015803 B1 015803 B1 (11) 015803

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(12)
(45)
(11)
015803
(13)
B1
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
Дата публикации и выдачи патента
(51) Int. Cl. C12P 13/22 (2006.01)
2011.12.30
(21)
Номер заявки
200900430
(22)
Дата подачи заявки
2007.09.12
(54)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕКОТОРЫХ СОЕДИНЕНИЙ ФЕНИЛАЛАНИНА
B1
(72)
Изобретатель:
(74)
Представитель:
(57)
Изобретение касается способа получения обогащенных энантиомером соединений фенилаланина
при реагировании соответствующего производного коричной кислоты с донором аминогрупп
в присутствии стереоселективной фенилаланинаммиаклиазы, последовательность которой по
меньшей мере на 50% идентична SEQ ID NO. 4 (аминокислотной последовательности PAL из
Idiomarina loihiensis).
Ван Ассема Фризо Бернард Ян,
Серейниг Наташа (NL)
Агуреев А.П. (RU)
B1
015803
(56) WO-A-2006069799
ЕР-A-1085095
DATABASE EMBL [Online], 30 May 2006
(2006-05-30), HOU, S. ET AL.: "Histidine ammonia
lyase",
XP002419453, Database accession no.
Q5QXE5, the whole document
015803
(31) 06019071.7
(32) 2006.09.12
(33) EP
(43) 2009.08.28
(86) PCT/EP2007/007945
(87) WO 2008/031578 2008.03.20
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL)
015803
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение касается способа получения обогащенных энантиомером соединений фенилаланина, в
котором соответствующее производное коричной кислоты подвергается реакции с донором аминогрупп
в присутствии стереоселективной фенилаланинаммиаклиазы.
Обогащенные энантиомером соединения фенилаланина являются важными промежуточными соединениями, к примеру, для фармацевтических препаратов, в частности, при получении ингибиторов
ангиотензин-I-превращающего фермента (АСЕ), которые применяются для лечения высокого кровяного
давления (гипертензии). Оптически активная (S)-индолин-2-карбоновая кислота, которая может быть
получена при замыкании кольца (S)-2-хлорфенилаланина, например, может использоваться при получении
[2S-[1[R*(R*),2α,3аβ,7аβ]]-1-[2-[[1-(этоксикарбонил)бутил]амино]-1-оксопропил]октагидро-1Hиндол-2-карбоновой кислоты, также известной под торговой маркой Perindopril, которая применяется в
качестве антигипертензивного средства (ингибитора АСЕ) или кардиотонического активного ингредиента. Другие полезные применения - это, к примеру, Pentopril и Indolapril.
Способ получения обогащенных энантиомером соединений фенилаланина известен из WO
2006/069799 А1, где в конкретном примере получают (S)-2-амино-3-(2-хлорфенил)пропионовую кислоту
при реагировании 3-(2-хлорфенил)акриловой кислоты с водным NH3 в присутствии фенилаланинаммиаклиазы (PAL) из R. glutinis. Аминокислотная последовательность PAL из Rhodotorula glutinis приведена в WO 01/11071 А2 и в SEQ ID NO. 9 в настоящем изобретении.
Недостатком способа, описанного в WO 2006/069799 А1, является то, что происходит субстратное
ингибирование. Поэтому способ приходится выполнять при низкой концентрации. Для получения приемлемого количества продукта необходимы большие объемы либо сложные методики загрузки, что делает его менее привлекательным с коммерческой точки зрения.
Следовательно, целью настоящего изобретения является обеспечение такого способа получения соединений фенилаланина, при котором субстратное ингибирование снижается.
Эта цель достигается посредством способа получения обогащенных энантиомером соединений фенилаланина при реагировании соответствующего производного коричной кислоты с донором аминогрупп в присутствии стереоселективной фенилаланинаммиаклиазы, последовательность которой по
меньшей мере на 50% идентична SEQ ID NO. 4.
Способ настоящего изобретения, таким образом, обеспечивает улучшенный и/или коммерчески
привлекательный способ получения соединений фенилаланина. Субстратное ингибирование, то есть
снижение первоначальной активности фермента при повышении концентрации субстрата, уменьшается
при использовании PAL, у которой последовательность по меньшей мере на 50% идентична SEQ ID NO.
4. Более того, фенилаланинаммиаклиазы (PALs), последовательности которых по меньшей мере на 50%
идентичны SEQ ID NO. 4, легко подвергаются суперэкспрессии в Е. coli. Другим преимуществом PALs,
идентичных SEQ ID NO. 4 по меньшей мере на 50%, по сравнению с PAL из R. glutinis является то, что
они обладают более высокой активностью.
