Автореферат Мартынова В.И. - Институт биоорганической химии
реклама
На правах рукописи МАРТЫНОВ Владимир Иванович ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫЕ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА GFP 02.00.10-Биоорганическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Москва – 2013 1 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук. Официальные оппоненты: Член-корреспондент РАН, Кочетков Сергей Николаевич доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией ИМБ РАН Доктор химических наук, Формановский Андрей Альфредович заведующий лабораторией ИБХ РАН Доктор химических наук, Бабаев Евгений Вениаминович Химический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова" Защита состоится 30 октября 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук по адресу: 117997 ГСП-7 Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук. Автореферат разослан "__"_________2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук В.А. Олейников 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Генетически кодируемые биосенсоры в последнее десятилетие стали одним из основных инструментов, используемых при исследовании живых систем. В соответствии с названием, эти технологии основаны на полном кодировании всех необходимых сенсорных свойств генами этих белковых структур. В основном в качестве таких биосенсоров используются недавно открытые флуоресцирующие белки (ФБ) семейства GFP. В 2008 году за цикл работ по этой тематике была присуждена Нобелевская премия по химии. Все оптические свойства различных представителей семейства GFP кодируются генетически. Далее генетическая информация реализуется с помощью автокаталитических посттрансляционных реакций, в результате которых из аминокислот синтезируются различные по структуре хромофоры, определяющие спектральные свойства каждого конкретного ФБ. В целом, все эти свойства позволяют проводить различные манипуляции с генами ФБ с целью получения сенсоров с заданными свойствами. В последнее время на основе ФБ созданы клеточные сенсоры на ионы Ca2+, Cu2+, Zn2+, Cl-, а также H2O2, cAMP, активность клеточных киназ, протеаз, GTP-аз. В настоящее время рассматривается возможность применения этой технологии в медицине для изучения молекулярных механизмов различных заболеваний в масштабе целого организма. Однако существующие на данный момент флуоресцентные маркеры характеризуются множеством недостатков и требуют существенного усовершенствования. В большинстве случаев, практическое применение биосенсоров на основе ФБ требует модификации их свойств и разработки новых измененных (мутантных) вариантов, существующих в мономерной форме и обладающих высокой яркостью, повышенной скоростью созревания хромофора, фотостабильностью. Для практического применения ФБ в медицине необходимо создание вариантов белков со спектрами, смещенными в длинноволновую область. Конструирование мутантных вариантов ФБ с эмиссией в дальне-красной и инфракрасной области спектра (650 – 900 нм) позволит преодолеть клеточную автофлуоресценцию, а также подавить рассеяние и поглощение света живыми тканями, что, в свою очередь, может привести к разработке флуоресцентных маркеров нового поколения для изучения молекулярных процессов в масштабе целого организма. Многообещающие перспективы применения ФБ в биотехнологии и медицине обусловили сдвиг основных исследовательских акцентов в прикладную область. Однако, помимо практического применения, флуоресцентные белки семейства GFP несомненно представляют собой значительный фундаментальный интерес как объекты белковой 3 химии и энзимологии. К моменту начала данной работы существовал постулат о хромопротеинах, как о сложных белках, образующихся путем соединения обычного белка (апобелка) с простетической группой небелковой природы. ФБ семейства GFP нарушают эти представления, поскольку для образования хромопротеина в данном случае не требуется присутствия простетической группы и хромофор ФБ синтезируется автокаталитически из собственных аминокислот внутри белковой молекулы. Особую актуальность представляют исследования механизмов автокаталитических посттрансляционных модификаций ФБ, поскольку эти знания позволят управлять процессом, корректируя или изменяя направление реакций и таким образом получать новые флуоресцентные маркеры с необходимыми свойствами. До сих пор конструирование клеточных маркеров со спектрами, смещенными в длинноволновую область, проводилось по пути случайного введения мутаций в белок с последующим поиском мутантов с искомыми свойствами среди огромного числа полученных вариантов. Изучение посттрансляционных модификаций белков семейства GFP, таким образом, является актуальной и научно значимой фундаментальной проблемой, решение которой будет способствовать разработке новых рациональных подходов в создании флуоресцентных маркеров с заданными свойствами. Дальнейшее применение этих знаний позволит создать флуоресцентные маркеры нового поколения с эмиссией в дальнекрасной и инфракрасной области для биотехнологии и медицины. Цель работы. Основной целью настоящей работы являлось изучение молекулярных факторов, определяющих спектральные характеристики белков семейства GFP. Особое внимание было уделено исследованию посттрансляционных реакций, которые приводят к синтезу различных по структуре хромофоров, а также изучению стереохимических особенностей строения белка, которые определяют его уникальные свойства, включая характеристики цветового спектра и ключевые аминокислотные остатки, ответственные за синтез хромофоров и спектральные сдвиги этих белков. Нужно было понять, является ли изменение химической природы хромофора необходимым условием при переходе от одной цветовой группы ФБ к другой и если это так, то какие типы структур хромофоров характерны для определенных цветовых групп. Альтернативным вариантом могли быть различия во взаимодействиях с аминокислотными остатками, окружающими хромофор, которые также могли определять фотофизические свойства этих белков. Таким образом, установление химической структуры хромофора и его взаимодействий с окружением представляли особый интерес. Ставилась также задача выявить и охарактеризовать основные интермедиаты автокаталитического синтеза различных хромофоров, а также 4 понять, каким образом ФБ в отсутствие каких-либо экзогенных кофакторов синтезирует хромофор из собственных аминокислот. Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе впервые детально исследованы молекулярные основы спектрального разнообразия белков семейства GFP. В результате проделанной работы показано, что посттрансляционные модификации, приводящие к синтезу различных по структуре хромофоров, используются этими белками в качестве инструмента для «грубой» настройки фотофизических свойств (в пределах 100 нм и более) на определенный спектральный диапазон. «Тонкая» настройка ФБ (в пределах ~ 30 нм) на определенную длину волны осуществляется за счет различных нековалентных взаимодействий хромофора с его аминокислотным окружением. Установлено, что, несмотря на исключительное спектральное разнообразие, ФБ семейства GFP используют достаточно консервативные химические механизмы для приобретения этих свойств. Все без исключения ФБ используют структуру п-ГБИ в качестве исходного блока в синтезе хромофора. Впервые показано, что в дальне-красных белках, как и в DsRed, структура п-ГБИ дополнительно модифицирована ацилиминным заместителем, за счет которого происходит расширение π-электронной системы хромофора и спектры приобретают дополнительный сдвиг (~ 110 нм) в длинноволновую область. В работе также впервые показано, что ацилимин, являясь довольно реакционноспособной группой, может вступать в дополнительные посттрансляционные реакции, что в свою очередь может служить дополнительным источником спектральной вариабельности. Так хромофор фотоактивируемого белка asFP595 из Anemonia sulcata образуется в результате посттрансляционной реакции гидролиза ацилиминзамещенного пГБИ и, таким образом, является производным хромофора DsRed-типа. За счет нуклеофильной реакции по ацилимину также, по-видимому, образуется хромофор в белке zFP538. Открыта новая посттрансляционная реакция хромофора белков GFP-семейства. Показано, что белок z2FP574 из Zoanthus sp.2 подвергается окислению- декарбоксилированию, и эта реакция является необходимым условием для перехода белка из зеленого флуоресцентного состояния в красное. Также, впервые показано, что превращение бесцветного нефлуоресцирующего аналога aceGFP-G222E в зеленую флуоресцирующую форму происходит в результате реакции УФ-зависимого окисления хромофора. 5 Полученные результаты существенно расширяют и углубляют современные знания о посттрансляционных модификациях белков семейства GFP. Информация о ковалентных модификациях хромофора и структурных детерминантах, соответствующих определенной цветовой группе белков, может быть использована для изменения или оптимизации оптических свойств ФБ с дальнейшей целью рационального подхода в создании флуоресцентных сенсоров с заданными свойствами для живых систем. В будущем, применение флуоресцентных сенсоров с заданными свойствами, внесет весомый вклад в развитие методик, используемых в медицине для изучения молекулярных механизмов множества заболеваний, включая такие как рак, нарушения связанные с генными дефектами и т.п. Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на международных и российских конференциях, в том числе: на Международной конференции по физико-химической биологии, посвященной памяти академика Ю.А. Овчинникова, (Москва 2004, 2006), 30-м Конгрессе FEBS - 9-ой конференции IUBMB (Будапешт, 2005), Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007, Казань, 2010, Петрозаводск, 2011), XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), конференции «Fluorescent Proteins and Biological Sensors. Janelia Farm» (США, 2007), международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, 2009), II-ой Национальной конференции «Рентгеновское, синхротронное излучения, нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов» (Москва, 2009), 34-м Конгрессе FEBS (Прага, 2009), XVIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, 2010), II-ой Международной конференции Российского химического общества им. Д. И. Менделеева (Москва, 2010), VIII-ой Международной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 2010), VI-м Съезде Российского фотобиологического общества (Краснодарский край, 2011). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 23 статьи в российских и международных рецензируемых журналах. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 191 страницы, 31 рисунок 9 схем и 17 таблиц. Список литературы включает 456 источников. Вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направлений и методов исследования, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, в 6 обсуждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций. Все результаты, обсуждаемые в работе, были получены лично автором или под его научным руководством, при непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. В работах, выполненных в соавторстве, личный вклад автора заключался в непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов, в обсуждении и литературном оформлении результатов. