ВВЕДЕНИЕ В СПЕКТРАЛЬНЫЙ И ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
КАФЕДРА МЕДИЦИНСКОЙ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ
В.Г. ЛЕЩЕНКО
ВВЕДЕНИЕ
В СПЕКТРАЛЬНЫЙ И
ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ
Учебно–методическое пособие
МИНСК 2002
УДК 577.3 (075.8)
ББК 28.071я73
Л54
А в т о р: канд. физ.-мат. наук, доцент В.Г. Лещенко.
Р е ц е н з е н т ы : профессор кафедры биохимии БГМУ, д-р мед. наук А.Д.
Таганович;
доцент кафедры общей химии БГМУ, канд. хим. наук С.В.Ткачев.
Утверждено Научно-методическим советом университета
в качестве учебно-методического пособия 27.02.2002 г., протокол №
.
Лещенко В.Г.
Введение в спектральный и люминесцентный анализ: Учеб.-метод. пособие / В.Г. Лещенко.-Мн.: БГМУ, 2002.– 37 с.
ISBN 000-000-000-0
Рассматривается взаимодействие электромагнитного излучения с веществом, устанавливаются основные законы поглощения света, рассматриваются
методы его описания и регистрации, методы определения концентрации поглощающих веществ в растворах. Основное внимание уделено взаимосвязи
атомных и молекулярных спектров веществ с энергетическими состояниями
их атомов и молекул. Подробно рассмотрено формирование спектров поглощения и испускания атомарного водорода, приводится классификация молекулярных спектров и их применение в медико-биологических исследованиях.
Рассматривается также люминесценция атомов и молекул, приводится ее
классификация по длительности и по способам возбуждения, определяются
основные характеристики и законы люминесценции, приводятся примеры использования люминесцентного анализа в медицине и молекулярной биологии.
Учебно-методическое пособие предназначено для студентов 1 курса медицинских Вузов всех факультетов.
УДК 577.3 (075.8)
ББК 28.071я73
2
ISBN 000-000-000-0
© Белорусский государственный
медицинский университет, 2002
ВВЕДЕНИЕ
Электромагнитное излучение инфракрасного, видимого и ультрафиолетового диапазонов взаимодействует с любыми веществами, в том числе и с биообъектами, и изучение этих взаимодействий дает важную информацию как о
молекулярной структуре этих объектов, так и о и процессах, происходящих в
них на атомном и молекулярном уровнях.
Если электромагнитное излучение проходит через вещество, то часть этого излучения поглощается, причем на разных частотах (длинах волн) поглощается разное количество электромагнитной энергии. Зависимость показателя
поглощения вещества от частоты или длины волны излучения называют
спектром поглощения (абсорбционным спектром) этого вещества.
Вместе с тем, любое вещество при определенных условиях способно излучать электромагнитные волны и имеет свой определенный спектр испускания.
Зависимость интенсивности электромагнитного излучения вещества от
частоты или длины волны называется спектром испускания (эмиссионным
спектром) этого вещества.
Спектры испускания и поглощения у каждого вещества строго индивидуальны и являются как бы его ''паспортом'', поэтому, зарегистрировав спектр
излучения или поглощения вещества или смеси веществ, можно определить
и вид вещества, состав и процентное содержание компонентов смеси, т.е.
провести и качественный и количественный спектральный анализ, что часто
используется не только в физике, но и в аналитической и биологической химии.
Спектры, лежащие в ультрафиолетовом, видимом и инфракрасном диапазонах называют оптическими спектрами. Спектры атомов и молекул отражают их энергетические состояния (энергию связей), поэтому оптические спектры веществ весьма чувствительны к изменению химических связей атомов и
3
молекул, к изменению их окружения, pH среды, к воздействию внешних электрических и магнитных полей и др.
По этим причинам спектральный анализ является одним из важнейших неразрушающих методов исследования как структуры вещества, так
и физических и химических процессов, происходящих в этом веществе на
атомном и молекулярном уровнях и широко используется как метод исследования в биохимии, молекулярной биологии и медицине.
1.Спектральные приборы.
Регистрация оптических спектров производится с помощью спектральных
приборов, которые в основном бывают двух типов: призменные и дифракционные. В первом случае разложение излучения в спектр осуществляется стеклянной или кварцевой призмой благодаря явлению дисперсии света. Во втором
случае используется явление дифракции света на дифракционной решетке с
большим числом штрихов на 1 мм (от 600 до 1800 штр/мм).
5
4
6
3
1
2
7
Кр
спектр
Ф
Рис.1. Схема призменного спектрального прибора.
1 – источник излучения, 2 - поглощаюший образец ,
3 – входная щель прибора, 4 – коллиматорная линза,
5 – призма, 6 – камерная линза, 7 – фокальная плоскость
камерной линзы.
4
На Рис.1 представлена схема призменного спектрального прибора в режиме регистрации спектров поглощения вещества. Свет от источника 1,
имеющего в этом случае сплошной спектр излучения, проходит через исследуемый поглощающий образец 2 и падает на узкую входную щель 3 спектрального прибора. Линза 4 преобразует излучение, идущее от щели, в параллельный
пучок, который затем падает на прозрачную призму 5. Вследствие дисперсии
света в призме лучи с разной длиной волны преломляются ею на разные углы
сначала на первой, а затем и на второй гранях призмы, причем с увеличением
длины волны угол отклонения луча призмой уменьшается. Но все лучи с одинаковой длиной волны остаются параллельными между собой и собираются
второй линзой 6 в одну точку (точнее, в вертикальную узкую полоску) в ее
фокальной плоскости 7. Излучения разных длин волн собираются в разных точках фокальной плоскости, в результате чего в плоскости 7 наблюдается спектр
поглощения вещества в виде темных или серых линий и полос на фоне цветного сплошного спектра источника излучения ( см Рис 2.).
λ
Рис.2. Вид спектра поглощения некоторого вещества в спектроскопе:
на фоне сплошного спектра излучения источника видны темные линии
поглощения исследуемого вещества.
λ
Рис. 3. Вид спектра испускания в спектроскопе: на темном фоне
видны яркие линии испускания вещества.
I
5
λ
Рис. 4. Спектр испускания того же вещества, полученный методом фотоэлектрической регистрации (зависимость интенсивности излучения от длины волны).
При регистрации спектров испускания в качестве источника 1 используют свечение самого исследуемого вещества (поглощающий образец 2 в этом
случае отсутствует), и в плоскости 7 наблюдают исследуемый спектр (см. Рис.3
и 4).
1.2. Типы спектральных приборов.
В зависимости от способа регистрации полученного спектра и его дальнейшего использования спектральные приборы можно подразделить на следующие типы:
 Спектроскопы – предназначены для визуального наблюдения
спектров, главным образом при экспресс-анализе веществ. В этом
случае в плоскости 7 прибора ставится полупрозрачный экран (матированная стеклянная пластинка), на котором и наблюдается
спектр вещества в виде, представленном на Рис. 2 или 3.