Идентичность в % в настоящем изобретении определяется в исследованиях по совмещению последовательностей с помощью Clone Manager 6, версия 6.00/Align Plus 4, версия 4.10 (Scientific & Educational Software), используя в качестве матрицы для подсчета баллов BLOSUM62.
Предпочтительно в способе настоящего изобретения используется PAL, последовательность которой идентична SEQ ID NO. 4 по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 53%,
более предпочтительно по меньшей мере на 55%, более предпочтительно по меньшей мере на 57%, еще
более предпочтительно по меньшей мере на 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 62%,
еще более предпочтительно по меньшей мере на 65%, еще более предпочтительно по меньшей мере на
70%, в особенности по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более
предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более
предпочтительно по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 97%, еще
более предпочтительно по меньшей мере на 98%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и
наиболее предпочтительно на 100%.
Последовательности PAL, которые могут использоваться в способе настоящего изобретения, легко
могут быть идентифицированы специалистами в этой области, например, при поиске с помощью BLAST
в базе данных, к примеру, в базе данных NCBI. Нуклеотидные последовательности, кодирующие эти последовательности PAL, легко могут быть идентифицированы, к примеру, с помощью программ, доступных через BLAST в NCBI. В качестве альтернативы, исходя из аминокислотной последовательности,
нуклеотидная последовательность может быть синтезирована при предпочтительной или оптимизированной для желательных клеток хозяина употребительности кодонов, например, такими коммерческими
компаниями, как GenScript или DNA 2.0. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность фермента PAL, используемого в способе настоящего изобретения, может быть
клонирована в подходящий вектор, а после введения в соответствующие клетки хозяина подвергнута
(супер)-экспрессии в соответствии со стандартными методами клонирования и экспрессирования, известными специалистам в этой области (например, как описано в Sambrook J., Fritsh E.F. and Maniatis T.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Labora-1-
015803
tory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), получая фермент PAL, который идентичен SEQ ID NO. 4 по
меньшей мере на 50%.
В рамках изобретения PAL (фенилаланинаммиаклиаза) определяется как фермент, обладающий фенилаланинаммиаклиазной активностью, т.е. способностью катализировать обратимое невосстановительное аминирование коричной кислоты до фенилаланина. HAL (гистидинаммиаклиаза) определяется как
фермент, обладающий гистидинаммиаклиазной активностью, т.е. способностью катализировать обратимое невосстановительное аминирование урокановой кислоты до гистидина.
Предпочтительно соединение фенилаланина, получаемое способом настоящего изобретения, представляет собой соединение формулы (1) или его соль
где Y означает гидроксильную группу, замещенную или незамещенную алкоксигруппу с 1-10 атомами углерода, замещенную или незамещенную арилоксигруппу либо аминогруппу или остаток амина
-NHR, где R означает алкил, аралкил, арил, алкарил, содержащий 1-10 атомов С и необязательно один
или несколько гетероатомов; а
Z означает один или несколько заместителей в ароматическом кольце, которые выбирают из водорода, гидроксильной группы, необязательно замещенной циклической или ациклической алифатической
группы с 1-10 атомами углерода, необязательно содержащей один или несколько гетероатомов, необязательно замещенной алифатической гетероциклической группы с 1-10 атомами углерода, необязательно
замещенной (гетеро)арильной группы, необязательно замещенной алкоксигруппы с 1-10 атомами углерода, атома галогена, аминогруппы, нитрогруппы, остатка карбоновой кислоты, остатка эфира карбоновой кислоты, остатка амида карбоновой кислоты, нитрила или трифторметила. В случае, когда Z означает циклическую или ациклическую алифатическую группу, алифатическую гетероциклическую группу,
(гетеро)арильную группу или алкоксигруппу, и в случае, когда Y означает алкоксигруппу или арилоксигруппу, заместитель, например, выбирают из тригалогенидов, к примеру, трифторметила, трихлорметила; атома галогена, например, фтора, хлора или йода; аминогруппы, к примеру, метиламина, диметиламина, бензиламина, этиламина, пропиламина, фениламина, 4-фторфениламина; алкоксигруппы или арилоксигруппы, например, метокси, этокси, изопропокси, бензилокси, фенокси, 4-фторфенокси, 3фторфенокси, 2-фторфенокси; остатка тиоэфира, к примеру, метилового тиоэфира, этилового тиоэфира,
бензилового тиоэфира; остатка тригалогеналкилового эфира, например, трифторметилового эфира; арила
или
гетероарила,
например,
фенила,
4-фторфенила,
3-фторфенила,
2-фторфенила,
2трифторметилфенила, 3-трифторметилфенила, 4-трифторметилфенила, тиофена, фурана, пиразола, пиррола, имидазола и др. Предпочтительными являются соединения, у которых Z означает водород, атом
галогена, трифторметил, гидрокси, метокси или нитрил, a Y означает гидроксил.
