Моделирование биологических мембран методами
реклама
Московский Физико-Технический Институт (Государственный Университет) Буслаев Павел Ильич Дипломная работа МОДЕЛИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН МЕТОДОМ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИНАМИКИ: ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ГЛАВНЫХ КОМПОНЕНТ ДЛЯ АНАЛИЗА КОНФОРМАЦИОННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ МОЛЕКУЛ ЛИПИДОВ Специальность: 577.352.332 Научный руководитель: Кандидат физико-математических наук Грудинин Сергей Владимирович Москва – июнь 2014 Содержание Содержание .................................................................................................................................... 1 Введение ......................................................................................................................................... 3 Обзор литературы .......................................................................................................................... 6 Введение .....................................................................................................................................6 Моделирование фосфолипидов................................................................................................9 Процессы, происходящие в мембранах ...............................................................................9 Уравновешивание бислоя ...................................................................................................12 Моделирование мембранных белков .....................................................................................13 Бактериородопсин и рецепторы, связанные с G-белком .................................................14 Акваглицеропорины ............................................................................................................16 Ионные каналы ....................................................................................................................18 Аденозинтрифосфатазы ......................................................................................................21 Методы моделирования ..........................................................................................................24 Силовые поля .......................................................................................................................24 Подготовка структуры ........................................................................................................27 Программный пакет GROMACS ........................................................................................29 Методы анализа .......................................................................................................................31 Марковские состояния ........................................................................................................33 Нормальные моды ...............................................................................................................35 Метод главных компонент .................................................................................................37 Методы ......................................................................................................................................... 39 Начальные структуры .............................................................................................................39 Параметры силовых полей .....................................................................................................42 Параметры моделирования .....................................................................................................43 Анализ.......................................................................................................................................46 Вычисление средней площади на липид ...........................................................................46 Объединение траекторий ....................................................................................................46 Среднеквадратичное отклонение .......................................................................................47 Метод главных компонент .................................................................................................48 Сравнение распределений ..................................................................................................51 Автокорреляция ...................................................................................................................53 Коллективность мод ............................................................................................................53 Изучение двугранных углов ...............................................................................................54 Результаты .................................................................................................................................... 56 Структура и конформационная динамика липидов .............................................................56 Анализ собственных значений и векторов............................................................................58 1 Уравновешивание мембран ....................................................................................................63 Сравнение распределений ..................................................................................................66 Анализ в собственных базисных векторах .......................................................................68 Анализ в базисных векторах объединённой траектории .................................................73 Влияние размера системы.......................................................................................................74 Поведение глицерольной группы ..........................................................................................77 Заключение................................................................................................................................... 80 Список литературы ...................................................................................................................... 82 2 Введение Клетка – это минимальная единица жизни, с собственным обменом веществ, способностью самостоятельно существовать, воспроизводиться и развиваться. Клетка отделена от внешнего мира мембраной, представляющей собой двойной слой (бислой) молекул липидов. Липиды – обширная группа органических соединений, включающая жиры и жироподобные вещества. Молекулы липидов имеют гидрофильную и гидрофобную части. При образовании мембран гидрофобные участки молекул оказываются обращены внутрь, а гидрофильные — наружу. Толщина мембраны составляет 7—8 нм. Липидный бислой практически непроницаем. Однако, для того чтобы клетка существовала, ей нужны различные вещества. Для обеспечения транспорта ионов, воды и других веществ через клеточную мембрану, в ней содержится множество различных белков. Некоторые из них нужны для того чтобы обеспечивать клетку необходимыми веществами, другие выполняют более специальные функции. Моделирование биологических мембран методом молекулярной динамики является удобным методом определения как свойств самих мембран, так и аспектов взаимодействия мембран с небольшими молекулами или белками. При этом, необходимо, чтобы статистические и динамические параметры системы соответствовали экспериментальным данным. Обычно, обращают внимание на макропараметры бислоя, такие как площадь, приходящаяся на одну молекулу липида, толщина мембраны и другие. Все эти параметры являются усреднёнными по системе и не дают информации о состоянии отдельного липида в мембране. Таким образом, несмотря на соответствие системы экспериментальным данным в среднем, свойства отдельной молекулы могут быть промоделированы и оценены не верно. 3 Типичная липидная молекула состоит из примерно пятидесяти тяжелых атомов (и некоторого количества атомов водорода, например, для DOPC – их 84). Так как каждый атом имеет три координаты, состояние липида описывается точкой в ~150-мерном пространстве. Данное представление крайне ненаглядно, и также не отражает физических свойств липида, в частности ограничений на конформации и близости тех или иных атомов. Одним из методов, позволяющих существенно сократить число степеней свободы и придать им наглядное представление, является метод главных координат. Метод главных компонент успешно применялся для белков, но не для изучения конформационной динамики молекул липидов. При этом для белков число значимых собственных векторов очень небольшое. Значительные конформационные изменения у белков связаны с изменением состояния. Большинство же движений – флуктуации около локального минимума энергии. В связи с этим конформационные изменения можно описать с помощью лишь нескольких главных компонент – которые описывают переходы между локальными минимумами. При детальном изучении, оказалось что многообразие состояний для липидов намного сложнее, чем для белков. Локальный минимум очень широк и число значимых собственных векторов достаточно большое. Метод главных компонент, однако, применим и в таких ситуациях. В данной работе показано, как метод главных компонент позволяет выбрать наиболее значимые движения липидов и проранжировать их в соответствии с вкладом в конформационные изменения. Становится возможным анализ динамических свойств отдельных молекул (времен релаксации, автокорреляции и т.п.), а также сравнение различных наборов параметров, используемых для моделирования липидных бислоев. Развитие метода, позволит сравнивать различные методы моделирования липидов и белков друг с другом. Также метод позволит оценивать степень уравновешенности 4 молекул в рассчитываемой системе. Можно будет сравнивать результаты моделирования с экспериментальными данными (например ЯМР данными). Таким образом, основным результатом данной работы, является универсальный метод, который позволяет изучать конформационную динамику биологических систем. 5 Обзор литературы Компьютерное моделирование – быстро развивающийся метод, который позволяет изучать структуру и конформационную динамику липидов и мембранных белков. Увеличение компьютерных мощностей даёт возможность получать реалистичные траектории мембран и активных пептидов. За счёт увеличения количества структур мембранных белков высокого разрешения, стало возможным моделирование различных необходимых биологических процессов. Увеличение временных масштабов симуляций стало возможным благодаря специальным компьютерным методам. В данном обзоре мы сфокусируемся на прогрессе, достигнутом в моделировании липидных бислоёв и мембранных белков. Введение В последнее время мощные компьютеры становятся всё более доступными. Это открывает новые возможности для изучения липидных мембран на атомарном уровне, позволяет детально изучить структуру и динамику липидов и мембранных белков [1]–[6]. Усложнение моделей, улучшение программного и технического обеспечения, а также растущие компьютерные мощности расширяют возможности по изучению различных биологических систем. Если раньше было возможно симулировать несколько наносекунд динамики нескольких молекул липидов, то сейчас возможно моделировать поведение гораздо больших систем и значительно больших временных масштабов. Быстро растущее число известных структур мембранных белков высокого разрешения, а также полученные знания о принципах формирования вторичных и третичных структур белков, позволяют компьютерному моделированию быть стандартным методом для изучения липидов и мембранных белков на атомарном уровне. Моделирование методом молекулярной динамики активно развивалось в последние годы. В результате, из метода изучения жидкостей с помощью модели твёрдых шаров или 6 частиц Леннарда-Джонса, получился универсальный метод, который позволяет исследовать широкий спектр различных структур на атомарном уровне. В основе метода лежит описание взаимодействия всех атомов в системе с помощью эмпирически заданной энергетической функции, дифференцирование которой позволяет вычислить силы, действующие на все атомы системы. Траектории, содержащие информацию о движении атомов во времени, получаются путем численного интегрирования уравнения Ньютона с временным интервалом порядка 10-15 с. Анализ этих движений позволяет разобраться в механизме работы исследуемых систем [7]. Что позволяет узнать моделирование методом молекулярной динамики биологических мембран? Вообще говоря, получаемые траектории дают детализированную информацию о движениях липидов и других молекул системы. С помощью этой информации и статистической механики можно оценивать различные термодинамические параметры системы. Пример стандартной системы, которую моделируют, содержащей воду, ионы, фосфолипиды и мембранный белок показан на рис. 1. Стоит однако отметить, что у данного метода есть ряд ограничений. Важным показателем того, насколько расчёт пригоден для анализа, является соотношение между длиной траектории и временем, которое требуется для того, чтобы исследуемое событие произошло. Необходимо, чтобы отношение этих времён было в несколько раз больше единицы. Кроме того есть ряд технических ограничений: точность эмпирически заданного потенциала, относительно небольшой размер исследуемых систем, а также ошибки, возникающие при учёте таких важных показателей, как pH, трансмембранный потенциал и малая концентрация ионов. Начальные структуры также вносят нежелательные моделирования. 