóëüôîêñèäå è 5 ìêë 500 ìÌ-HEPES ñ ðÍ 8,0, 1 ìÌ-õëîðèñòûé ìàãíèé. Äîáàâèâ 108 ìèêðîêþðè 32Ð-g-àäåíîçèíòðèôîñôîðíîé êèñëîòû, 5 Ñòðàíèöà: 7 RU 2 281 973 C2 5 10 15 ìêë 10 ìêÌ-àäåíîçèíòðèôîñôîðíîé êèñëîòû è 50 ìêë âîäû, ïðè 37°Ñ â òå÷åíèå 3 ÷ ïðîâîä ò èíêóáèðîâàíèå. Îïðåäåëåíèå àêòèâíîñòè Ïîäëîæêó (10 ìêë 32P-CheA) ñìåøèâàþò ñ 10 ìêë áóôåðà äë êîëè÷åñòâåííîãî àíàëèçà (100 ìÌ-òðèýòàíîëàìèí/ñîë íà êèñëîòà ñ ðÍ 8,0 ñ 0,1% 2-ìåðêàïòîýòàíîëà è 0,02% àçîòèñòîêèñëîãî íàòðè ) è ôåðìåíòíûì ðàñòâîðîì. Ðåàêöèþ îñóùåñòâë þò ïðè 37°Ñ â òå÷åíèå 30 ìèí. Çàòåì äîáàâë þò 2 ìêë 500 ìÌ-ýòèëåíäèàìèíòåòðàóêñóñíîé êèñëîòû è 126 ìêë ðàñòâîðà ìåòàíîë/àöåòîí â ñîîòíîøåíèè 1:1. Ïî çàâåðøåíèè öåíòðèôóãèðîâàíè (5 ìèí, 15,800 ã) îòäåë þò íàäîñàäî÷íóþ æèäêîñòü, â êîòîðîé çàòåì ñ ïîìîùüþ ñöèíòèëë öèîííîãî ñ÷åò÷èêà ïðîâîä ò âñå íåîáõîäèìûå èçìåðåíè . Òàêèì îáðàçîì, îïèñàííóþ ôîñôàòàçó îòëè÷àþò îò äðóãèõ ïðîòåèí-ôîñôàòàç, èñõîä èç 1) ñïåöèôè÷íîñòè ê ôîñôîãèñòèäèíó (Òàáëèöà 1), ãèñòèäèí-ôîñôàòàçà íå ãèäðîëèçîâàëà, íàïð., ð-íèòðîôåíèëôîñôàò; 2) ñîõðàíåíè àêòèâíîñòè, íåñìîòð íà âîçäåéñòâèå îêàäàåâîé êèñëîòû èëè âàíàäàòà, èíãèáèðóþùèõ àêòèâíîñòü îñòàëüíûõ ôîñôàòàç (Òàáëèöà 2); 3) çíà÷èòåëüíî áîëåå íèçêîé ìîëåêóë ðíîé ìàññû. Òàáëèöà 1 Ãèäðîëèç íîâîé ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçîé 20 Àçîêîëë - [γ- 32P] ÀÒÔ - ð-íèòðîôåíèëôîñôàò - [γ 32-P]Ser/Thr-êàçåèí - Tyr-õõõ - [γ- 32P] His-íóêëåîçèä-äèôîñôàò-êèíàçà - [γ- 32P] His-cheA + 25 Òàáëèöà 2 Ðåàãåíòû, âîçäåéñòâóþùèå íà àêòèâíîñòü ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû 30 35 40 Ðåàãåíò Êîíöåíòðàöè Àêòèâíîñòü (%) Ôîñôàò 10 ìÌ 0 Îêàäàåâà êèñëîòà 10 ìêÌ 108 Ìèêðîöèñòèí 5 íÌ 110 Òàóòîìèöèí 0,5 íÌ 90 Èíãèáèòîðíûé ïðîòåèí I1 1 íÌ 120 Ìîëèáäàò 10 ìêÌ 71 Âàíàäàò 10 ìêÌ 62 Ôòîðèä 5 ìÌ 105 ÝÄÒÓ 5 ìÌ 108 ÝÃÒÓ 5 ìÌ 91 Mg 2+ 1 ìÌ 142 Mg 2+ 10 ìÌ 226 Ñà 2+ 1 ìÌ 165 Ñà 2+ 10 ìÌ 240 100%=xxx íìîëü/ìèí õ ìã -1 45 50 (Â) ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈÅ ÃÈÑÒÈÄÈÍ-ÏÐÎÒÅÈÍ-ÔÎÑÔÀÒÀÇÛ Ñ ïîìîùüþ àíàëèçà ìåòîäîì ýëåêòðîôîðåçà â ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå äîäåöèëñóëüôàòîì íàòðè â î÷èùåííîé áåëêîâîé ôðàêöèè áûëà îáíàðóæåíà ÷åòêà ïîëîñà ñ ìîëåêóë ðíîé ìàññîé âíî 14,000 (Ôèã.4). Ïðîâåä àíàëèç ìàññ, ïîëó÷èëè ïðîòåèí ñ ìîëåêóë ðíîé ìàññîé 13,768 (Ôèã.5). Ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçà íà N-êîíöå áëîêèðóåòñ àöåòèëüíîé ãðóïïîé. Òàêèì îáðàçîì, ìåòîäîì ðàñùåïëåíè ïî Ýäìàíó äîñòóï ê èíôîðìàöèè, ñîäåðæàùåéñ â ïîñëåäîâàòåëüíîñòè, ïîëó÷èòü íåëüç . Èññëåäîâàòü ïðîòåèí ìîæíî òîëüêî â òîì ñëó÷àå, åñëè ïðîèñõîäèò ïðîòåîëèòè÷åñêèé ðàñïàä. (Ã) ÀÍÀËÈÒÈ×ÅÑÊÎÅ ÎÏÐÅÄÅËÅÍÈÅ ÏÐÎÒÅÈÍÀ Àêòèâíóþ ôðàêöèþ (Ôèã.4), ñ öåëüþ îïðåäåëåíè àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè, ïîäâåðãëè ôåðìåíòàòèâíîìó ðàñùåïëåíèþ. Ïîëó÷åííûå ïåïòèäíûå ôðàãìåíòû ñåêâåíèðîâàëè, ïðèìåí ðàñùåïëåíèå ïî Ýäìàíó è ìàññ-ñïåêòðîìåòðèþ (Kellner R., Ñòðàíèöà: 8 RU 2 281 973 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Lottspeich F., Meyer Í.Å. (1999) Microcharacterization of Proteins, Wiley-VCH). Ôåðìåíòàòèâíîå ðàñùåïëåíèå Ñ ïîìîùüþ ñêàëüïåë îòðåçàëè ïîëîñêó ãåë , êîòîðóþ ïîìåùàëè â òðóáêó Ýïïåíäîðôà. Ïðîöåññ ôåðìåíòàòèâíîãî ðàñùåïëåíè íà÷èíàëñ ïîñëå äîáàâëåíè òðèïñèíà â êà÷åñòâå ïðîòåàçû (1 ìêã òðèïñèíà, 100 ìêë 0,5 Ì-êèñëîãî óãëåêèñëîãî àììîíè , 37°Ñ, 12 ÷). Ïîëó÷åííûå ïåïòèäíûå ôðàãìåíòû ýêñòðàãèðîâàëè (50% òðèôòîðóêñóñíîé êèñëîòû, 50% àöåòîíèòðèëà). Ýêñòðàêò êîíöåíòðèðîâàëè â âàêóóìíîé öåíòðèôóãå. Õðîìàòîãðàôè÷åñêîå ðàçäåëåíèå ïåïòèäíûõ ôðàãìåíòîâ Ïåïòèäíûå ôðàãìåíòû ðàñòâîð ëè â ýëþåíòå À (0,1% òðèôòîðóêñóñíîé êèñëîòû â âîäå) è ðàçäåë ëè ìåòîäîì õðîìàòîãðàôèè ñ îáðàùåííîé ôàçîé (ýëþåíò Â: 20% 0,1%-íîé òðèôòîðóêñóñíîé êèñëîòû â âîäå, 80% àöåòîíèòðèëà).  ðåçóëüòàòå ôðàêöèîíèðîâàíè ñ îïðåäåëåíèåì ïðè ïîìîùè óëüòðàôèîëåòîâîãî èçëó÷åíè (äëèíà âîëíû 214 íì) (ñì. Ôèã.6) ðàçäåëåííûå ïåïòèäíûå ôðàãìåíòû ðàñòâîð ëèñü è îïðåäåë ëèñü ñ ïîìîùüþ ñåêâåíèðîâàíè ïî Ýäìàíó è ìàññ-ñïåêòðîìåòðèè. Îïðåäåëåíèå ìåòîäàìè ñåêâåíèðîâàíè ïî Ýäìàíó è ìàññ-ñïåêòðîìåòðèè Ïî çàâåðøåíèè õðîìàòîãðàôè÷åñêîãî ðàçäåëåíè ñ 90% æèäêèõ ôðàêöèé ïðîâåëè ñåêâåíèðîâàíèå ïî Ýäìàíó (ñòàíäàðòíûå óñëîâè , ïðèáîð: ìîäåëü 494, PE-Applied Biosystems, Âàéòåðøòàäò). Îñòàëüíûå ôðàêöèè ïðîøëè àíàëèç ìàññ (MALDI-MS), (ïðèáîð: Voyager STR, Perseptive Biosystems, Âèñáàäåí). Èäåíòèôèöèðîâàííûå ïåïòèäíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè Áûëè îïðåäåëåíû ñëåäóþùèå ïåïòèäíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè (êðîëèê): AAAGLAQIPD VDIDSDGVFK YVLIR VHAAPPSEAPGGESK DIVR WAEYHADIYDK VSGELQK ISHQSQDR KIHVYGYSMGYGR YPDYEVTWADDGY Ýòè ïåïòèäû ñîñòàâë þò ïåïòèä ôåðìåíòà êðîëèêà (SEQ. ¹6): (Ä) Ñåêâåíèðîâàíèå íóêëåîòèäà Ñ ïîìîùüþ ïðàéìåðîâ, êîòîðûå âûáèðàëè èç ïîëó÷åííîé àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè äë íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû, ïðîâåëè ñêðèíèíã áèáëèîòåêè ÄÍÊ êðîëèêà.  