 Спектрографы – предназначены для регистрации спектров на бумаге, фотопленках или фотопластинках. При фотографической регистрации спектров в плоскости 7 прибора размещается фотоматериал, на который и регистрируется исследуемый спектр (см. Рис.2 и
3).
 Монохроматоры – предназначены для выделения узкого спектрального диапазона (определенной длины волны) из наблюдаемого
6
спектра, для этого в плоскости 7 прибора помещается узкая выходная щель. Перемещая эту щель вдоль фокальной плоскости 7 или
смещая спектр относительно нее (вращением призмы 5) можно выделить необходимую длину волны, т.е. получить монохроматичное излучение. Эта схема используется также для фотоэлектрической регистрации спектров (см. Рис.4).
 Фотоэлектроколориметры – предназначены для измерения оптической плотности окрашенных растворов на определенных длинах
волн (обычно для последующего определения концентрации поглощающего вещества), схема и принцип работы их рассмотрены
ниже.
2. Законы поглощения света.
В этом разделе под светом мы будем понимать электромагнитное излучение оптического диапазона, т.е. не только видимое глазом излучение, но также излучение ультрафиолетового и инфракрасного диапазонов.
Явление поглощения такого излучения веществом хорошо изучено. Так,
экспериментально установлено, что при прохождении излучения через тонкий
поглощающий слой интенсивность его изменяется на величину ∆I, которая
прямо пропорциональна толщине ∆х этого слоя и интенсивности I падающего
на него излучения (см.Рис.5):
∆I = – k I ∆х,
где k - коэффициент пропорциональности, а знак « – » указывает на уменьшение интенсивности излучения после прохождения через слой.
соотношение как дифференциальное
∆х
Iпрош
I0
I
Записывая это
уравнение:
I+∆I
dI = - kIdх ,
и решая его: dI/I = - kdх,
x
7
Рис. 5. Прохождение света
через поглощающее вещество
∫ dI/I = - k ∫dх,
ln I = - kx + ln C,
получим сначала общее решение:
I = Ce - kx ,
а затем и частное решение, пользуясь тем, что I=I0 при х=0, откуда следует,
что C = I0 .
В результате окончательно получаем закон поглощения света,
связывающий интенсивность I излучения, прошедшего через слой вещества
толщиной х, и интенсивность I0 падающего на него излучения:
I = I0 e – kx ,
(1)
который известен как закон Бугера - Ламберта.
Поглощающие свойства вещества здесь полностью определяются величиной k, которая называется показателем поглощения и является одной из
важнейших оптических характеристик вещества, измеряется в обратных метрах (м–1 ) или обратных сантиметрах (см–1). Величина показателя поглощения k
зависит от длины волны λ падающего излучения и эта зависимость k(λ) или
k(ν) и определяет спектр поглощения, индивидуальный для каждого вещества.
Закон Бугера (1) справедлив для всех веществ, но у каждого из них своя
зависимость показателя поглощения k от длины волны, что и определяет разное
поглощение ими одного и того же излучения.
Для растворов при небольших концентрациях “c” справедлив закон
Бера- показатель поглощения раствора прямо пропорционален концентрации
поглощающего
вещества
:
k
=
αc,
(2)
где α – удельный (в расчете на единицу концентрации) показатель поглощения
вещества. Поскольку концентрацию принято измерять в Моль/л или г/л, то α
измеряется соответственно в л/м∙Моль или в л/г∙∙см. Таким образом, для рас-
8
I = I0 e – αсx .
творов закон поглощения света принимает вид, известный как закон Бугера –
Ламберта – Бера:
(1а).
Введем теперь несколько общепринятых определений.
Коэффициентом пропускания образца называют отношение интенсивности света, прошедшего через образец, к интенсивности падающего на него света:
Т = I /I0 ;
Оптической плотностью образца называют десятичный логарифм величины, обратной коэффициенту пропускания Т:
D = lg (1/T) = – lg T.
(3)
Подставляя в эти соотношения законы (1) или (1а), получим зависимости коэффициента пропускания и оптической плотности от толщины х поглощающего
слоя и концентрации с растворенного поглощающего вещества:
для твердых образцов:
Т = I /I0 = e – kx ;
D = kх· lg е = 0,43kх= k1х ,
и для растворов:
Т = I /I0 = e
– αсx
(3а)
;
D = αсx·lg e = 0,43αсx = α1сx .
(3б)
Видно, что зависимость коэффициента пропускания Т и от толщины x
образца, и от концентрации “c” растворенного поглощающего вещества экспоненциальная, тогда как оптическая плотность D образца линейно зависит
от этих параметров, что очень удобно при измерениях концентрации веществ
по их спектрам поглощения.
Кроме того, из соотношений (3а) и (3б) видно, что зависимость оптической плотности от длины волны излучения такая же, как и у показателей поглощения k или α: D(λ) ~ k(λ) ~ α(λ), и поэтому тоже представляет собой
спектр поглощения образца. Поэтому на практике в качестве спектра по-
9
глощения обычно регистрируют именно зависимость оптической плотности
от длины волны D(λ).
Оптическая плотность растворов, как уже отмечалось, прямо пропорциональна концентрации поглощающего вещества (см.(3б)). Поэтому, измерив оптическую плотность раствора на определенной длине волны (вблизи максимума
поглощения), можно определить концентрацию поглощающего вещества. Для
этих целей используются приборы, называемые фотоэлектроколориметрами.
Схема однолучевого фотоэлектроколориметра представлена на рис.6.
Растворитель
оптический клин
фотоэлемент
Источник
λ
Оптический
фильтр
Раствор
измерительный прибор
Рис.6. Схема однолучевого фотоэлектроколориметра.
Свет от источника сплошного спектра проходит через оптический фильтр,
пропускающий излучение лишь определенной длины волны λ. Это монохроматическое излучение сначала проходит через кювету с чистым растворителем,
попадает на фотоэлемент и с помощью поглощающего оптического клина показания измерительного прибора устанавливают точно на 100 процентов пропускания. Затем вместо кюветы с растворителем на пути луча помещают кювету с
исследуемым раствором: - измерительный прибор сразу показывает его коэффициент пропускания и оптическую плотность, зная которые можно определить
концентрацию поглощающего вещества в растворе.
10
3. Излучение и поглощение энергии атомами.
(теория Бора)
Оптические спектры многих веществ были хорошо известны и систематизированы уже в ХIХ веке, но физическая природа их возникновения была
неясна.
Впервые правильное объяснение наблюдавшимся спектрам излучения и
поглощения атомов дал Нильс Бор в начале ХХ столетия. Основываясь на
планетарной модели атома, выдвинутой Резерфордом, и на квантовых свойствах
света, установленных Планком, он постулировал следующие положения:
1.
Электроны в атоме могут находиться только в определенных
энергетических состояниях Е1, Е2, Е3 … Еn, которые являются стационарными и находясь в которых электрон не излучает и не поглощает энергию.
При переходе электрона из одного стационарного состояния Еn в
2.
другое Еk он или излучает энергию в виде кванта света (если Еn > Еk), либо поглощает квант соответствующей энергии
(если Еn < Еk ), при этом
энергия h  кванта и частота  излучения определяются соотношением (условие Бора):
h  = Еn – Еk.