7 искажения в результаты Рис. 1 Пример стандартной системы, которую моделируют методом молекулярной динамики. В ней содержатся как липиды, так и мембранный белок. Недавние достижения внесли большой вклад в резкое увеличение количества опубликованных работ по моделированию методом молекулярной динамики. Программные средства становятся всё более доступны и удобны для пользователей. Полезные вычисления сейчас стало возможно выполнять на дешёвых и легкодоступных машинах. Всё больше структур высокого разрешения, пригодных для моделирования, появляется в последнее время. Методологический прогресс в разработке силовых полей, использовании параллельного программирования для процессов, которые, по идее, слишком долгие, чтобы их смоделировать, а также алгоритмы для эффективного вычисления электростатических сил, сыграли ключевую роль в прогрессе метода [8]–[11]. В связи с увеличением эффективности методов метадинамики (метод расчёта «свободной энергии»), ожидаемым развитием методов параллельного программирования, развитие моделирования методом Монте-Карло, можно ожидать и дальнейшего прогресса в области [9], [12]–[14]. В данном обзоре будут описаны недавние достижения в области моделирования липидов и мембранных белков. Внимание будет уделено различным аспектам моделирования, в том числе и программному пакету GROMACS [15]–[17], будут рассмотрены различные методы анализа траекторий. Первая часть обзора будет посвящена моделированию и уравновешиванию липидных бислоёв. Далее, будут представлены основные результаты, 8 связанные с моделированием мембранных белков. В продолжении будут рассмотрены различные детали и методы моделирования. В последней части обзора будут описаны различные методы анализа траекторий. Моделирование фосфолипидов Липиды – основная составляющая биологических мембран. Они образуют непроницаемый для молекул воды и ионов бислой. Весь транспорт ионов и других веществ между клеткой и внешним пространством происходит с помощью мембранных белков. В этой связи, изучение поведения липидов в мембране является важной задачей. Для того чтобы понять механизмы функционирования транспортных белков, нужно изучить взаимодействия белков с липидами, а для этого нужно уметь разделять явления, которые происходят с липидами из-за присутствия белка и которые могут происходить в чистом липидном бислое. Процессы, происходящие в мембранах Наличие реалистичных моделей липидных бислоёв является обязательным условием для моделирования мембранных белков. Эти модели также важны для понимания основных принципов структурирования мембраны. Большой прогресс был достигнут как в вопросах связанных с улучшением основных моделей и методов, так и в определении возможностей для дальнейшего развития. Более детализированные обзоры можно найти в работах [2], [4]–[6], [18]. Мы остановимся на более современных работах. Несколько недавних работ рассчитывали траектории бислоёв, состоящих из 128 липидов, длиной 100 нс и больше. Полученные данные позволяют аккуратно посчитать коэффициент диффузии липидов в добавок к другим свойствам, которые уравновешиваются быстрее [19], [20]. Моделирования бислоёв разных размеров помогли понять, какие артефакты вносит конечный размер системы, а также позволили бегло рассмотреть крупномасштабные явления, как, например, волнистость мембран, которые эффективно подавлялись в небольших липидных «патчах» [21], [22]. Другое интересное исследование заключается в 9 систематическом применении моделирования методом молекулярной динамики к ряду липидов в различных внешних условиях, включая температуру, концентрации солей и электрические поля. Результаты сравниваются с результатами различных экспериментов. В настоящее время такие исследования проведены для ненасыщенных липидов [23]–[28], фосфатидилсерина [29]–[31], сфингомиелина [32]–[34], липополисахаридов [35] и катионных липидов, таких как DMTAP [36] и DOTAP, которые используются при трансфере ДНК. Из-за чувствительности получаемых траекторий к алгоритмам моделирования и потенциальным полям, желательно повторить некоторые вычисления с тем же потенциалом и соответствующим ему алгоритмам, для того чтобы получить более точные и аккуратные данные. Моделирование также применяется для исследования различных крупноразмерных явлений, как, например, объединение липидов в бислой или везикулы, электроимпульсное открытие пор, переходы между фазами, плавление. Процесс образования из случайным образом расположенных липидов бислоя длится порядка 10 наносекунд [37], в то время как везикулы образуются за времена порядка 100 нс [38]. Образование пор в мембранах под действием электрического поля или механического напряжения было промоделировано в работах [39]–[41], процесс разрыва мембраны при взаимодействии с кристаллом [42]. Очевидным продолжением данных работ стало бы исследование процесса образования пор в мембранах при взаимодействии с пептидами или токсинами. С помощью моделирования методом молекулярной динамики изучалась как кубическая липидная фаза, так и процесс перехода между кубической и инверсной гексагональной фазами [43]–[46]. Дальнейшие исследования кубических фаз должны помочь в понимании широкого спектра явлений, включая кристаллизацию мембранных белков в кубических липидных фазах. Так называемые «крупнозернистые» потенциалы в будущем могут успешно применяться для изучения таких длительных процессов [47]–[49]. Уже сейчас метод крупномасштабного моделирования позволяет изучать различные свойства бислоёв, 10 образование везикул, гексагональные фазы и многое другое [48], [50]–[52]. Как «крупнозернистое» так и полноразмерное моделирования приближаются к мезоскопической области, в которой характеристики мембраны, посчитанные при детальном анализе траектории, можно сравнить с параметрами, например жёсткость изгиба, полученными теорией непрерывной среды [40], [53]. В реальных биологических мембранах содержание заряженных липидов 10-30%. Моделирование липидных смесей всё ещё остаётся сложной задачей, в связи с тем, что для уравновешивание таких систем, требуются очень длинные траектории [54], [55]. Ожидается, что эти времена будут порядка сотен наносекунд или даже больше. Одна из вероятных возможностей решить данную проблему – улучшение методов самплинга для ускорения процесса уравновешивания. Другая область, которая активно изучается – моделирование мембран с холестерином [56]–[59]. Ранее существовали только короткие траектории для данных систем, которые позволяли изучить лишь локальные взаимодействия. Сейчас появляются более длинные траектории, порядка нескольких десятков наносекунд, что увеличивает статистическую выборку для проведения анализа данных взаимодействий. Со временем будет ещё больше возможностей получать длинные траектории, что сделает задачу изучения липидных смесей ещё более важной и интересной, так как многие свойства мембранных белков зависят от состава бислоя. Взаимодействие небольших молекул с мембранами – одна из задач, которая была изучена в первую очередь [6]. В последнее время работы в этой области всё больше фокусируются на определении положений молекул значительного размера, связью между структурой и функцией (например изучается взаимодействие с анестетиками [60], [61]), а так же соотношения между формой, жёсткостью, полярностью и положением в мембране [30], [62], [63]. Вычисления такого типа сами по себе представляют большой интерес, но помимо этого позволяют понять, как можно изменить параметры для лучшего вычисления динамики белков, и иногда позволяют непосредственно сравнивать результаты 11 моделирования с экспериментальными данными [64]. Небольшие молекулы регулируют некоторые мембранные белки, в связи с этим важно знать детали взаимодействий всех частей мембранного комплекса, чтобы разобраться в механизмах таких систем. Уравновешивание бислоя Как уже говорилось выше, в последнее время был достигнут огромный прогресс в моделировании липидных бислоёв [6], [18], [65]. Вычисления позволяют изучать различные процессы, начиная от образования бислоя, заканчивая изучением кубических фаз и изучением поведения смесей липидов. При этом взаимодействия между липидами вычисляются с помощью специальной потенциальной функции, которую в дальнейшем будем называть силовым полем. Параметры этих силовых полей оптимизируются эмпирически таким образом, чтобы максимально соответствовать и молекулярным представлениям, и различным экспериментальным данным. Недавно было показано, что качество используемых потенциальных функций, является залогом надёжности и правдоподобности результатов вычислений [66]. В этой связи сравнение силовых полей для липидов становится одной из первостепенных задач [67]–[69]. Три наиболее часто используемых силовых поля – GAFF [70], Berger [71], [72] и CHARMM27 [73]. Эти потенциальные функции создавались для различных целей. Так, GAFF изначально был создан для моделирования белков, но после был расширен и на липиды [74]. Berger – силовое поле, которое специально создавалось для моделирования липидов, основанное на OPLS [75]. CHARMM27 оптимизировался на структурных свойствах алканов. Сравнение и оценка качества различных силовых полей основаны на вычислении различных характеристик мембран, которые воспроизводятся при моделировании процесса уравновешивания бислоя. Такими характеристиками могут быть распределение электронной плотности, площадь, приходящаяся на липид, параметры порядка, толщина 12 мембраны и другие. Ещё один параметр, который часто выбирают для сравнения с экспериментальными данными является коэффициент диффузии [69], [76]–[78]. В качестве примера наиболее глубокого анализа процесса уравновешивания мембран, можно привести работу 2008 года [69]. В работе сравнивались три приведённых выше силовых поля для мембран диолеолфосфатидихолина (далее DOPC). Основные результаты данной работы: 1) Все силовые поля хорошо предсказывают среднюю площадь, приходящуюся на липид (отличие порядка 5%) 2) В параметрах порядка наблюдаются существенные отличия. Если силовые поля Berger и CHARMM27 предсказывают одинаковое распределение параметра порядка по углеродной цепочке для обеих цепочек, то GAFF предсказывает различие между sn1 и sn2 цепочками. В эксперименте различие между параметрами порядка для различных цепочек также наблюдается [79], [80] 3) Такие характеристики, как распределение электронных плотностей и толщина мембраны, хорошо соотносятся друг с другом для разных силовых полей 4) Для всех силовых полей коэффициент диффузии липидов оказывается меньше, чем измеренный в экспериментах [81]. Наиболее правдоподобное значение соответствует потенциальной функции Berger. Моделирование мембранных белков Фундаментальным условие существования живых организмов является отделение клеток и органелл от внешней среды с помощью биологических мембран. Кроме базовой функции барьера, мембраны выполняют ряд других функций, которые определяются типом белков, взаимодействующих, или встроенных в мембрану. Таким образом, изучение мембранных белков очень актуально, так как они играют ключевые роли в таких важных процессах, как преобразование энергии, транспорт, распознавание сигналов и трансдукция. 13 Получить экспериментальные данные высокого разрешения о структуре для мембранных белков намного сложнее, чем для растворимых: в данный момент число структур водорастворимых белков в несколько десятков раз превышает число структур мембранных белков [82]. Получение более полной информации о структуре мембранных белков – одна из наиболее важных задач в современной структурной биологии. Не смотря на то, что экспериментальные методики разрешения структур белков будут только улучшаться, сейчас различные теоретические и компьютерные методы становятся всё более важными [83]. Сейчас существует широкий спектр программных методов: от моделирования по гомологии [84]–[86], до квантово-механических расчётов [87]–[93]. Бактериородопсин и рецепторы, связанные с G-белком Бактериородопсин и родопсин мембранные белки с 7 трансмембранными спиралями (рис. 2), содержащие ретиналь, которые функционально отличаются, несмотря на их похожие архитектуры [94] и фотохимию [95]. Когда детализированная информация о структуре бактериородопсина стала доступна [96], то появилась возможность построить модели по гомологии для целого ряда белков из семейства рецепторов, связанных с G-белком (GPCR), также известных, как семиспиральный (7-TMH) трансмембранный белок. GPCRы занимают 1-3% генома человека, и их функции представляют собой широкий спектр физиологических процессов, которые интересны и важны для фармацевтических исследований. Исследования родопсина и других GPCR-ов были недавно рассмотрены в работах [97]–[100]. Родопсин также использовался в качестве модели, для разработки алгоритмов по прогнозированию конформации петель, соединяющих спирали в трансмембранных белках [101]. 14 Рис. 2 Структура родопсина. Видны 7 трансмембранных спиралей, которые есть и в бактериородопсине. Восьмая спираль – находится в цитоплазматической части мембраны и не наблюдается в бактериородопсине [102]. Цель большинства теоретических исследований – понять, как изменения в ретинале, расположенном между трансмембранными спиралями, влияют на структуру белка, и как эти изменения связаны с активацией G-белков, которые, в свою очередь усиливают сигнал, передаваемый в клетку. Опубликованные на сегодняшний день работы по моделированию описывают поведения белка в целом [102], а также влияние изомеризации ретиналя на изменения в активном центре белка [103], которые приводят к передаче сигнала [104], [105]. Недавнее моделирование родопсина в бислое POPC и воде, длиной 40-нс, изучает кооперативные взаимодействия и переходы в системе, такие как взаимодействие трансмембранных спиралей с липидами, образование водородных связей, все при отсутствии возбуждающего сигнала [102]. Расчёты, в которых исследовалась изомеризация ретиналя из 11-цис состояния в полностью-транс, показали структурные 15 перестройки трансмембранных спиралей [104], [105]. Учитывая масштаб времени и размер ограничения системы, наблюдаемые перестройки кажутся разумными, но полный переход между неактивным и активным состояниями ещё не наблюдается. Цель моделирования бактериородопсина – понять, как изменения в конформации ретиналя влияют на функцию белка – перенос протона. Первая структура бактериородопсина появилась в 1990 году [106], методом электронной микроскопии с разрешением в 3,5 ангстрема в плоскости мембраны, и 10 – в перпендикулярной плоскости. В первых работах по моделированию бактериородопсина, Нонела и др. [107] закончили модель исследуемого белка и рассчитали 20 пс динамики бактериородопсина в вакууме. В другое ранней работе, сравнивалось поведение белка в вакууме и липидном бислое, при длине траекторий 300 пс [108]. С того времени компьютерные возможности заметно увеличились, а методы сильно улучшились, что сделало возможным квантовомеханическое изучение фотоцикла [103], [109]. Акваглицеропорины Мембранные белки из семейства акваглицеропоринов способствуют пассивной диффузии воды и других небольших нейтральных молекул. На данный момент известны и подробно изучены две структуры из этого семейства: аквапориновый водный канал AQP1 и глицериновый канал GlpF. Канал AQP1 является проницаемым для воды и непроницаемым для протонов или ионов; GlpF обладает меньшей пропускной способностью для воды. Кристаллические структуры канала AQP1 [110], [111], взятого из эритроцитов, и GlpF [112], синтезированного из Escherichia coli показали, что эти белки образуют тетрамеры в мембране, и каждый мономер образует отдельный канал (рис. 3). Моделирование акваглицеропоринов особенно интересно, потому что масштаб времени, в котором эти мембранные белки выполняют свою природную функцию проводимости воды и / или глицерина, порядка нескольких наносекунд. Обзор структурных свойств и достижения теоретических исследований представлены в работах [10], [113]–[116]. 