Более предпочтительно соединение фенилаланина, получаемое способом настоящего изобретения,
представляет собой соединение формулы (2) или его соль
где Y соответствует вышеприведенному определению для формулы (1), Z соответствует вышеприведенному определению для формулы (1), а X означает уходящую группу, выбранную из числа атомов
фтора, брома, хлора или йода, радикала мезилата, нозилата, тозилата, трифлата, бороновой кислоты,
нитрогруппы и др.
Термин "уходящая группа" в контексте настоящего изобретения означает группу, способную служить в качестве уходящей группы в способе получения обогащенной энантиомером необязательно замещенной индолин-2-карбоновой кислоты формулы (3) или её соли:
где Y и Z соответствуют вышеприведенным определениям, а обогащенное энантиомером хиральное
орто-Х-замещенное соединение фенилаланина формулы (2) подвергают циклизации при температуре
ниже 140°С с образованием обогащенной энантиомером индолин-2-карбоновой кислоты формулы (3).
Заместители Y или Z в формуле (3) определены ниже. Эта реакция циклизации раскрыта в WO
2006/069799 А1, включенном в настоящее изобретение путем ссылки.
Подходящими примерами солей соединений формул (1), (2) и (3) являются, к примеру, соли HCl,
-2-
015803
соли HBr, аммонийные соли, соли уксусной кислоты, соли метансульфоновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты, n-толуолсульфоновой кислоты, малеиновой кислоты, винной кислоты, лимонной кислоты
или глюконовой кислоты.
Если Z в формуле (1), (2) или (3) означает циклическую или ациклическую алифатическую группу с
1-10 атомами углерода, замещенную алифатическую гетероциклическую группу с 1-10 атомами углерода, замещенную (гетеро)арильную группу, замещенную алкоксигруппу с 1-10 атомами углерода, которые
содержат один или несколько гетероатомов, то эти гетероатомы независимо друг от друга обычно выбирают из группы Р, N, О и S. Если Y содержит один или несколько гетероатомов, то эти гетероатомы тоже
независимо друг от друга обычно выбирают из группы Р, N, О и S.
Предпочтительно в вышеприведенных формулах Y означает ОН или OR1, где R1 означает алкил,
обычно с 1-10 атомами С, предпочтительно алкил с 1-6 атомами С, а наиболее предпочтительно Y означает ОН. Предпочтительно Z означает Н или галоген, к примеру, атом фтора, хлора, брома или йода, а
наиболее предпочтительно Z означает Н. Предпочтительно X в формуле (2) означает атом фтора, брома,
хлора или йода, а наиболее предпочтительно атом хлора или брома. Вследствие его низкой стоимости
и/или с экологической точки зрения наиболее предпочтительным является атом хлора.
Подходящими примерами соединений фенилаланина являются, к примеру, 2-бром-фенилаланин, 2хлорфенилаланин, 2-йодфенилаланин, метиловый эфир 2-бромфенилаланина, метиловый эфир 2хлорфенилаланина, метиловый эфир 2-йодфенилаланина, этиловый эфир 2-бромфенилаланина, этиловый
эфир 2-хлорфенилаланина, этиловый эфир 2-йодфенилаланина, бензиловый эфир 2-бромфенилаланина,
бензиловый эфир 2-хлорфенилаланина, бензиловый эфир 2-йодфенилаланина, амид 2бромфенилаланина, амид 2-хлорфенилаланина, амид 2-йодфенилаланина и др. Предпочтительными являются 2-бром-фенилаланин, 2-хлорфенилаланин, бензиловый эфир 2-бромфенилаланина и бензиловый
эфир 2-хлорфенилаланина. Более предпочтительны 2-бромфенилаланин и 2-хлорфенилаланин. Еще более предпочтительны (S)-энантиомеры соответствующих примеров соединений фенилаланина. Наиболее
предпочтительны (S)-2-хлорфенилаланин и (S)-2-бромфенилаланин.