(4)
3. Стационарными являются те состояния, в которых момент импульса электрона принимает значения, кратные величине ħ = h/2 ,
mvr = nh/2 = nħ,
(5)
где h –постоянная Планка, ħ= h/2, а m, v и r –масса, скорость и радиус орбиты
электрона, n = 1,2,3,4,…- целое положительное число.
Постулаты Бора дали возможность вычислить радиусы стационарных
орбит и энергию электрона в этих состояниях для простейшего атома - атома
водорода и водородоподобных ионов (т.е. имеющих только один электрон) и
затем рассчитать их спектры излучения и поглощения.
11
Теория Бора впервые объяснила и правильно описала наблюдавшиеся
спектры излучения и поглощения атома водорода и водородоподобных ионов,
указала правильное направление для последующего развития всей квантовой
механики, объяснившей явления, происходящие на атомном и молекулярном
уровнях.
Таким образом, было установлено, что испускание атомами квантов электромагнитного излучения происходит при переходе электронов из более высоких энергетических состояний в более низкие, а поглощение квантов электромагнитной энергии сопровождается переходами электронов с нижних энергетических состояний на более высокие в соответствии с условием (4).
Поскольку энергия электрона в атоме прямо зависит от заряда ядра Ze и,
следовательно, от номера Z элемента, то набор возможных энергетических
состояний у атома каждого химического элемента или у молекулы строго
индивидуален,
поэтому и спектры испускания и поглощения атомов и мо-
лекул также строго индивидуальны. Благодаря этому по спектрам испускания
или поглощения можно определять химический состав образца. В этом состоит одно из основных направлений практического применения спектрального
анализа.
3.1. Энергия электрона в стационарных состояниях.
( для ознакомительного чтения)
На электрон, движущийся по круговой орбите радиуса r вокруг ядра с зарядом Ze, действует кулоновская сила FКул= Zе2/40r2, сообщающая электрону
необходимое центростремительное ускорение в соответствии со вторым законом Ньютона:
FКул = maц.с.,
то есть
Zе2/40r2 = mv2/r,
12
(6)
Zе2/40r = mv2 ,
или
(6а)
где 0 – электрическая постоянная вакуума, e и m – заряд и масса электрона, r и
v – радиус орбиты электрона в атоме и его скорость на этой орбите.
Возведя соотношение (5) в квадрат и разделив его на (6а), найдем радиусы
стационарных орбит электрона в атоме водорода и водородоподобных ионов:
rn = n2 0 h2/ Zе2m ,
где n = 1,2,3,4… - номер орбиты.
(7)
Потенциальная энергия электрона в электрическом поле ядра равна:
Епот = - е = - е Ze/40r = - Zе2/40r ,
(8)
а кинетическая энергия электрона с учетом (6а) равна:
Екин = mv2/2= Zе2/80r .
(9)
Поскольку потенциальная энергия электрона отрицательна и по модулю
вдвое превосходит его кинетическую энергию, то полная энергия электрона в
атоме всегда отрицательна, что указывает на то, что электрон не свободен, а
связан со своим ядром (энергия этой связи равна модулю полной энергии электрона):
Е = Е пот + Екин = - Zе2/80r ,
(10)
Подставляя сюда выражение (7) для радиусов стационарных боровских
орбит, получим выражение для полной энергии электрона в стационарных состояниях:
Еn = - Z2е4m / 802h2n2 = - Z2Е0/n2,
(11)
Здесь Е0 = е4m / 802h2 = 2,176·10–18 Дж = 13,6 эВ (электрон-Вольт) - постоянная, определяющая энергию электрона на первой боровской орбите в атоме водорода.
Т.о., полная энергия электрона в атоме всегда отрицательна и ее величина
прямо пропорциональна квадрату заряда ядра ( т.е. квадрату порядкового номер
элемента в таблице Менделеева) и обратно пропорциональна квадрату номера
орбиты. Наибольшую по модулю (но отрицательную по знаку) полную энергию
электрон имеет на 1-ой, самой близкой к ядру орбите (при n = 1): Е1 = - Z2Е0 ,
13
поэтому это энергетическое состояние является основным для электрона, а соответствующий энергетический уровень является самым нижним на энергетической диаграмме. Остальные энергетические состояния (Е2, Е3 и т.д.) расположены выше, в обычных условиях свободны и электрон может переходить в
эти состояния лишь при поглощении необходимых порций энергии в виде
квантов электромагнитного излучения в соответствии со вторым постулатом
Бора. Набор частот электромагнитного излучения, который может поглощать
данный атом, и определяет его спектр поглощения. Затем, при последующих
обратных переходах электрона из верхних, возбужденных энергетических состояний на более низкие (в том числе и на основное Е1) состояния, атом излучает электромагнитные кванты соответствующих частот (см. условие Бора (4))
и образуется его спектр испускания.
3.2. Спектр атома водорода
Рассмотрим более подробно энергетические состояния электрона в простейшем атоме – атоме водорода.
В соответствии с постулатами Бора энергия электрона в атоме водорода может принимать только вполне определенные значения, описываемые
формулой (11) при Z = 1:
Еn = – Е0 / n2,
n =1,2,3,4….
(11а)
Здесь Е0 = е4m / 802h2 =2,176·10–18 Дж = 13,6 эВ– постоянная, определяющая
энергию электрона на первой (n = 1), самой нижней боровской орбите в атоме
водорода. Положительное целое число n, определяющее радиусы стационарных
орбит (7) и энергию электрона в этих состояниях (11) и (11а) называют главным квантовым числом.
Диаграмма энергетических уровней атома водорода, рассчитанная в соответствии с формулой (11а), представлена на Рис.7.
Область ионизации
14
n=∞
Е∞ = 0
Е 4 = - Е0 /16
n =5
n=4
Е 3 = - Е0 /9
n=3
Серия Пашена
Е 2 = - Е0 /4
n=2
Серия Бальмера
Серия Лаймана
Е1 = - Е0
n=1
Рис. 7. Диаграмма энергетических уровней атома водорода
и схема образования основных спектральных серий в излучении.
В первом энергетическом состоянии, при n = 1, полная энергия электрона в атоме наименьшая (а модуль ее, т.е. энергия связи электрона, наибольшая:
Есв =│Е0│= 13,6 эВ), поэтому это состояние является основным для электрона,
и соответствующий ему уровень энергии является самым глубоким на энергетической диаграмме. В других состояниях (при n = 2, 3, 4, 5…) полная энергия
электрона больше (а энергия связи с ядром меньше), поэтому он там долго находиться не может и примерно через 10–
9
секунды переходит на основной,
энергетически более выгодный уровень, испуская электромагнитные кванты
соответствующей энергии. Частота ν излучения, возникающего при переходе
15
электрона с энергетического уровня Ек на уровень Еn , определяется правилом
Бора (4) и соотношением (11а):
1
1
 = (Ек – Еn)/h = E 0 ( 2 – 2 ),
h n
k
где
n = 1, 2, 3, 4,…
(12)
k = n+1, n+2, n+3, …
Эта формула, правильно описывающая частоты всех линий в спектре излучения
атома водорода, была задолго до теории Бора эмпирически установлена Бальмером (для n=2 и k=3,4,5…) и названа его именем, но лишь теория Бора смогла
правильно объяснить физическое происхождение этих линий, что и явилось
одним из важнейших доказательств ее правоты.