16 Рис. 3 Структура и механизм вытеснения протонов из акваглицеропоринов [113], [117]. В последние несколько лет моделированию AQP1 и GlpF уделялось большое внимание. В недавних работах, где в качестве кристаллические структуры высокого разрешения использовались в качестве начальной топологии, аквапорины имели устойчивые вторичные, третичные и четвертичные структуры[118], [119]. Было, например, показано, что поток молекул воды в AQP1 закрывается из-за взаимодействий с боковыми группами в области NPA остатка [119]. Процесс прохождения потока воды через AQP1 и GlpF исследовался методами классического моделирования [120], [121], хотя они и плохо описывают различные квантовомеханические явления, в частности поведение протона. Одно из наблюдений, сделанных при анализе траекторий – переориентация дипольного момента молекул воды, которая обнаруживается при прохождении молекулы через пору 17 белка. Интересные, но абсолютно нереалистичные работы [121], [122], изучали поведение молекул воды без учёта их электростатических взаимодействий с NPA остатком и частью атомов структуры, располагающихся в области межклеточного пространства. Оказалось, что переориентация дипольного момента молекул воды в таком случае не наблюдается. Кроме того разрабатывается ряд специальных методов для численного анализа различных параметров процесса переноса воды [92], [123]. Белок GlpF пропускает не только воду, но и глицерин. Ряд работ посвящен исследованию данного процесса. Процесс перенос глицерина и воды рассматривались в работе[124]. Два этих процесса коррелируют между собой, так как при транспорте используются одинаковые партнёры для образования водородных связей. Для изучения механизмов работы канала, в работе [125] к центру масс глицерина прикладывалась сила. Это исследование позволило построить профиль свободной энергии вдоль оси поры. Ионные каналы Ионные каналы стали одними из первых белков, которые были исследованы методом моделирования молекулярной динамики. Структуры многих каналов были получены начиная с 1998 года [126]–[137], когда была решена структура калиевого канала. Глубокий обзор материалов по ионным каналам представлен в работах [138]–[142]. Ионные каналы одна из наиболее интересных категорий мембранных белков из-за их простой функции: перекачка ионов через мембрану. Раньше для описания механизма их работы использовались приближённые модели [143], но с увеличением доступности различных структурных данных, построение более точных моделей стало возможным. Грамицидин A – один из наиболее изученных ионных каналов, на основе которого изучены основные механизмы транспорта ионов [138], [144], [145]. Он образует канал за счёт объединения мономеров в димер. Распад димера соответствует закрытию канала. Этот процесс был теоретически исследован в работе [146]. В другой работе [147] в 18 качестве начальных структур были взяты недавние ЯМР данные [148], [149]. Оба этих состояния оказались ненативными. Они существуют в динамическом равновесии. Грамицидин A также стал белком, на котором проверялись различные теории транспорта, происходящего в ионных каналах. Оказалось, что стандартные теории ошибочны, но могут быть доработаны [150]–[152]. Другой класс ионных каналов – механочувствительные каналы. Примеры таких белков – MscL и MscS [153]. MscS управляется как натяжением, так и напряжением. При этом аргинины оказываются обращёнными к мембране, что важно для управления напряжением [154]. Интересно, что в других каналах, которые управляются напряжением, аргинины находятся далеко от поверхности белка [155]. MscL- чувствителен только к натяжению. В открытом состоянии он настолько легко пропускает ионы, что разница между открытым и закрытым состояниями должна быть существенной. MscL – пентамер, в котором каждая субъединица состоит из 2 трансмембранных спиралей (рис. 4). TM1 спирали образуют внутреннюю стенку канала, TM2 спирали – внешнее кольцо. Кроме того около C-конца каждого мономера есть небольшой домен, который нужен для фильтрации потока ионов [156]. Рис. 4 Механизм работы MscL. Канал является пентамером. Трансмембранные спирали каждого мономера показаны одним цветом. Размер поры в открытом состоянии 16-18Å. Белок MscL активно изучался различными методами моделирования. Динамика канала и его мутантов изучалась, например, в работах [157], [158], с целью получения 19 рекомендаций для дальнейших экспериментальных исследований. Существует две основных гипотезы, которые описывают механизм функционирования белка. По первому сценарию – трансмембранные спирали TM2 выступают в качестве сенсора внешнего натяжения, и управляют сильными конформационными изменениями внутренней стенки канала. Второй сценарий предсказывает одновременное движение трансмембранных спиралей TM1 и TM2, подобно механизму работы затвора некоторых фотокамер. Первый механизм изучался в работах [158]–[160], второй [161], [162]. Механизм фильтрации также рассматривался для данного канала [156]. Калиевые каналы – играют очень важную роль в клетках. Представителями белков класса, например, KcsA и MthK. KcsA имеет форму конуса, широкое основание которого находится во внешней части мембраны. За селективность в канале отвечает фильтр, находящийся в области белка около межклеточного пространства. Подробное изучение механизма селективности было проведено Сансомом [127], как продолжение работы 1998 года [163]. При моделировании ионных каналов важным аспектом является воспроизведение взаимодействия ионов с другими частями биологической системы. К сожалению, на данный момент, данные взаимодействия моделируются достаточно плохо [164]. Рис. 5 Механизм работы калиевого канала. 20 Моделирование методом молекулярной динамики – идеальный инструмент для изучения возможных конформационных изменений канала. В качестве начальной структуры рассматривают обычно закрытое состояние KcsA, после чего строятся различные модели открытия пор [165]–[168]. Данные теоретические исследования подтверждаются экспериментальными результатами [169]–[172]. Аденозинтрифосфатазы Другой широкий класс транспортных белков – аденозинтрифосфатазы, включает такие семейства как протонные насосы F-типа и ABC-транспортёры [173]. ABC-транспортёры одно из самых больших семейств белков и очень важны с точки зрения медицины, так как принимают участие в таких болезнях как рак и фиброз. До появления структур высокого разрешения (рис. 6) [174] компьютерные исследования в основном занимались предсказанием структуры данных белков по гомологии [175]. Так, например, полученная теоретически модель димера [176] была подтверждена экспериментальными исследованиями [177]–[179]. Другие работы фокусировались на моделировании важных, с медицинской точки зрения, белков по гомологии [180]–[182]. Важные детали механизма функционирования ABC-транспортёров, как АТФ связывание, гидролиз и др., остаются неизученными. Поэтому многие экспериментальные и теоретические исследования фокусируются на этих и других аспектах [183], [184]. Моделирование димера в липидном бислое было проведено группой Тилемана [185]. В работе было показано, что белок остаётся стабильным на протяжении 15 нс, но при появлении в системе нуклеотидов, структура сильно меняется. Другой класс белков – протонные насосы F-типа. Один из них, F1F2 аденозинтрифосфатаза, играет важную роль в синтезе АТФ [186], [187]. Данный класс белков очень привлекателен для компьютерных исследований в связи с тем, что существует очень много экспериментальных 21 структур. Кроме того механизм функционирования во многом напоминает процесс работы мотора, созданного человеком [188]. При этом такой мотор может работать в двух направлениях: синтез АТФ и её гидролиз [189]. F1F0 аденезитрифосфатаза состоит из двух, F0 – трансмембранный и F1 - цитоплазматический, доменов, которые были кристаллизованы отдельно друг от друга. F1 домен существует в трёх различных конформациях [190]. Оба домена исследовались различными компьютерными методами. Интерполяционные модели позволяют покрыть гораздо большие временные интервалы, чем моделирование методом молекулярной динамики и грубо предсказать механизм функционирования. С помощью такого метода изучался процесс присоединения АТФ к F1 домену [191]. Полноразмерное моделирование таких систем не может дать информации о принципе работы белка, так как присоединение АТФ происходит за время порядка миллисекунды, а доступные расчётные времена для данных систем не превышают нескольких сотен наносекунд. Однако за процесс закрывания кармана присоединения отвечает небольшая субъединица, поведение которого можно смоделировать методом молекулярной динамики [192], [193]. Также цитоплазматический домен изучался с помощью методов вычисления свободной энергии [194] и квантовомеханических расчётов [195]. Последние применяются для изучения химических реакций, происходящих во время гидролиза. 22 Рис. 6 Димер BtuCD в липидном бислое POPE. Молекулы АТФ не видны. Прогресс в компьютерных исследованиях трансмембранного домена гораздо более скромный. Дело в том, что структура некоторых субъединиц этой области белка до сих пор не решена. Но даже несмотря на это механизм работы F0 домена был частично изучен. Так, например, в работе [196] был исследован механизм генерации вращений. В работе, для описания изменений на поверхности неразрешённых субъединиц использовалась смесь методов моделирования молекулярной динамикой и математических моделей. 23 Рис. 7 F1F0 аденозинтрифосфатаза. Состоит из двух доменов: трансмембранного F0 домена и цитоплазматического – F1. Методы моделирования Мембранные белки играют важную роль в ряде биологических процессов. Структуры высокого разрешения этих молекул, позволяют изучать механизмы функционирования различных белков, но в функционирования, до сих то же пор время, остаётся детализированное сложной описание задачей. процесса Дополнением к экспериментальным методикам является такой инструмент, как моделирование методом молекулярной динамики. Он позволяет более полно описать динамику и энергетику белка. В этой части, будут рассмотрены существующие на данный момент методики для запуска расчётов молекулярной динамики мембранных белков. Силовые поля Для того, чтобы успешно использовать моделирование методом молекулярной динамики, важно проверить два основных момента: 1. Достаточно ли точно учтены взаимодействия между атомами 24 2. Достаточна ли длина полученной траектории, для того чтобы система побывала во всех возможных точках своего фазового пространства Результаты, которым можно доверять, получаются лишь тогда, когда оба этих условия выполнены. Разработка силовых полей, позволяет всё больше быть уверенным в том, что первое условие выполнено. При моделировании методом молекулярной динамики, атомы обычно рассматриваются как точечные частицы. Взаимодействия между атомами обычно даётся суммой потенциалов взаимодействия атомов. Общий вид функции потенциальной энергии выглядит следующим образом Потенциальная энергия зависит от координат всех атомов r, от расстояний между частицами b и , от углов θ и двугранных углов ϕ и ψ. Параметры, описывающие поведение ковалентносвязанных атомов – длины ковалентной связи , угла , , , , а также равновесные значения , двугранных углов и , а также кратность n. Нековалентные взаимодействия описываются суммой потенциалов Леннарда-Джонса и Кулоновским взаимодействием; Джонса, – глубина потенциальной ямы потенциала Леннарда- – эффективный диаметр частицы, зависят от типа частиц. и – заряды на частицах. Эти параметры – константа кулоновского потенциала. Вид функции потенциальной энергии и набор параметров образуют силовое поле. Параметры 25 выбираются исходя их различных экспериментальных данных и квантовомеханических вычислений [67]. В настоящее время наиболее используемыми силовыми полями являются CHARMM [197], AMBER [8], [198], GROMOS [199] и OPLS [200]. Все они достаточно хорошо согласуются с экспериментом. Все эти силовые поля развиваются независимо друг от друга и следуют собственной философии. Это приводит к большой разнице в наборе параметров, описывающих даже одинаковые молекулы. В связи с этим использование разных силовых полей для разных частей исследуемых систем не рекомендуется. Другая проблема заключается в том, что с каждым из этих силовых полей может быть использована лишь определённая модель молекулы воды: TIP3P (CHARMM, AMBER) [201], SPC (GROMOS) [202]. В различных силовых полях допускается различная степень детализации молекул (см. рис 2). В полноразмерных системах для расчёта используются абсолютно все атомы, включая атомы водорода. В моделях присоединённые атомы «эффективных» атомов более тяжёлые атомы и водорода объединяются в «эффективные» частицы. В крупнозернистых моделях объединяют несколько тяжёлых атомов в одну эффективно моделируемую единицу. 26 Рис. 8 Степень детализации молекул в различных силовых полях. Слева – полноразмерная система, по центру – модель «эффективных» атомов, справа – крупнозернистая модель. Подготовка структуры Для того чтобы начать моделирование методом молекулярной динамики, необходимо иметь начальную структуру биологической системы. При этом, если начальная структура является неправильной, то и результаты расчёта не дадут никакой значимой информации. Для моделирования мембранного белка, необходимо выполнить три основных шага. 1. Подготовка белка 2. Подготовка липидного бислоя 3. Встраивание мембранного белка в бислой 27 Для первой части, в первую очередь, требуется структура белка. Их можно взять в базе данных PDB [203] (http://www.rcsb.org). Опубликованные там структуры, помимо координат атомов белка, содержат также координаты атомов лигандов, молекул воды или липидов. Если биологическая функция этих молекул важна для поддержания стабильности белка, то их оставляют в рассчитываемой системе. Остальные атомы не рассматривают. Стоит отметить, что экспериментальные структуры часто бывают неполными. Часто полученное разрешение не позволяет установить положение атомов водорода или боковых групп. Программные пакеты, в которых можно производить расчёты, помогают установить координаты недостающих атомов (например, инструмент pdb2gmx в пакете GROMACS [15]–[17]). Если в структуре отсутствует значительная часть атомов, то можно пользоваться более специализированными пакетами [204], [205]. Для восстановления информации о протонированных состояниях остатков, используются пакеты PROPKA и H++ [206], [207]. Для моделирование рекомендуется использовать метод минимизации энергии. Липидные бислои часто используются при моделировании клеточных мембран. Если раньше получение структуры бислоя было непростой задачей, то сейчас для этого можно использовать стандартный инструмент пакета CHARMM, или брать данные с сервера lipidbook [208] (http://lipidbook.bioch.ox.ac.uk/). Важно убедиться, что размер бислоя превосходит размер встраиваемого белка на столько, что белки в соседних ячейках не будут взаимодействовать. После изменений в начальной структуре, рекомендуется уравновесить получившийся бислой, с помощью моделирования длиной в несколько десятков наносекунд. Следующим шагом является встраивание белка в мембрану. Если выполнять эту процедуру с помощью метода самоорганизации (то есть просто поместить липиды 28 случайным образом вокруг белка), то моделирование процесса встраивания займёт очень много времени [209]. В связи с этим существуют различные методики для ускорения этого процесса. Существует специальный метод для определения положения мембранного белка в бислое (основан на расчёте трансмембранной области белка) [210]. Ещё один стандартный метод предполагает моделирование бислоя, при фиксированном белке. Это позволяет быстрее рассчитать область взаимодействия белка с липидами. Программный пакет GROMACS В последнее время моделирование методом молекулярной динамики стало общепринятым инструментом для теоретического изучения как простых жидкостей, так и больших биологических систем, как, например, ДНК в реалистичной окружающей среде. Такие вычисления всегда отличались сложностью. В связи с этим, большое количество исследований фокусировались на разработке алгоритмов. Одни из первых работ обсуждали ограничения на длину связи [211] и модели молекул воды [201], [202]. Наиболее важным достижением в развитии метода, стала возможность параллелизации расчётов [212], [213]. Стоит, однако, помнить, что не все вычисления можно распараллелить. В связи с этим важно также улучшать производительность вычислений на одном процессоре. Программный пакет GROMACS позволяет максимально эффективно использовать возможности одного расчётного ядра благодаря таким алгоритмам, как, например, SSE, SSE2, ALTIVEC и др. [15]. В результате, GROMACS – это программный пакет с максимальной возможной производительностью, в котором эффективно реализованы алгоритмы параллелизации, а также возможности каждого отдельного процессора используются