"Обогащенный энантиомером" в настоящем изобретении служит эквивалентом термина "оптически
активный" и означает то, что один из энантиомеров соединения находится в избытке по сравнению с другим энантиомером. Этот избыток в дальнейшем будет именоваться как "энантиомерный избыток" или
э.и. (например, при определении методом хиральной хроматографии GLC или HPLC). Энантиомерный
избыток э.и. равняется разности между количествами энантиомеров, деленной на сумму количеств энантиомеров, причем этот показатель может быть выражен в процентах после умножения на 100.
В способе изобретения оптическая чистота соединений фенилаланина предпочтительно составляет
по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, еще более предпочтительно по
меньшей мере 90%, в особенности по меньшей мере 95%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере
98%.
Предпочтительными примерами солей соединений фенилаланина формулы (1) или (2) являются, к
примеру, соли HCl, соли HBr, соли уксусной кислоты, соли метансульфоновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты, n-толуолсульфоновой кислоты, малеиновой кислоты, винной кислоты, лимонной кислоты или глюконовой кислоты.
Подходящими донорами аминогрупп являются, к примеру, NH3 или NH4OH либо B-NH2, где В означает группу -COR1, в которой R1 может быть выбран из необязательно замещенной циклической или
ациклической алифатической группы с 1-10 атомами углерода, необязательно замещенной алифатической гетероциклической группы с 1-10 атомами углерода, необязательно замещенной (гетеро)арильной
группы, необязательно замещенной алкоксигруппы с 1-10 атомами углерода, необязательно замещенной
сульфонильной группы и т.п. Предпочтительными являются NH3 и NH4OH. Конечно, можно использовать и комбинацию из различных доноров аминогрупп. Необязательно находящимися на R1 заместителями могут служить гидроксильная группа, тригалогениды, к примеру, трифторметил, трихлорметил;
атом галогена, например, фтора, хлора или йода; аминогруппа, к примеру, метиламин, диметиламин,
бензиламин, этиламин, пропиламин, фениламин, 4-фторфениламин; алкоксигруппа или арилоксигруппа,
например, метокси, этокси, изопропокси, бензилокси, фенокси, 4-фторфенокси, 3-фторфенокси, 2фторфенокси; остаток тиоэфира, к примеру, метилового тиоэфира, этилового тиоэфира, бензилового тиоэфира; остаток тригалогеналкилового эфира, например, трифторметилового эфира; арил или гетероарил,
например,
фенил,
4-фторфенил,
3-фторфенил,
2-фторфенил,
2-трифторметилфенил,
3трифторметилфенил, 4-трифторметилфенил, тиофен, фуран, пиразол, пиррол, имидазол и др.
Под стереоселективностью PAL подразумевается то, что PAL преимущественно катализирует образование одного из энантиомеров соединения (2). Стереоселективность фермента может выражаться на
основе Е-отношения, т.е. отношения констант Vmax/KM специфичности двух энантиомеров, как описано в
C-S. Chen, Y. Fujimoto, G. Girdaukas, C.J. Sih, J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 7294-7299. В рамках изобретения Е-отношение PAL определяется по значениям Vmax и KM при неокислительном деаминировании орто-Х-замещенного соединения фенилаланина (= соединения (1)) с помощью PAL.
Предпочтительно PAL образует продукты со значениями э.и. >80%, более предпочтительно со зна-3-
015803
чениями э.и. >90%, еще более предпочтительно со значениями э.и. >95%, наиболее предпочтительно со
значениями э.и.>99%. Предпочтительно PAL стереоселективно катализирует образование (S)энантиомера соединения фенилаланина, более предпочтительно образуется орто-Cl-замещенное (S)соединение фенилаланина.
Используемая в способе настоящего изобретения PAL предпочтительно не подвергается субстратному ингибированию, т.е. она предпочтительно не подвергается ингибированию коричной кислотой или
её производными.
Способ изобретения никоим образом не ограничивается тем, в каком виде используется PAL, которая по меньшей мере на 50% идентична SEQ ID NO. 4. Например, PAL может иметь вид раствора неочищенного фермента, раствора очищенного фермента (пермеабилизированных или иммобилизированных) клеток, обладающих активностью PAL естественным образом или посредством генетической модификации, лизата клеток с такой активностью, иммобилизированной формы, химически модифицированной формы или иной формы, известной специалистам в этой области, либо комбинации из двух и
больше таких форм.
Специалистам в этой области должно быть понятно, что могут использоваться и мутанты природных ферментов PAL (дикого типа). Например, можно получить мутантов по активности PAL, т.е. мутантов, проявляющих более высокую активность хотя бы на одном из субстратов, чем PAL дикого типа, мутантов по экспрессии PAL, т.е. мутантов, проявляющих лучшую экспрессию, чем PAL дикого типа, и т.д.