3.3. Спектральные серии атома водорода.
Частоты всех спектральных линий в спектре атома водорода описываются
формулой Бальмера (12).
На Рис.7 представлена диаграмма расположения
энергетических уровней атома водорода, построенная в соответствии с формулой (11а), и схема электронных переходов, образующих основные спектральные
серии в спектрах испускания водорода.
Совокупность спектральных линий, соответствующих переходам с любых верхних энергетических уровней на один и тот же нижний уровень образует спектральную серию в излучении. В спектре атома водорода выделяют
следующие основные спектральные серии:
1. Серия Лаймана – возникает при переходах электронов со всех верхних
уровней (k = 2, 3, 4 …) в основное состояние (n = 1). Частоты спектральных
линий этой серии получают из формулы Бальмера при n = 1 и k = 2, 3, 4 …:
 =
E 0 (1 - 1 ),
h
k2
где
k = 2, 3, 4, 5 …
(13)
Линии серии Лаймана лежат в ультрафиолетовой области спектра.
3. Серия Бальмера - соответствует переходам на второй уровень (n = 2)
со всех верхних уровней (k ≥ 3). Их частоты определяются формулой:
16
1
1
 = (Ек – Е2)/h = E 0 (  2 ),
h 4 k
где k = 3, 4, 5, 6 …
(14)
Линии этой серии лежат в видимой области спектра.
3. Серия Пашена – соответствует переходам со всех верхних уровней на
1 1
 = E 0 (  2 ),
h 9 k
третий (n = 3):
где k = 4, 5, 6, 7 …
(15)
Эта серия лежит в инфракрасной (ИК) области спектра.
Указанные спектральные серии наблюдаются также и в спектрах поглощения
атома водорода, где им соответствуют переходы с одного нижнего
уровня (1-го для серии Лаймана, 2-го для серии Бальмера и 3-го для серии Пашена) на все более высокие энергетические уровни.
Как видим, спектры атомов состоят из отдельных узких линий, поэтому
называются линейчатыми (см. Рис.8).
серия Лаймана
с. Бальмера
с. Пашена
λ
ν
УФ область
Видимый ИК
Свет область
Рис.8. Схема расположения спектральных линий
основных серий атома водорода.
3.4. Спектры сложных атомов.
(выделенное курсивом - для ознакомительного чтения)
Атомы называют сложными, если они имеют на своих орбитах два и более электронов. Хотя теория Бора правильно объяснила происхождение спек17
тров атома водорода и водородоподобных ионов, описать также точно спектры
сложных атомов она уже не смогла, но послужила отправной точкой для развития новой, более точной теории атома – квантовой механики.
Согласно квантовой механике, состояние электрона в атомах описывается четырьмя квантовыми числами: главным квантовым числом n, орбитальным квантовым числом ℓ, магнитным числом m и спиновым числом ms.1)
Главное квантовое число n определяет энергию электрона в атоме и
может принимать последовательные целые значения от 1 и выше.
Орбитальное (побочное или азимутальное) квантовое число ℓ определяет
орбитальный момент импульса электрона:
p = √ℓ(ℓ+1) h/2π= √ℓ(ℓ+1) ħ,
(16)
и форму его орбиты ( круговая , эллиптичная) и может принимать n целых
значений от нуля до (n-1):
ℓ = 0, 1, 2, …n-1.
Магнитное число m может принимать ( 2ℓ + 1 ) целых значений от -ℓ
до +ℓ: m = -ℓ, …0, …+ℓ , и определяет проекцию орбитального момента импульса электрона на направление внешнего поля:
pz = m·h/2π= mħ.
(17)
Спиновое квантовое число принимает лишь два значения: ms = ± 1/2 и
определяет проекцию спина (т.е. собственного механического момента) электрона на выделенное направление.
Электронные состояния в зависимости от значения орбитального числа ℓ обозначаются соответственно как s – состояния (ℓ=0, - “круговая” орбита), p – состояния (ℓ=1, эллиптичная орбита), d – состояния (ℓ=2, эллиптичная более вытянутая орбита ), f – состояния (ℓ =3, - эллиптичная, еще
более вытянутая орбита) и т.д..
1 )
Часто используют и другую четверку квантовых чисел : n, ℓ, j, mj, где числа j и mj определяют полный механический момент электрона и его проекцию на выделенное направление.
18
По принципу Паули в одном квантовом состоянии (т.е. состоянии с
определенным набором четырех квантовых чисел: n, ℓ, m и ms) в атоме может находиться не более одного электрона.
В общем случае число электронов в состоянии с заданным орбитальным
числом ℓ и разными значениями m и ms равно 2(2ℓ + 1).
Поэтому в s– состояниях (ℓ=0)
может находиться не более 2-х электронов
(m = 0, ms = ± 1/2), в p- состояниях (ℓ=1) – 6 электронов (m = 0, ±1, ms = ±
½), в d- состояниях (ℓ=2) – 10 электронов (m = 0, ±1,±2, ms = ± ½) и т.д.
Основное отличие сложных атомов от от атома водорода в том, что
энергия электронов в сложных атомах зависит не только от главного
квантового числа n , но и от орбитального квантового числа ℓ.2)
Энергия связи электрона в атоме обычно тем больше (т.е. энергетический уровень расположен глубже) , чем меньше главное квантовое число n, а
при заданном n – чем меньше орбитальное число ℓ. Поэтому по мере возрастания заряда ядра Z, и, следовательно количества электронов в атоме, заполнение электронами энергетических уровней в сложных атомах начинается с
нижнего состояния 1s, в котором может находиться не более 2-х электронов,
затем заполняются 2s- состояние (2 электрона), 2p- состояние (6 электронов),
3s-, 3p- и т.д., так что электронные состояния (конфигурации) многоэлектронных атомов заполняются в следующем порядке:
1s2 2s2 2p6 3s2 3p6 4s2 3d10 4p6 …,
где цифра справа вверху указывает количество электронов в данном состоянии.
На самом верхнем занятом электронами энергетическом уровне находятся валентные электроны атома и это состояние для них будет основным энергетическим состоянием. Все более высокие энергетические уровни будут свободны, а все более низкие – заняты остальными электронами атома.
2 )
При наложении внешних электрических и магнитных полей энергия электронов будет за-
висеть и от магнитного m и от спинового ms квантовых чисел.
19
При поглощении атомом квантов электромагнитной энергии происходят
переходы валентных электронов атома на свободные, более высокие энергетические состояния (уровни энергии),
и совокупность соответствующих
частот ν (или длин волн λ=с/ν) электромагнитных волн, поглощаемых атомом, определяет его спектр поглощения. Обратные переходы с верхних энергетических уровней на нижние определяют спектр испускания атома. Во
всех случаях энергия поглощаемого или излучаемого электромагнитного кванта
связана с энергией перехода правилом Бора (4): h = Еn - Еk.