ðåçóëüòàòå êëîíèðîâàíè è ñåêâåíèðîâàíè áûëà èäåíòèôèöèðîâàíà íóêëåîòèäíà ïîñëåäîâàòåëüíîñòü, ïðèâåäåííà íà Ôèã.7à. 327 îñíîâ ñîîòâåòñòâóþò ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ïðîòåèíà ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû, íà÷èíàþùåéñ â ïîëîæåíèè 11-119 (Ôèã.7á). Ïîèñê â áàçå äàííûõ Ïîèñê â áàçå äàííûõ îñóùåñòâë ëè, èñïîëüçó àëãîðèòì BLAST. Ïðîòåèíû â áàçàõ äàííûõ ïðîòåèíîâ èäåíòèôèöèðîâàëè èç C.elegans, Drosophila melanogaster, Drosophila pseudoobscura. Ïóòè ÝÒÑ (ýóêàðèîòíîé òðàíñäóêöèè ñèãíàëà) â áàçàõ äàííûõ íóêëåîòèäîâ èäåíòèôèöèðîâàëè â ÷åëîâåêå, êðûñå è ìûøè. ×åëîâå÷åñêèé ãîìîëîã ïîêà íå îïóáëèêîâàí. Èñõîä èç ñòðóêòóðû ýòèõ ïóòåé ÝÒÑ, ïðîòåèí ÷åëîâåêà ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçà èìååò ñëåäóþùóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü (SEQ. No 2 áåç ìåòèîíèíîâîãî îñòàòêà): 50 Ãîìîëîã êðûñû åùå íå îïóáëèêîâàí. Èñõîä èç ñòðóêòóðû ýòèõ ïóòåé ÝÒÑ, ïðîòåèí êðûñû ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçà èìååò ñëåäóþùóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü (SEQ. ¹7): Ñòðàíèöà: 9 RU 2 281 973 C2 5 Ãîìîëîã ìûøè åùå íå îïóáëèêîâàí. Èñõîä èç ñòðóêòóðû ýòèõ ïóòåé ÝÒÑ, ïðîòåèí ìûøè ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçà èìååò ñëåäóþùóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü (SEQ. ¹8): Òàáëèöà 3 Ãîìîëîãè ïîñëåäîâàòåëüíîñòè äë ïðîòåèíà ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû èç ðàçëè÷íûõ áèîëîãè÷åñêèõ âèäîâ, âûðàæåííà â % èäåíòè÷íîñòè 10 1 ÷åëîâåê 2 êðîëèê 3 ìûøü 1 2 3 4 5 6 7 100 84,0 65,3 64,3 68,2 38,0 40,3 100 72,4 71,4 71,0 36,0 42,0 100 67,3 52,7 32,7 33,3 4 êðûñà 100 5 ïîëîñàòûé äàíèî 15 6 c.elegans 7 äðîçîôèëà 20 25 30 35 40 45 50 51,6 30,8 29,5 100 33,7 42,1 100 39,7 100 (Å) ËÎÊÀËÈÇÀÖÈß ÏÐÎÒÅÈÍΠè èõ ðàñïðåäåëåíèå â òêàíè Ãåí ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû ÷åëîâåêà ëîêàëèçóþò â õðîìîñîìå 9 (9q33-Tel, ìàðêåð sts-N90764, èíòåðâàë D9S159-qTEL).  