Мутанты ферментов дикого типа по активности PAL могут быть получены, к примеру, путем модификации ДНК, кодирующей фермент дикого типа, используя известные специалистам в этой области методы
мутагенеза (случайного мутагенеза, направленного мутагенеза, направленной эволюции, перетасовки
генов и т.п.) с тем, чтобы ДНК кодировала фермент, отличающийся как минимум одной аминокислотой
от фермента дикого типа, а затем экспрессировать модифицированную ДНК в подходящих клетках хозяина.
С другой стороны, могут быть получены мутанты по экспрессии PAL путем модификации ДНК,
кодирующей фермент дикого типа, используя известные специалистам в этой области методы мутагенеза
с тем, чтобы при экспрессии ДНК в клетках хозяина уровень экспрессии PAL оказался выше у мутировавшей ДНК, чем у немутировавшей ДНК. Специалистам известно, как проводить отбор таких мутантов
по экспрессии PAL, например, путем измерения относительной активности по меньшей мере для трех
разных субстратов и сравнения соотношения этих активностей с ферментом дикого типа. Мутанты по
экспрессии обладают более высокой активностью для всех различных субстратов, тогда как соотношение
активностей между субстратами равно таковому у фермента дикого типа. Мутанты фермента PAL могут
обладать улучшенными свойствами в отношении (стерео)селективности и/или активности, и/или стабильности, и/или устойчивости к растворителям, и/или рН-профиля, и/или температурного профиля,
и/или экспрессии, и/или продукта, и/или субстратного ингибирования, причем таких мутантов PAL можно подвергать специфической селекции на наличие любого из этих улучшенных свойств поодиночке или
в комбинации из двух или нескольких свойств.
Для способа настоящего изобретения может оказаться полезным добавление восстановительного
реагента, чтобы уменьшить отрицательные эффекты кислорода на долговечность PAL. Примеры таких
восстановительных реагентов - сероводород, тиогликолевая кислота, тиосерная кислота, азотистая кислота, сернистая кислота, их аммониевые соли и соли металлов, дитиотреитол, этилмеркаптан, этиленмеркаптан, метилмеркаптан, 2-меркаптоэтанол, водород, закись азота, соединения железа (II), соединения марганца (II), сера и цинк. Предпочтительно для уменьшения эффектов кислорода на долговечность
PAL способ настоящего изобретения может выполняться в анаэробных условиях так, как это известно
специалистам в этой области, например, при выполнении способа настоящего изобретения в атмосфере
азота. Специалист может провести рутинные эксперименты для выбора оптимальных условий реакции в
отношении - среди прочего - температуры, рН, концентрации и растворителей.
Предпочтительно температура на стадии PAL выбирается таким образом, чтобы активность выбранного фермента PAL была оптимальной. Например, предпочтительная температура реакции для PAL
из Idiomarina loihiensis находится в пределах от 0 до 50°С, в особенности от 25 до 45°С, наиболее предпочтительно от 27 до 37°С.
Предпочтительно значение рН на стадии PAL и концентрация донора аминогрупп (предпочтительно NH3) выбираются таким образом, чтобы активность выбранного фермента PAL, стабильность образующегося соединения фенилаланина и выход этих соединений были оптимальными. Например, значение рН для PAL из Idiomarina loihiensis предпочтительно находится в пределах от рН 8 до рН 14, в особенности в пределах от рН 10 до 12, более предпочтительно в пределах от рН 10,5 до 11,5.
Например, концентрация гидроксида аммония (NH4OH) в воде для PAL из Idiomarina loihiensis
предпочтительно составляет от 5 до 25 мас.%, более предпочтительно от 10 до 15 мас.%, наиболее предпочтительно от 12 до 14% мас.
Способ настоящего изобретения может выполняться, к примеру, в водном растворе аммиака, в который необязательно можно добавить сорастворитель, солюбилизирующее вещество или добавку, чтобы
-4-
015803
усилить солюбилизацию соответствующего соединения коричной кислоты либо повысить активность
или стабильность PAL. Примеры сорастворителей включают диметилформамид, тетрагидрофуран, ацетонитрил, глутаральдегид, глицерин, толуол, этанол, ацетон, эфир и диметилсульфоксид (ДМСО). Примеры солюбилизирующих веществ включают тритон X100 (производится фирмой Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis), твин-80 (производится фирмой Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee,
Wis), полиэтиленгликоль (ПЭГ). Примеры добавок включают глутаминовую кислоту, изолейцин, этиленгликоль и сорбитол.