по максимуму. Алгоритмы параллелизации изучал в своих работах Шо [214]. В, так называемых, зонных методах параллелизации сила между i-той и j-той частицами не должна вычисляться на процессоре, на котором одна из этих частиц рассчитывается. Два наиболее эффективных метода – это восьмизонный метод [215] и метод средней точки [216]. В GROMACS 29 реализован первый из этих методов. При этом, области расчёта пересчитываются, как правило, каждые 10 шагов. Минимальная ячейка, которую можно использовать при вычислениях, должна содержать не менее 10 атомов. Для того, чтобы увеличить шаг интегрирования и при этом не потерять информацию о динамики системы, на межатомные связи необходимо накладывать ограничения. Если ограничения наложены на все связи в системе, то максимальный разрешённый шаг – 2 фс. Обычно для этих целей используют алгоритмы SHAKE [211] и LINCS [217]. LINCS – лучше поддаётся параллелизации [218]. Для того, чтобы наложить ограничения на молекулы воды используется алгоритм SETTLE [219]. Вычислительные мощности процессоров растут, согласно закону Мура, но, к сожалению, доступ к памяти занимает гораздо больше времени. При моделировании информация о соседних атомах, может храниться очень далеко друг от друга на жёстком диске, и это существенно замедляет процесс вычислений. Частичное упорядочивание атомов[220], помогает более эффективно моделировать сложные системы. Этот алгоритм можно применить для ускорения вычисления дальнодействующих сил: силы Леннарда-Джонса и электростатические силы. Расчёт электростатических сил производится с помощью быстрого преобразования Фурье [221]. Для того чтобы максимально эффективно распараллелить этот тип взаимодействий, необходимо, чтобы эти вычисления сочетались с восьмизонным методом распараллеливания. Для этого часть процессоров была выделена специально под вычисления электростатики (Multi-Program, Multi-Data parallelization). На рисунке 9 показана блок-схема одного шага интегрирования в GROMACS. Как уже говорилось, вычисления в реальном и обратном пространствах проводятся параллельно и практически независимо друг от друга. Для этого используется метод восьмизонного распараллеливания и MPMD. 30 Рис. 9 Блок-схема одного шага интегрирования. Серым, показаны шаги, для выполнения которых нужна информация от других процессоров. Методы анализа При изучении различных систем основное внимание уделяется двум аспектам: переходы между различными устойчивыми состояниями и движения вблизи нативного состояния. Когда рассматривают переходы между различными состояниями, чаще всего говорят о 31 фолдинге белков [9], [222], [223]. Дело в том, что профиль свободной энергии для любого белка имеет очень много локальных минимумов (рис. 10). Это означает, что помимо нативного состояния у белка есть множество других устойчивых состояний. Метод Марковских состояний позволяет изучить связи и переходы между этими состояниями [224]. Рис. 10 Профиль свободной энергии для белка. Изучение конформационных изменений вблизи нативного состояния также является важной составляющей анализа. В биологических молекулах число степеней свободы очень велико. Для того, чтобы упростить анализ нужно использовать методы, которые 32 позволяют с помощью наименьшего количества переменных описать максимальное количество конформационной динамики. Такими методами являются, например, метод анализа нормальных мод [225], [226] и метод главных компонент [227], [228]. Марковские состояния Процесс фолдинга белков очень сложный и компьютерного времени. Наиболее дорогостоящий, с точки зрения эффективный и наглядный способ анализа получающихся траекторий – построение Марковских моделей. Метод заключается в том, чтобы параметризовать многообразие возможных состояний белка конечным количеством конформаций и посчитать связи, между этими устойчивыми состояниями. Два основных вопроса: 1. Как определить устойчивые состояния? 2. Как правильно и эффективно построить матрицу переходов? Для того, чтобы ответить на эти вопросы, нужно разобраться с исходными данными. Бывает две принципиально разные ситуации – богатый информационный режим, и режим нехватки информации. В первом случае есть множество траекторий, которые начинаются из денатурированного состояния и заканчиваются в нативном [229], во втором случае таких траекторий мало. Богатый информационный режим позволяет провести глубокий анализ процесса фолдинга, в случае же нехватки информации Марковские модели позволяют направить дальнейшие исследования в правильном направлении, что увеличивает эффективность работы и ускоряет процесс получения результата. Для построения моделей можно использовать методы моделирования с различной термодинамической выборкой, как, например, REMD [230]–[233]. Эти методы позволяют сделать предварительное разбиение конформационного пространства, а иногда даже получить правильные марковские матрицы [234]. 33 Первым делом, как уже говорилось выше, нужно получить набор устойчивых состояний. Методы кластеринга, которые применялись раньше [235], [236], не учитывали различные кинетические свойства рассчитываемых систем. Первым шагом – является разбиение конформационного многообразия на так называемые «микросостояния» (число таких состояний 10000-100000). В связи с большим количеством «микросостояний», среднеквадратичное отклонение структур, соответствующих одному из них, не превосходит 2-3 Å [237], [238]. Объединение «микросостояний» в более крупные кластеры, проводится исходя из степени похожести динамических свойств в каждом «микросостоянии». Для этого необходимо построить матрицу переходов. Матрица переходов получается следующим образом: берётся набор отобранных состояний (для первой итерации – «микросостояний) и доступные траектории. Каждому кадру каждой траектории приписывается номер, соответствующий состоянию, к которому структура наиболее близка. В результате получаем проекцию траектории на набор кластеров. После этого вычисляется количество переходов между всеми парами состояний за время τ. После чего вычисляется матрица вероятности переходов [239]–[241]. Получившаяся матрица – это очень точная Марковская модель. Для того, чтобы сделать модель более наглядной (рис. 11), необходимо уменьшить число значимых состояний. Для этого применяются специальные методы, которые увеличивают τ, и, тем самым, уменьшают число релевантных состояний – методы спектрального кластеринга [242]– [244]. 34 Рис. 11 15 основных состояний и переходы для фолдинга белка NTL9. Каждый узел – это макросостояние. Размер тем больше, чем меньше свободная энергия. Стрелочками обозначаются переходы между состояниями. Чем, толще стрелочка, тем чаще происходят переходы. Нормальные моды Анализ нормальных мод позволяет изучить поведение системы вблизи нативного состояния [225]. Считается, что система уравновешивается с помощью гармонического потенциала. Раньше, метод использовался для изучения явлений классической физики, таких как атомарный спектр или транспорт в твёрдом теле. Впервые, анализ нормальных мод был применён к белкам в 1980-х годах [245]–[248]. Однако метод стал широко использоваться для анализа конформационных изменений только в последние 10 лет. 35 Основная причина популярности метода – функциональная значимость получаемых коллективных мод [225]. С точки зрения физики, коллективные моды – это просто переход к другому базису из обычной системы координат. При этом движения вдоль одной оси в новых координатах соответствуют определённой частоте. По идее, метод нормальных компонент позволяет получить энергетический спектр биологической системы. Одно из ключевых свойств анализа нормальных мод, как и метода главных компонент, заключается в том, что полученные моды слабо зависят от деталей структуры и специфических взаимодействий между атомами [249]. Оказывается, что для белков, нормальные моды определяются топологией контактов нативного состояния [250]. Математическую теорию нормальных мод можно найти в любой книге по классической механике [251]. Поэтому здесь будут разобраны лишь основные моменты. Основная задача метода – диагонализация матрицы H размера где N – количество атомов в системе. Матрица H называется Гессианом. Приближение, которое используется при анализе нормальных мод, заключается в том, что система флуктуирует около одного чётко-определённого состояния. Кроме того, эти флуктуации должны в хорошем приближении описываться гармонической функцией. Это означает, что при использовании данного метода для анализа поведения системы нужно быть очень осторожным. Кроме того, метод нормальных мод будет учитывать такие движения, как колебания связей. Поэтому для получение удовлетворительного результата на метод должны накладываться определённые ограничения [252], [253]. Это приводит к тому, что метод применим в следующих случаях: 36 1. Изучение движений около локального минимума энергии. При этом все движения будут точно предсказываться. При увеличение амплитуды конформационных изменений, нужно использовать специальный адаптированные методы. 2. Применение анализа нормальных мод для траекторий, полученных с помощью крупнозернистого моделирования или других, не полноразмерных методов [254], позволяет выявить моды, которые нечувствительны к структурным и энергетическим деталям. Метод главных компонент Динамика биологической системы – это её конформационные изменения, как функция времени. Для анализа траектории отлично подходят различные статистические методы. Один из них – метод главных компонент, применяется для эффективного уменьшения размерности конформационного многообразия соответствующего системе [227], [255], [256]. Метод главных компонент (рис. 12) – линейной преобразование, которое позволяет выявить наиболее значимые элементы в данных, опираясь на матрицу ковариации [257]. Единственное предположение заключается в том, что выборка данных (в нашем случае длина траектории) репрезентативна. Рис. 12 Метод главных компонент, применённый к HAMP домену Конформационные изменения соответствующие первой главной компоненте. 37 [258]. При применении метода главных компонент необходимо построить матрицу ковариаций, размерность которой метода становятся – число частиц в изучаемой системе. Результатом собственных векторов и столько же собственных значений. При этом собственные значения будут убывать с ростом номера моды. Если оказывается, что существенными оказываются лишь несколько мод, то это позволяет значительно сократить размерность конформационного многообразия. Обычно, степень коллективности (числа частиц, участвующих в движении) так же падает с ростом номера моды [259]. Метод главных компонент очень часто применятся для анализа траекторий белков [260]– [262]. Иногда для увеличения точности метода и получения информации о движениях определённых частей белка, метод главных компонент применяется не к целому белку, а только к его части. Другим методом изучения коллективных движений, является анализ нормальных мод, о котором говорилось выше [225]. Метод главных компонент и анализ нормальных мод для траекторий белков, находящихся вблизи нативных состояний, дают схожие результаты [263]–[265]. Основное отличие между анализом нормальных мод и методом главных компонент, является то, что второй из них, не предполагает, что конформационные изменения в системе подчиняются гармоническому потенциалу. Часто белки двигаются совершенно не по гармоническим законом [266], так что данное предположение может сильно испортить анализ нормальных мод [267]–[269]. Как уже говорилось выше, метод главных компонент, позволяет существенно уменьшить размерность конформационных многообразий для биологических систем. Выбор значимых компонент, можно проводить с использованием данных о кумулятивной сумме собственных векторов. Если сумма (в процентах) превышает некоторую отметку (например 90%), то все последующие собственные вектора считаются ненужными [270], [271]. 38 Методы Начальные структуры Для исследования были выбраны три различные системы мембран DOPC. Две системы с полноатомным разрешением, содержащие по 72 липида для силовых полей General AMBER force field [70] (система A) и CHARMM27 force field [73] (система C). В качестве третьей структуры была выбрана модель, состоящая из 128 молекул DOPC, в которой вместо реальных атомов использовались «эффективные» атомы. В модели «эффективных» атомов считается, что водород жёстко привязаны к более тяжёлым атомам, которые в свою очередь заменяются модельными частицами, которые чуть тяжелее и больше. Такая система (система B) была рассчитана с помощью специального силового поля Berger force field [71], [72]. Для всех силовых полей начальные структуры – это заранее уравновешенные модели бислоя DOPC (последние кадры траектории длиной в 100 нс, доступные на домене LipidBook [208]), полученные в результате расчётов, проведённых группой Сью [69]. Все системы полностью гидратированы. Для полноатомных моделей отношение числа молекул воды к числу молекул липида равнялось 37.9, а для модели «эффективных атомов» это соотношение было 37.4. Эти значения превышают экспериментально измеренное значение полной гидратации – 32.5 [272]. Полноатомные модели содержали 72 молекулы липидов и 2727 молекул воды и состояли из 18117 атомов. Модель, которая использовалась для изучение силового поля Berger, содержала 128 липидов, 4798 молекул воды и 21279 атомов. Все начальные структуры были внимательно изучены и для системы C было обнаружено следующее. Из-за внутренних особенностей силового поля CHARMM27 полярные и неполярные группы липида должны рассчитываться отдельно друг от друга. В связи с тем, что все расчёты сейчас проводят с применением периодических граничных условий [16], 39 Рис. 13 Схематичное изображение процесса разрыва липида, происходящего в системе C. [17], для некоторых липидов, в результате моделирования, проведённого Сью [69], полярные и неполярные группы соответствующие одному липиду оказались в разных ячейках. Это привело к тому, что в такие липиды в начальных структурах были разорваны (например один из липидных остатков был параллельно перенесён в противоположную часть элементарной ячейки) (рис. 13). Перед началом расчётов эти разрывы были устранены путём параллельного переноса оторвавшихся частей на вектор трансляции. Ещё один момент, который было необходимо исправить, перед началом работы – различные имена атомов в разных структурах. Дело в том, что при анализе расчётов использовались некоторые стандартные инструменты, для использование которых необходимо, чтобы имена атомов в различных структурах совпадали. Для исправления этой проблемы все атомы были переименованы. Старые и новые имена приведены в таблице 1. 