êà÷åñòâå èñòî÷íèêîâ ýêñïðåññèè êÄÍÊ èñïîëüçîâàëè: ãîëîâíîé ìîçã, ãðóäíóþ æåëåçó, öåíòðàëüíóþ íåðâíóþ ñèñòåìó, òîëñòóþ êèøêó, êðàéíþþ ïëîòü, çàðîäûøåâóþ êëåòêó, ñåðäöå, ïî÷êó, ïå÷åíü, ëåãêîå, ìûøöó, ïîäæåëóäî÷íóþ æåëåçó, îêîëîùèòîâèäíóþ æåëåçó, pooled, ïðîñòàòó, ñåëåçåíêó, è÷êî, ùèòîâèäíóþ æåëåçó, ìèíäàëåâèäíóþ æåëåçó, ìàòêó, âåñü çàðîäûø. Ïðîâåä àíàëèç ðàñïðåäåëåíè ìÐÍÊ ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû, íàèáîëüøèé åå óðîâåíü îáíàðóæèëè â íîðìàëüíûõ òêàí õ, òàêèõ êàê ñåðäöå, ïî÷êà, ïå÷åíü, ïîäæåëóäî÷íà æåëåçà, ñêåëåòíà ìûøöà è è÷êî (Ôèã.9à, á). (Æ) Àíòèòåëà ê ãèñòèäèí-ôîñôàòàçå Àíòèòåëà ê ãèñòèäèí-ôîñôàòàçå äîëæíû îáåçâðåæèâàòü òðè îòäåëüíûå çîíû ýòîãî ïðîòåèíà, à èìåííî n-êîíöåâîé, ñðåäíèé è ñ-êîíöåâîé ôðàãìåíòû ìîëåêóëû.  êà÷åñòâå òàêèõ çîí èçáðàëè òðè ïåïòèäíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè: ïåïòèä 1 - QIPDVDIDSD GVFKYV (16àà, SEQ. ¹9); ïåïòèä 2 - CLGGGRISHQ SQDK (14aa, SEQ. ¹10); ïåïòèä 3 - CTEKIKAKYP DYEV (14aa, SEQ. ¹11). Ýòè ïåïòèäû ñèíòåçèðîâàëè, èñïîëüçó ñòàíäàðòíóþ õèìèþ ÔÌÎÊ. Ñ öåëüþ èììóíèçàöèè êàæäûé èç ïåïòèäîâ âïðûñêèâàëè (4 èíúåêöèè) äâóì êðîëèêàì. Äåëàëè ÷åòûðå àíàëèçà êðîâè (â ïîñëåäíèé ðàç ÷åðåç ïðèáëèçèòåëüíî 3 ìåñ öà). Îáðàçîâàâøèåñ àíòèòåëà ñïîñîáíû âû âë òü è ëîêàëèçîâàòü ãèñòèäèí-ôîñôàòàçó. Êðîìå òîãî, èìååòñ âîçìîæíîñòü èññëåäîâàíè ðàçëè÷íûõ çîí ìîëåêóëû ïî îòäåëüíîñòè.  ÷àñòíîñòè, ïðåäïîëàãàåòñ , ÷òî öåíòðàëüíûé ôðàãìåíò ãèñòèäèíôîñôàòàçû, îòëè÷àþùèéñ âûñîêîé êîíñåðâàòèâíîñòüþ è ñîäåðæàùèé ñëåäóþùóþ àìèíîêèñëîòíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü: DCECLGGGRISHQSQD (SEQ. ¹3), âêëþ÷àåò àêòèâíûé öåíòð, îòâåòñòâåííûé çà ôóíêöèè ïðîòåèíîâ in vivo. Àíòèòåëî ê ïåïòèäó äîëæíî îáåçâðåæèâàòü ýòó çîíó, èíãèáèðó è íåéòðàëèçó åå. Âîò âêðàòöå õàðàêòåðèñòèêè ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû: 1. Àìèíîêèñëîòíà ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû ÷åëîâåêà ñîäåðæèò îêîëî 124 àìèíîêèñëîò. 2. Àìèíîêèñëîòíà ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû õàðàêòåðèçóåòñ âûñîêîé ãîìîëîãèåé â Ñ-êîíöåâîì ôðàãìåíòå â îòëè÷èå îò òàêîâîãî N-êîíöà, ãäå ãîìîëîãè âåñüìà ñëàáà. 3. Ìîëåêóë ðíà ìàññà ñîñòàâë åò 13,800 +/-100 (Ôèã.5). Ñòðàíèöà: 10 RU 2 281 973 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 4.  N-êîíöå ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçà áëîêèðóåòñ àöåòèëèðîâàíèåì. Ôàðìàöåâòè÷åñêèå ïðåïàðàòû Íàòèâíûé (-íûå), à òàêæå ðåêîìáèíàíòíûé (-íûå) ïðîòåèí (-íû), ìîæåò (-ãóò) ïðèìåí òüñ â êà÷åñòâå ëåêàðñòâà, ïðèíèìàòü êîòîðîå ïàöèåíòû ìîãóò êàê òàêîâîå ëèáî â ñîñòàâå ôàðìàöåâòè÷åñêèõ êîìïîçèöèé. Òàêèì îáðàçîì, î÷åðåäíîé öåëüþ íàñòî ùåãî èçîáðåòåíè âë åòñ ïîëó÷åíèå îïèñàííîãî âûøå è ïðèâîäèìîãî íèæå ïî òåêñòó ðåêîìáèíàíòíîãî èëè íàòèâíîãî ïðîòåèíà, êîòîðûé ìîæíî áûëî áû ïðèìåí òü â êà÷åñòâå ëåêàðñòâà, è ïðèãîòîâëåíèå ñîîòâåòñòâóþùåé ôàðìàöåâòè÷åñêîé êîìïîçèöèè, ñîäåðæàùåé óïîì íóòûé ïðîòåèí è åãî ôàðìàöåâòè÷åñêè ïðèåìëåìûé ðàñòâîðèòåëü, íîñèòåëü èëè ýêñöèïèåíò.  