Соединения фенилаланина, получаемые способом настоящего изобретения, могут непосредственно
использоваться на следующей стадии или сначала подвергаться очистке. Соединения фенилаланина могут подвергаться очистке из реакционной смеси, полученной способом настоящего изобретения, используя стандартные методы, известные специалистам в этой области. Например, полученную реакционную
смесь, содержащую соединение фенилаланина, можно фильтровать или центрифугировать (для удаления
нерастворенных частиц, к примеру, клеток хозяина, экспрессирующих PAL). Далее можно, к примеру,
удалить донора аминогрупп испарением, после чего можно выделить соединение фенилаланина, предпочтительно путем осаждения.
Выход продукта в способе настоящего изобретения предпочтительно составляет по меньшей мере
30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере 50%,
еще более предпочтительно по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% и
наиболее предпочтительно по меньшей мере 90%.
В предпочтительном воплощении способа настоящего изобретения получают орто-С1-замещенный
(S) фенилаланин (формула 2, в которой X означает Cl, a Z означает Н) при реагировании соответствующей 2-хлорзамещенной коричной кислоты в водном растворе NH4OH, причем концентрация NH4OH в
воде составляет от 12 до 14 мас.%, в присутствии фермента PAL из Shewanella oneidensis, Idiomarina loihiensis, Fibrobacter succinogenes или Vibrio vulnificus, аминокислотная последовательность которой приведена, соответственно, в SEQ ID NO. 2 (которая на 60% идентична SEQ ID NO. 4), SEQ ID NO. 4, SEQ
ID NO. 6 (которая на 53% идентична SEQ ID NO. 4) и SEQ ID NO. 8 (которая на 63% идентична SEQ ID
NO. 4). Вне ожидания, хотя эти четыре фермента аннотированы как гистидинаммиаклиазы в базе данных
GenBank от NCBI, однако все они обладают фенилаланинаммиаклиазной активностью. Предпочтительно
в этом воплощении температура составляет от 25 до 45°С, а значение рН в пределах от рН 10,5 до 11,5.
Изобретение также касается способа получения обогащенных энантиомерами соединений фенилаланина по изобретению в присутствии стереоселективной фенилаланинаммиаклиазы, последовательность которой по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 90%, наиболее предпочтительно на 95%
идентична SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 или SEQ ID NO. 8.
Как изложено в WO 2006/069799 A1, соединения фенилаланина, получаемые способом настоящего
изобретения, могут применяться для получения оптически активной (S)-индолин-2-карбоновой кислоты,
которая, в свою очередь, является промежуточным продуктом при получении [2S-[1[R*(R*),2α,3аβ,7аβ]]1-[2-[[1-(этоксикарбонил)бутил]амино]-1-оксопропил]октагидро-1Н-индол-2-карбоновой кислоты.
Поэтому изобретение также касается способа, включающего способ настоящего изобретения, в котором полученное соединение фенилаланина подвергается дальнейшему превращению в активный фармацевтический ингредиент, в частности [2S-[1[R*(R*),2α,3аβ,7аβ]]-1-[2-[1-(этоксикарбонил)бутил]амино]-1-оксопропил]октагидро-1Н-индол-2-карбоновую кислоту.
Далее изобретение будет раскрыто на следующих примерах, которыми оно, однако, не ограничивается.
Примеры
При тестировании на активность PAL использовали следующие клоны.
Гены, нуклеотидные последовательности которых приведены выше, подвергали амплификации методом ПЦР, а очищенные продукты ПЦР вставляли по сайтам NcoI и BglII в вектор pSE420 (Invitrogen
Corp., CA, USA), используя метод клонирования Xi. При этом методе сайт NcoI разрушается после клонирования гена. Полученными плазмидами трансформировали клетки Е. coli TOP 10 (Invitrogen) и проверяли правильность вставки методами рестрикционного анализа и агарозного гель-электрофореза, получая клоны, номера которых приведены выше.
Ген PAL R. glutinis синтезировали на фирме GenScript Corporation, Scotch Plains, США, в соответствии с белковой последовательностью PAL Rhodosporidium toruloides АТСС 10788, которая приведена в
-5-
015803
белковой базе данных NCBI под номером САА31209. Кодоны синтетического гена подвергали оптимизации для экспрессирования в Е. coli. Синтезированный ген лигировали по сайту SmaI в плазмиду pUC57
на фирме GenScript, получая конструкцию pUC57_PAL. Лиофилизированные плазмиды (5 мкг), полученные из GenScript, растворяли в 50 мкл воды MilliQ и использовали 1 мкл для трансформации порции
химически компетентных клеток Е. coli DH5α; (Invitrogen, Breda, Нидерланды) в соответствии с методикой поставщика.