40 A B C Новые имена A B C Новые имена N1 N4 PCG, N N C12 C46 OLE1, C12 C12A C20 C1 PCG, C6 C1 C13 C47 OLE1, C13 C13A C21 C2 PCG, C7 C2 C14 C48 OLE1, C14 C14A C22 C3 PCG, PCG,C8 C3 C15 C49 OLE1, C15 C15A C19 C5 PCG, C5 C4 C16 C50 OLE1, C16 C16A C23 C6 PCG, C4 C5 C17 CA1 OLE1, C17 C17A O5 O7 PCG, OP2 O1 C18 CA2 OLE1, C18 C18A P1 P8 PCG, P P O6 O14 PCG, O2 O1B O2 O10 PCG, OP3 O2 C27 C15 OLE2, C1 C1B O3 O9 PCG, OP4 O3 O8 O16 OLE2, O1 O2B O4 O11 PCG, OP1 O4 C28 C17 OLE2, C2 C2B C24 C12 PCG, C3 C6 C29 C18 OLE2, C3 C3B C25 C13 PCG, C2 C7 C30 C19 OLE2, C4 C4B C26 C32 PCG, C1 C8 C31 C20 OLE2, C5 C5B O7 O33 PCG, O1 O1A C32 C21 OLE2, C6 C6B C1 C34 OLE1, C1 C1A C33 C22 OLE2, C7 C7B O1 O35 C36C3 OLE1, O1 O2A C34 C23 OLE2, C8 C8B C2 C36 5 OLE1, OLE1,C2 C2A C35 C24 OLE2, C9 C9B C3 C37 OLE1, C3 C3A C36 C25 OLE2, C10 C10B C4 C38 OLE1, C4 C4A C37 C26 OLE2, C11 C11B C5 C39 OLE1, C5 C5A C38 C27 OLE2, C12 C12B C6 C40 OLE1, C6 C6A C39 C28 OLE2, C13 C13B C7 C41 OLE1, C7 C7A C40 C29 OLE2, C14 C14B C8 C42 OLE1, C8 C8A C41 C30 OLE2, C15 C15B C9 C43 OLE1, C9 C9A C42 C31 OLE2, C16 C16B C10 C44 OLE1, C10 C10A C43 CA3 OLE2, C17 C17B C11 C45 OLE1, C11 C11A C44 CA4 OLE2, C18 C18B Таблица 1 В столбцах под буквами A, B, C записаны имена атомов в молекулах липида, соответствующих системам A, B и C соответственно. В столбцах, под фразой «новые 41 имена» указаны универсальные имена, которые были присвоены атомам липидов всех систем Помимо описанных выше систем, для исследования влияния размера системы, на динамику липидов, для силового поля CHARMM была создана большая полноразмерная система, состоящая из 288 липидов. Для этого начальная структура из 72 молекул DOPC была параллельно перенесена на вектор трансляции в направлениях (1,0,0), (0, 1, 0), (1, 1, 0). После, все 4 структуры, три новые и одна исходная, были слиты вместе в одну большую. Для того, чтобы PDB файл новой структуры соответствовал топологии силового поля CHARMM, порядок атомов был изменен соответствующим образом. В итого, получившаяся структура содержала 288 липидов, 10908 молекул воды и 72468 атомов. Параметры силовых полей В данной работе для исследования были выбраны три наиболее популярных силовых поля. Параметры для молекул липида DOPC для всех систем были выбраны такими же, как в работе Сью [69]. Полные заряды на холиновой и фосфатной группах, на глицерольном основании, на карбонильных группах, а также на углеродных цепях были одинаковы для всех исследуемых силовых полей. Отличия наиболее заметны в распределении зарядов на холиновой группе: для систем B и C заряд на атоме азота имеет большую отрицательную величину, в то время как для силового поля GAFF, этот атом оказывается практически незаряженным. Также есть отличия для углеродных цепей. Для системы B атомы углеродной цепи нейтральны, в то время как для силового поля GAFF только углероды в начале цепи, ненасыщенные углероды, присоединённые водорода и метильные группы несут на себе существенно отличный от нуля заряд, а для CHARMM27 все атомы углеродных цепей оказываются довольно значительно заряженными. 42 Как говорилось выше, все системы липидных бислоёв, изучаемые в данной работе, содержат достаточно большое количество молекул воды. В связи с этим, для запуска расчётов, помимо параметров для молекул липида нужно знать и параметры для молекул воды. Для моделирования мембраны DOPC методом молекулярной динамики с силовым полем Berger, использовалась модель воды Simple Point Charge (SPC) [202],так как данное силовое поле разрабатывалось непосредственно для данной модели воды. По этой же причине в системе C, использовалась модель растворителя TIP3P [201]. Что касается силового поля GAFF, для него использовалась модель воды Extended Simple Point (SPC/E) [273]. Выбор в пользу данной модели растворителя был сделан исходя их того, что в работе Сью [69] предсказывалось наилучшее соответствие экспериментальным данным, именно для этой модели. Параметры моделирования Все расчёты были сделаны с помощью программного пакета GROMACS [16], [17]. Одной из проблем в моделировании является проблема реалистичности границ рассчитываемой области. Наиболее логичным и общепринятым методом решения которой, является применение периодических граничных условий во всех направлениях. По сути, это означает, что элементарная ячейка бесконечно репродуцируется во всех направлениях. Этот метод был использован и в наших расчётах. Другая принципиальная проблема, заключается в том, что для поддержания температуры системы постоянной, необходимо постоянно термостатировать систему. Причём, для того, чтобы температуры различных частей системы (в нашем случае эти части липиды и растворитель) также были одинаковы, необходимо термостатировать различные части системы отдельно. В наших расчётах использовалось термостатирование улучшенным методом Берендсена к температуре 310 К отдельно для липидов и растворителя с характерной константой связывания 0.1 пс-1 [274]. Кроме того, чтобы монослои не двигались друг относительно друга при расчётах, центры масс каждого монослоя, а также растворителя жёстко 43 привязываются к начальному положению. Это делается для того, чтобы предотвратить потерю энергии при термостатировании на глобальные движения системы. На связи с атомами водорода, которым соответствует очень высокая частота колебаний, накладывались ограничения с помощью алгоритмов LINCS [217] и SETTLE [219]. Интегрирование производилось с помощью стандартного интегратора leap-frog [15], а временной шаг интегрирования был равен 2 фс (меньше характерного периода колебания связей соседних атомов в молекулах). Список взаимодействующих неграничных атомов (находящихся на расстоянии более 4 связей, если двигать по цепочкам ковалентных связей в молекулах) обновлялся каждые 10 шагов. Взаимодействия атомов, находящихся дальше друг от друга, чем 1 нм не учитывались. Расстояние отсечки для ближнепольных Ван дер Ваальсовых сил равнялось 1 нм. Для расчёта электростатических взаимодействий использовался метод быстрого суммирования по решётке PME с интервалом 0.12 нм и кубическим приближением. Длительность Площадь (Å2) # N.DOPC N. воды Силовое поле Вода Ансамбль A 72 2727 GAFF SPC/E NPγT 500 нс 682 B 128 4789 Berger SPC NPT 300 нс 641 C 72 2727 CHARMM TIP3P NPγT 500 нс 683 C2 288 10908 CHARMM TIP3P NPγT 125 нс - C3 288 10908 CHARMM TIP3P NPγT 0.1 нс - Таблица 2 В таблице представлена сводная информация о параметрах моделирования различных систем. Первый столбец – краткое обозначение системы; второй – количество молекул DOPC в системе; третий – количество молекул воды; четвёртый – используемое силовое поле; пятый – используемая модель воды; шестой – условия моделирования (NPT – постоянные давления и температура, NPγT – постоянные давление и температура с добавлением поверхностного напряжения на липидный монослой); седьмой – временной 44 масштаб моделирования; восьмой – получившаяся средняя площадь, приходящаяся на один липид. Система B моделировалась при постоянном давлении, при это давление уравновешивалось изотропно и независимо в плоскости бислоя и перпендикулярно ему. При расчётах использовался баростат Берендсона с давлением в 1 бар и с характерным временем релаксации 1 пс [274]. Для того чтобы средняя площадь, приходящаяся на липид, согласовывалась с экспериментально полученными значениями, в системах A и C, С2, С3 к бислоям DOPC дополнительно прикладывалось поверхностное натяжение γ (γ=22 дин/см на монослой). Время релаксации баростата было таким же как и в случае силового поля Berger – 1 пс. Так как начальные структуры не содержали информации о скоростях атомов, перед моделированием все системы были сначала уравновешены в таких же условиях, которые были использованы в дальнейшем исследовании, за исключением того, что время релаксации баростатов было 10 пс. Длительность подготовительных симуляция составляла 10 пс. Все системы исследовались при постоянной температуре. Для термостатирования использовался улучшенный термостат Берендсона – V-rescale, привязанный к температуре 310 К с характерным временем релаксации 10 пс. Согласно обозначениям, принятым в работе Сью [69], условия моделирования, при которых система держится при постоянных температуре и давлении, обозначаются, как NPT ансамбль, а условия, при которых к бислою прикладывалось поверхностное натяжение, будем называть NPγT ансамблем соответственно. Объёмная сжимаемость для всех систем равнялась 4.510-5 бар-1. Для всех систем, кроме C3, данные записывались каждые 10 пс. Для системы C3 данные записывались каждые 20 фс. При расчётах, для минимизации энергии всех систем, использовался метод наискорейшего спуска. Длительность моделирования для систем A и C составила 500 нс, для системы B – 300 нс, для C2 – 125 нс и для системы C3 – 0.1 нс. Обзор всех параметров моделирования для всех систем представлен в таблице 2. 45 Анализ Вычисление средней площади на липид Для того чтобы вычислить среднюю площадь, приходящуюся на липид, сначала вычислялась площадь элементарной ячейки моделируемой системы. Для этого использовалась стандартная функция пакета визуализации VMD. Для каждого кадра траектории была собрана информация о площади ячейки, после чего каждое значение делилось на число липидов в монослое. Полученные данные записывались и потом обрабатывались с помощью пакетов Origin и Mathematica. Объединение траекторий Так как в работе исследовались конформационные изменения молекул липида, то для анализа различных свойств, необходимо иметь не траекторию бислоя, а траекторию отдельно взятого липида. Для того, чтобы набрать достаточно статистики и увеличить самплинг, все траектории липидов из бислоя были слиты в одну более длинную. То есть, если длина траектории бислоя N, а число липидов в элементарной ячейке l, то объединённая траектория устроена следующим образом: первые N кадров траектории – траектория первого липида бислоя, следующие N кадров – траектория второго липида и так далее. Всего в этой объединённой траектории N*l кадров. При этом, так как в системе B атомы водорода отсутствуют, то и для систем A и C эти атомы также не включались в объединённые траектории. Понятное дело это никак не влияло на траектории тяжёлых атомов. Для получения этих объединённых траекторий использовались программный пакет GROMACS, пакет визуализации VMD, а также язык программирования, совместимый с VMD – Tcl. Один из способов анализа конформационных изменений – сравнение сопряжённых подпространств, в которых двигаются липиды каждой из систем. Для такого анализа необходимо, чтобы базисные вектора каждого из сопряжённых подпространств 46 совпадали. Для этого необходимо последовательно соединить объединённые траектории для систем A, B и C соответственно. Для этого использовались программный пакет GROMACS и язык программирования C/C++. В последующем изложении объединённые траектории только для одной системы будем называть просто траекториями данной системы (например, траектория системы A), если же речь будет идти о траектории мембраны целиком – будем использовать термин – траектория бислоя системы, если же речь будет идти об объединённой траектории для всех липидных систем – будет применяться словосочетание «объединённая траектория». Среднеквадратичное отклонение Среднеквадратичное отклонение для двух структур, определяется как среднее расстояние между соответствующими атомами данных структур: , где s1, s2 обозначения двух различных структур, – координаты i-того атома структуры s, n – число атомов в структуре. Среднеквадратичное отклонение позволяет провести одно из наиболее простых и понятных исследований конформационных изменений липидов. Вообще говоря, молекула липида в мембране является очень подвижной. Среднеквадратичное отклонение для структур двух разных липидов в бислое в один и тот же момент времени может быть достаточно большим. Однако, из-за вязкости среды, среднеквадратичное отклонения для структур одного липида в различные, но близкие, моменты времени будет достаточно небольшим. Очевидно, что с ростом временного интервала, RMSD будет расти. Эта идея и лежит в основе данного анализа. Через будем обозначать структуру i-того липида в бислое в момент времени t. Первым делом, для систем A, B и C были рассчитаны референсные значения среднеквадратичного 47 отклонения. Для этого для каждого сотого кадра траектории мембраны рассчитывалось - среднеквадратичное отклонение структур различных липидов в один момент времени. Эти значения слабо отличались для различных пар липидов и практически не менялась со временем. Усреднённое значение этих величин можно принять за некий ориентир для данной системы. В качестве следующего шага, была исследована динамика среднеквадратичного отклонения. То есть были измерены величины . При этом при фиксированном τ сначала проводилось усреднение по различным моментам времени, затем проводилось усреднение по всем липидам. Получившиеся зависимости в чём-то похожи на автокорреляции – они характеризуют среднее различие между структурами в зависимости от временного интервала, разделяющего их. Следующее исследование было проведено для больших систем C2 и C3. Так как начальные кадры этих систем были получены четырёхкратным репродуцированием начальной структуры системы C, то очевидно, что среднеквадратичное отклонение соответствующих липидов в нулевой момент времени равно 0: . Можно сказать, что система уравновесится к тому моменту, когда среднеквадратичное отклонение соответствующих пар липидов сравняется с референсом полученным для системы C. Система C3 была инициализирована для того, чтобы лучше проследить зависимость от времени среднеквадратичного отклонения для соответствующих липидов в большой системе Метод главных компонент Метод главных компонент – один из основных способов уменьшить размерность данных, потеряв при этом наименьшее количество информации [227]. Вычисление главных компонент сводится к вычислению собственных векторов и собственных значений 48 матрицы ковариации исходных данных. Задача анализа главных компонент может быть сформулирована по-разному: Аппроксимировать данные линейными многообразиями меньшей размерности Найти подпространства меньшей размерности, в ортогональной проекции на которые разброс данных максимален Найти подпространства меньшей размерности, в ортогональной проекции на которые среднеквадратичное расстояние между точками максимально Для данной многомерной случайной величины построить такое ортогональное преобразование координат, в результате которого корреляции между отдельными координатами обратятся в ноль Так как липид практически не испытывает ограничений движения, то конформационные изменения молекулы DOPC можно рассматривать как случайный процесс. В связи с этим, наиболее удобной формулировкой задачи для траекторий всех систем является последняя. Более формально, процесс определения главных компонент можно описать следующим образом: пусть матрица данных, , определяет некий случайный процесс (в нашем случае этим процессом являются конформационные изменения липида определённой системы). Математически, ортогональное преобразование можно задать с помощью матрицы весов . Тогда вектора данных в новой системе координат будут определяться как При этом, для того чтобы корреляция между первой координатой и остальным подпространством была равна нулю (или чтобы максимизировать проекцию вариации на первую ось координат), первый вектор матрицы 49 должен удовлетворять условию Для того, чтобы найти k-тый вектор матрицы , нужно вычесть из пространства данных многообразие, опирающееся на первые k-1 базисных вектора после чего, нужно просто найти первую главную координату для матрицы данных . Анализ главных компонент в данной работе проводился с помощью программного пакета GROMACS [17]. Анализ проводился для траекторий определённых систем. Сначала вычислялась матрица ковариации и главные компоненты. При этом каждый кадр траектории выравнивался таким образом, чтобы минимизировать среднеквадратичное отклонение структуры данного кадры и некоторой референсной структуры. Также для каждой системы определялись средние структуры, которые сначала были выровнены друг с другом, а далее использовались как референсные для пересчёта матрицы ковариации и главных компонент. После вычисления главных компонент и соответствующих собственных значений, все траектории были спроецированы на новые базисные вектора. Также были рассчитаны максимальные и минимальные проекции на данный вектор, и структуры липидов, соответствующие этим проекциям, а также некоторые промежуточные проекции. При анализе вычислялась матрица скалярных произведений собственных векторов для каждой системы. Степень диагональности данной матрицы показывает, насколько похожи две системы базисных векторов, и, как следствие, позволяет судить об одинаковости многообразий конформационных изменений для различных систем. Кроме того, вычислялось среднеквадратичное внутреннее произведение (RMSIP) [228]. Эта величина характеризует степень пересечения подпространств, соответствующих определённым собственным векторам системы. В нашем случае выбирались первые n главных компонент. 