ñîñòàâ ôàðìàöåâòè÷åñêèõ êîìïîçèöèé ïî äàííîìó èçîáðåòåíèþ ìîæåò âõîäèòü öåëûé ð ä äîïîëíèòåëüíûõ àêòèâíûõ ôàðìàöåâòè÷åñêèõ ñîåäèíåíèé. Òåðìèí "ôàðìàöåâòè÷åñêè ïðèåìëåìûé íîñèòåëü" â êîíòåêñòå íàñòî ùåãî îïèñàíè îáîçíà÷àåò èíåðòíûé, íåòîêñè÷íûé òâåðäûé èëè æèäêèé íàïîëíèòåëü, ðàñòâîðèòåëü ëèáî âåùåñòâî, îáðàçóþùåå îáîëî÷êó êàïñóëû, êîòîðîå íå ðåàãèðóåò ñ àêòèâíûì ñîåäèíåíèåì è íå ìîæåò ïîâðåäèòü ïàöèåíòó. Ïîäõîä ùèå â ïðåäïî÷òèòåëüíîì âàðèàíòå æèäêèå íîñèòåëè øèðîêî èçâåñòíû â äàííîé îáëàñòè. Òàêèìè íîñèòåë ìè ìîãóò ñëóæèòü ñòåðèëüíà âîäà, ñîëü, âîäíà äåêñòðîçà, ñàõàðíûå ðàñòâîðû, ýòàíîë, ãëèêîëè è ìàñëà, âêëþ÷à òàêîâûå æèâîòíîãî èëè ðàñòèòåëüíîãî ïðîèñõîæäåíè , ïîëó÷àåìûå â ðåçóëüòàòå ïåðåðàáîòêè íåôòè ëèáî ñèíòåòè÷åñêèå, íàïðèìåð àðàõèñîâîå ìàñëî, ñîåâîå ìàñëî è ìèíåðàëüíîå ìàñëî. Ñîåäèíåíè ïî íàñòî ùåìó èçîáðåòåíèþ ìîæíî ââîäèòü êàê ðàçîâûå äîçû, ñîäåðæàùèå îáû÷íûå íåòîêñè÷íûå ôàðìàöåâòè÷åñêè ïðèåìëåìûå íîñèòåëè, ðàñòâîðèòåëè, àäúþâàíòû è ñâ çóþùèå, òèïè÷íûå äë ïàðåíòåðàëüíîãî ïðèìåíåíè . Ïîä òåðìèíîì "ïàðåíòåðàëüíûé" â êîíòåêñòå íàñòî ùåãî îïèñàíè ïîäðàçóìåâàþòñ ïîäêîæíà , âíóòðèâåííà , âíóòðèñóñòàâíà è âíóòðèòðàõåàëüíà èíúåêöèè, à òàêæå âëèâàíè . Êðîìå òîãî, ïðèåìëåìû äðóãèå ñïîñîáû ïðèìåíåíè , òàêèå êàê îðàëüíîå è ìåñòíîå. Êîìïîçèöèè è êîìáèíèðîâàííûå ïðåïàðàòû äë ïàðåíòåðàëüíîãî ïðèìåíåíè â íàèáîëåå ïðåäïî÷òèòåëüíîì âàðèàíòå ââîä ò âíóòðèâåííî â ôîðìå áîëþñà èëè â êà÷åñòâå ïîñòî ííûõ ôóçèé, ïîëüçó ñü ïðè ýòîì èçâåñòíûìè ìåòîäàìè. Òàáëåòêè è êàïñóëû, ïðåäíàçíà÷åííûå äë îðàëüíîãî ââåäåíè , ñîäåðæàò îáû÷íûå ýêñöèïèåíòû, òàêèå êàê ñâ çóþùèå âåùåñòâà, íàïîëíèòåëè, ðàñòâîðèòåëè, àãåíòû òàáëåòèðîâàíè , ñìàçî÷íûå ìàòåðèàëû, âåùåñòâà, ñïîñîáñòâóþùèå îñâîáîæäåíèþ äåéñòâóþùåãî íà÷àëà, è ïîâåðõíîñòíî-àêòèâíûå âåùåñòâà. Ñ ïîìîùüþ øèðîêî èçâåñòíûõ â äàííîé îáëàñòè ìåòîäîâ òàáëåòêè ìîæíî ïîêðûâàòü îáîëî÷êîé. Æèäêèå ïðåïàðàòû äë îðàëüíîãî ïðèìåíåíè ìîãóò èìåòü ôîðìó âîäíûõ èëè ìàñë íûõ ñóñïåíçèé, ðàñòâîðîâ, ýìóëüñèé, ñèðîïîâ ëèáî ýëèêñèðîâ èëè âûïóñêàòüñ â êà÷åñòâå ñóõîãî ïðîäóêòà, êîòîðûé ïåðåä ïðèìåíåíèåì ñëåäóåò äîâåñòè äî íåîáõîäèìîé êîíñèñòåíöèè, äîáàâèâ âîäó ëèáî èíîå ïîäõîä ùåå ñâ çóþùåå. Ïîäîáíûå æèäêèå ïðåïàðàòû ìîãóò ñîäåðæàòü