Получение клеток и бесклеточных экстрактов
Культивирование Е. coli, содержащих ферменты PAL
Содержащие соответствующие плазмиды Е. coli инокулировали в 20 мл среды 2 × TY (16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 7 г/л NaCl) с добавлением карбеницилина (100 мкг/мл) и инкубировали в течение ночи при 28°С. Эти культуры использовали для инокулирования больших объемов среды
(250 мкл предварительной культуры на 250 мл среды). Клетки культивировали при 37°С до достижения
OD ≈ 1. Клоны PAL из Shewanella oneidensis (клон № 1), Idiomarina loihiensis (клон № 2), Fibrobacter succinogenes (клон № 3), Vibrio vulnificus (клон № 4) подвергали индукции с помощью IPTG (конечная концентрация 0,5 мМ). Клон PAL из Rhodotorula glutinis подвергали индукции IPTG в конечной концентрации 1 мМ. После индукции культуры встряхивали при 28°С в течение ночи.
Клетки (∼ 2 г/250 мл среды) собирали центрифугированием (8000 об/мин при 4°С) и ресуспендировали в буфере 0,1 М трис/HCl рН 8,8 (1 мл буфера на 0,5 г клеток). Клеточные суспензии разделяли на
порции по 0,2 мл и центрифугировали. Супернатанты отбрасывали, а осадки клеток (примерно по 0,1 г)
хранили при -20°С.
Определение белка, SDS-PAGE, получение бесклеточных экстрактов
Ресуспендировали 0,1 г клеток в буфере 0,1 М трис/HCl рН 8,8 и разрушали клетки обработкой
ультразвуком. Часть обработанных ультразвуком клеток центрифугировали и декантировали бесклеточный экстракт (CFE). Концентрацию белка в различных фракциях определяли по методу Брэдфорда.
Для определения уровня экспрессии на гель NuPAGE наносили 25 мкг белка бесклеточного экстракта.
++++ > 50% от всего белка
+++ = 30-50% от всего белка
++ = 10-30% от всего белка
Такой анализ показал, что гены PAL хорошо экспрессируются в Е. coli. Тельца включения не образовывались. Клон 2 (Idiomarina loihiensis) проявлял самый высокий уровень экспрессии в Е. coli.
Начальные активности при рН 9,25
Раствор для реакции готовили доведением 10 мас.% раствора аммиака до рН 9,25 с помощью серной кислоты при 30°С.
10 мМ раствор транс-2-бромокоричной кислоты готовили в растворе аммиака. 4,8 мл раствора субстрата нагревали до 30°С. 100 мг осадка клеток суспендировали в 100 мкл соответствующего раствора
аммиака и вносили в реакционную смесь. Реакцию отслеживали по времени. Образовавшийся (L)-2бромфенилаланин определяли методом ВЭЖХ.
Измеряли относительные начальные активности (относительно активности клеток Е. coli, содержащих PAL R. glutinis) за первые 30-60 мин реакции.
Таблица 1. Относительные начальные активности индивидуальных клонов PAL относительно PAL R. glutinis
Как видно из табл. 1, все гены, клонированные из S. oneidensis, I. loihiensis, F. succinogenes и V. vulnificus, оказались намного более активными, чем ген, клонированный из R. glutinis, при исследованных
условиях.
Определение субстратного ингибирования
Для реакций при рН 11: брали по 4,8 мл 100 мМ, 50 мМ, 20 мМ и 10 мМ раствора транс-2бромокоричной кислоты в 13 мас.% аммиаке (доведенном до рН 11 с помощью серной кислоты при
-6-
015803
30°С) и нагревали до 30°С.
Для реакций при рН 9,25: твердую транс-2-бромокоричную кислоту суспендировали в 4,8 мл 8
мас.% аммиака (доведенного до рН 9,25 с помощью серной кислоты при 30°С) до конечной концентрации в 50 мМ, 20 мМ и 10 мМ. Реакционные смеси нагревали до 30°С. Для запуска реакции вносили 100
мг осадка клеток в 100 мкл соответствующего раствора аммиака. Реакцию отслеживали по времени. Образовавшийся (L)-2-бромфенилаланин определяли методом ВЭЖХ.