50 где n – число рассматриваемых собственных векторов, системы, – i-тый базисный вектор первой - j-тый базисный вектор второй системы. Сравнение распределений В уравновешенном липидном бислое каждый липид непрерывно совершает переходы между большим числом разрешённых конформационных состояний. В связи с этим, наиболее удобно описать многообразие конформационных изменений молекулы липида можно, используя функцию распределения плотности вероятности обнаружения молекулы вблизи определённого конформационного состояния в некотором базисе. Для того, чтобы понять уравновешен ли бислой, можно сравнить функции распределения плотности вероятности для исследуемой системы и для уже точно уравновешенной. После проведения PCA, траектории для всех силовых полей были спроецированы на полученные собственные вектора, полученные наборы данных были структурированы следующим образом: первые N точек относились к первому липиду, следующие N точек – ко второму и так далее. N – число кадров в траектории мембраны. Общее число наборов данных равнялось числу собственных векторов, которое в свою очередь равняется , где n – число тяжёлых атомов липида DOPC (54). Каждая траектория состоит из, по крайней мере, 72 (72 для систем A, C и 128 для системы B) траекторий для отдельных липидов, при этом каждая траектория длится не менее 300 нс. В итоге, получающиеся траектории для всех систем получаются не короче 10 μс. Учитывая случайный характер конформационных изменений молекул DOPC, а также объём имеющейся статистики, можно считать что распределение плотности вероятности 51 для траектории для всех систем слабо отличается от распределений для точно уравновешенных мембран этих же систем. Для исследования процесса уравновешивания использовались траектории только отдельных липидов (то есть траектории различных липидов бислоя не объединялись в одну). Для сравнения распределений плотности вероятности уравновешенных и неуравновешенных систем использовался тест Колмогорова-Смирнова (рис. 14) [275] где – это накопительная сумма функции распределения. Рис. 14 Тест Колмагорова-Смирнова. В левом ряду показаны различные варианты взаимного расположения соответствующие функций кумулятивные распределений. функции В распределения. правом ряду показаны Стрелочками показаны результаты теста Колмогорова-Смирнова для соответствующих пар распределений. 52 Автокорреляция Автокорреляция – это кросс-корреляция зависящих от времени величин самих с собой. С точки зрения статистики, автокорелляция случайного процесса – это корреляция между величинами, характеризующими данный процесс, измеренными в различные моменты времени. Для дискретного набора данных, как например проекции траекторий на главные компоненты, автокорреляция определяется выражением где j – временной промежуток, для которого измеряется автокорреляция. Другими словами, автокорреляция это проекция набора данных самого на себя, только один из наборов сдвинут во времени относительно другого (рис. 3). Рис. 15 Автокорреляция – проекция ряда данных самого на себя, при этом один из наборов сдвинут во времени относительно другого. Коллективность мод Величина, которая характеризует степень вовлечённости в определённое главное движение степеней свободы (или атомов) в макромолекуле, была успешно выведена для белков [259]. В данной работе эта величина использовалась для того, чтобы оценить коллективность движений соответствующих определённой главной компоненте, то есть рассчитывалось соответствующее количество степеней конформационное свободы изменение. (или атомов) Степень вовлечённых коллективности, экспоненциально зависит от, так называемой, «информационной энтропии» 53 в κ, где суммирование происходит по всем степеням свободы (или атомам), α нормировочный коэффициент, ,а - собственный вектор, соответствующий определённой PC (или характерная величина смещения атомов, соответствующих данной главной компоненте). Величина κ показывает, сколько степеней свободы (или атомов вовлечено в движение), количество ненулевых . Она лежит в интервале от 1/N до 1. Если , то соответствующая главная компонента является максимально коллективной – все степени свободы (или атомы) вовлечены в движение. Максимально коллективными являются движения поступательного и вращательного движений. Так как при расчётах, мы привязывали центры масс бислоёв, то есть ограничивали поступательное и вращательное движение в системе, то соответствующие этим движением главные компоненты, должны быть исключены от из рассмотрения. Зависимость коллективности от номера моды помогает понять, какие моды соответствуют поступательным и вращательным движениям. Маленькие же значения коллективности говорят о том, что в соответствующее конформационное изменение вовлечено лишь несколько степеней свободы (или атомов). Изучение двугранных углов Под двугранным углом понимается угол между двумя плоскостями: если взять 4 последовательных атома, то первая плоскость определяется положением первых трёх атомов, а вторая – это плоскость последних трёх атомов (рис. 16). 54 Рис. 16 Двугранный, или торсионный угол, определяется, как угол между плоскостями, которые определяются положениями атомов (A1, A2, A3) и (A2, A3, A4) соответственно. В работе исследовалась динамика двугранных углов глицерольной части молекулы. При этом для одного из торсионных углов, к изучаемой структуре DOPC был добавлен атом водорода, связанный с центральным углеродным атомом глицерольного основания. Двугранные углы измерялись с помощью стандартного инструмента пакета визуализации VMD. Из-за геометрических ограничений, эти углы могут принимать ограниченное количество состояний. С помощью VMD переходы между этими состояниями так же исследовались. Для всех систем была вычислена частота переходов между состояниями, которая определяется, как число соответствующих переходов (из состояния A в состояние B, или наоборот) в единицу времени. 55 Результаты Структура и конформационная динамика липидов Перед началом расчётов, был проведён анализ начальных структур. На рисунке 17 показана элементарная ячейка для системы C. Молекулы воды на этом рисунке не показаны для увеличения наглядности. Рис. 17 Липидный бислой DOPC. Стартовая структура системы C, которая использовалась при моделировании с силовым полем CHARMM27. Зелёным цветом показаны углероды, белым – водороды, красным – кислороды, синим – азоты и оранжевым – фосфоры. 56 Видно, что липиды в системе расположены неупорядочено и упакованы довольно плотно. Разнообразие начальных состояний молекул DOPC, подсказывает, что для описания многообразия конформационных состояний потребуется множество степеней свободы. Молекула DOPC состоит из 54 тяжёлых атомов. Углеродные хвосты липида ненасыщенны – есть двойные связи между 9 и 10 атомами цепи (рис. 18 а). Рис. 18 Химическая формула, конформационные состояния и средние структуры для молекулы DOPC. На панели (a) показана химическая структура липида DOPC. На панели (b) представлено многообразие конформационных состояний липида. На панели (c) показаны средние структуры липида для трёх форсфилдов. Красная структура соответствует силовому полю GAFF, зелёная – Berger, синяя – CHARMM. Так как силовое поле Berger основано на модели «эффективных» атомов, то средняя структура ожидаемо получилась ширя чем для GAFF и CHARMM. Многообразие возможных состояний одного липида показаны на рис. 18b. При этом показаны лишь 500 случайных кадров из траектории для системы C. Серыми шарами показаны средние положения атомов. На рис. 18c сравниваются средние структуры для различных систем. Так как в системе B используется модель «эффективных» атомов, то 57 средняя структура получилась шире, чем для систем A и C, как и должно было быть. Интересно, что средняя структура для системы A получилась короче, чем для системы C. Это можно объяснить тем, что система C оказалась более подвижной. Главным результатом анализа начальных структур, можно назвать тот факт, что многообразие возможных состояний липида кажется очень большим, а состояния различных липидов – независимыми. Это означает, что траектория молекулы DOPC может быть проанализирована различными статистическими методами. Анализ собственных значений и векторов После получения траекторий для всех систем, был проведён анализ главных мод. Была вычислена матрица ковариации и соответствующие ей собственные вектора и собственные значения. Все траектории были спроецированы на оси новой системы координат. На рисунке 19 показаны основные движения, соответствующие системе C. Рис. 19 Пример конформационных изменений, связанных с первыми главными модами. На рисунке изображены состояния, соответствующие экстремальным значениям проекций, а также промежуточные состояния для первых трёх главных компонент траектории CHARMM27. Усреднённые по всей траектории позиции атомов, показаны серым цветом. Видно, что первое движение очень простое – движение углеродных хвостов в одной плоскости. Это движение характерно для всех систем. Следующие движения уже более 58 сложные. Конформационные изменения, соответствующие большому номеру моды, становятся всё менее коллективными. Последние движения – это просто колебания нескольких атомов (например, метильных групп). Важно помнить, что во всём анализе суперколлективные моды исключены из рассмотрения, так как перед началом анализа было проведено выравнивание структур. Следующим важным шагом анализа является анализ собственных значений. В связи с особенностью метода главных компонент, собственные значения оказываются отсортированы по величине (рис. 20а). Для всех трёх изучаемых систем зависимости собственных значений от номера моды очень близки друг к другу. При этом начиная с десятого номера, зависимости хорошо фиттируются функцией , где ev(i) – собственное значение, соответствующее i-той главной компоненте. Физический смысл коэффициента показательной функции не понятен, но может быть выявлен при подробном теоретическом изучении мембран. На рисунке 20a также показана зависимость кумулятивной суммы собственных значений от номера моды. Так как величина собственных значений матрицы ковариации пропорциональна квадрату амплитуды соответствующих конформационных изменений, то нормированная кумулятивная сумма собственных значений показывает, какую часть информации о конформационной динамике описывают первые несколько мод. Оказывается, что для описания 50 процентов динамики, достаточно четырёх главных компонент, а для 90% – 10 компонент. Видно, что зависимость кумулятивной суммы несколько отличается для системы A, но для систем B и C отличия незначительны. 59 Рис. 20 Метод главных компонент для конформаций молекулы липида DOPC. (a) На верхнем рисунке показаны собственные вектора матрицы ковариации. Величина ошибки компьютерных вычислений показана чёрной отметкой на уровне 510-4 нм2, что соответствует максимальной абсолютной величине отрицательного собственного значение. Очевидно, что собственное значение на может быть отрицательным. В связи с этим все собственные вектора, собственные значения которых меньше ошибки, должны быть исключены из рассмотрения. На нижнем рисунке представлена кумулятивная сумма собственных значений, нормированная на единицу. Первые четыре главные компоненты описывают 50% 60 структурных изменений липида, первые 10 – описывают 90% конформационной динамики. (b) Коллективность главных компонент. Наблюдается общая тенденция, что коллективность линейно падает с ростом номера моды. На рисунке 20b представлена зависимость коллективности моды от её номера. Общая тенденция – линейное убывание коллективности с ростом моды. Интересно, что для всех силовых полей наблюдается резкий провал в районе 30 моды. Он возникает из-за наличия в молекуле DOPC двойной связи в середине углеродных цепочек. Этим модам соответствуют движения лишь части углеродной цепочки между метильной группой и двойной связью. Ещё раз отметим, что суперколлективные моды были исключены из рассмотрения. Следующим, после сравнения собственных значений, шагом было сравнения конформационных многообразий для различных систем. Наиболее простой и наглядный способ провести данный анализ – построить матрицу скалярных произведений для собственных векторов различных систем (рис. 21). При этом, чем более диагональна эта матрица, тем более похожи многообразия между собой. Видно, что для первых мод, получившиеся матрицы более диагональны, чем для больших номеров. Однако, при более детальном рассмотрении (правые панели) выясняется, что даже для первых 10 главных компонент, которые описывают более 90% конформационной динамики, матрицы скалярных произведений получаются довольно грязными. Наибольшую степень диагональности можно наблюдать для матрицы скалярных произведений собственных векторов систем B и C. При моделировании с использованием силового поля GAFF, получающееся конформационное многообразие отличается от подпространств, соответствующих системам B и C. Это может означать две вещи: либо липиды в системе A ещё не уравновесились, либо к этому результату приводит отличие в структуре силовых полей. 