Следует отметить, что в атомах и молекулах переходы между энергетическими уровнями подразделяются на излучательные (оптические) и безизлучательные ( неоптические, тепловые) переходы.
Безизлучательные переходы
возможны между любыми уровнями энергии и они тем вероятнее, чем меньше
энергия перехода ∆Е =Еn - Еk.
Оптические спектры атомов определяются, естественно, только излучательными (оптическими) переходами электронов из одних энергетических
состояний в другие, а такие переходы возможны лишь между определенными
уровнями энергии и определяются специальными правилами отбора квантовой механики. В частности, оптические переходы разрешены лишь с изменением орбитального квантового числа ℓ на единицу и без изменения спина S
электронного состояния атома: ∆ℓ = ± 1, ∆S = 0.
Переходы, запрещенные правилами отбора, могут происходить, но их
вероятность значительно ( примерно в 104 – 106 раз) меньше, чем разрешенных
переходов. Поскольку интенсивность спектральных линий прямо пропорциональна количеству оптических переходов в единицу времени, т.е. прямо
пропорциональна вероятности этих переходов, то интенсивность спектральных линий, соответствующих разрешенным переходам, – велика, а интенсив-
20
ность спектральных линий, соответствующих запрещенным переходам, обычно
мала.
4. Спектры молекул.
В молекулах кроме движения электронов вокруг ядер, существуют и
другие виды движения, которые тоже квантуются, то есть принимают дискретные значения и описываются соответствующими квантовыми числами. Это колебательное движение ядер атомов относительно их положения равновесия и
вращение всей молекулы в целом вокруг осей, проходящих через ее центр
масс:
Емол. = Еэл.дв. + Екол. дв + Евращ.,
(18)
при этом энергия электронного движения значительно больше энергии колебательного движения ядер, а та , в свою очередь, значительно больше энергии
вращения молекулы, т.е. выполняются неравенства:
Еэл.дв. >> Екол. дв >> Евращ.
Энергия электронного движения описывается квантовыми числами n и ℓ, а
колебательного и вращательного движений – квантовыми числами v и j соответственно.
В результате структура энергетических уровней молекулы значительно
усложняется по сравнению с энергетической структурой атома.
У каждого
электронного состояния (n = 1,2,3,..) появляются свои колебательные (v=1,2,..)
и вращательные ( j ) подуровни, как схематично показано на Рис.9. Наличие
колебательных и мелких вращательных подуровней приводит к образованию у
каждого электронного состояния сплошных зон колебательно-вращательных
состояний, причем в обычных условиях лучше “заселены” нижние подуровни
этих зон ( см. кривые заселенности уровней слева от диаграммы).
Переходы молекулы с нижних энергетических уровней на верхние будут
сопровождаться поглощением энергии молекулой, а оптические переходы с
21
верхних состояний на нижние сопровождаются испусканием электромагнитных волн.
Область ионизации
n=∞
Е=0
V=2
τ~10–11с
j
Внутренняя
конверсия, τ ~10–11с
V=1
j
n=3
2-я полоса
поглощения
2-я полоса испускания
V=2
j
–11
τ~10 с
V=1
j
n=2
1-я полоса испускания
1-я полоса
поглощения
j
V=3
j
j
V=2
j
V=1
j
n=1
Рис. 9. Диаграмма энергетических уровней молекулы.
Схема образования спектров поглощения и испускания.
Поглощение обычно идет с самых нижних, наиболее заселенных, подуровней основного состояния на любые колебательно-вращательные подуровни
верхних электронных состояний, образующих сплошную зону состояний (см.
Рис.9), поэтому в спектрах поглощения молекул наблюдаются не отдельные линии (как у атомов), а широкие спектральные полосы поглощения.
22
Первая полоса поглощения соответствует переходам из основного состояния на различные колебательно - вращательные подуровни 1-го возбужденного электронного состояния.
Вторая полоса поглощения соответствует переходам с основного уровня
на колебательно-вращательные подуровни 2-го возбужденного электронного
состояния и т.д. (см. Рис.9).
В возбужденных колебательно-вращательных состояниях молекула долго
находиться не может и за время 10–11 – 10–12 секунды совершает безизлучательные переходы на энергетически более выгодные, самые нижние колебательновращательные подуровни этого же электронного состояния, - это явление называется внутренней конверсией.
Вследствие внутренней конверсии испускание электромагнитных квантов происходит с самых нижних подуровней возбужденных состояний на
любые подуровни нижележащих (главным образом основного) электронных
состояний. В результате образуются полосы испускания (люминесценции) –
первая, вторая и т.д., которые не совпадают по частоте с полосами поглощения,
а смещены относительно них в сторону меньших частот (больших длин волн)
– эта закономерность молекулярных спектров известна как закон Стокса.
4.1. Виды молекулярных спектров
Частоты отдельных линий в спектрах молекул так же определяются условием Бора:
=
E мол..2  E мол..1
h
=
E эл.  E кол.  Евращ.
h
(19)
Если изменяются все три вида энергии при переходе молекулы из одного
состояния в другое,
то спектры называются электронно-колебательно-
вращательными или, проще, электронными (по наибольшей энергии) спектрами. Они имеют вид достаточно широких спектральных полос, расположен-
23
ных в ультрафиолетовой (УФ), видимой или ближней инфракрасной (ИК) областях спектра (см. Рис.10).
Электронные спектры поглощения большинства биомолекул (белков,
нуклеиновых кислот и др.) лежат в УФ – области спектра. Они используются
для идентификации исследуемого вещества, для исследования кинетики
химических реакций, а также для определения концентрации растворенного
вещества путем измерения оптической плотности раствора вблизи максимума полосы поглощения вещества. Спектры поглощения позволяют
получать информацию о свойствах
макромолекул и их взаимодействиях с
другими молекулами, поскольку эти
Рис.10. Электронные спектры
поглощения (1) и испускания (2)
триптофана.
спектры существенно зависят от ближайшего и внешнего окружения поглощающей молекулы.
Поглощение белков в области длин волн 250 – 300 нм обусловлено
главным образом ароматическими аминокислотами: триптофаном (см.Рис.10),
тирозином и фенилаланином, хотя УФ-излучение с длиной волны 250 нм поглощают также гистидин и серусодержащие аминокислоты – цистин, цистеин и
метионин.
Электронные спектры испускания называют также спектрами люминесценции и они будут подробнее рассмотрены ниже.
Колебательные-вращательные (проще - колебательные) спектры молекул наблюдаются только в поглощении, когда энергия движения электронов
не изменяется, т.е. ΔЕэл. = 0, а изменяются лишь колебательная и вращательная
энергии молекулы в пределах основного электронного состояния. Они лежат в
24
инфракрасной области спектра и имеют вид полос, зачастую перекрывающихся
между собой.