Начальные активности (относительно клона PAL из R. glutinis) в 13% NH3 рН 11 при различных
концентрациях субстрата:
Начальные активности (относительно клона PAL из R. glutinis) в 8% NH3 рН 9,27 при различных
концентрациях субстрата:
*н/о: активность не была определена из-за очень низкой активности при этих условиях
Примечание: реакционные смеси в 8% аммиаке рН 9,27 представляли собой взвеси при концентрациях свыше 20 мМ.
Как свидетельствуют вышеприведенные результаты, все ферменты PAL проявляли меньшее субстратное ингибирование, чем PAL R. glutinis. Клонированная из I. loihiensis PAL проявляет исключительную толерантность к высоким концентрациям субстрата даже при высоких значениях рН, при которых субстрат обладает высокой растворимостью.
-7-
015803
Список последовательностей
-8-
015803
-9-
015803
- 10 -
015803
- 11 -
015803
- 12 -
015803
- 13 -
015803
- 14 -
015803
- 15 -
015803
- 16 -
015803
- 17 -
015803
- 18 -
015803
- 19 -
015803
- 20 -
015803
- 21 -
015803
- 22 -
015803
- 23 -
015803
- 24 -
015803
- 25 -
015803
- 26 -
015803
- 27 -
015803
- 28 -
015803
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения обогащенного энантиомером соединения фенилаланина при реагировании соответствующего производного коричной кислоты с донором аминогрупп в присутствии стереоселективной фенилаланинаммиаклиазы, последовательность которой по меньшей мере на 50% идентична SEQ ID
NO. 4.
2. Способ по п.1, в котором соединение фенилаланина представляет собой соединение формулы (1)
или его соль
где Y означает гидроксильную группу, замещенную или незамещенную алкоксигруппу с 1-10 атомами углерода, замещенную или незамещенную арилоксигруппу либо остаток амина;
Z означает один или несколько заместителей в ароматическом кольце, которые выбирают из водорода, гидроксильной группы, необязательно замещенной циклической или ациклической алифатической
группы с 1-10 атомами углерода, необязательно замещенной алифатической гетероциклической группы с
1-10 атомами углерода, необязательно замещенной (гетеро)арильной группы, необязательно замещенной
алкоксигруппы с 1-10 атомами углерода, атома галогена, аминогруппы, нитрогруппы, остатка карбоновой кислоты, остатка эфира карбоновой кислоты, остатка амида карбоновой кислоты, нитрила или трифторметила.
3. Способ по п. 1, в котором соединение фенилаланина представляет собой соединение формулы (2)
или его соль
где Z означает один или несколько заместителей в ароматическом кольце, которые выбирают из водорода, гидроксильной группы, необязательно замещенной циклической или ациклической алифатической группы с 1-10 атомами углерода, необязательно замещенной алифатической гетероциклической
группы с 1-10 атомами углерода, необязательно замещенной (гетеро)арильной группы, необязательно
замещенной алкоксигруппы с 1-10 атомами углерода, атома галогена, аминогруппы, нитрогруппы, остатка карбоновой кислоты, остатка эфира карбоновой кислоты, остатка амида карбоновой кислоты, нитрила
или трифторметила;
Y означает гидроксильную группу, замещенную или незамещенную алкоксигруппу с 1-10 атомами
углерода, замещенную или незамещенную арилоксигруппу либо остаток амина; а
X означает уходящую группу, например, выбранную из числа атомов галогенов, радикала мезилата,
нозилата, тозилата, трифлата, бороновой кислоты, нитрогруппы и др.
4. Способ по п.3, в котором
X означает атом хлора или брома,
Y означает гидроксил, a
Z означает водород.
5. Способ по п.4, в котором соединение формулы (1) представляет собой (S)-2-хлорфенилаланин
или (S)-2-бромфенилаланин.
6. Способ по любому из пп.1-5, в котором донором аминогрупп является NH3 или NH4OH.
7. Способ по любому из пп.1-6, в котором стереоселективная фенилаланинаммиаклиаза имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 или SEQ
ID NO. 8.
8. Способ по любому из пп.3-7, дополнительно включающий стадию циклизации обогащенного
энантиомером хирального орто-Х-замещенного фенилаланина формулы (2)
или его соли,
где Y и Z соответствуют вышеприведенным определениям, а
X означает уходящую группу, при температуре ниже 140°С,
при этом образуется обогащенная энантиомером индолин-2-карбоновая кислота формулы (3)
- 29 -
015803
9. Способ получения активного фармацевтического ингредиента, в котором соединение фенилаланина, полученное способом по любому из пп.1-8, подвергают дальнейшему превращению.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 30 -