îáû÷íûå äîáàâêè, òàêèå êàê ñóñïåíäèðóþùèå àãåíòû, ýìóëüãàòîðû, íåâîäíûå ñâ çóþùèå è ïðîòèâîñòàðèòåëè. Ïðåïàðàòû äë ìåñòíîãî ïðèìåíåíè ìîãóò èìåòü ôîðìó âîäíûõ èëè ìàñë íûõ ñóñïåíçèé, ðàñòâîðîâ, ýìóëüñèé, ãåëåé ëèáî, ÷òî âë åòñ ïðåäïî÷òèòåëüíûì, ýìóëüñèîííûõ ìàçåé. Ðàçîâûå äîçû ïî íàñòî ùåìó èçîáðåòåíèþ ìîãóò ñîäåðæàòü äíåâíûå êîëè÷åñòâà ïðîòåèíà ïî äàííîìó èçîáðåòåíèþ èëè åãî äîëüíûå åäèíèöû, ñîñòàâë þùèå íåîáõîäèìóþ äîçó. Êàêà äîçèðîâêà áóäåò îïòèìàëüíîé äë òîãî èëè èíîãî ïàöèåíòà (ìëåêîïèòàþùèå, â òîì ÷èñëå ÷åëîâåê), çàâèñèò îò öåëîãî ð äà ôàêòîðîâ, òàêèõ êàê àêòèâíîñòü ïðèìåí åìîãî äåéñòâóþùåãî âåùåñòâà, âîçðàñò, ìàññà òåëà, îáùåå ñîñòî íèå çäîðîâü , ïîë, äèåòà, âðåì è ñïîñîá ââåäåíè , ñêîðîñòü âûâåäåíè , àêòèâíîñòü ôåðìåíòà (åäèíèöû/ìã ïðîòåèíà), öåëü ïðèìåíåíè ïðåïàðàòà, ò.å. ïðåäíàçíà÷åí ëè îí äë òåðàïèè ëèáî ïðîôèëàêòè÷åñêîãî ëå÷åíè , à òàêæå õàðàêòåð çàáîëåâàíè . Òàêèì îáðàçîì, ôàðìàöåâòè÷åñêè ýôôåêòèâíà äíåâíà äîçà ïðîòåèíà ïî íàñòî ùåìó èçîáðåòåíèþ â êîìïîçèöè õ è êîìáèíèðîâàííûõ ïðåïàðàòàõ â îðãàíèçìå ïàöèåíòà (in vivo) ñîñòàâë åò îêîëî 0,01-100 ìã/êã (èñõîä èç óäåëüíîé àêòèâíîñòè 100 êÅä/ìã), ïðåäïî÷òèòåëüíî îò 0,1 äî 10 ìã/êã ìàññû òåëà.  çàâèñèìîñòè îò ôîðìû ïðèìåíåíè îäíà Ñòðàíèöà: 11 RU 2 281 973 C2 5 10 15 20 25 30 äîçà ìîæåò ñîäåðæàòü îò 0,5 äî 10 ìã ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû. Êðàòêîå îïèñàíèå ôèãóð Ôèã.1: Ñõåìà î÷èñòêè, èñïîëüçóåìà ñ öåëüþ âûäåëåíè ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû Ôèã.2: Èäåíòèôèêàöè íåîðãàíè÷åñêîãî ôîñôàòà êàê ïðîäóêòà ðåàêöèè ðàñùåïëåíè ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû. Ïðèìåí åòñ ìåòîä òîíêîñëîéíîé õðîìàòîãðàôèè íà ïëàíøåòàõ (ïîëèýòèëåíèìèííà öåëëþëîçà, 0,8 M-LiCl); ñëåâà: îáíàðóæåíèå ñ èñïîëüçîâàíèåì ìîëèáäåíîâîêèñëîãî àììîíè ; ñïðàâà: îáíàðóæåíèå ìåòîäîì àâòîðàäèîãðàôèè; 1: [ 32P] his-cheA, 2: ïðîäóêò ðåàêöèè, 3: ÀÒÔ, 1-3: ôîñôàò (NaH2PO4) Ôèã.3: Äåôîñôîðèëèðîâàíèå ïîäëîæêè cheA, çàâèñ ùåå îò âðåìåíè è ïðîòåèíà; ñëåâà: äåñòðóêöè ÷åðåç 0, 20 è 40 ìèí, ñïðàâà: âûõîä ìå÷åíîãî ðàäèîèçîòîïîì ôîñôàòà (ëåâà îñü ó: %, ïðàâà îñü ó: ðàäèîàêòèâíîñòü) äë ðàçëè÷íûõ êîëè÷åñòâ ïîäëîæêè (îñü õ: íã ïðîòåèíà) Ôèã.4: Àíàëèç ôðàêöèè ñ àêòèâíîé ãèñòèäèí-ôîñôàòàçîé (ýëåêòðîôîðåç â ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå äîäåöèëñóëüôàòîì íàòðè ); ÀÔ: àêòèâíà ôðàêöè ; 1,2: BSA (ñûâîðîòî÷íûé àëüáóìèí êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà) (1 