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Первый представитель семейства GFP, зеленый флуоресцентный белок, был обнаружен в 1962 году в фотоцитах люминесцирующей медузы Aequorea victoria (Shimomura et al., 1962). В 1999 году из нелюминесцирующих кораллов класса Anthozoa были клонированы гены еще шести белков, гомологичных avGFP, часть из которых обладала флуоресценцией в более длинноволновой, по сравнению с avGFP, области спектра (Matz et al., 1999). К настоящему времени известно более ста природных и мутантных вариантов флуоресцентных белков (ФБ), которые перекрывают практически весь диапазон видимого спектра. Несмотря на достаточно отдаленную гомологию первичных структур, ФБ из кораллов обладают значительной гомологией третичных структур. К моменту начала настоящей работы было известно, что, как и avGFP, молекула красного ФБ из коралла Discosoma sp.(DsRed) имеет форму цилиндра, стенки которого образованы из 11-ти сегментов β-складчатых структур (Ormo et al., 1996; Wall et al., 2000; Yarbrough et al., 2001) (рис. 1). Через центральную ось этого цилиндра проходит αспираль, содержащая последовательность из трех аминокислот -Xxx-Tyr-Gly-, из которых в дальнейшем образуется хромофор. После образования цилиндрической структуры белок вступает в фазу созревания, которая характеризуется несколькими последовательными автокаталитическими реакциями в пределах последовательности -Хxx-Tyr-Gly- (рис. 1, увеличение, и схема 1), приводящими к синтезу хромофора и определяющими флуоресцентные свойства данного белка. В результате этих реакций в avGFP образуется хромофор, 4-(п-гидроксибензилиден)имидазолид-5-он (Shimomura, 1979) (п-ГБИ, схема 1), который в пространстве расположен в центре цилиндра. В случае красного ФБ DsRed пГБИ является исходным соединением при дальнейшем синтезе «красного» хромофора. В этом случае п-ГБИ подвергается дополнительному окислению с образованием ацилиминной группы (на схеме 1 отмечена красным), которая расширяет сопряженную πэлектронную систему п-ГБИ (Gross et al., 2000). 7 Рис. 1. Пространственная структура ФБ. В увеличении показано состояние, предшествующее циклизации, реакции, в которой в случае avGFP участвуют хромофоробразующие аминокислоты Ser65, Tyr66 и Gly67. Эта нуклеофильная реакция, по-видимому, катализируется аминокислотами, окружающими хромофор, Arg96 и Glu222. HO HO HO O HN HO O O NH NH O O Циклизация HN N R2 OH HO O O Дегидратация Окисление N R2 GFP O R1 R1 O Окисление N N R NH HO NH O N R2 O R1 HO N O O R2 DsRed R1 Схема 1. Последовательные посттрансляционные реакции в процессе синтеза хромофоров зеленого (avGFP) и красного (DsRed) флуоресцентных белков. Все природные белки семейства GFP можно разделить на две большие группы: флуоресцентные белки и исходно нефлуоресцирующие хромопротеины. Последние являются также гомологами avGFP и при помощи введения определенных мутаций могут быть превращены в ФБ. Белки семейства GFP можно также условно разделить на группы согласно цвету флуоресценции: синие, циановые, зеленые, желтые, оранжевые, красные, дальне-красные и излучающие свет в ближней инфракрасной области. В настоящей работе белки семейства GFP объединены в подсемейства согласно определенному типу хромофоров. 1. Хромопротеины gtCP из Goniopora tenuidens и cgCP из Condylactis gigantea принадлежат к DsRed-подсемейству GFP-подобных белков. Хромопротеины gtCP и cgCP могут быть причислены к дальне-красной спектральной группе, поскольку после введения соответствующих мутаций (Gurskaya et al., 2001), они 8 излучают свет именно в этом диапазоне (615 и 622 нм соответственно). В этой части работы нас интересовало, является ли изменение структуры хромофора необходимым условием при переходе от красной к дальне-красной спектральной группе белков. 384 нм 436 нм Поглощение А нм Б кДа 1 2 3 4 Рис. 2. Превращение белка gtCP в денатурирующих условиях. А. Гипсохромное спектральное превращение gtCP при рН 1,8. Спектры поглощения снимались с двухминутным интервалом при комнатной температуре. Б. Фрагментация белков при денатурации в более жестких условиях. Дорожка 1-DsRed в стандартных условиях после кипячения в буфере для электрофореза; 2-то же после кипячения в растворе 0,1 М HCl; 3- gtCP после кипячения в буфере для электрофореза; 4- gtCP после кипячения в растворе 0,1 М HCl в течение 5 мин. В ходе работ по определению структуры хромофоров gtCP из Goniopora tenuidens и cgCP из Condylactis gigantea учитывался тот факт, что эти структуры могут включать в себя достаточно лабильные элементы, которые при денатурации могут совершать различные превращения. Так, хромофор красного флуоресцентного белка DsRed, как было показано ранее (Gross et al., 2000), при денатурации присоединяет по ацилиминной группе молекулу воды (схема 2) и это превращение сопровождается гипсохромным сдвигом. При этом спектры приобретают характерный вид с такими же максимумами поглощения, как и у денатурированного GFP с п-ГБИ хромофором. В более жестких условиях (кипячение в растворе 0,1 М HCl в течение 5 мин) происходит полный гидролиз с разрывом по С=N связи ацилимина. 9 При денатурации в «мягких» условиях (рН 1,8) наблюдалось мгновенное смещение максимумов поглощения нативных белков gtCP и cgCP (580 нм для gtCP и 571 нм для cgCP) к максимуму 436 нм. Затем форма с максимумом 436 нм претерпевала дальнейшее гипсохромное превращение в форму с максимумом 384 нм (рис. 2А). Характерно, что такое гипсохромное превращение имеет изобестическую точку при 406 нм, предполагающую прямое, без каких либо дополнительных интермедиатов, превращение. При обратном титровании до значений рН 4,0 и выше форма 436 нм, но не 384 нм, ренатурировала, судя по вновь появляющимся пикам поглощения нативных белков и исчезновению поглощения при 436 нм (на рисунке не показано). Эти результаты подразумевали наличие в структуре формы 436 нм модификации хромофора, которая приводит к сдвигу поглощения в красную область спектра. Эта же форма, судя по моментальной ренатурации и восстановлению поглощения нативного белка, содержит интактную структуру хромофора. Форма же с максимумом 384 нм утрачивает такую батохромную модификацию и имеет спектр поглощения практически идентичный спектру денатурированного GFP. В свою очередь, форма 384 нм при титровании вплоть до рН 14,0 обратимо превращалась в новую форму с максимумом при 450 нм. Установленный pKa этого спектрального превращения (pKa=7.9 соответствует диссоциации фенольного протона п-ГБИ), а также максимумы поглощения двух взаимопревращающихся форм в точности совпадали с максимумами поглощения и pKa хромофора GFP. Таким образом, полученные данные предполагали, что оба хромофора gtCP и cgCP содержат ядро в виде GFP-подобной п-ГБИ структуры (соответствует спектральной форме 384 нм на рис. 2А) и дополнительно некий заместитель, который вызывает батохромный сдвиг (рис. 2А, форма 436 нм). Предполагалось, что этот заместитель представляет собой лабильное соединение и является причиной гипсохромного превращения в «мягких» условиях денатурации. Также ожидалось, что таким лабильным заместителем, как и в DsRed, может быть ацилиминная группа. Для подтверждения этих предположений те же эксперименты были проведены с красным ФБ DsRed. При денатурации в «мягких» условиях DsRed претерпевал такое же гипсохромное превращение, как gtCP и cgCP, с максимумами поглощения при 436 нм и 384 нм, и изобестической точкой при 406 нм. Анализ DsRed, gtCP и cgCP с помощью SDS-электрофореза показал, что эти хромопротеины мигрируют в виде единственной преобладающей полосы и представляют собой одноцепочечные полипептиды с молекулярными массами ~ 28 кДа (рис. 2Б, дорожки 1 и 3, показано для DsRed для gtCP). Как было установлено ранее (Gross et al., 2000), при более жестких условиях денатурации DsRed наблюдается образование двух фрагментов с молекулярными массами ~ 10 и 18 кДа, предположительно в результате 10 полного гидролиза с последующим разрывом по С=N связи ацилимина (схема 2). В случае DsRed, однако, проходит неполная фрагментация белка (рис. 2Б, дорожка 2), поскольку он содержит около 50% незрелой зеленой формы с п-ГБИ хромофором без ацилиминного заместителя. В случае хромобелков gtCP и cgCP доля фрагментированного белка значительно увеличивается (около 80%, показано для gtCP, дорожка 4), что вероятно связано с преобладанием зрелой формы с хромофором, содержащим ацилимин. HO HO O N O N R N H2O R2 денатурация рН 1,8 R1 HO O N N R H O N H O 436 нм O O 0,1 M HCl кипячение R2 N R R1 O O O N R2 + NH2 O 384 нм R1 Фрагментация Схема 2. Предполагаемые превращения хромофоров gtCP и cgCP в различных денатурирующих условиях. Таким образом, описанные выше эксперименты показали, что хромофоры белков gtCP и cgCP содержат лабильный заместитель в структуре п-ГБИ, который претерпевает такое же, как и в DsRed, превращение в «мягких» денатурирующих условиях. В более жестких условиях, как и у DsRed, наблюдается гидролитическое расщепление по этой лабильной группе, приводящее к образованию фрагментов 10 и 18 кДа. В результате проведенных экспериментов было сделано предположение, что, так же как и в DsRed, хромофоры дальне-красных белков gtCP и cgCP содержат ацилиминный заместитель в качестве батохромной модификации п-ГБИ. Для подтверждения этого предположения были проведены структурные исследования хромофоров gtCP и cgCP с помощью масс-спектрометрии. Белки денатурировали в «мягких» условиях и подвергали протеолитическому расщеплению химотрипсином (gtCP) и пепсином (cgCP). Полученный гидролизат наносили на колонку с обращенной фазой и разделяли с помощью ВЭЖХ. Детекцию фракций осуществляли одновременно при двух длинах волн – 210 и 380 нм. Детектируемая при 380 нм фракция хромопептида использовалась далее в структурных исследованиях. Очевидно, что эта фракция содержит пептид, с такой же структурой хромофора, что и форма 384 нм (рис. 2А), которая предположительно является продуктом присоединения Н2О по C=N связи ацилимина (схема 2). В дальнейших экспериментах по определению структур хромофоров gtCP и cgCP мы учитывали данные, полученные Гросс с соавт. (Gross et al., 2000), согласно которым форма хромофора DsRed с присоединенной водой в сильно 11 дегидратирующих условиях масс-спектрометра вновь превращается в ацилиминзамещенный п-ГБИ. Рис. 3. Структура хромопептида gtCP. Наиболее характерные фрагменты хромопептида в тандемных масс-спектрах обозначены квадратными скобками (более подробно данные тандемных масс-спектров gtCP представлены в таблице 1). Таблица 1. Основные пики, полученные в результате индуцируемой столкновениями фрагментации хромопептида gtCP. m/z (набл.) m/z (рассч.) Отнесение 263.1 313.1 400.2 417.2 463.1 498.2 512.2 527.0 691.2 726.2 772.2 813.3 926.3 1004.4 1171.4 263.1 313.15 400.2 417.2 463.2 498.2 512.2 527.1 691.3 726.3 772.3 813.3 926.4 1004.4 1171.5 y2 b3 b4 (V) c4 (I) y4 a5 (III) (b10)2+ y7b9 x6 (IV) b7 z7-H (II) b8 b9 y9 z11 Анализ N-концевой последовательности Относительн ая амплитуда 22 5 3 13 2 4 8 1 5 1 30 1.5 100 13 31 хромопептидов показал, что протеолитическому расщеплению подвергаются связь между Leu-60 и Ser-61 в обоих белках (для удобства здесь и далее нумерация аминокислот всех белков cоответствует нумерации GFP). Анализ масс-спектров с ионизацией образца методом электроспрэя (далее ESI-масс-спектрометрия) позволил определить массы выделенных хромопептидов, - 1187.4 Да и 993.4 Да для gtCP и cgCP соответственно. Эти массы соответствовали расчетным массам хромопептидов с последовательностями 12 SPQSQYGSIPF и SPCCAYGSKT для тех же белков. Кроме того, полученные массы предполагали, что образованию хромофоров gtCP и cgCP предшествуют реакции циклизации с дегидратацией (–Н2О) и две последовательные реакции окисления (–2H2), так же, как это показано для DsRed на схеме 1. На следующем этапе структура хромопептидов gtCP и cgCP была изучена с помощью тандемной масс-спектрометрии. В результате индуцируемой столкновениями фрагментации исходного иона хромопептида был получен ряд дочерних ионов (Таблица 1, показано для хромопептида gtCP), которые соответствовали массам