61 Рис. 21 Сравнение собственных векторов, полученных для разных систем, методом главных компонент. Матрица скалярных произведений соответствующих собственных векторов. Матрицы имеют структуру, относительно близкую к диагональной, что указывает на то, что многообразия конформационных изменений для всех систем сохраняют основные свойства. Другой мерой сравнения многообразий является RMSIP (рис. 22). Можно отметить для всех силовых полей провал значения RMSIP для первых мод. В зависимости собственных значений от номера моды (рис. 20a) есть следующая особенность – собственные значения, соответствующие 2, 3 и 4 модам очень близки. Это означает, что эти моды могут просто поменяться порядком в различных системах. Такая перестановка как раз и приведёт к провалу в RMSIP. Из анализа этой зависимости можно опять таки сделать вывод, что 10 первых компонент достаточно для описания конформационной динамики молекул 62 липидов. Ещё один вывод – различия между системами B и C меньше, чем между системой A и любой другой. Рис. 22 Сравнение собственных векторов, полученных для разных систем, методом главных компонент. RMSIP для подпространств, соответствующих определённому количеству первых главных мод. Видно, что начиная с n=10, значение среднеквадратичного внутреннего произведения достаточно близко к единице. Основной результат, полученный из анализа собственных значений и собственных векторов – метод главных компонент может быть успешно применён для уменьшения размерности конформационных многообразий, описывающих динамику молекул липида. Для описания 90% конформационных изменений достаточно 10 главных компонент. В то время как результаты для систем B и C достаточно похожи, система A демонстрирует ряд существенных отличий. Уравновешивание мембран В предыдущем пункте, были представлены результаты сравнения подпространств, описывающих многообразия конформационных состояний молекул липидов. Цель данной работы, однако, сравнение динамических свойств мембран и изучение процесса уравновешивания. Как уже говорилось выше, большинство работ по этой тематике анализируют различные усреднённые свойства, как например, средняя площадь, приходящаяся на липид. Для того чтобы убедиться в том, что полученные результаты 63 реалистичны, для всех систем зависимости средней площади от времени также были вычислены (рис. 23). Так как получившиеся значения (таблица 2) совпадали с экспериментальными данными, а также с результатами, полученными Сью [69], другие усреднённые параметры в данной работе не рассчитывались. Рис. 23 Зависимость средней площади, приходящейся на липид, от времени. Значения усреднены за каждый временной интервал в 1 нс. На левой панели представлена эволюция площади для «маленьких» систем (A, B, C). На правой – для «большой» системы CHARMM (C2). Значения средней площади для «маленькой» и «большой» систем, рассчитываемых в силовом поле CHARMM, слабо отличаются друг от друга. Анализируя зависимости средней площади от времени, можно сделать следующие выводы: Средняя площадь на липид не зависит от размера системы Система C наиболее подвижна Следующим очевидным шагом является анализ среднеквадратичных отклонений липидов (см. методы). На рисунке 24 представлены зависимости RMSD от времени для всех систем. Важно отметить некоторые особенности. Во-первых, для времён меньших 10 пс данные не собирались. Во-вторых, из-за уменьшения самплинга величина стандартной ошибки растёт с увеличением τ. 64 Что касается первого замечания, очевидно, что при , RMSD также равняется 0. Этот факт, а также зависимость для малых времён, полученная для больших систем (рис. 32) позволяет поспекулировать о механизмах уравновешивания и, соответственно, установления величины среднеквадратичных отклонений. При малых значений RMSD, липиды практически не влияют друг на друга. По этому они довольно свободно двигаются и, как следствие, среднеквадратичное отклонение быстро растёт. При этом влияние липидов друг на друга постоянно увеличивается, что, в итоге, приводит к изменению режима, который характеризуется более медленной динамикой RMSD (начальный участок на рис. 24, средний участок на рис. 32). Тот факт, что для всех систем начальные участки на рис. 24 параллельны ( ) подтверждает данную теорию. Рис. 24 Эволюция во времени среднеквадратичного отклонения конформации липида от начального состояния. Равновесная величина RMSD быстрее всего устанавливается в системе C (за время порядка 20 нс), в системе B время установления RMSD порядка 50 нс, для силового поля GAFF – время уравновешивания среднеквадратичного отклонения более 100 нс. Если говорить о зависимостях RMSD от времени, в применении к уравновешиванию липидов, то можно сказать следующее: 1. Быстрее всего среднеквадратичное отклонение устанавливается для системы C 65 2. Медленнее всего – для системы A 3. Липиды в системе A наименее подвижны 4. Время установления RMSD для системы A порядка 200 нс, для систем B и C – порядка 20 нс Сравнение распределений Наиболее интересный анализ связан с изучением проекций траекторий на главные моды. Первым делом были рассчитаны распределения плотностей вероятности для проекций траекторий всех систем. Причём траектории каждой системы считались уравновешенными, и соответственно распределения проекций для них – идеальными. Для того чтобы изучить процесс уравновешивания бислоя идеальное распределение сравнивалось с частичным, рассчитанным для части траектории одного липида. На рисунке 20 приведены механизм сравнения и пример схождения распределений для системы C. Важно помнить, что мера Колмогорова-Смирнова тем меньше, чем более похожи распределения. Из нижних графиков рисунка 25 видно, что чем больше длина частичной траектории, тем её распределение ближе к идеальному, и, как следствие, максимальная разница в кумулятивных суммах (которая и является мерой Колмогорова-Смирнова) падает. Частичных траекторий данной длины намного больше одной, их число по-крайней мере не меньше числа липидов в системе. Распределения для частичных траекторий, особенно для коротких траекторий, могут сильно отличаться между собой. Поэтому для дальнейшего анализа использовалось усреднение статистики Колмогорова-Смирнова по множеству частичных траекторий одной длины. Интересно оценить максимальное возможное значение меры Колмогорова-Смирнова. Для этого нужно сравнивать идеальную траекторию с максимально короткой – по сути с 66 дельта функцией. Дальнейшие вычисления будут приведены в предположении, что идеальное распределение является нормальным. Рис. 25 В верхней части рисунка показана методика расчёта меры Колмогорова-Смирнова. Для непересекающихся распределений она близка к единицы. Чем ближе распределения друг к другу, тем меньше статистика Колмогорова-Смирнова. На двух нижних графиках показаны примеры из расчётов для распределений проекций на первую главную моду для силового поля CHARMM. Синим цветом – показано распределение для уравновешенной траектории. Оранжевым для частичной траектории длиной в 10 нс, розовым – в 20 нс, зелёным – в 40 нс, коричневым – в 80. Статистика Колмогорова-Смирнова падает с 67 увеличением длины частичной траектории, то есть распределение проекций стремиться к равновесному. Идеальное распределение описывается формулой , Наиболее короткое частичное распределение – где распределено нормально. Тогда среднее значение меры Колмогорова-Смирнова будет , , Из представленных расчётов получается, что максимальная возможная величина усреднённой меры Колмогорова-Смирнова – 0.75. Предположение о нормальности идеального распределения, строго говоря, не верно (рис. 25). Однако, при анализе полученных траекторий, полученные, при сравнение идеального и кротчайших частичных распределений, для меры Колмогорова-Смирнова значения получались близкими к расчётному для всех мод. Анализ в собственных базисных векторах Первым делом, после того, как проекции траекторий были получены, необходимо вычислить идеальные проекции (рис. 26). Интересно, что в то время как распределение для первой главной компоненты сильно отличается от нормального, последующие распределения все более похожи на Гауссианы. Вид распределения первой проекции легко объяснить исходя из того, как устроено первое главное движение (рис. 19). Первое 68 движение, напомним, это просто движение углеродных хвостов молекулы DOPC в плоскости. Очевидным ограничением является тот факт, что углеродные цепочки не могут проникать друг через друга, тем самым возникает естественное ограничение на минимальное значение угла между цепями, и, как следствие, распределения обрезаются с одной из сторон. Рис. 26 Распределения плотностей вероятности для проекций на главные компоненты для различных силовых полей. N-ая главная компонента обозначена здесь и далее через PCN. Для каждого графика, собственные вектора вычисляются для данной траектории. В то время, как распределения для первой главной компоненты сильно отличается от Гауссианы, остальные проекции распределены практически нормально. Из рис. 26 также видна общая тенденция – с увеличением номера моды, распределения становятся всё более узкими. Исходя из этого, можно сделать предположение, что при определённой длине траектории, проекции частичных распределений для больших номеров главных компонент должны сходиться быстрее. Зависимости статистики Колмогорова-Смирнова от длины частичной траектории для всех мод приведены на 69 рисунке 27. На нижних графиках приведены характерные времена падения меры Колмогорова-Смирнова от среднего значения в нуле (0.75) в e – сплошная кривая, и e2 – пунктирная, раз для всех систем. Как видно, предположение в среднем оправдывается. Рис. 27 Схождение меры Колмогорова-Смирнова для проекций на главные компоненты. Верхний ряд: статистика Колмогорова-Смирнова для схождения распределений плотности вероятности проекция на различные моды. Красные оттенки соответствуют системе A, зелёные относятся к системе B, синие – к системе C. На каждом графике цвет непрерывно меняется в сторону более тёмных тонов с увеличением номера моды. Нижний ряд: характерные времена релаксации статистики Колмогорова-Смирнова в зависимости от номера моды. Сплошная линия соответствует уменьшению меры Колмогорова-Смирнова в e раз, пунктирная – уменьшению в e2 раз. Из всех систем, медленнее всего уравновешивается система A. Другая характеристика, которая также позволяет получить информацию о схождении проекций траекторий – автокорреляции. Физический смысл этой величины заключается в следующем – степень похожести траекторий с началом в разные моменты времени. 70 Временной интервал, для которого траектории перестают быть похожи друг на другу, можно понимать как время, через которое система забывает о своём начальном состоянии. Рис. 28 Автокорреляции траекторий, спроецированных на базисные вектора различных главных компонент. Верхний ряд: автокорреляции траекторий, спроецированных на различные моды. Красные оттенки соответствуют системе A, зелёные относятся к системе B, синие – к системе C. На каждом графике цвет непрерывно меняется в сторону более тёмных тонов с номером моды. Нижний ряд: характерные времена релаксации автокорреляций в зависимости от номера моды. Сплошная линия соответствует уменьшению автокорреляций в e раз, пунктирная – уменьшению в e2 раз. Из всех систем, медленнее всего уравновешивается система A. Зависимости автокорреляций от временного интервала для всех мод всех систем приведена на рисунке 28. Характерные время падения автокорреляций от номера моды приведено на нижних рисунках. Общие закономерности, которые можно выявить из данного анализа, следующие: 71 1. Время схождения автокорреляций на порядок меньше времени схождения меры Колмогорова-Смирнова. 2. Медленнее всех уравновешивается система A. Первое следствие подтверждает тот факт, что анализируемые траектории хорошо моделируют случайный процесс. Второе следствие, подтверждает замеченное ранее отличие системы A от двух других. Рис. 29 Сравнение соответствующих времён схождения меры Колмогорова-Смирнова и автокорреляций. Чёрная линия соответствует фиттированию методом наименьших квадратов логарифмических значений времён линейной функцией области больших времён ( , для нс). При этом . На рисунке 29 представлены корреляция между характерными временами схождения для автокорреляций и статистики Колмогорова-Смирнова. Как видно, для значимых мод эти времена хорошо соотносятся друг с другом. 72 Анализ в базисных векторах объединённой траектории Для того чтобы сравнить распределения для разных систем между собой, необходимо, чтобы проекции вычислялись для одного и того же базиса. Поэтому следующий шаг – вычислений распределений проекций для всех систем в базисе объединённой траектории. Идеальные распределения представлены на рисунке 30. Видно, что распределения для всех систем получаются похожими. Рис. 30 Распределения плотностей вероятности для проекций на главные компоненты для различных силовых полей в базисе объединённых траекторий. В то время, как распределения для первой главной компоненты сильно отличается от Гауссианы, остальные проекции распределены практически нормально. Для того, чтобы численно сравнить распределения опять же использовалась статистика Колмогорова-Смирнова (рис. 31). Можно отметить, что для любого номера моды, полученные значения малы (порядка 0.1 и меньше). Это позволяет судить о том, что в целом, использование любого из силовых полей GAFF, Berger и CHARMM, приводит к одному результату – получающиеся многообразия конформационных состояний похожи между собой, как и движения молекул липида. Сделать вывод о том, что данный набор параметров лучше или хуже – нельзя, так как непонятно, что понимается под словом лучше. Можно также сделать вывод, что системы B и C уравновешиваются быстрее системы A, при этом для всех систем время уравновешивания бислоя должно быть не меньше 100 нс. 73 Рис. 31 Сравнение распределений проекций для разных систем на главные вектора в объединённом базисе. Максимальное значение меры Колмогорова-Смирнова порядка 0.1. То есть распределения получаются довольно похожими. Влияние размера системы Влияние размера системы на конформационную динамику липидов изучалось на примере систем C и C2. Учитывая метод получения системы C2, первым делом необходимо понять, как быстро соответствующие друг другу липиды становятся независимыми. Наиболее простой способ ответить на этот вопрос – изучение динамики RMSD. Рис. 32 Среднеквадратичное отклонение между соответствующими друг другу липидами большой системы. Видно, что система забывает о начальных связях за время порядка 10 нс. 74 На рисунке 32 показана зависимость величины среднеквадратичного отклонения от длины траектории большой системы. Оранжевым показан разброс величины RMSD для маленькой системы. Видно, что RMSD устанавливается за время порядка 5 нс, то есть система довольно быстро забывает о своём начальном состоянии. Рис. 33 Собственные значения и их кумулятивная сумма для большой и маленькой систем, моделируемых силовым полем CHARMM. Видно, что отличие отсутствует. Следующий шаг, как и для маленьких систем – сравнение собственных значений. На рис. 33 представлены графики зависимостей величины собственных значений и кумулятивных сумм от номера моды. Отличия между большой системой и маленькой не наблюдаются. На рисунке 34 показана матрица скалярных произведений собственных векторов для большой и маленькой систем. Видно, что отличия практически полностью отсутствуют – матрица для первых десяти мод получается абсолютно диагональной, а для всех мод – 75 практически диагональной. Отличия от диагональности могут быть обусловлены шумом, вносимым алгоритмами расчёта траектории. Рис. 34 Сравнение собственных векторов для систем C и C2. Матрицы скалярных произведений получились практически идеально диагональными. Что говорит о том, что многообразия конформационных изменений для систем почти полностью совпадают. Времена схождений меры Колмогорова-Смирнова и автокорреляций показаны на рисунке 35. На рисунке 36 показано соотношения между соответствующими временами для большой и маленькой систем. Рис. 35 Времена схождения меры Колмогорова-Смирнова и автокорреляций для большой и маленькой систем. Эти времена слабо отличаются друг от друга. Можно предположить, что отличие связано в первую очередь с меньшим самплингом для системы C2. 