Колебательные спектры дают информацию об энергиях валентных
связей молекулы, энергиях межмолекулярных взаимодействий, о конформационных и других изменениях в структуре молекул и поэтому
широко ис-
пользуются при спектральных исследованиях молекул.
Вращательные спектры молекул образуются при переходах между вращательными подуровнями одного и того же электронно-колебательного состояния , то есть при ΔЕэл. = 0 и
ΔЕкол. = 0, но ΔЕвращ.  0 и могут наблюдаться
лишь в радиодиапазоне.
5. Люминесценция.
Если атом или молекулу каким-либо образом перевести в возбужденное электронное состояние, то они затем возвращаются в основное электронное состояние, испуская электромагнитное излучение, которое и называют
люминесценцией. Чтобы отличать люминесценцию от теплового излучения тел
и рассеянного света, С.И. Вавилов предложил следующее определение люминесценции: “Люминесценция – это излучение, превышающее тепловое при
данной температуре и имеющее длительность послесвечения много больше периода световых колебаний (τ >> 10 – 15 с)”.
Интенсивность люминесценции вещества в сотни раз превышает интесивность его теплового излучения в том же спектральном диапазоне, поэтому ее
часто называют холодным свечением.
По способу возбуждения атома или молекулы люминесценция делится
на следующие основные виды:
1. Фотолюминесценция – возбуждение происходит в результате поглощения электромагнитной энергии (обычно видимого или ультрафиолетового
диапазонов).
25
2. Катодолюминесценция – возбуждение производится электронным
ударом по атому или молекуле вещества ( наблюдается в кинескопах, электронно-лучевых трубках и т.п..).
3. Электролюминесценция – возбуждение атомов и молекул производится электрическим полем.
4.
Рентгенолюминесценция – возбуждение производится рентгенов-
скими лучами.
5.
Хемилюминесценция – возбуждение происходит в результате хими-
ческой реакции, по схеме:
А + В  АВ*  АВ + hν (квант люминесценции).
6. Биолюминесценция - возбуждение молекул происходит в результате
биохимических реакций, происходящих в живом организме.
Существуют и другие разновидности люминесценции по способу возбуждения.
Заметим, что благодаря люминесценции различные виды энергии преобразуются в электромагнитное излучение, часто видимого диапазона и это
широко используется на практике (экраны кинескопов, рентгенолюминесцентные экраны, электронно-оптические преобразователи и др.).
Если возбуждение молекулы или атома происходит непрерывно, то и люминесценция тоже будет непрерывной с некоторой интенсивностью I0 и в этом
случае ее называют стационарной люминесценцией.
Iлюм
I0
I0е – t/τ
I0/e
0
τ
t
Рис. 11. Затухание интенсивности люминесценции во времени.
26
Если же возбуждение молекулы или атома внезапно прекратить, то интенсивность люминесценции начнет экспоненциально затухать (см. Рис.11) по за-
Iлюм. = I0 е – t /τ,
кону:
(20)
где параметр τ называется длительностью люминесценции3) и является важнейшей характеристикой люминесцирующего вещества. Он определяет время,
за которое интенсивность люминесценции уменьшается в е = 2,7 раз . Это время
обычно находят из графика, полученного опытным путем (Рис.11).
По длительности послесвечения  люминесценция делится на два вида:
- флуоресценцию, если  < 10 – 7 с, т.е. затухание люминесценции происходит очень быстро (для глаза – мгновенно),
- фосфоресценцию, если  > 10
– 4
с, – в этом случае затухание идет
сравнительно медленно и часто хорошо наблюдается невооруженным
глазом.
С точки зрения квантовой механики флуоресценция – это излучение,
возникающее в результате разрешенных оптических переходов,
вероятность
которых очень велика, поэтому время высвечивания  очень мало:  < 10 -- 7 с.
Фосфоресценция, напротив, возникает в результате оптических переходов, запрещенных правилами квантовой механики, поэтому их вероятность
очень мала ( в 106 – 104 раз меньше, чем вероятность разрешенных переходов,
т.е. флуоресценции), а соответственно время высвечивания ( время жизни в
возбужденном состоянии) весьма велико.
5.1. Основные характеристики и законы люминесценции.
Основные характеристики :
3)
Часто параметр τ называют также длительностью послесвечения или временем жизни
возбужденного состояния.
27
1. Спектр люминесценции – спектральные линии или полосы, которые
наблюдаются при люминесценции данного вещества. Характеризуются длиной
волны или частотой линий люминесценции, либо длиной волны max (или частотой max) линии, соответствующей максимуму полосы люминесценции, а
также шириной этой полосы  (или  ). По спектру люминесценции определяют вид люминесцирующего вещества, а по интенсивности - его концентрацию и другие важные характеристики.
2. Длительность люминесценции  - как уже отмечалось, это время,
за которое интенсивность люминесценции уменьшается в е = 2,7 раз; это время
жизни электронов в возбужденном состоянии, в результате оптических переходов из которого в основное состояние и возникает люминесценция.
3. Квантовый выход люминесценции γ - это отношение числа квантов
люминесценции к количеству квантов, поглощенных при возбуждении молекулы: γ = nлюм/nпогл . Квантовый выход всегда меньше единицы (γ < 1) из-за наличия неоптических переходов. Вещество считается хорошо люминесцирующим,
если его квантовый выход γ > 0,01, т.е. если γ > 1%.
4. Спектр возбуждения – это зависимость интенсивности фотолюминесценции от длины волны возбуждающего излучения (для многих молекул он
совпадает с их спектром поглощения) .
5. Степень поляризации люминесценции– это степень поляризации
излучения люминесценции, когда ее возбуждение производится линейно поляризованным светом, – позволяет оценить скорость вращения люминесцирующей молекулы и микровязкость ее окружения.
Каждое люминесцирующее вещество имеет свой индивидуальный
спектр люминесценции, что используется при исследовании структуры веществ
с помощью люминесцентного анализа. По спектру люминесценции можно определить как вид, так и концентрацию люминесцирующего вещества. Люминесцентный анализ чувствительнее абсорбционного (по спектрам поглощения)
28
спектрального анализа более чем в 1000 раз. Так, он позволяет определить наличие люминесцирующего вещества в смеси при ничтожно малых концентрациях: до 10 – 12 г/л при квантовом выходе всего около одного процента.
Спектры люминесценции очень чувствительны к химическим свойствам
окружения (полярности, pH, концентрации, вязкости и др.) люминесцирующей
молекулы, что широко используются в биохимических исследованиях. Люминесценция позволяет изучать изменения конформации макромолекул, а при использовании люминесцентного микроскопа изучать и локализацию люминесцирующих молекул внутри клетки.
Укажем здесь лишь два основных закона люминесценции:
1. Закон Стокса: Спектр люминесценции вещества всегда смещен в
область более длинных волн относительно его спектра поглощения (см.,
например, спектры на Рис.10).
2. Закон Вавилова: Квантовый выход и спектр люминесценции сложных молекул не зависят от длины волны возбуждения. Основное требование
к спектральному диапазону волн, используемому для возбуждения люминесценции: - он должен попадать внутрь полосы поглощения этого вещества.