фрагментов после расщепления полипептидной цепи хромопептида со структурой показанной для gtCP на рис. 3. Сравнение полученных масс фрагментов показало, что в случае хромопептида gtCP дополнительное окисление с образованием двойной связи происходит между α-углеродом и азотом Gln-65. Аналогичные данные в тандемных масс-спектрах были получены и для хромопептида cgCP. Таким образом, было установлено, что белки дальне-красной группы gtCP и cgCP содержат DsRed-подобный хромофор с ацилимином в качестве батохромной модификации в структуре п-ГБИ. 2. Красная флуоресценция белка z2FP574 из Zoanthus sp. 2 является результатом реакции окисления-декарбоксилирования Asp-65. При анализе строения хромопептида белка z2FP574 из кораллового полипа Zoanthus sp. 2 (Labas et al., 2002) было обнаружено, что кроме второй реакции окисления с образованием ацилимина, хромофор этого красного флуоресцентного белка подвергается дополнительной посттрансляционной модификации. Анализ N-концевой последовательности химотриптического хромофорсодержащего пептида z2FP574, а также данные масс-спектров SAAFDYGNRLF. С согласовывались помощью с последовательностью ESI-масс-спектрометрии была аминокислот определена масса хромопептида, - 1193,6 Да. Эта масса предполагала, что образованию хромофора z2FP574 предшествуют реакция циклизации с дегидратацией (-Н2О, -18 Да) и две последовательные реакции окисления (-2H2, -4 Да), так же как в случае DsRed, gtCP и cgCP. Кроме того, на основании этих данных было сделано предположение, что хромофор z2FP574 подвергается декабоксилированию, что отражается в дополнительной потере массы хромопептида (-СО2, -44 Да). Это предположение было подтверждено при анализе данных тандемных масс-спектров хромопептида z2FP574. При сравнении масс полученных фрагментов (Таблица 2) оказалось, что окислению-декарбоксилированию подвергается остаток Asp-65 хромофоробразующей последовательности (схема 3). 13 Таблица 2. Экспериментальные и расчетные значения m/z ионов-фрагментов в тандемных масс-спектрах хромопептида z2FP574. Отнесение m/z (набл.) m/z (рассч.) a9 b9 a10 b10 b11 z3 y4 z4 x6+2H y7 z7 y8 y9 y10 z11 888.4 916.4 1001.4 1029.4 1176.5 418.2 549.3 532.3 777.3 818.4 801.4 965.4 1036.4 1107.5 1177.5 888.4 916.4 1001.5 1029.5 1176.6 418.2 549.3 532.3 777.3 818.4 801.4 965.4 1036.5 1107.5 1177.5 O HO Относительная амплитуда 1 19 5 23 22 1 1 3 9 24 100 3 4 1 33 O O O N N NH Окисление O Декарбоксилирование Asn-68 Asn -... 69 O N N N ...-Phe Phe-6465 O Asn-68 Asn 69-... ...-Phe Phe-64 65 Схема 3. Образование хромофора красного флуоресцентного белка z2FP574. Однако, как отмечалось выше, хромофоры красных флуоресцентных белков могут содержать лабильные группы, которые, в свою очередь, могут претерпевают различные химические превращения при денатурации белка. Поэтому, на следующем этапе работы было важно показать, что аспартат 65 подвергается окислению-декарбоксилированию в результате посттрансляционных реакций в нативном белке. С этой целью, с помощью метода рентгеноструктурного анализа, была определена пространственная структура z2FP574 при разрешении 1.51 Ǻ*. Высокое качество карты электронной плотности позволило однозначно вписать остатки 64-68 (рис. 4), включающие хромофоробразующие аминокислоты. Из карты электронной плотности, видно, что Cα-углеродный атом аминокислоты 65 находится в sp2–гибридизованном состоянии, характерном и для других ацилиминсодержащих хромофоров. Кроме того, боковая цепь этой аминокислоты не содержит карбоксильной группы (на рисунке показано стрелкой). __________________ * Данная часть работы выполнена совместно с лабораторией рентгеноструктурного анализа ИБХ РАН под руководством д.х.н. В.З. Плетнева. 14 Phe-64 Asn-68 Рис. 4. Изображение структуры хромофора z2FP574 в электронной плотности 2FoFc (уровень электронной плотности ρ≥ 1.3 σ) Для определения промежуточных форм в процессе образования зрелого хромофора z2FP574 был проведен кинетический анализ созревания белка. Для этого свежетрансформированные клетки E.coli выращивали в жидкой среде, содержащей ампициллин, при 37°С в течение ночи. Затем наработанный в E.coli белок быстро выделяли при помощи металл-хелатной хроматографии на Ni-NTA. Полученный образец белка не имел поглощения в видимой области спектра, что свидетельствовало об отсутствии синтезированного хромофора. За кинетикой созревания следили по изменению спектров поглощения во времени (рис. 5). Из спектров следует, что на ранних стадиях формирования хромофора образуется преимущественно зеленая форма с максимумом поглощения при 505 нм, тогда как со временем доминирующим становится поглощение красной формы с максимумом при 552 нм. Анализ кривых показывает, что изменение концентрации красной формы имеет сигмоидный характер, что свидетельствует о существовании промежуточного продукта, предшествующего образованию зрелой формы хромофора. С другой стороны, рост поглощения при 505 нм не может отражать кинетику образования “зеленого” хромофора, так как красная форма белка также поглощает при этой длине волны. Так как полностью созревший белок не содержит зеленой формы, спектры поглощения белка, несущего “зеленый” хромофор, получали путём вычитания нормированных при 552 нм спектров поглощения красной формы из суммарного спектра белка. Изменение концентрации зеленой формы, полученное после вычитания спектров, представлено на вставке рис. 5. Видно, что в случае z2FP574 зеленая форма является промежуточной при образовании красной. Это отличает z2FP574 от другого красного флуоресцентного белка DsRed, для которого характерно образование зеленой формы хромофора, однако она не способна превращаться в красную. 15 Длина волны, нм Рис. 5. Кинетика созревания z2FP574. Изменение спектров поглощения в процессе созревания z2FP574. на вставке показаны изменение поглощения во времени при 552 нм (□) и 505 нм (○),а также расчетное изменение поглощения зеленой формы при 505 нм после вычитания поглощения красной формы при этой же длине волны (∆). Cравнение известной последовательности зеленого флуоресцентного белка zFP506 из Zoanthus sp. с аминокислотной последовательностью красного флуоресцентного белка z2FP574 показало высокую степень гомологии этих двух природных белков (84% идентичных аминокислот). Кроме того, рассмотрение кристаллических структур z2FP574 и zFP506 (Pletneva et al., 2007) обнаружило практически одинаковое аминокислотное окружение хромофоров zFP506 и z2FP574. Единственным существенным отличием являлся хромофоробразующий остаток Asp-65, который в зеленом флуоресцентном белке замещен на Asn. Для того, чтобы понять насколько важен характер боковой цепи аминокислоты 65, были получены мутантные варианты z2FP574 и zFP506 с заменами в этой позиции. Влияние мутаций изучали с помощью оптической спектроскопии полученных мутантных форм и масс-спектрометрии соответствующих хромопептидов, выделенных из мутантных белков с помощью ВЭЖХ. Прежде всего, мы проверили, будет ли происходить дополнительное окисление и образование хромофора DsRed-типа после “выключения” реакции декарбоксилирования. Очевидно, что аланин является декарбоксилированным вариантом аспарагиновой кислоты. Заменой D65A в белке z2FP574, мы имитировали процесс декарбоксилирования до начала синтеза хромофора и далее проверяли, будет ли осуществляться дополнительное окисление. Выделенный белок z2FP574 D65A в спектрах поглощения имел один максимум в видимой области при 491 нм. В спектрах флуоресценции при возбуждении светом 490 нм наблюдалась интенсивная эмиссия в зеленой области спектра 16 (максимум 506 нм), однако в красной области (для природного z2FP574 максимум 570 нм) флуоресценции не детектировалось. Из полностью созревшего z2FP574 D65A после денатурации и расщепления пепсином был выделен хромопептид. Масса хромопептида, полученная с помощью ESIмасс-спектрометрии, оказалась равной 1048,5 Да. Это значение на 20 Да меньше массы немодифицированного пептида SAAFАYGNRL (1068,5 Да), что соответствует одной стадии дегидратации и одной стадии окисления (хромофор GFP-типа, схема 1). Таким образом, предварительное удаление карбоксильной группы приводит к образованию хромофора GFP-типа, который не подвергается последующему окислению. Кроме того, для изучения влияния декарбоксилирования на окисление была произведена замена аспартата в позиции 65 z2FP574 на изостерический остаток аспарагина. Полученный белок характеризовался поглощением с максимумом при 492 нм и зеленой флуоресценцией с максимумом эмиссии при 506 нм. Никаких следов красной формы, как и в случае с z2FP574 D65A, обнаружено не было. В масс-спектрах выделенного хромопептида, полученного после расщепления белка пепсином, был обнаружен пик с m/z 1092,5, что соответствует массе на 20 Да меньшей, чем масса немодифицированного пептида SAAFNYGNRL. Таким образом, при образовании хромофора z2FP574 D65N происходит одна стадия дегидратации и одна стадия дегидрирования, как и случае с другими белками, имеющими хромофор GFP-типа. Далее был получен вариант z2FP574 с заменой D65E. В этом мутанте, как и в природном белке z2FP574, боковая цепь первой хромофоробразующей аминокислоты содержит карбоксильную группу, однако она изолирована от участка окисления дополнительной метиленовой группой. В этом случае предполагалось, что потенциально возможные процессы окисления и декарбоксилирования не должны влиять друг на друга. С помощью этой мутации мы хотели разобщить эти два процесса, чтобы проверить могут ли они протекать независимо друг от друга. Полученный белок имел ярко выраженное поглощение в зеленой области спектра с максимумом при 491 нм. Кроме того, в спектре поглощения был обнаружен небольшой пик с максимумом при 552 нм (рис. 6А). Однако, по сравнению с зеленой формой, выход красной был очень низким (< 4%). Первоначально красную форму удалось детектировать только в спектрах флуоресценции с максимумом эмиссии при 570 нм при возбуждении светом 550 нм (рис. 6Б). 17 А Б Рис. 6. Спектральные свойства мутантного белка z2FP574 D65E. А. Спектр поглощения (пунктирная линия - спектр белка с увеличенной в 5 раз концентрацией); Б. Спектры возбуждения (—) и эмиссии (--)красной формы. С помощью ВЭЖХ удалось разделить хромопептиды, представляющие зеленую и красную формы. Оба выделенных хромопептида были проанализированы массспектрометрически. В ESI масс-спектре основной фракции был обнаружен пик с m/z 1107,5 соответствующий пептиду SAAFEYGNRL (1126,5 Да) с хромофором GFP-типа. В масс-спектре второй фракции был обнаружен пик с m/z 1105,5 с хромофором DsRed-типа, в котором Glu-65 дополнительно окислен, но не декарбоксилирован. Таблица 3. Анализ тандемных масс-спектров зеленой (исходный m/z 1107,5) и красной (исходный m/z 1105,5) форм хромопептида z2FP574 D65E. Ион a2 b2 b3 b4 a7 b7 a8 b8 a9 b9 a10 b10 z2FP574 D65E m/z Зелен. m/z Зелен. m/z Красн. ∆ m/z m/z Зелен. m/z Зелен. m/z Красн. ∆ m/z Ион (рассч.) (набл.) (набл.) (набл.) (рассч.) (набл.) (набл.) (набл.) 131,1 131,1 131,1 0 z1 115,1 115,1 115,1 0 159,1 159,1 159,1 0 y2 288,2 288,2 288,2 0 230,1 230,1 230,1 0 z2 271,2 271,2 271,2 0 377,2 377,1 377,1 0 y3 402,2 402,2 402,2 0 678,3 678,3 676,4 1,9 z3 385,2 385,2 385,2 0 706,3 706,3 704,3 2 x5+2H 630,3 630,2 630,2 0 792,3 792,3 790,3 2 y6 731,3 731,3 729,3 2 820,3 820,3 818,3 2 z6 714,3 714,3 712,2 2,1 948,4 948,4 946,4 2 y7 878,4 878,4 876,3 2,1 976,4 976,4 974,4 2 z7 861,4 861,4 859,3 2,1 1061,4 1061,4 1059,4 2 y8 949,4 949,4 947,3 2,1 1089,5 1089,4 1087,4 2 z8 932,4 932,4 930,4 2 y9 1020,5 1020,4 1018,4 2 18 Для подтверждения этих выводов, были сняты тандемные масс-спектры зеленой (исходный m/z 1107,5) и красной (исходный m/z 1105,5) форм хромопептидов. Из табл. 3. видно, что разница ∆m/z между одинаковыми фрагментами хромопептидов обеих форм, содержащих Glu-65, составляет 2 Да. Для дальнейшей характеристики перехода белка из зеленого в красное флуоресцентное состояние, в гомолог z2FP574, природный зеленый флуоресцирующий белок zFP506 вводили замену N65D. После введения мутации красная форма белка действительно образовывалась, однако её образование, по сравнению с z2FP574, при комнатной температуре оказалось существенно замедленным. А Длина волны, нм Б Рис. 7. Изменение спектральных свойств zFP506 N65D в процессе его превращения из зеленой в красную флуоресцирующую форму. А. Изменение спектров поглощения при 50°С (спектры записывали с интервалом в 1 ч). Б. Изменение цвета белка (превращение остановлено на разных стадиях понижением температуры до 0ºС). Зелено-красное превращение zFP506 N65D в значительной степени зависело от температуры (рис. 7). При 4ºС спектры поглощения белка не обнаруживали практически никаких изменений в течение месяцев, тогда как при 75ºС для максимального превращения требовалось менее 15мин. Это свойство N65D мутанта было в дальнейшем использовано для характеристики промежуточных состояний хромофора при созревании белка. Для получения белка в исходном зеленом флуоресцирующем состоянии, свежетрансформированные клетки E.coli высевали на чашки Петри с твёрдой питательной 19 средой и выращивали в течение ночи при 37°С. После этого белок созревал в течение нескольких дней при 4°С в клетках и затем был выделен на Ni-NTA. Для изучения промеРис. 