ìêã, 0,5 ìêã), 3: ÀÔ; 4,5: ìîëåêóë ðíûå ìàðêåðû Ôèã.5: Àíàëèç ìàññ ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû. Îñü ó: îòñ÷åò, îñü õ: ìàññà (m/z) Ôèã.6: Ðàçäåëåíèå ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû ìåòîäîì õðîìàòîãðàôèè ñ îáðàùåííîé ôàçîé ïî çàâåðøåíèè ôåðìåíòàòèâíîãî ðàñùåïëåíè ; ýëþåíò À: 0,1%-íà òðèôòîðóêñóñíà êèñëîòà â âîäå è ýëþåíò Â: 20% 0,1%-íîé òðèôòîðóêñóñíîé êèñëîòû â âîäå, 80% àöåòîíèòðèëà; îïðåäåëåíèå ïðè ïîìîùè óëüòðàôèîëåòîâîãî èçëó÷åíè , äëèíà âîëíû 214 íì Ôèã.7à: (×àñòè÷íà ) íóêëåîòèäíà ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû êðîëèêà Ôèã.7á: Òðàíñëèðîâàííà ïîëíà àìèíîêèñëîòíà ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ãèñòèäèíïðîòåèí-ôîñôàòàçû êðîëèêà Ôèã.8à: Ðàñïðåäåëåíèå ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû â ëèíèè îïóõîëåâûõ êëåòîê Ôèã.8á: Ðàñïðåäåëåíèå ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû â îïóõîëåâîé òêàíè (î. ò. îïóõîëåâà òêàíü, â. ê. - âîñïàëèòåëüíûé êîíãëîìåðàò) Ôèã.8â: Ðàñïðåäåëåíèå ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû â íîðìàëüíîé òêàíè Ïåðå÷åíü ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé ïðèâåäåí â êîíöå îïèñàíè . 35 40 45 50 Ñòðàíèöà: 12 RU 2 281 973 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Ñòðàíèöà: 13 RU 2 281 973 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Ñòðàíèöà: 14 RU 2 281 973 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Ñòðàíèöà: 15 RU 2 281 973 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Ñòðàíèöà: 16 RU 2 281 973 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Ñòðàíèöà: 17 RU 2 281 973 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Ôîðìóëà èçîáðåòåíè 1. Âûäåëåííûé ïîëèïåïòèä, îáëàäàþùèé áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ ãèñòèäèíôîñôàòàçû, èìåþùèé ìîëåêóë ðíóþ ìàññó 13,800+/-100, îïðåäåëåííóþ ìàñññïåêòðîìåòðè÷åñêè, êîòîðûé ïîëó÷àþò ïóòåì îñóùåñòâëåíè ïîñëåäîâàòåëüíûõ ýòàïîâ âûäåëåíè èç ëèçàòîâ òêàíè ìëåêîïèòàþùåãî, âêëþ÷àþùèõ àíèîíîîáìåííóþ õðîìàòîãðàôèþ, ãåëü-ôèëüòðàöèþ è àôôèííóþ õðîìàòîãðàôèþ. 2. Ïîëèïåïòèä ïî ï.1, ñîäåðæàùèé, ïî ìåíüøåé ìåðå, îñíîâíîé ôðàãìåíò àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè DCECLGGGRISHQSQD. 