Оба эти закона объясняются наличием внутренней конверсии в сложных
молекулах, в результате которой испускание всегда происходит с самых нижних
подуровней возбужденных электронных состояний на все подуровни основного
состояния,
независимо от того, на какие колебательно- вращательные поду-
ровни верхних электронных состояний была возбуждена молекула (см. Рис.9).
5.2. Собственная люминесценция биомолекул
(для ознакомительного чтения).
При облучении различных клеток позвоночных и беспозвоночных животных, а также растений и микроорганизмов коротковолновым ультрафиолетом (λ=250–280нм), можно зарегистрировать их флуоресценцию. Это свечение
29
объясняется тем, что многие ткани организма содержат вещества (витамины,
белки и др.), способные флуоресцировать под действием света. Такая флуоресценция биомолекул называется собственной. Собственная
ультрафиоле-
товая флуоресценция живых тканей определяется, главным образом, свечением белков. Спектры собственной ультрафиолетовой флуоресценции многих
клеток имеют сходную форму, хотя одни из них светятся сильнее, другие – слабее (рис.12).
Вместе с тем разные ультраструктурные компоненты одной и той же клетки
флуоресцируют неодинаково. Наиболее яркая ультрафиолетовая флуоресценция
присуща сократительному аппарату клетки, митохондриям и ядрышкам.
В состав клеток животного происхождения входит ряд веществ, люминесцирующих как в ультрафиолетовой, так
и в видимой области спектра. По положению спектров люминесценции биомолекул в шкале длин волн их можно
разделить на следующие группы: нуклеиновые кислоты, белки, коферменты,
продукты окисления и витамины [1].
Спектры поглощения нуклеиновых кислот определяются входящими
в их состав пуриновыми и пиримидинм
Рис. 12 . Спектры ультрафиолетовой флуоресценции мышечных волокон (1), нейронов (2),
эритроцитов (3).
новыми основаниями. Люминесценция
нуклеиновых кислот в водных растворах очень слаба: квантовый выход люминесценции ДНК, например, состав-
ляет около 10 – 4, а положение максимума флуоресценции 330 – 335 нм.
Из аминокислот способны люминесцировать только три ароматических
аминокислоты: триптофан, тирозин и фенилаланин, максимумы флуоресцен-
30
ции которых в водных растворах приходятся на 348, 303 и 282 нм, а квантовые
выходы равны 0,2; 0,21 и 0,04 соответственно. Поэтому собственная люминесценция белков лежит в УФ области спектра и полностью определяется люминесценцией этих трех аминокислот, при этом основной вклад в люминесценцию белков принадлежит триптофану, а в его отсутствие – тирозину, и только
в отсутствие их обоих проявляется слабая люминесценция фенилаланина.
В клетках человека и животных содержится много белков, в состав которых входят триптофан, тирозин и фенилаланин. Это актин, миозин, ферменты
типа дегидрогеназ, фосфатаз, оксидаз, некоторые гормоны, ферменты пищеварительной системы, альбумины и глобулины плазмы крови, и другие вещества.
Собственная ультрафиолетовая флуоресценция всех этих белков определяется,
главным образом, триптофаном3, что и определяет схожесть спектров люминесценции многих белков и клеток (см. Рис.12).
В видимой области спектра люминесцируют различные продукты окисления белков и липидов (синяя область спектра с максимумом около 405 нм).
Флуоресценция живых тканей в синей и желто-зеленой областях связана с
наличием в клетках восстановленной формы
пиридиннуклеотидов (НАД·Н и
НАДФ·Н) и окисленной формы флавопротеинов (ФП). Эти вещества участвуют
в таких процессах, как гликолиз,
пентозный цикл, цикл Кребса, окисление
жирных кислот и, что особенно важно, клеточное дыхание. Поэтому практически любые сдвиги в клеточном метаболизме отражаются и на динамике флуоресценции НАД•Н и ФП, что может быть выявлено при люминесцентном анализе живых тканей.
3
)
Очень важным свойством люминесценции триптофана является смещение максимума его флуоресценции при изменении полярности и жесткости его микроокружения, что
позволило разработать флуоресцентный метод анализа структурного состояния нативных триптофансодержащих белков как в растворе, так и в составе клетки. Конформационно- чувствительными оказались и другие параметры флуоресценции этих белков: квантовый
выход, длительность флуоресценции и степень поляризации.
31
Восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотида (НАД•Н) обладает характерным спектром поглощения, включающим две полосы поглощения в ультрафиолетовой части спектра с максимумом в области 260 нм и 340 нм,
а также собственной синей флуоресценцией с максимумом в интервале 465—
480 нм. Переход НАД•Н в окисленное состояние сопровождается потерей одной
полосы (при λ=340 нм) в спектре поглощения и утратой способности флуоресцировать.
Пиридиннуклеотиды в восстановленной
форме (НАД·Н, НАДФ·Н)
флуоресцируют с максимумом 470 нм в водных растворах и 440 нм при связывании с белками, в последнем случае почти в 6 раз увеличивается и квантовый
выход.
Флавины - витамин В2 (рибофлавин), ФМН (флавинмононуклеотид) и
ФАД (флавинадениндинуклеотид) в окисленной форме обладают спектрами
флуоресценции с максимумом в голубовато-зеленой области спектра при 530
нм (см.Рис.13).
Рис.13. Спектры поглощения (1) и флуоресценции (2) водных
растворов ФАД (флавинадениндинуклеотид) [1]
Среди флавопротеинов (ФП) наибольший интерес представляют собой
производные рибофлавина. В окисленном состоянии флавопротеины обладают
характерным спектром поглощения и собственной желто-зеленой флуоресцен-
32
цией с максимумом в области 530 нм, обусловленной рибофлавином. При восстановлении флавопротеины утрачивают собственную флуоресценцию.4
Билирубин, являющийся промежуточным продуктом распада гемоглобина, в водных растворах слабо флуоресцирует в голубовато-зеленой области 500550 нм, но при взаимодействии с сывороточным альбумином человека его люминесценция возрастает почти в 50 раз, а максимум приходится на 515 нм.
Флуоресценция в красной области присуща прежде всего порфиринам.
Порфириновая структура свойственна цитохромам, пероксидазе, каталазе,
гемоглобину, миоглобину. Спектры флуоресценции порфиринов обычно имеют
две полосы: более интенсивную в красно-оранжевой области 600 – 650 нм и
менее интенсивную в красной, более длинноволновой области. Однако в гемопорфиринах флуоресценция «потушена» атомами железа, что ограничивает
возможности ее исследования в живых тканях. При обработке ткани некоторыми веществами атом железа отрывается от простетической группы внутриклеточных гемопорфиринов, и тогда выявляется характерная красная флуоресценция порфиринов5.