8. Изменения в ESI массспектрах химотриптического гидролизата zFP506 N65D в процессе зеленокрасного превращения. Сверху вниз: исходный образец, а также белок после 40 и 250 мин инкубации при 65°С). Внизу показаны структуры хромопептидов, соответствующие указанным значениям m/z. жуточных продуктов zFP506 N65D нагревали до 65°С и через определенные интервалы времени отбирали образцы белка. Далее белок денатурировали и подвергали протеолитическому химотрипсином. расщеплению Для того чтобы проанализировать все возможные формы хромофора, возникающие превращения в белка, процессе разделение хромопептидов в этом случае не проводили. Полученный таким химотриптический подвергали образом гидролизат сразу масс-спектрометрическому анализу (рис. 8). В исходном образце был обнаружен пик с m/z 1226,6, соответствующий, как было отмечено выше, пептиду, несущему хромофор GFP-типа. В образцах же подвергшихся нагреванию был идентифицирован дополнительный пик с m/z 1180,6, который соответствовал дополнительно окисленному и декарбоксилированному хромофору (-46 Да). С увеличением времени инкубации относительная амплитуда дополнительно модифицированного хромопептида с m/z 1180,6 увеличивалась. Следует отметить, что в ходе масс-спектрометрических исследований на промежуточных стадиях превращения не было обнаружено только окисленной (-2 Да) или только декарбоксилированной (-44 Да) форм хромофора. Эти данные, а также наличие изобестической точки в спектрах превращения белка (рис. 7А) свидетельствует о том, что переход происходит без промежуточных продуктов. Таким образом, на основании 20 полученных результатов можно сделать заключение, что белок z2FP574 также принадлежит к DsRed подсемейству GFP-подобных белков, однако образованию хромофора этого белка предшествуют другие посттрансляционные реакции. 3. Является ли желтая флуоресценция результатом необычного микроокружения хромофора, или следствием дополнительной посттрансляционной модификации пГБИ? Цветовая вариабельность белков семейства GFP является, в основном, следствием различных дополнительных посттрансляционных модификаций хромофора GFP-типа (пГБИ). Как отмечалось выше, дополнительное окисление п-ГБИ хромофора в белке DsRed вызывает сдвиг из зеленой спектральной области в красную (~ 80 нм). С другой стороны, как было показано на белках gtCP и cgCP, дополнительные модификации хромофора DsRed-типа не являются необходимым условием при переходе от красной к дальнекрасной спектральной группе белков. Желтый флуоресцентный белок phiYFP из медузы Phialidium (Shagin et al., 2004) обладает максимумами возбуждения и эмиссии 525 и 537 нм, соответственно. Из кораллового полипа Zoanthus класса Anthozoa был клонирован еще один желтый флуоресцирующий белок zFP538 (Matz et al., 1999) с похожими на phiYFP характеристиками (максимумы возбуждения и эмиссии при 528 и 538 нм). Поскольку желтые флуоресцентные белки представляют промежуточную между зелеными и красными белками спектральную группу, нас интересовало, являются ли фотофизические свойства первых следствием дополнительных посттрансляционных модификаций хромофора или результатом необычного микроокружения хромофора GFP-типа. C помощью гомологичного моделирования была построена трехмерная структура phiYFP. Очевидно, что этот подход неприменим в «чистом» варианте для белков семейства GFP, так как при помощи моделирования невозможно предсказать структуру хромофора – ключевого компонента флуоресцентного белка. В настоящей работе разработан метод установления структуры флуоресцентных белков объединяющий гомологичное моделирование in silico для определения общей пространственной структуры белка и эксперименты in vitro для установления структуры хромофора. Структуру хромофора phiYFP определяли с помощью MALDI- и тандемной массспектрометрии. Для этого, после расщепления денатурированного белка пепсином, был выделен хромопептид phiYFP. Определенная с помощью MALDI-масс-спектрометрии масса (1035.5 Да) была на 20 Да меньше расчетной массы немодифицированного пептида Val-Thr-Thr-Leu-[Thr-Tyr-Gly]-Ala-Gln-Cys из ранее опубликованной последовательности 21 белка phiYFP (Shagin et al., 2004). Дальнейшая фрагментация иона хромопептида с m/z 1036.5 в тандемных масс-спектрах привела к образованию дочерних ‘‘a-,’’ ‘‘b-,’’ ‘‘c-,’’ и ‘‘x-,’’ ‘‘y-’’ионов (табл. 4). Сравнение значений m/z между соседними ‘‘y-’’ионами соответствовало массам фрагментов с последовательно отщепленными остатками Val, Thr, Thr и Leu. Такой же анализ ‘‘a,’’ ‘‘b’’ и ‘‘c’’-ионов позволил определить С-концевую последовательность хромопептида (табл. 4). Исходя из полученных масс- спектрометрических данных можно было предположить, что хромофор phiYFP является результатом внутримолекулярной реакции циклизации (с потерей одной молекулы Н2О) и реакции окисления (с потерей Н2), точно так же, как это происходит в хромофоре GFP. Таким образом, среди всех известных на данный момент ФБ с немодифицированным пГБИ хромофором, phiYFP характеризуется флуоресценцией с максимумом эмиссии (537 нм) наиболее сдвинутым в длинноволновую область спектра. Таблица 4. Сравнительный анализ ионов-фрагментов phiYFP, полученных в тандемных масс-спектрах в результате фрагментации исходного иона с m/z 1036.5 хромопептида VTTL[TYG]AQC. Тип иона y9 y8 y7 y6 x5+2H y3 y2 b9 b8 c4 b4 a4 b3 b2 a2 m/z (набл.) 937.40 836.35 735.32 622.26 549.18 321.11 250.08 915.45 787.40 432.29 415.26 387.24 302.15 201.13 173.16 [MH+] (вычисл.)a) 937.41 836.36 735.31 622.23 549.18 321.12 250.09 915.46 787.40 432.28 415.26 387.26 302.17 201.12 173.13 Ошибка -0.01 -0.01 0.01 0,03 0,00 -0.01 -0.01 -0.01 0,00 0,01 0,00 -0.02 -0.02 0,01 0,03 Последовательность TTL[TYG]AQC TL[TYG]AQC L[TYG]AQC [TYG]AQC [TYG]AQC AQC QC VTTL[TYG]AQ VTTL[TYG]A VTTL VTTL VTTL VTT VT VT а) в вычисленных значениях [MH+] для ионов-фрагментов учтена посттрансляционная реакция образования хромофора (аминокислоты [TYG]) с соответствующей потерей массы 20 кДа. Моделирование пространственной структуры phiYFP осуществляли при помощи программы MODELLER. При моделировании в качестве шаблона была использована опубликованная ранее кристаллическая структура avGFP (51% идентичных аминокислот). Полученная структура хромофора включалась в последовательность белка в виде гетерогруппы на стадии выравнивания последовательностей. В этом случае MODELLER переносит хромофор в созданную модель без модификаций, как жёсткое тело. 22 Рис. 9. Хромофор phiYFP и его окружение. Предполагаемые водородные связи обозначены пунктирными линиями. Остаток хромофора отмечен темно серым, а остаток Tyr-203 светло серым тоном Полученная модель на следующем этапе использовалась для определения аминокислот в окружении хромофора, которые могут влиять на фотофизические свойства белка (рис. 9), и по некоторым ключевым позициям производились замены с помощью направленного мутагенеза. При анализе окружения хромофора оказалось, что Tyr-203 лежит в непосредственной близости от фенольного кольца хромофора (рис. 9), что предполагает наличие π-π стэкинг-взаимодействий между этими ароматическими кольцами. Ранее было сделано предположение (Wachter et al, 1998), что мутация T203Y в avGFP является ключевым фактором, приводящим к батохромному сдвигу максимума эмиссии (527 нм). Для того чтобы понять, какой вклад вносят эти нековалентные взаимодействия в общий сдвиг флуоресценции phiYFP, были получены мутанты с заменами Y203V и Y203T. Вариант Y203V характеризовался максимумами возбуждения и эмиссии при 512 нм и 525 нм соответственно. Мутант Y203T обладал максимумами возбуждения и эмиссии при 501 нм и 516 нм. Поскольку Val и Thr являются алифатическими аминокислотами, полученные результаты позволили сделать вывод, что π-π стэкинг-взаимодействия хромофора с фенольным кольцом Tyr-203 вносят лишь небольшой вклад (около 10 нм) в общий сдвиг спектров в красную область по сравнению с avGFP (максимум эмиссии 508 нм). Кроме Tyr-203, дополнительное влияние на спектры флуоресценции phiYFP, повидимому, оказывает позиция 205, в которой в данном случае находится остаток валина. В avGFP в этом положении находится остаток Ser, который через внутрибелковую молекулу воды образует водородную связь с кислородом фенолята хромофора и, таким образом, частично стабилизирует отрицательный заряд на фенолятном конце хромофора. 23 Известно, что при возбуждении химических соединений, подобных по структуре п-ГБИ, происходит сдвиг общего отрицательного заряда в сторону гетероциклического конца хромофора (Chattoraj et al, 1996). Стабилизирующий эффект ОН-содержащих алифатических аминокислот, очевидно, препятствует переносу заряда и вызывает гипсохромный сдвиг в avGFP (Jung et al, 2005). Замена V205S в белке phiYFP также вызывала смещение эмиссии флуоресценции к максимуму 529 нм. Напротив, остаток Val205 в природном phiYFP не обладает таким стабилизирующим эффектом и, вероятно, является причиной дополнительного (около 10 нм) сдвига в спектрах флуоресценции. Еще одним существенным, и не менее важным фактором, обусловливающим спектральные свойства phiYFP, может служить образующаяся водородная связь между Glu-222, Thr-65 и N2 азотом имидазолонового цикла хромофора (рис. 9). Для проверки этого предположения, были получены T65V и E222Q варианты phiYFP. Обе замены вызывали гипсохромный сдвиг в спектрах возбуждения и эмиссии, с максимумами при 514 нм; 524 нм для T65V и 517 нм; 530 нм для E222Q. Таким образом, сравнительный анализ мутантов phiYFP показал, что сразу несколько факторов определяют фотофизические характеристики белка и вклад этих факторов имеет, по-видимому, аддитивный характер. Второй белок, который нас интересовал, zFP538 из Zoanthus sp. (Matz et al., 1999), характеризуется очень похожими на phiYFP фотофизическими характеристиками (максимумы возбуждения и эмиссии при 528 и 538 нм). В 2005 году была опубликована кристаллическая структура zFP538 (Remington et al., 2005). На основании полученной структуры были сделаны предположения о необычной трициклической структуре хромофора zFP538, которая по всей вероятности должна образовываться в результате нуклеофильной атаки атома азота Lys-65 по C=N связи ацилимина (схема 4). Схема 4. Предполагаемая реакция синтеза хромофора белка zFP538. Однако, опубликованная структура была получена с достаточно низким разрешением (2.7 Ǻ) и с неудовлетворительным качеством карты электронной плотности, в том числе в районе хромофоробразующей последовательности. 