3. Ïîëèïåïòèä ïî ï.1, ñîäåðæàùèé, ïî ìåíüøåé ìåðå, îñíîâíîé ôðàãìåíò àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè DCECLGGGRISHQSQDX 1KIHVYGYSMX 2YGX 3AQH, â êîòîðîì Õ 1=Ê èëè R, Õ 2=À ëèáî G è Õ 3=Ð èëè R. 4. Ïîëèïåïòèä ïî ï.1, ñîäåðæàùèé, ïî ìåíüøåé ìåðå, îñíîâíîé ôðàãìåíò àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè YHADIYDKVSGDMQKQCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSM. 5. Ïîëèïåïòèä, îáëàäàþùèé áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû, îòëè÷àþùèéñ âûñîêîé ñïåöèôè÷íîñòüþ ê ôîñôîãèñòèäèíó è èìåþùèé ìîëåêóë ðíóþ ìàññó 13,000-15,000, è ñîäåðæàùèé ñëåäóþùóþ àìèíîêèñëîòíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü: (M)AVADLALIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHSAPRSGAPAAESKEIVRGYKWAEYHADIYDKVSGD MQKQGCDCECLGGGRISHQSQDKKIHVYGYSMAYGPAQHAISTEKIKAKYPDYEVTWANDGY. 6. Ïîëèïåïòèä, îáëàäàþùèé áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ ãèñòèäèí-ôîñôàòàçû, îòëè÷àþùèéñ âûñîêîé ñïåöèôè÷íîñòüþ ê ôîñôîãèñòèäèíó è èìåþùèé ìîëåêóë ðíóþ ìàññó 13,000-15,000, àìèíîêèñëîòíà ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êîòîðîãî íà 64-99% ãîìîëîãè÷íà ïîñëåäîâàòåëüíîñòè, ïðèâåäåííîé â ï.5. 7. Ïîëèïåïòèä ïî ï.6, ñîäåðæàùèé ñëåäóþùóþ àìèíîêèñëîòíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü: AAAGLAQIPDVDIDSDGVFKYVLIRVHAAPPSEAPGGESKDIVRGYKWAEYHADIYDKVSGEL QKKGHDCECLGGGRISHQSQDRKIHVYGYSMGYGRAQHSVSTEKIRAKYPDYEVTWADDGY. 8. Ïîëèíóêëåîòèä, ïî ñóùåñòâó, õàðàêòåðèçóþùèéñ ïîëèíóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòüþ, êîäèðóþùåé ïîëèïåïòèä ïî ï.7. 9. Ïîëèíóêëåîòèä, ïî ñóùåñòâó, õàðàêòåðèçóþùèéñ ïîëèíóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòüþ, êîäèðóþùåé ÷åëîâå÷åñêèé ïîëèïåïòèä ïî ï.5. 10. Ôàðìàöåâòè÷åñêèé ïðåïàðàò, ïðèìåí åìûé ïðè ïàòîëîãè÷åñêèõ ñîñòî íè õ, ñâ çàííûõ ñ íàðóøåíèåì ôóíêöèè ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû, ñîäåðæàùèé ôàðìàöåâòè÷åñêè ýôôåêòèâíîå êîëè÷åñòâî ãèñòèäèí-ïðîòåèí-ôîñôàòàçû ïî ïï.1-7, êîòîðîå ñîñòàâë åò îò 0,01 äî 100 ìã/êã ïîëèïåïòèäà íà âåñ òåëà. 11. Àíòèòåëî ê ïåïòèäó, êîòîðîå âûðàáàòûâàåòñ â ðåçóëüòàòå èììóíèçàöèè ïîëèïåïòèäàìè, âûáðàííûìè èç ãðóïïû ïîëèïåïòèäîâ ñ ïîñëåäîâàòåëüíîñò ìè Seq. No 3, 9, 10 èëè 11. Ïðèîðèòåò â ÷àñòè ïðèçíàêîâ ïï.3, 5-11 óñòàíîâëåí îò 04.03.1999, â ÷àñòè äðóãèõ ïðèçíàêîâ îò 02.03.2000. Ñòðàíèöà: 18 CL RU 2 281 973 C2 Ñòðàíèöà: 19 DR RU 2 281 973 C2 Ñòðàíèöà: 20 RU 2 281 973 C2 Ñòðàíèöà: 21 RU 2 281 973 C2 Ñòðàíèöà: 22 RU 2 281 973 C2 Ñòðàíèöà: 23 RU 2 281 973 C2 Ñòðàíèöà: 24 RU 2 281 973 C2 Ñòðàíèöà: 25