Значительный интерес представляют порфирины и их люминесцентные
свойства в связи со способностью этих соединений избирательно накапливать4
)
Неодинаковая флуоресценция пиридиннуклеотидов и флавопротеинов в восстановленной и окисленной формах лежит в основе использования флуоресцентного анализа для
количественной оценки клеточного дыхания живых тканей. Усиление клеточного дыхания
сопровождается изменением соотношения восстановленных и окисленных форм компонентов дыхательной цепи в сторону преобладания вторых над первыми. Угнетение дыхания
приводит к противоположному эффекту. Поэтому при усиленном дыхании клетки в ней нарастает желто-зеленая и затухает синяя флуоресценция, тогда как при ослаблении дыхания
характерно усиление синего свечения НАД • Н и угасание желто-зеленой флуоресценции
ФП.
5
) Протопорфирин является частью молекулы гемоглобина, поэтому обнаруживаются в эритроцитах и в небольших количествах количествах в плазме крови, благодаря чему
эритроциты обычно слабо люминесцируют красным светом. Но при недостаточности железа, отравлении свинцом и других патологических состояниях красная люминесценция протопорфирина увеличивается в десятки и сотни раз. Этим свойством пользуются судебные
медики для обнаружения отдельных эритроцитов по их порфириновой флуоресценции после
обработки исследуемого объекта серной кислотой.
33
ся в злокачественных опухолях. Помимо диагностики это свойство порфиринов
используется сейчас в фототерапии опухолей (гематопорфирин и его производные).
5.3. Вторичная люминесценция, люминесцентные зонды.
Есть много биологически важных соединений, которые сами не люминесцируют и поэтому использовать весьма чувствительные, неразрушающие вещество и хорошо отработанные методы люминесцентного анализа для их изучения напрямую невозможно. Поэтому в настоящее время при изучении биообъектов наряду с исследованием собственной флуоресценции клеток и тканей широко используется метод флуоресцентных зондов. Суть этого метода заключается в следующем: существует ряд люминесцирующих веществ (зондов), которые избирательно взаимодействуют с определенными компонентами клетки
и отдельными молекулами, причем образующийся комплекс флуоресцентного
зонда и взаимодействующего с ним вещества клетки как правило имеет более
интенсивную флуоресценцию, чем люминесцентный зонд в несвязанном состоянии. Свечение этого комплекса под действием света называют вторичной
(наведенной) или зондовой флуоресценцией.
Так, в результате творческого содружества кафедры медицинской и биологической физики БГМУ, Республиканского центра гемо- и лимфосорбции и
лаборатории молекулярного анализа Института физики НАН РБ, был предложен быстрый и эффективный метод оценки степени очистки сывороточного
Рис.14
34
альбумина человека путем добавления к плазме крови флуоресцентного зонда
АНС. Флуоресценция АНС в водном растворе очень слаба (квантовый выход
0,006), но при связывании с белком квантовый выход возрастает до 0,3-0,8. Поэтому, чем интенсивнее люминесценция зонда (АНС), тем большее количество
зонда связалось с сывороточным альбумином и значит, тем выше степень очистки альбумина. Этот эффект иллюстрируется на рис.14.
Применение вторичной флуоресценции позволило, например, изучить
распределение ионов кальция в клетке и в различных органах, а также его изменение в процессе жизнедеятельности организма. Наибольшее распространение в качестве зонда на кальций нашел хлортетрациклин. Он образует сложный
комплекс с ионами кальция, связанными биомембранами, который флуоресцирует тем интенсивнее, чем больше кальция адсорбировано на биомембранах
[4].
В настоящее время известно более ста различных флуоресцентных зондов, специфически связывающихся с определенными биомолекулами и клеточными субструктурами (см.[2]).
Литература:
35
1. Е.А.Черницкий, Е.И.Слобожанина. Спектральный люминесцентный
анализ в медицине. Минск, Наука и техника, 1989 г.
2. Г.Е. Добрецов. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. М., Наука, 1989 г.
3. Д. Фрайфельдер. Физическая биохимия. М., Мир, 1980 г.
4. Медицинская биофизика., п/ред. проф. В.О.Самойлова, Ленинград,
1986г.
Контрольные вопросы:
1. Приведите схему призменного спектрального прибора и объясните
принцип его действия. Как выглядят спектры испускания и поглощения, в
чем различие методов их регистрации?
2. Выведите закон поглощения света. Какая величина в этом законе отражает поглощающие свойства вещества? Что называют спектром поглощения вещества?
4. Что такое коэффициент пропускания и оптическая плотность образца,
как они связаны с показателем поглощения о размерами образца?
5. Как возникают оптические спектры поглощения и испускания, почему
они индивидуальны для каждого вещества? Приведите основные постулаты теории Бора.
6. Приведите схему энергетических уровней атома водорода и объясните
формирование спектральных серий.
36
7. В чем особенности энергетической структуры молекул, почему молекулярные спектры не линейчатые, а полосатые? Приведите классификацию молекулярных спектров, в каких областях спектра они наблюдаются и какую информацию о структуре молекулы они несут?
8. Что такое люминесценция, на какие виды она подразделяется по способу возбуждения и по длительности послесвечения?
9. Приведите основные характеристики люминесценции и ее законы, в
чем заключается люминесцентный анализ и каковы его преимущества
по сравнению с абсорбционным спектральным анализом?
10. Какие биомолекулы способны люминесцировать, в каких областях
спектра?
11. Что такое люминесцентные зонды и вторичная люминесценция? Как
люминесцентный анализ используется в медицинских исследованиях?
СОДЕРЖАНИЕ
Введение____________________________________________________ 3
1.Спектральные приборы _______________________________________ 4
2.Законы поглощения света______________________________________7
3. Излучение и поглощение энергии атомами (теория Бора)
___________10
3.1.Энергия электрона в стационарных состояниях_______________12
3.2. Спектр атома водорода__________________________________ 13
3.3. Спектральные серии атома водорода ______________________ 15
3.4. Спектры сложных атомов_______________________________ 17
4. Спектры молекул ___________________________________________20
4.1.Виды молекулярных спектров_____________________________ 22
37
5. Люминесценция____________________________________________ 24
5.1. Основные характеристики и законы люминесценции__________26
5.2. Собственная люминесценция биомолекул__________________ 28
5.3. Вторичная люминесценция, люминесцентные зонды_________
32
Литература__________________________________________________ 34
Контрольные вопросы _________________________________________35
Учебное издание
Лещенко Вячеслав Григорьевич
ВВЕДЕНИЕ
В СПЕКТРАЛЬНЫЙ И
38
ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ
Учебно-методическое пособие
Ответственный за выпуск В.Г.Лещенко
Редактор
Компъютерный набор В.Г.Лещенко
Компъютерная верстка
Подписано в печать________ Форма 60х84/16. Бумага писчая. Печать офсетная.
Усл. печ. л.______ Уч .- изд.л. ______ Тираж 300 экз. Заказ ________
Издатель и полиграфическое исполнениеБелорусский государственный медицинский университет.
220050, г. Минск, Ленинградская, 6.
В.Г. ЛЕЩЕНКО
39
ВВЕДЕНИЕ
В СПЕКТРАЛЬНЫЙ И
ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ
МИНСК 2002
40