24 Phe-64 Asp-68 Рис. 10. Хромофор zFP538 с остатком Phe-64, предшествующим хромофоробразующей последовательности KYG, и последующим остатком Asp-68 в 2Fo-Fc электронной плотности (уровень ρ=1.0σ) Для проверки предположений, приведенных выше, нами была получена кристаллическая структура zFP538 при разрешении 1,8 Ǻ*. Асимметрическая часть кристаллической ячейки zFP538 содержала один тетрамер белка. Высокое качество карты электронной плотности позволило однозначно вписать остатки 6-231 для всех четырёх протомеров (A, B, C, D). Топология полученной структуры zFP538 при разрешении 1,8 Å оказалась похожей на определенную ранее структуру для того же белка при разрешении 2.7 Ǻ (Remington et al., 2005) и характеризовалась величиной RMSD = 0.44 Ǻ для всех эквивалентных Cα атомов. Как и в случае других белков семейства GFP, структура протомера zFP538 имела форму закрытого с торцов β-цилиндра, сформированного из 11ти антипараллельных β-сегментов и одной α-спирали, в центре которой располагается хромофор. Как и предполагалось ранее, хромофор zFP538 имел трициклическую структуру, в которой третий тетрагидропиридиновый цикл, по-видимому, образуется в результате нуклеофильной реакции трансиминирования, показанной на схеме 4. Эта реакция сопровождается разрывом основной цепи белка по связи Cα−N остатка Lys-65 с образованием концевой карбоксамидной группы у Phe-64. При этом, амино- и карбонильная группы карбоксамида располагаются на расстояниях водородной связи (рис. 10) соответственно с карбонильной группой Gly-67 (2,97 Å) и атомом азота Nε гетероциклического кольца бывшего остатка Lys-65 (2.82Å), что свидетельствует о протонированной форме Nε. Атомы Cα и Nε дополнительного гетероцикла хромофора принимают sp2-гибридизацию и формируют кратную связь Cα=Nε (d = 1,33 Å). Эта связь __________________ * Данная часть работы выполнена совместно с лабораторией рентгеноструктурного анализа ИБХ РАН под руководством д.х.н. В.З. Плетнева. 25 и две прилегающие к ней связи, в отличие от остальных связей гетероцикла, имеет планарное расположение. Связь Cα=Nε располагается в одной плоскости с хромофором (торсионный угол ψ[C−Cα] ~16°), что приводит к расширению конъюгированной системы сопряженных двойных связей и, как следствие, сдвигу спектральных характеристик в более длинноволновую область. На основании полученных в данной работе данных можно сделать вывод, что настройка флуоресценции белков семейства GFP в желтом спектральном диапазоне может осуществляться как за счет различных нековалентных взаимодействий п-ГБИ хромофора с его аминокислотным окружением (phiYFP, максимум эмиссии 537 нм), так и с помощью дополнительных посттрансляционных модификаций хромофора DsRed-типа (zFP538, максимум эмиссии 538 нм). 4. Хромофор фотоактивируемого белка asFP595 из Anemonia sulcata является производным хромофора DsRed-типа. Некоторые белки семейства GFP обладают уникальной способностью изменять оптические свойства в ответ на облучение светом. Так, при облучении светом определенной длины волны некоторые природные нефлуоресцирующие белки могут переходить во флуоресцентное, а при облучении светом другой длины волны, возвращаться в исходное нефлуоресцентное состояние (явление фотоактивации). Другая группа белков этого семейства способна изменять максимумы возбуждения/эмиссии при освещении светом определенной длины волны (фотоконверсия, фотопревращение). Все эти изменения могут иметь как обратимый, так и необратимый характер. Белки, способные к таким светоиндуцируемым превращениям, могут применяться в клеточной биологии как маркеры (highlighters) для мечения определенных популяций клеточных объектов и исследования их подвижности в живой клетке. Фотоактивируемый белок asFP595 из морского анемона Anemonia sulcata исходно обладает незначительной флуоресценцией при 595 нм (квантовый выход Φ<0.001) (Lukyanov K.A. et al., 2000). При освещении светом ~570 нм он переходит во флуоресцентное состояние, которое со временем вновь возвращается в исходную нефлуоресцирующую форму (Chudakov et al., 2003). Превращение в нефлуоресцирующую форму можно также мгновенно инициировать облучением синим светом (~ 450 нм). Таким образом, флуоресцентные свойства фотоактивируемого белка asFP595 можно контролировать светом определенной длины волны и интенсивности. Возможно, столь необычные свойства первоначально привели к множеству ошибок в интерпретации 26 структуры этого белка (Wiedenmann et al., 2000), а также структуры его хромофора (Martynov et al., 2001; Zagranichny et al., 2004; Andresen et al., 2005; Wilmann et al., 2005). На основании известной последовательности ДНК можно было предположить, что полноразмерный asFP595, так же, как и другие белки семейства GFP, должен иметь массу ~ 28 кДа (Lukyanov K.A. et al., 2000). Однако при анализе очищенного белка с помощью SDS-гель электрофореза было обнаружено, что белок с массой 28 кДа присутствует лишь в незначительных количествах, а основные полосы соответствуют полипептидам 20 кДа и 8 кДа (рис. 11А). После переноса на ПВДФ мембрану, N- и C-концевые последовательности этих полипептидов анализировали с помощью деградации по Эдману и с помощью карбоксипептидазы А. Было установлено, что полипептид с массой 8 кДа представляет собой N-концевую часть молекулы и содержит на С-конце аминокислоты Cys, Ser и Thr, соответствующие С-концевой последовательности –Thr-Ser-Cys. Подобные же эксперименты с полипептидом 20 кДа не дали никакой информации относительно Nконцевой последовательности, но позволили определить аминокислоты, составляющие Cконцевую последовательность (Asn и His). В результате проведенных экспериментов было сделано предположение, что полипептиды 8 кДа и 20 кДа являются N- и C-концевыми фрагментами последовательности asFP595, которые образуются после расщепления полноразмерного полипептида непосредственно перед хромофоробразующими аминокислотами Met-Tyr-Gly- (рис. 11Б). Позже эти результаты были подтверждены кристаллической структурой asFP595 другими авторами (Quillin et al., 2005). А кДа Б Рис. 11. Фрагментация белка asFP595. А. Анализ очищенного белка с помощью SDS-гель электрофореза (15% полиакриламид). Б) Схема фрагментации белка с образованием полипептидов 8 кДа и 20 кДа. Место предполагаемого расщепления отмечено стрелкой. 27 Некоторое время существовали противоречивые данные относительно посттрансляционных реакций, приводящих к фрагментации asFP595. Так Zagranichny с соавт. (Zagranichny et al., 2004), Andresen с соавт. (Andresen et al., 2005) и Wilmann с соавт. (Wilmann et al., 2005) предположили, что фрагментация происходит в результате расщепления полипептидной цепи между азотом и карбонильным углеродом ацилимина (схема 4, структура а) с образованием иминозамещенного варианта п-ГБИ (схема 4, структура б). Опубликованная позже Quillin с соавт. (Quillin et al., 2005) кристаллическая структура asFP595 обнаруживала расщепление полипептидной цепи, однако даже при разрешении 1,38 Ǻ нельзя было однозначно сказать, атом азота или кислорода входит в состав заместителя п-ГБИ (схема 4, структуры б и в, выделено серым фоном). С помощью встречного синтеза Yampolsky с соавт. (Yampolsky et al., 2005) показал, что модельный ацетилзамещенный п-ГБИ обладает исключительно схожими c хромофором asFP595 характеристиками в спектрах флуоресценции и поглощения в диметилформамиде. Схема 5. Возможные реакции фрагментации asFP595 по ацилиминной группе. Однако прямых доказательств присутствия структуры б или в в природном белке не было приведено. В своей работе мы исходили из предположения, что при наличии иминозамещенного варианта п-ГБИ (схема 5, структура б) в структуре хромофора природного asFP595, денатурация белка в кислой среде должна сопровождаться спектральным превращением похожим на превращение при денатурации DsRed, gtCP и cgCP в тех же условиях (см. рис. 2А). Предполагалось, что в этом случае, как и в белках подсемейства DsRed с ацилиминозамещенным хромофором, денатурация asFP595 должна сопровождаться гипсохромным превращением с присоединением Н2О по C=N связи с образованием продукта, поглощающего около 380 нм (первая стадия превращения, 28 показанного на схеме 2). Однако полученные экспериментальные данные не подтвердили этого предположения. Кислотная денатурация asFP595 сопровождалась сдвигом максимума поглощения нативного белка (568 нм) к максимуму 430 нм, и форма 430 нм не претерпевала дальнейшего гипсохромного превращения в форму 384 нм, что предполагало отсутствие лабильной С=N связи. Наличие изобестической точки при 485 нм свидетельствовало о том, что переход из нативного состояния в денатурированную форму 430 нм происходит без каких-либо дополнительных промежуточных продуктов (рис. 12). В дальнейшем, для установления структуры хромофора природного белка, мы выделяли концевые протеолитические пептиды, прилегающие к месту разрыва полипептидной цепи asFP595, и анализировали их структуру с помощью массспектрометрии. После денатурации в кислой среде (рН 2,8), asFP595 подвергали протеолитическому расщеплению пепсином и пептиды полученного гидролизата разделя- Рис. 12. Изменение спектра поглощения белка asFP595 при денатурации в кислой среде (рН 2,8) Спектры снимали с интервалом в 2 мин. ли с помощью ВЭЖХ. Хромофорсодержащий пептид, поглощающий при 430 нм, анализировали с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрии. Масс-спектр хромопептида содержал пик с зарядом +1 и m/z 665,2. Дальнейшая фрагментация иона с m/z 665,2 в тандемных масс-спектрах привела к образованию пиков с m/z 546,2, 418,3 и 331,1, которые интерпретировались как b5, b4 и b3 ионы-фрагменты, соответствующие Cконцевой последовательности хромопептида -Ser-Lys-Thr (рис. 11Б). Таким образом, можно было сделать заключение, что исходный родительский ион с m/z 665,2 соответствует пептиду [хромофор]-Ser-Lys-Thr, в котором п-ГБИ хромофор образован последовательностью Met-Tyr-Gly и содержит карбонильную группу в качестве заместителя (схема 5, структура в). В более ранних работах (Gross et al., 2000) было показано, что ацилиминозамещенный хромофор DsRed устойчив к гидролизу в условиях, 29 в которых происходит масс-спектрометрический анализ хромопептида. Поэтому, представлялось маловероятным, что детектируемое в масс-спектрах кето-производное является продуктом полного гидролиза иминозамещенного хромофора в процессе опосредованной матриксом лазерной десорбции образца. В отличие от хромофорной группировки, С-концевые карбоксильная или карбоксамидная группы фрагмента 8 кДа, которые могут образовываться в результате двух альтернативных реакций фрагментации (схема 5, структуры г и д), являются стабильными соединениями в условиях, применяемых в масс-спектрометрии. Для идентификации С-концевой группы, фрагмент 8 кДа был выделен с помощью гельфильтрации на сефадексе G-100, и впоследствии подвергнут расщеплению протеазой S. aureus V8. Очищенный с помощью ВЭЖХ С-концевой пептид фрагмента 8 кДа анализировали с помощью MALDI-TOF. В результате этих экспериментов был идентифицирован основной пик с зарядом +1 и m/z 1545,8, который соответствовал сайту расщепления протеазой после остатка Glu-48 и массе пептида с последовательностью GGPLPFAFHILSTSC с амидной группой на С-конце. Поскольку разница в массах пептида с амидом и карбоксилом составляет всего одну единицу, для уверенного определения этой разницы был синтезирован такой же пептид, содержащий С-концевую карбоксильную группу. Как природный, так и синтетический пептиды GGPLPFAFHILSTSC были подвергнуты фрагментации в тандемных масс-спектрах. Таблица 5. Ионы-фрагменты, обнаруженные в тандемных масс-спектрах синтетического и протеолитического пептидов GGPLPFAFHILSTSC ←←←←←←←←←←← →→→→→→→→→→→ GGPLPFAFHILSTSC GGPLPFAFHILSTSC Тип иона y3 y7 y8 y9 y10 y11 y13 y14 y15 C-концевые ионы m/z m/z (выч)a) (синт)б) 310.1 310.0 760.4 760.1 907.5 907.3 978.5 978.4 1125.6 1125.4 1222.6 1222.5 1432.8 1432.7 1489.8 1489.6 1546.8 1546.8 m/z (прот)в) 309.0 759.1 906.2 977.3 1124.5 1221.4 1431.6 1488.5 1545.6 Тип иона a4 b6 a7 b7 b9 a11 b12 b13 b14 N- концевые ионы m/z m/z (выч)a) (синт)б) 297.1 297.1 569.1 569.1 612.2 612.2 640.2 640.1 924.4 924.3 1122.6 1122.5 1237.6 1237.6 1338.7 1338.7 1425.8 1425.8 m/z (прот)в) 297.0 569.0 612.0 640.1 924.2 1122.5 1237.5 1338.7 1425.7 а) вычисленные значения m/z для ионов-фрагментов, содержащих СООН группу на С-конце; б) и в) экспериментальные значения m/z для ионов-фрагментов, полученных в тандемных масс-спектрах синтетического (синт.) пептида и пептида, полученного после протеолитического расщепления (прот.) фрагмента 8 кДа. Сравнение полученных фрагментов (табл. 5) показало, что N-концевые ионыфрагменты как синтетического, так и протеолитического пептида GGPLPFAFHILSTSC 30 имеют практически одинаковые m/z. Напротив, С-концевые ионы протеолитического пептида характеризуются значениями m/z на одну единицу меньшими, чем соответствующие ионы синтетического пептида. На основе полученных результатов было сделано предположение о наличии карбоксамида в качестве С-концевой группы фрагмента 8 кДа. Таким образом, масс-спектрометрический анализ концевых протеолитических пептидов, прилегающих к месту разрыва полипептидной цепи asFP595, согласуется с реакцией, показанной на схеме 5 справа. Эта реакция приводит к фрагментации asFP595 с образованием кето-производного п-ГБИ в качестве хромофорной группировки, и одновременно к образованию амида цистеина в качестве С-концевого остатка фрагмента 8 кДа (схема 6). Также, полученные результаты позволили предположить, что хромофор фотоактивируемого белка asFP595 из Anemonia sulcata является производным хромофора DsRed-типа и является результатом посттрансляционной реакции гидролиза ацилиминного заместителя п-ГБИ. Такая же реакция с фрагментацией происходила в случае хромопротеинов gtCP и cgCP, но не в процессе созревания белка, а при денатурации в жестких денатурирующих условиях (рис. 2Б). Схема 6. Посттрансляцинная фрагментация asFP595 с образованием полипептидов 8 кДа и 20 кДа. Для изучения последовательности реакций, приводящих к фрагментации белка, была изучена кинетика созревания asFP595. С этой целью, был получен незрелый белок (не имеющий поглощения в видимой области спектра), и за синтезом хромофора наблюдали по изменению спектров поглощения (рис.13). Изменение спектров поглощения белка в процессе его созревания показало, что конечная форма хромофора, поглощающая при 568 нм, образуется из промежуточной формы с максимумом при 420 нм. Аналогичная картина наблюдалась при изучении кинетики созревания красного флуоресцентного белка DsRed и хромобелков gtCP и cgCP (Verkhusha et al., 2004). Однако три последних белка 31 имеют типичный для красных флуоресцентных белков хромофор, содержащий ацилимин (хромофор DsRed-типа). Спектры созревания asFP595 характеризуются изобестической точкой при переходе из формы 420 нм в 568 нм, что свидетельствует об исключительно коротких временах жизни промежуточных соединений, либо их отсутствии. Далее были проведены эксперименты с целью определения типа хромофора промежуточной формы asFP595, поглощающей при 420 нм. Для этого белок на промежуточной стадии созревания денатурировали и подвергали протеолитическому расщеплению пепсином. Хромофорсодержащий пептид, выделяли при помощи ВЭЖХ и анализировали масс-спектрометрически. Масса полученного хромопептида составила 1406,3 Да (1407,3 m/z), что на 20 Да меньше теоретической массы пептида HILSTSCMYGSKT (1426,6 Да). Такая потеря в массе наблюдается в ходе синтеза хромо 568 нм 420 нм Рис. 13. Изменение спектров поглощения asFP595 в процессе созревания белка. Спектры снимали с интервалом в 1ч при 22°С. фора GFP и других зеленых флуоресцентных белков и возникает в результате посттрансляционных реакций дегидратации и окисления хромофоробразующей последовательности аминокислот. Максимум в спектрах поглощения при 420 нм свидетельствует о протонировании фенольной группы хромофора этой промежуточной формы (Brejc et al., 1997). Таким образом, было сделано предположение, что в случае asFP595 конечный хромофор образуется из промежуточного протонированного GFPподобного хромофора. Как уже отмечалось выше (схема 1), хромофор красного флуоресцентного белка DsRed образуется в результате дополнительного окисления п-ГБИ в присутствии О2. Для изучения природы окислительной реакции при образовании зрелой формы asFP595, мы использовали метод детекции перекиси водорода, которая должна выделяться в ходе окисления хромофора кислородом. Аналогичный подход был ранее использован при изучении реакций синтеза хромофора GFP (Zhang et al., 2006). На стадии образования формы белка с поглощением 420 нм к образцу добавлялся реагент AmplexRed и пероксидаза хрена, катализирующая окисление AmplexRed перекисью. По количеству 32 образовавшейся окисленной формы AmplexRed проводили оценку выделившейся в ходе синтеза хромофора перекиси. Однако детекция перекиси, способной выделяться на стадии превращения GFP-хромофора в конечную кето-форму, осложняется тем, что синтез самого GFP-хромофора сопровождается также выделением пероксида. Чтобы учитывать образование перекиси только на последней стадии, детекцию начинали с момента появления изобестической точки в спектрах поглощения белка. В этом случае происходит только один процесс – превращение 420 нм - формы (GFP-хромофора) в конечную 568 нм - форму, а вклад первой реакции исключительно мал. Оказалось, что превращение хромофора из формы 420 нм в конечную зрелую сопровождается эквимолярным выделением перекиси водорода (нами было определено молярное соотношение H2O2:asFP595 = 0,96). Таким образом, на основании приведенных здесь данных можно заключить, что на промежуточной стадии синтеза образуется хромофор GFP-типа, который далее окисляется с выделением эквимолярного количества перекиси водорода. Наиболее вероятным продуктом этой реакции может быть ацилиминзамещеный хромофор. Кето-заместитель образуется в результате гидролитического расщепления ацилимина, однако из-за высокой скорости последней реакции детектировать ацилимин не удается и наблюдается “изобестическое” образование конечной формы (схема 7). 420 нм HO O N N R NH O R1 O2 568 нм HO HO H 2O2 O O N N R2 R N O O N R2 O N H 2O R O + R2 NH2 O O R1 R1 Схема 7. Предполагаемая последовательность реакций в ходе синтеза хромофора asFP595 5. Фотопревращение хромофора флуоресцентного белка из Dendronephthya sp. В отличие от обратимого характера перехода фотоактивируемого белка asFP595 из нефлуоресцирующего во флуоресцентное состояние, зеленый фотоконвертируемый флуоресцентный белок из коралла Dendronephthya sp. (Dend FP) (Labas et al., 2002) претерпевает необратимое светозависимое превращение в форму, излучающую красный свет. Очищенный на Ni-NTA агарозе рекомбинантный Dend FP обладал характерным для зеленых флуоресцентных белков спектром поглощения с максимумом при 494 и плечом при 470 нм. После денатурации белка, вызванной кислотой (0,1 М HCl, pH 1,8), или 33 щелочью (0,1 M NaOH, pH 14,0) наблюдались максимумы в видимой области спектра при 380 и 450 нм соответственно. Эти две формы (380 и 450 нм) денатурированного белка взамопревращались одна в другую рН-зависимым образом, характерным для превращения п-ГБИ, вызванного диссоциацией фенольной группы Tyr-66. После освещения УФ – светом (366 нм) зеленой формы Dend FP наблюдались значительные изменения в спектрах поглощения нативного белка. Поглощение при 494 нм зеленой формы падало и одновременно появлялась полоса поглощения при 557 нм с плечом при 521 нм. Визуально это превращение сопровождалось изменением цвета белка от зелено-желтого к красному. В спектрах поглощения денатурированного белка также наблюдались значительные превращения. В отличие от зеленой формы Dend FP, красная форма денатурированного белка характеризовалась новыми рН-зависимыми формами с максимумами при 430 нм (0,1 М HCl) и 500 нм (0,1 M NaOH). В дальнейшем эти параметры были использованы нами при выделении, для детекции хромофорсодержащего пептида красной формы Dend FP. Облучение УФ – светом приводило также к значительным изменениям в спектрах флуоресценции нативного белка. Исходно Dend FP обладал максимумом эмиссии при 508 нм, а в результате фотоиндуцированного превращения белок излучал ярко-красный свет с максимумом при 575 нм. Рис. 14. Светоиндуцируемая фрагментация Dend FP. 1 – зеленая форма Dend FP мигрирует в ПААГ в виде одной полосы ~ 28 кДа; 2 – красная форма белка. SDS- ПААГ электрофорез проводили в 15% полиакриламиде. При анализе зеленой формы Dend FP с помощью SDS-гель электрофореза очищенный белок мигрировал в 15% полиакриламидных гелях в виде единственной полосы, соответствующей массе 28 кДа, характерной для полноразмерных GFP-подобных белков (рис. 14, дорожка 1). Однако в процессе облучения белка УФ – светом (~ 380 нм), 34 интенсивность полосы с массой 28 кДа уменьшалась. Одновременно с этим наблюдалось образование двух фрагментов белка, соответствующих массам 18 и 10 кДа (рис. 14, дорожка 2). Учитывая массы образующихся фрагментов, а также положение в общей полипептидной цепи белка инвариантных аминокислот (X-Tyr-Gly), образующих хромофор во всех GFP-подобных белках, можно было предположить, что светозависимая фрагментация Dend FP, так же, как это было описано выше для asFP595, происходит в результате разрыва полипептидной цепи недалеко от хромофорного центра. Для установления молекулярных основ светозависимого превращения Dend FP, денатурированная красная форма Dend FP подвергалась протеинолизу при помощи трипсина. Полученный гидролизат белка наносили на колонку с обращенной фазой и разделяли с помощью ВЭЖХ. Очищенный с помощью ВЭЖХ хромопептид Dend FP характеризовался теми же рН-зависимыми спектральными формами, что и белок после денатурации (430 и 500 нм). Детекцию фракций осуществляли одновременно при двух длинах волн – 210 и 430 нм. Полученная фракция хромопептида, поглощающая при 430 нм, использовалась далее в структурных исследованиях. Все попытки определить N-концевую аминокислотную последовательность хромопептида с помощью автоматического аминокислотного секвенирования в конечном итоге не увенчались успехом. Это обстоятельство позволяло предположить, что в результате светозависимого превращения белка в красную форму происходит разрыв полипептидной цепи непосредственно перед хромофорным центром и результатом такой модификации представлялось хромопептида является потеря возможным лишь с α-NH2-группы определение помощью His-65. Также аминокислотной в этой ситуации последовательности масс-спектрометрических методов. Фракция хромопептида Dend FP после ВЭЖХ далее анализировалась с помощью ESI-массспектрометрии. Как показано на рис. 15, в ЭСИ масс-спектрах был обнаружен однозарядный молекулярный ион МН+=609,3, который соответствовал массе хромопептида 608,3 Да. Расчетная масса исходного, немодифицированного пентапептида составляла 645,3 Да. При сравнении этих двух значений масс (разность 37 Да) можно было предположить, что хромофор Dend FP является результатом внутримолекулярной реакции циклизации (с потерей одной молекулы Н2О) и реакции окисления (с потерей Н2), 35 Рис. 15. ESI-масс-спектр хромопептида Dend FP. Шкала m/z соответствует положительным однозарядным ионам МН+ точно так же, как это происходит в хромофоре GFP. Кроме того, дополнительная разница в 17 Да, как предполагалось, соответствует потере гистидином-65 α-аминогруппы и одновременному образованию дополнительной двойной связи в боковой цепи этой аминокислоты (-1Н). Рис. 16. Тандемный масс-спектр хромопептида Dend FP. Все эти предположения были в дальнейшем проверены с помощью методов тандемной масс-спектрометрии и ЯМР. Во вторичных (MС/MС) спектрах, полученных в результате фрагментации иона хромопептида Dend FP, был обнаружен ряд пиков (рис. 16, табл. 6). Среди них был идентифицирован пик с m/z 609,3, соответствующий исходному 36 Таблица 6. Отнесение пиков, полученных в тандемных масс-спектрах в результате фрагментации основной цепи хромопептида Dend FP. При расчете относительных амплитуд, амплитуда пика с m/z 592,2 (М-NH2)+ была принята за 100% m/z (набл.) m/z (рассч.) Отнесение Относительная амплитуда 175,1 272,1 175,1 272,1 y1 z2 0,6 1,2 281,2 281,1 c2 1,8 293,1 321,0 293,1 321,1 a3 b3 1,1 3,5 338,2 338,1 c3 1,2 407,1 435,1 452,2 407,1 435,1 452,2 a4 b4 c4 5 10 23 молекулярному иону пептида, и ряд положительно заряженных ионов, соответствующих массам фрагментов после расщепления [His-Tyr-Gly]-Asn-Arg полипептидной цепи. В таблице 6 приведено отнесение МС/МС пиков, полученных в результате индуцируемой столкновениями фрагментации основной цепи хромопептида Dend FP (согласно принятой классификации, в зависимости от места разрыва основной цепи, - а+, b+, c+ и x+, y+, z+ ионы соответственно). Полученные результаты подтверждали происхождение хромопептида, как результат внутримолекулярного фотолитического расщепления связи между аминогруппой и α-углеродным атомом His-65, а также протеолитического расщепления трипсином связи между Arg-69 и Val-70 полипептидной цепи белка (рис. 17 б). Эта структура хромопептида Dend FP была также подтверждена с помощью * протонного ЯМР . На основании полученных ЯМР-спектров (рис. 17, а) было проведено отнесение протонов исследуемого образца. В спектре были идентифицированы пять спиновых систем: две из них соответственно – __________________ * Данная часть работы выполнена совместно с лабораторией биомолекулярной ЯМРспектроскопии ИБХ РАН (Т.А. Балашова) под руководством д.х.н. А.С. Арсеньева. 37 а б Рис. 17. Структура хромофора красной формы Dend FP. а – 1Н – ЯМР – спектр хромопептида Dend FP в 10% D2O, 30o, pH 4,0. Области NH и протонов ароматических/непредельных связей (слева); справа область алифатических протонов; б – общая схема превращений, приводящих к образованию хромопептида Dend FP –NH-CαH(Х)-CβH2-CγH2- CδH2-NH- (1) и – NH-CαH(Х)-CβH2-СО- (2), и три спиновые системы, включающие в себя ароматические остатки и/или непредельные связи – (CH=СH-)2 (3), -CH=CH- (4) и -CH=Х-CH- (5). Спиновые системы 1 и 2 представляли собой остатки Arg(NH 8,03 м.д., 3JNH-CαH 7,6 Гц; CαH 4,18 м.д.; CβH2 1,65 и 1,80 м.д.; CγH2 1,46 м.д.; CδH2 3,03 м.д. и NεH 6,97 м.д., при 6,50 м.д. наблюдался сигнал протонов гуанидиновой группы) и Asn(NH 8,92 м.д., 3JNH-CαH 6,6 Гц; CαH 4,7 м.д.; CβH2 2,79 и 2,90 м.д.; сигналы амидных протонов боковой цепи наблюдались при 6,93 м.д. и 7,63 м.д.). Два дублета в две протонные единицы каждый (6,99 м.д. и 8,12 м.д., 3J 8,6 Гц, спиновая система 3) соответствовали сигналам ароматического кольца модифицированного Tyr-66, синглет при 7,24 м.д. – его СβН при двойной связи -Сα=Сβ-. Спиновая система 4 представляла собой фрагмент -СαН=СβН- (6,85 м.д. и 7,86 м.д., 3 J 16,2 Гц) модифицированного His-65, с транс-ориентацией протонов. Два пика (с J ~0,4 Гц) по протонной единице каждый при 7,71 и 8,47 м.д. являлись соответственно сигналами С4Н иС2Н модифицированного гистидина. При 20о в спектре наблюдалась шестая спиновая система - два сигнала по 1 протонной единице каждый, взаимодействующие друг с другом 38 с J 17,7 Гц. Эта спиновая система соответствовала СαН2 протонам Gly. Все описанные выше данные позволили предложить структуру хромофорсодержащего пептида Dend FP (рис. 17, б, соединение III). 6. Фотоактивируемый аналог белка acGFPL из Aequorea coerulescens. Как уже отмечалось выше, хромопротеины семейства GFP представляют собой нефлуоресцирующие окрашенные белки, которые имеют такую же, как и у флуоресцентных гомологов, пространственную структуру. Хромопротеины обычно обладают поглощением в видимой спектральной области в диапазоне длин волн 560-610 нм. Белок acGFPL, полученный из медузы Aequorea coerulescens (Gurskaya et al., 2003), является первым представителем семейства GFP, не обладающих ни флуоресценцией, ни поглощением в видимом диапазоне спектра. Эксперименты по рассеянному мутагенезу acGFPL показали (Gurskaya et al., 2003), что после нескольких аминокислотных замен, и в том числе замены строго консервативного для всех известных белков семейства GFP остатка Glu-222 на Gly, можно получить флуоресцирующий вариант aceGFP этого белка (пять мутаций, включая замену E222G, схема 8). Обратная замена в aceGFP остатка глицина 222 на глутаминовую кислоту приводит к образованию мутантного варианта белка aceGFP-G222E, который, как и дикий тип acGFPL, не обладает ни флуоресценцией, ни заметным поглощением в видимой области. Однако, в отличие от исходной дикой формы, при освещении УФ светом aceGFP-G222E приобретает яркую зеленую флуоресценцию с такими же максимумами возбуждения и эмиссии, что и aceGFP (480 и 505 нм соответственно). Для того чтобы понять, какие структурные особенности важны для приобретения флуоресцентных свойств в белке aceGFP и какие структурные перестройки происходят в процессе фотоактивации белка aceGFP-G222E, нами была * определена кристаллическая структура мутантных вариантов acGFPL . Были установлены пространственные структуры зеленого флуоресцентного белка aceGFP (разрешение 1,5 Å) (схема 8), исходного бесцветного нефлуоресцирующего белка aceGFP-G222E (разрешение 1,14 Å) и белка, полученного в результате экспозиции aceGFP-G222E в УФ-свете (белок aceGFP-G222E-UV, разрешение 1,75 Å). __________________ * Данная часть работы выполнена совместно с лабораторией рентгеноструктурного анализа ИБХ РАН под руководством д.х.н. В.З. Плетнева. 39 acGFPL (природный белок из медузы Aequorea coerulescens) бесцветный, нефлуоресцирующий Мутагенез (5 замен, в том числе E222G) (Gurskaya et al., 2003) Зеленый флуоресцирующий белок aceGFP Мутагенез, обратная замена G222E (Gurskaya et al., 2003) Бесцветный нефлуоресцирующий белок aceGFP- G222E Фотоактивация УФ-свет , (250–300 нм) Флуоресцентный белок aceGFP- G222E-UV (λex=480 нм; λem= 505 нм) Схема 8. Зеленый флуоресцентный белок aceGFP и его фотоактивируемый aналог aceGFP-G222E (Gurskaya, N. G. et al. Biochem. J., 2003, 373, 403–408) Полученные кристаллические структуры всех мутантных вариантов белка acGFPL показали, что протомеры aceGFP и aceGFP-G222E имеют пространственную структуру характерную для других белков семейства GFP в виде 11-ти антипараллельных βсегментов, образующих структуру β - цилиндра. Через центральную ось этого цилиндра проходит α-спиральный последовательность участок аминокислот полипептидной –Ser65–Tyr66–Gly67-, цепи, из который которых в содержит результате посттрансляционных реакций образуется хромофор. В кристаллическом состоянии оба белка образуют димерные структуры, состоящие из двух протомеров. Вариант aceGFP обладает яркой флуоресценцией в зеленой области (максимумы возбуждения и эмиссии – 480 и 505 нм соответственно). По сравнению с природными белками семейства GFP, где позицию 222 около хромофора занимает строго консервативный для всех белков каталитический остаток Glu, в положении 222 в aceGFP находится остаток Gly. Тем не менее, в белке aceGFP образуется та же структура хромофора, что и в других зеленых флуоресцентных белках семейства GFP (рис. 18а). Хромофор имеет копланарную бициклическую структуру (рис. 18б) типичную для avGFP, в которой пятичленный имидазолоновый гетероцикл имеет пара-гидроксибензилиденовый заместитель с фенольным кольцом в цис-ориентации. Согласно полученной структуре, Сα атом Tyr-66 хромофора характеризуется тригональной планарной геометрией химических связей с другими атомами, что характерно для связей, имеющих двойной характер Сα=Cβ. Напротив, для Сα Ser-65 характерна sp3-гибридизация, что соответствует простой Сα-N связи и транс-конфигурации предшествующей пептидной связи. 40 а б Tyr66 Arg96 Tyr66 Arg96 Tyr220 Ser65 Ser65 Tyr220 в г Tyr66 Glu222 Tyr66 Arg96 Glu222 Arg96 Tyr220 д Glu222 е Tyr66 Tyr66 Arg96 Glu222 Arg96 Tyr220 Рис. 18. Хромофор и окружение различных вариантов aceGFPL, показанные в проекции под двумя углами. Окружение хромофора aceGFP (а) и копланарная бициклическая структура хромофора aceGFP (б); окружение хромофора (в) и его структура в белке aceGFP- G222E до освещения (г); окружение хромофора (д) и его структура после экспонирования белка aceGFP- G222E в ультрафиолете (aceGFP- G222E-UV). 41 После замены Gly-222 в aceGFP на консервативный остаток Glu (рис. 18в) созревание белка останавливается на промежуточной форме, которая не имеет ни поглощения в видимой области, ни флуоресценции. Кристаллическая структура aceGFPG222E обнаруживает хромофор в его неполностью созревшем виде. В этом случае посттрансляционный синтез останавливается на стадии циклизации полипептидной цепи, и хромофор представляет собой непланарную, несопряженную бициклическую систему (рис. 18г), где Tyr-66 имеет одинарную Сα-Cβ связь в боковой цепи. Экспериментальные значения длин связей Tyr-66 Сα-Cβ и Cβ-Сγ, тетраэдрическая геометрия связей с Сα углеродным атомом, а также характерные значения торсионного угла χ1 = -55º вокруг СαCβ однозначно говорят об sp3-гибридизации Сα и Cβ атомов. Следует отметить, что карбоксильная группа в aceGFP-G222E смещена на ~ 2 Å относительно соответствующей позиции, занимаемой Glu-222 в белках avGFP и cgGFP. Этот сдвиг стабилизирован водородной связью с Tyr-220. УФ 250–300 нм Рис. 19. Фотоактивация белка aceGFP-G222E. Непланарный несопряженный бициклический хромофор aceGFP-G222E приобретает полностью копланарную структуру и зеленую флуоресценцию после облучения УФ светом. Облучение бесцветного варианта aceGFP-G222E УФ светом (λ = 250-300 нм) приводит к необратимому фотопревращению белка в зеленую флуоресцирующую форму. В отличие от необлученного белка aceGFP-G222E, aceGFP-G222E-UV обладает практически идентичными с aceGFP спектральными характеристиками. Хромофор aceGFP-G222E-UV образует копланарную бициклическую структуру (рис. 18е) состоящую из имидазолонового и фенольного колец, соединенных Сα=Cβ мостиком. Таким образом, эти два циклических фрагмента вовлечены, как и во всех зрелых зеленых флуоресцентных белках, в единую коньюгированную систему π-электронов хромофора. За исключением 42 самого хромофора, трехмерные структуры белков aceGFP, aceGFP-G222E и aceGFPG222E-UV практически идентичны. В отличие от фотопревращения avGFP, декарбоксилирования Glu-222 в процессе УФ-индуцируемого фотопревращения aceGFPG222E не наблюдалось. Таким образом, с помощью рентгеноструктурного анализа различных вариантов aceGFP показано, что бесцветная нефлуоресцирующая форма этого белка под действием УФ-света приобретает яркую зеленую флуоресценцию в результате необратимого превращения непланарного бициклического хромофора в полностью планарный хромофор (рис. 19). Это фотопревращение происходит за счет УФ-индуцируемой реакции окисления и образования Сα=Cβ связи между двумя циклами. дегидратация окисление IV окисление дегидратация V Рис. 20. Последовательность реакций биосинтеза хромофора avGFP. Кроме того, полученные результаты позволяют сделать еще один важный вывод. До настоящего времени существовали разногласия относительно последовательности реакций в процессе биосинтеза хромофора зеленого флуоресцентного белка. Очевидно, что на первой стадии должна проходить циклизация полипептидной цепи (рис. 20, структура II). Дальше возможны два варианта развития событий. Barondeau и соавт. (Barondeau et al., 2003) на основании рентгеноструктурных исследований мутантов GFP 43 сделали заключение, что реакция окисления завершает процесс биосинтеза хромофора (на рис. 20 последовательность реакций слева). Напротив, на основании кинетических исследований, Zhang и соавт. (Zhang et al., 2006) предположили, что окисление предшествует реакции дегидратации (рис. 20, справа). На примере нефлуресцентного аналога белка aceGFP с заменой G222E, мы обнаружили переходную структуру хромофора, который дегидратирован, но не окислен (рис. 20, структура III). Таким образом, по-крайней мере для белка aceGFP, можно предположить последовательность реакций циклизация-дегидратация-окисление. ВЫВОДЫ 1. Впервые детально исследованы посттрансляционные модификации ряда флуоресцентных белков представителей семейства GFP. Установлено, что, несмотря на исключительное спектральное разнообразие, флуоресцентные белки используют достаточно консервативные химические механизмы для приобретения этих свойств. Все без исключения белки используют структуру п-ГБИ в качестве исходного блока в синтезе хромофора. 2. Показано, что в дальне-красных белках, как и в DsRed, структура п-ГБИ дополнительно модифицирована ацилиминным заместителем, за счет которого происходит расширение π-электронной системы хромофора и спектры приобретают дополнительный в сравнении с GFP сдвиг (~ 110 нм) в длинноволновую область. 3. Установлено, что ацилимин, являясь довольно реакционноспособной группой, способен вступать в дополнительные посттрансляционные реакции, что в свою очередь может служить дополнительным источником спектральной вариабельности. Обнаружено, что хромофор фотоактивируемого белка asFP595 из Anemonia sulcata образуется в результате посттрансляционной реакции гидролиза ацилиминзамещенного п-ГБИ и, таким образом, является производным хромофора DsRed-типа. 4. С помощью рентгеноструктурного анализа подтверждена трициклическая структура хромофора желтого флуоресцентного белка zFP538. Эта структура, так же как хромофор asFP595, образуется за счет нуклеофильной реакции по ацилимину и результатом этой реакции является фрагментация основной цепи белка. Иминогруппа образующегося тетрагидропиридинового кольца расширяет π-электронную систему п-ГБИ хромофора, вследствие чего в спектрах флуоресценции наблюдается дополнительный сдвиг 30 нм. 5. Показано, что в отличие от zFP538, дополнительный сдвиг ~ 30 нм желтого флуоресцентного белка phiYFP осуществляется без дополнительных посттрансляционных 44 модификаций п-ГБИ, а за счет нековалентных взаимодействий хромофора с необычным аминокислотным окружением. Наиболее важные из них - π-π стэкинг-взаимодействия хромофора с фенольным кольцом Tyr-203, пониженная стабилизация отрицательного заряда фенолята хромофора, как результат отсутствия гидроксилсодержащих алифатических аминокислот в позициях 205 и 203, а также предполагаемое наличие водородной связи между Glu-222 и атомом азота имидазолонового кольца. 6. Впервые продемонстрировано, что хромофор белка z2FP574 из Zoanthus sp.2 подвергается окислению-декарбоксилированию, и эта реакция является необходимым условием для перехода из зеленого флуоресцентного состояния в красное. В отличие от красного флуоресцентного белка DsRed, «зеленая» форма хромофора является промежуточной в синтезе «красной» формы z2FP574. Таким образом, z2FP574 принадлежит к DsRed подсемейству в классификации по типу хромофора, однако образованию хромофорной группировки этого белка предшествуют другие посттрансляционные реакции. 7. На примере фотоконвертируемого флуоресцентного белка Dend FP обнаружено, что необратимое светозависимое превращение из зеленого флуоресцентного состояния в красное происходит в результате реакции элиминирования с расщеплением N-Cα связи His-65 и одновременного образования двух фрагментов белка. В результате этой реакции π-электронная система п-ГБИ хромофора приобретает дополнительное расширение за счет Сα=Сβ двойной связи His-65 и его имидазольного кольца, и, как следствие, максимум эмиссии флуоресценции белка смещается на ~ 70 нм в длинноволновую область спектра. 8. С помощью рентгеноструктурного анализа различных вариантов aceGFP впервые продемонстрировано, что бесцветная нефлуоресцирующая форма этого белка под действием УФ-света приобретает зеленую флуоресценцию в результате необратимого превращения непланарного бициклического хромофора в полностью планарный хромофор. Это фотопревращение происходит за счет УФ-индуцируемой реакции окисления и образования Сα=Cβ связи между двумя циклами хромофора. 9. На примере нефлуресцентного белка aceGFP G222E, обнаружена переходная дегидратированная, но не окисленная форма хромофора. Таким образом, по-крайней мере для белка aceGFP, можно предположить последовательность реакций циклизациядегидратация-окисление в биосинтезе его хромофора. 45 СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Обзоры: 1. Pakhomov A.A. and Martynov V.I. (2008) GFP family: Structural insights into spectral tuning // Chem Biol 15, 755-764. 2. А.А. Пахомов, В.И. Мартынов (2009) Посттрансляционная химия белков семейства GFP // Биохимия 74, 309-319. Статьи: 3. Martynov V.I., Savitsky A.P, Martynova N.Y, Savitsky P.A, Lukyanov K.A, Lukyanov S.A. (2001) Alternative cyclization in GFP-like proteins family. The formation and structure of the chromophore of a purple chromoprotein from Anemonia sulcata. // J Biol Chem. 276, 21012-21016. 4. Gurskaya N.G, Fradkov A.F, Terskikh A., Matz M.V, Labas Y.A, Martynov V.I., Yanushevich Y.G, Lukyanov K.A, Lukyanov S.A. (2001) GFP-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins. // FEBS Lett. 507, 16-20. 5. Fradkov A.F, Verkhusha V.V, Staroverov D.B, Bulina M.E, Yanushevich Y.G, Martynov V.I., Lukyanov S., Lukyanov KA. (2002) Far-red fluorescent tag for protein labelling. // Biochem J. 368, 17-21. 6. Martynov V.I., Maksimov B.I, Martynova N.Y, Pakhomov A.A, Gurskaya N.G, Lukyanov S.A. (2003) A purple-blue chromoprotein from Goniopora tenuidens belongs to the DsRed subfamily of GFP-like proteins. // J Biol Chem. 278, 46288-46292. 7. А.А. Пахомов, Н.Ю. Мартынова, Н.Г. Гурская, Т.А. Балашова, В.И. Мартынов (2004) Фотопревращение хромофора флуоресцентного белка из Dendronephthya sp. // Биохимия 69, 1108-1117. 8. Pakhomov A.A., Pletneva N.V., Martynov V.I. (2005) The molecular basis for the green to red conversion of the fluorescent protein from Dendronephthya sp. // FEBS J. 272, S. 1, p. 384. 9. Yampolsky I.V, Remington S.J, Martynov V.I., Potapov V.K., Lukyanov S., Lukyanov K.A. (2005). Synthesis and properties of the chromophore of the asFP595 chromoprotein from Anemonia sulcata. // Biochemistry 44, 5788-5793. 10. Pletneva N., Pletnev S., Tikhonova T., Popov V., Martynov V., and Pletnev V., (2006) Structure of a red fluorescent protein from Zoanthus, zRFP574, reveals a novel chromophore, // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 527-532. 46 11. Pakhomov A.A., Pletneva N.V., Balashova T.A., and Martynov V.I. (2006) Structure and reactivity of the chromophore of a GFP-like chromoprotein from Condylactis gigantea // Biochemistry 45, 7256-7264. 12. Н. В. Плетнева, С. В. Плетнев, Д. М. Чудаков, Т. В. Тихонова, В. О. Попов, В. И. Мартынов, А. Влодавер, З. Даутер, В. З. Плетнев (2007) Пространственная структура желтого флуоресцентного белка zYFP538 (Zoanthus sp.) при разрешении 1.8 Å. // Биоорг. химия 33, 390-398. 13. Tretyakova, Y.A., Pakhomov, A.A., and Martynov, V.I. (2007) Chromophore structure of the kindling fluorescent protein asFP595 from Anemonia sulcata, // J Amer Chem Soc 129, 7748-7749. 14. Pletneva N, Pletnev V, Tikhonova T, Pakhomov AA, Popov V, Martynov V.I., Wlodawer A, Dauter Z, Pletnev S (2007) Refined crystal structures of red and green fluorescent proteins from the button polyp Zoanthus , // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63, 1082-1093. 15. Pakhomov A.A. and Martynov V.I. (2007) Chromophore aspartate oxidation- decarboxylation in the green-to-red conversion of a fluorescent protein from Zoanthus sp. 2, // Biochemistry 46, 11528-11535. 16. Pakhomov A and Martynov V. (2009) Molecular mechanisms of chromophore modifications in fluorescent proteins, // FEBS J. 276, s. 1, 381-382. 17. Pletnev S., Gurskaya N., Pletneva N.V., Lukyanov K.A., Chudakov D.M., Martynov V.I., Popov V.O., Kovalchuk M.V., Wlodawer A., Dauter Z. and Pletnev V. (2009) Structural basis for phototoxicity of the genetically encoded photosensitizer KillerRed, // J Biol Chem. 284, 32028-32039. 18. А.А. Пахомов, Ю.А. Третьякова, В.И. Мартынов (2010) Посттрансляционные реакции, приводящие к смещению спектров белка asFP595 из Anemonia sulcata в длинноволновую область, // Биоорг. химия 36, 117-121. 19. Pletneva, N.V., Pletnev, V.Z., Lukyanov, K.A., Gurskaya, N.G., Goryacheva, E.A., Martynov, V.I., Wlodawer, A., Dauter, Z., and Pletnev, S. (2010) Structural evidence for a dehydrated intermediate in green fluorescent protein chromophore biosynthesis, // J Biol Chem. 285, 15978-15984. 20. Pakhomov, A.A. and Martynov V.I. (2011) Probing the structural determinants of yellow fluorescence of a protein from Phialidium sp. // Biochem Biophys Res Commun. 407, 230235. 21. Пахомов А.А., Мартынов В.И. (2011) Метод определения трехмерной структуры флуоресцентных белков при помощи гомологичного моделирования и массспектрометрии. // Биоорг. химия 37, 429-432. 47 22. Пахомов А.А., Третьякова С.А., Мартынов В.И. (2012) Влияние хромофор – белковых взаимодействий на спектральные свойства желтого флуоресцентного белка // ДАН 445, 594–596. 23. Pletneva, N.V., Pletnev, V.Z., Souslova E., Chudakov D. M., Lukyanov S., Martynov V.I., Arhipova S., Artemyev I., Wlodawer, A., Dauter, Z., and Pletnev, S. (2013) Yellow fluorescent protein phiYFPv (Phialidium): structure and structure-based mutagenesis // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69, 1005-1012. Работа выполнена при финансовой поддержке программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН, гранта министерства образования и науки в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» (П1071), Российского Фонда Фундаментальных Исследований (02-04-48054-а, 06-0448196-а, 09-04-00212-а, 12-04-00076-а) и программы МНТЦ (партнерские соглашения 2325 и 3223). СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ФБ – флуоресцентный белок; ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография; avGFP – зеленый флуоресцентный белок из медузы Aequorea victoria; SDS – додецилсульфат натрия; ПААГ – полиакриламидный гель; DsRed – красный флуоресцентный белок из Discosoma sp; zFP538 - желтый флуоресцентный белок из Zoanthus sp.; phiYFP – желтый флуоресцентный белок из медузы Phialidium sp.; cgCP – хромопротеин из коралла Condylactis gigantea; gtCP - хромопротеин из коралла Goniopora tenuidens; z2FP574 - красный флуоресцентный белок из Zoanthus sp.; Dend FP - флуоресцентный белок из Dendronephthya sp. ; acGFPL - белок из медузы Aequorea coerulescens; ESI-масс-спектрометрия – масс-спектрометрия с ионизацией образца методом электрораспыления; MALDI-масс-спектрометрия – масс-спектрометрия с ионизацией образца методом лазерной десорбции; ПВДФ – поливинилидендифторид; п-ГБИ - 4-(п-гидроксибензилиден)имидазолид-5-он, хромофор GFP-типа; 48