76 Рис. 36 Сравнение времён схождения меры Колмогорова-Смирнова и автокорреляций для большой и маленькой систем. Получившиеся отличия незначительны. Отличия во временах схождения если и присутствуют, то они небольшие и могут быть объяснены меньшим самплингом большой системы. Основным выводом, который можно сделать из сравнения конформационной динамики большой и маленькой системы – влияние размера системы незначительно. Остаётся открытым вопрос о том, что будет происходить при дальнейшем увеличении размеров системы. Дело в том, что различные коллективные движения, как, например, изменения радиуса кривизны бислоя и др., играют большую роль для больших систем. Для системы C2, эти явления наблюдаются, но в меньшей степени, чем для реальных мембран. Поведение глицерольной группы В процессе изучения конформационный динамики, также уделялось внимание поведению глицерольной группы. Оказалось, что некоторые двугранные углы в ней (рис. 37) могут принимать конечный набор значений. Причём распределения этих углов для всех систем сильно отличаются. Напомним, что в работе [69] были получены существенные различия 77 в распределениях параметров порядка для углеродных цепочек в системе A. Эти отличия могут быть объяснены разным поведением глицерольных групп в различных системах. Рис. 37 Многообразие состояний глицерольной части липида. Двугранный угол, содержащий ковалентную связь C1-C2 существует в трёх различных состояниях. Двугранный угол, содержащий ковалентную связь C2-O2 существует в двух различных состояниях. Двугранный угол, содержащий ковалентную связь C2-C3 существует в трёх различных состояниях. На рисунке 38 показаны распределения различных двугранных углов и частоту переходов между состояниями. Видно, что в системе C такие переходы сильно ограничены и происходят они значительно реже, чем в системах A и B. Также видно, что распределения для всех систем сильно отличаются друг от друга. Эти распределения и частота переходов между состояниями может быть измерена экспериментально с помощью ЯМР. Важность этого наблюдения, в первую очередь заключается в том, что этот результат может помочь группам, которые занимаются разработкой силовых полей изменить параметры для межатомных взаимодействий таким образом, чтобы получающиеся результаты стали более реалистичными. 78 Рис. 38 Верхний ряд: распределения двугранных углов для связей C1-C2, C2-O2 и C2-C3 соответственно. Нижний ряд: частоты перехода между этими состояниями. Некоторые переходы (отмеченные *) происходят очень редко. 79 Заключение Основные выводы данной работы можно сформулировать следующим образом: 1. Разработан метод, который позволяет эффективно описывать конформационную динамику молекул липидов. Метод основан на статистическом анализе траекторий и рассмотрении различных аспектов движения, как например: автокорреляции, распределения плотностей вероятности, анализ собственных векторов, изучение конформационных многообразий. Совокупность данного анализа и расчёта усреднённых величин, как средняя площадь на липид, толщина бислоя, параметры порядка и др., позволяет сделать полный глубокий анализ процесса уравновешивания мембран. 2. Время уравновешивания одной конкретной молекулы липида составляет 10-100 наносекунд. Как уже отмечалось ранее, время схождения усреднённых величин в среднем меньше, чем время уравновешивания конкретного липида. утверждение например, подтверждается, зависимостями RMSD и Это меры Колмогорова-Смирнова от времени (вторая сходится куда медленнее). Данный результат даёт строгую оценку снизу для времени, которое необходимо для уравновешивания конкретного липида. 3. Разработанный метод позволяет количественно и качественно сравнивать траектории, полученные в различных условиях или силовых полях. Сравнивать возможно различные параметры: от собственных значений ковариационной матрицы до различных параметров конформационной динамики. При глубоком анализе можно обнаружить принципиальные различия в силовых полях, так, например, в данной работе было обнаружены сильные различия в поведении глицерольной группы молекулы DOPC для силовых полей GAFF, Berger и CHARMM. 80 Стоит отметить, что данный метод может быть полезен как для анализа траекторий и сравнения силовых полей, так и для разработки силовых полей. Он может применяться не только к липидам, но и к различным другим биологическим системам. Один из вариантов применения – изучение влияния холестерина, пептидов и мембранных белков на конформационную динамику липидов. Полноразмерное моделирование больших биологических систем занимает довольно много времени. Поэтому многие группы разрабатывают различные методы ускорения, например, крупнозернистое моделирование и др. Разработанный метод позволяет оценивать такие силовые поля и сравнивать их с полноразмерным моделированием. Кроме результаты данного метода могут быть использованы, для лучшего соответствия результатов ускоренного моделирования и всеатомного. Ключевым моментом должно быть правильное воспроизведение главных движений и собственных значений, которые этим движения соответствуют. Более глубокий анализ силовых полей и траекторий, получаемых при их использовании, может позволить найти ключевые места в алгоритмах и параметрах, которые позволят добиться большего соответствия эксперименту. 81 Список литературы [1] C. Domene, P. J. Bond, and M. S. P. Sansom, “Membrane Protein Simulations: Ion Channels And Bacterial Outer Membrane Proteins,” in Advances in Protein Chemistry, vol. Volume 66, Valerie Daggett, Ed. Academic Press, 2003, pp. 159–193. [2] S. E. Feller, “Molecular dynamics simulations of lipid bilayers,” Curr. Opin. Colloid Interface Sci., vol. 5, no. 3–4, pp. 217–223, Jul. 2000. [3] L. R. Forrest and M. S. Sansom, “Membrane simulations: bigger and better?,” Curr. Opin. Struct. Biol., vol. 10, no. 2, pp. 174–181, Apr. 2000. [4] R. W. Pastor, “Molecular dynamics and Monte Carlo simulations of lipid bilayers,” Curr. Opin. Struct. Biol., vol. 4, no. 4, pp. 486–492, 1994. [5] H. L. Scott, “Modeling the lipid component of membranes,” Curr. Opin. Struct. Biol., vol. 12, no. 4, pp. 495–502, Aug. 2002. [6] D. P. Tieleman, S. J. Marrink, and H. J. C. Berendsen, “A computer perspective of membranes: molecular dynamics studies of lipid bilayer systems,” Biochim. Biophys. Acta BBA - Rev. Biomembr., vol. 1331, no. 3, pp. 235–270, Nov. 1997. [7] A. R. Leach, Molecular Modelling: Principles and Applications. Pearson Education, 2001. [8] J. W. Ponder and D. A. Case, “Force Fields for Protein Simulations,” in Advances in Protein Chemistry, vol. Volume 66, Valerie Daggett, Ed. Academic Press, 2003, pp. 27–85. [9] Y. M. Rhee and V. S. Pande, “Multiplexed-Replica Exchange Molecular Dynamics Method for Protein Folding Simulation,” Biophys. J., vol. 84, no. 2, pp. 775–786, Feb. 2003. [10] E. Tajkhorshid, A. Aksimentiev, I. Balabin, M. Gao, B. Isralewitz, J. C. Phillips, F. Zhu, and K. Schulten, “Large Scale Simulation of Protein Mechanics and Function,” in Advances in Protein Chemistry, vol. Volume 66, Valerie Daggett, Ed. Academic Press, 2003, pp. 195–247. [11] C. Sagui and T. A. Darden, Molecular dynamics simulations of biomolecules: Long-range electrostatic effects, vol. 28. 1999. [12] A. F. Voter, “Parallel replica method for dynamics of infrequent events,” Phys. Rev. B Condens. Matter Mater. Phys., vol. 57, no. 22, pp. R13985–R13988, 1998. [13] M. Shirts and V. S. Pande, “Screen savers of the world unite,” Science, vol. 290, no. 5498, pp. 1903–1904, 2000. [14] Y. Sugita and Y. Okamoto, “Replica-exchange molecular dynamics method for protein folding,” Chem. Phys. Lett., vol. 314, no. 1–2, pp. 141–151, Nov. 1999. [15] D. Van Der Spoel, E. Lindahl, B. Hess, G. Groenhof, A. E. Mark, and H. J. C. Berendsen, “GROMACS: Fast, flexible, and free,” J. Comput. Chem., vol. 26, no. 16, pp. 1701–1718, Dec. 2005. [16] B. Hess, C. Kutzner, D. van der Spoel, and E. Lindahl, “GROMACS 4: Algorithms for Highly Efficient, Load-Balanced, and Scalable Molecular Simulation,” J. Chem. Theory Comput., vol. 4, no. 3, pp. 435–447, Mar. 2008. [17] S. Pronk, S. Páll, R. Schulz, P. Larsson, P. Bjelkmar, R. Apostolov, M. R. Shirts, J. C. Smith, P. M. Kasson, D. van der Spoel, B. Hess, and E. Lindahl, “GROMACS 4.5: a highthroughput and highly parallel open source molecular simulation toolkit,” Bioinformatics, vol. 29, no. 7, pp. 845–854, Apr. 2013. [18] W. L. Ash, M. R. Zlomislic, E. O. Oloo, and D. P. Tieleman, “Computer simulations of membrane proteins,” Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr., vol. 1666, no. 1–2, pp. 158–189, Nov. 2004. [19] C. Anézo, A. H. De Vries, H.-D. Höltje, D. P. Tieleman, and S.-J. Marrink, “Methodological issues in lipid bilayer simulations,” J. Phys. Chem. B, vol. 107, no. 35, pp. 9424–9433, 2003. [20] R. A. Böckmann, A. Hac, T. Heimburg, and H. Grubmüller, “Effect of Sodium Chloride on a Lipid Bilayer,” Biophys. J., vol. 85, no. 3, pp. 1647–1655, Sep. 2003. 82 [21] E. Lindahl and O. Edholm, “Mesoscopic Undulations and Thickness Fluctuations in Lipid Bilayers from Molecular Dynamics Simulations,” Biophys. J., vol. 79, no. 1, pp. 426–433, Jul. 2000. [22] S. J. Marrink and A. E. Mark, “Effect of undulations on surface tension in simulated bilayers,” J. Phys. Chem. B, vol. 105, no. 26, pp. 6122–6127, 2001. [23] N. V. Eldho, S. E. Feller, S. Tristram-Nagle, I. V. Polozov, and K. Gawrisch, “Polyunsaturated docosahexaenoic vs docosapentaenoic acid - Differences in lipid matrix properties from the loss of one double bond,” J. Am. Chem. Soc., vol. 125, no. 21, pp. 6409–6421, 2003. [24] S. E. Feller, K. Gawrisch, and A. D. MacKerell Jr., “Polyunsaturated fatty acids in lipid bilayers: Intrinsic and environmental contributions to their unique physical properties,” J. Am. Chem. Soc., vol. 124, no. 2, pp. 318–326, 2002. [25] S. E. Feller, K. Gawrisch, and T. B. Woolf, “Rhodopsin exhibits a preference for solvation by polyunsaturated docosohexaenoic acid,” J. Am. Chem. Soc., vol. 125, no. 15, pp. 4434– 4435, 2003. [26] T. Huber, K. Rajamoorthi, V. F. Kurze, K. Beyer, and M. F. Brown, “Structure of docosahexaenoic acid-containing phospholipid bilayers as studied by 2H NMR and molecular dynamics simulations,” J. Am. Chem. Soc., vol. 124, no. 2, pp. 298–309, 2002. [27] M. T. Hyvönen, T. T. Rantala, and M. Ala-Korpela, “Structure and dynamic properties of diunsaturated 1-palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine lipid bilayer from molecular dynamics simulation,” Biophys. J., vol. 73, no. 6, pp. 2907–2923, Dec. 1997. [28] L. Saiz and M. L. Klein, “Computer simulation studies of model biological membranes,” Acc. Chem. Res., vol. 35, no. 6, pp. 482–489, 2002. [29] J. J. L. Cascales, J. G. de la Torre, S. J. Marrink, and H. J. C. Berendsen, “Molecular dynamics simulation of a charged biological membrane,” J. Chem. Phys., vol. 104, no. 7, pp. 2713–2720, Feb. 1996. [30] P. Mukhopadhyay, H. J. Vogel, and D. P. Tieleman, “Distribution of Pentachlorophenol in Phospholipid Bilayers: A Molecular Dynamics Study,” Biophys. J., vol. 86, no. 1, pp. 337– 345, Jan. 2004. [31] S. A. Pandit and M. L. Berkowitz, “Molecular Dynamics Simulation of Dipalmitoylphosphatidylserine Bilayer with Na+ Counterions,” Biophys. J., vol. 82, no. 4, pp. 1818–1827, Apr. 2002. [32] S. W. Chiu, S. Vasudevan, E. Jakobsson, R. J. Mashl, and H. L. Scott, “Structure of Sphingomyelin Bilayers: A Simulation Study,” Biophys. J., vol. 85, no. 6, pp. 3624–3635, Dec. 2003. [33] M. T. Hyvönen and P. T. Kovanen, “Molecular dynamics simulation of sphingomyelin bilayer,” J. Phys. Chem. B, vol. 107, no. 34, pp. 9102–9108, 2003. [34] E. Mombelli, R. Morris, W. Taylor, and F. Fraternali, “Hydrogen-Bonding Propensities of Sphingomyelin in Solution and in a Bilayer Assembly: A Molecular Dynamics Study,” Biophys. J., vol. 84, no. 3, pp. 1507–1517, Mar. 2003. [35] R. D. Lins and T. P. Straatsma, “Computer Simulation of the Rough Lipopolysaccharide Membrane of Pseudomonas aeruginosa,” Biophys. J., vol. 81, no. 2, pp. 1037–1046, Aug. 2001. [36] S. Bandyopadhyay, M. Tarek, and M. L. Klein, “Molecular Dynamics Study of a Lipid−DNA Complex,” J. Phys. Chem. B, vol. 103, no. 46, pp. 10075–10080, Nov. 1999. [37] S. J. Marrink, E. Lindahl, O. Edholm, and A. E. Mark, “Simulation of the spontaneous aggregation of phospholipids into bilayers [23],” J. Am. Chem. Soc., vol. 123, no. 35, pp. 8638–8639, 2001. [38] A. H. De Vries, A. E. Mark, and S. J. Marrink, “Molecular Dynamics Simulation of the Spontaneous Formation of a Small DPPC Vesicle in Water in Atomistic Detail,” J. Am. Chem. Soc., vol. 126, no. 14, pp. 4488–4489, 2004. 83 [39] D. P. Tieleman, H. Leontiadou, A. E. Mark, and S.-J. Marrink, “Simulation of pore formation in lipid bilayers by mechanical stress and electric fields,” J. Am. Chem. Soc., vol. 125, no. 21, pp. 6382–6383, 2003. [40] H. Leontiadou, A. E. Mark, and S. J. Marrink, “Molecular Dynamics Simulations of Hydrophilic Pores in Lipid Bilayers,” Biophys. J., vol. 86, no. 4, pp. 2156–2164, Apr. 2004. [41] D. P. Tieleman, “The molecular basis of electroporation,” BMC Biochem., vol. 5, pp. 1–12, 2004. [42] A. Wierzbicki, P. Dalal, J. D. Madura, and H. S. Cheung, “Molecular dynamics simulation of crystal-induced membranolysis,” J. Phys. Chem. B, vol. 107, no. 44, pp. 12346–12351, 2003. [43] S.-J. Marrink and D. P. Tieleman, “Molecular dynamics simulation of a lipid diamond cubic phase,” J. Am. Chem. Soc., vol. 123, no. 49, pp. 12383–12391, 2001. [44] S.-J. Marrink and D. Peter Tieleman, “Molecular Dynamics Simulation of Spontaneous Membrane Fusion during a Cubic-Hexagonal Phase Transition,” Biophys. J., vol. 83, no. 5, pp. 2386–2392, Nov. 2002. [45] G. Khelashvili, P. B. C. Albornoz, N. Johner, S. Mondal, M. Caffrey, and H. Weinstein, “Why GPCRs behave differently in cubic and lamellar lipidic mesophases,” J. Am. Chem. Soc., vol. 134, no. 38, pp. 15858–15868, Sep. 2012. [46] N. Johner, S. Mondal, G. Morra, M. Caffrey, H. Weinstein, and G. Khelashvili, “Protein and Lipid Interactions Driving Molecular Mechanisms of in meso Crystallization,” J. Am. Chem. Soc., vol. 136, no. 8, pp. 3271–3284, Feb. 2014. [47] G. Ayton, A. M. Smondyrev, S. G. Bardenhagen, P. McMurtry, and G. A. Voth, “Interfacing Molecular Dynamics and Macro-Scale Simulations for Lipid Bilayer Vesicles,” Biophys. J., vol. 83, no. 2, pp. 1026–1038, Aug. 2002. [48] S. J. Marrink, A. H. De Vries, and A. E. Mark, “Coarse Grained Model for Semiquantitative Lipid Simulations,” J. Phys. Chem. B, vol. 108, no. 2, pp. 750–760, 2004. [49] J. C. Shelley, M. Y. Shelley, R. C. Reeder, S. Bandyopadhyay, and M. L. Klein, “A coarse grain model for phospholipid simulations,” J. Phys. Chem. B, vol. 105, no. 19, pp. 4464– 4470, 2001. [50] S. J. Marrink and A. E. Mark, “The mechanism of vesicle fusion as revealed by molecular dynamics simulations,” J. Am. Chem. Soc., vol. 125, no. 37, pp. 11144–11145, 2003. [51] M. J. Stevens, J. H. Hoh, and T. B. Woolf, “Insights into the Molecular Mechanism of Membrane Fusion from Simulation: Evidence for the Association of Splayed Tails,” Phys. Rev. Lett., vol. 91, no. 18, p. 188102, Oct. 2003. [52] S. J. Marrink and A. E. Mark, “Molecular Dynamics Simulation of the Formation, Structure, and Dynamics of Small Phospholipid Vesicles,” J. Am. Chem. Soc., vol. 125, no. 49, pp. 15233–15242, 2003. [53] G. Ayton and G. A. Voth, “Bridging Microscopic and Mesoscopic Simulations of Lipid Bilayers,” Biophys. J., vol. 83, no. 6, pp. 3357–3370, Dec. 2002. [54] A. H. De Vries, A. E. Mark, and S. J. Marrink, “The binary mixing behavior of phospholipids in a bilayer: A molecular dynamics study,” J. Phys. Chem. B, vol. 108, no. 7, pp. 2454–2463, 2004. [55] S. A. Pandit, D. Bostick, and M. L. Berkowitz, “Mixed Bilayer Containing Dipalmitoylphosphatidylcholine and Dipalmitoylphosphatidylserine: Lipid Complexation, Ion Binding, and Electrostatics,” Biophys. J., vol. 85, no. 5, pp. 3120–3131, Nov. 2003. [56] S. W. Chiu, E. Jakobsson, R. J. Mashl, and H. L. Scott, “Cholesterol-Induced Modifications in Lipid Bilayers: A Simulation Study,” Biophys. J., vol. 83, no. 4, pp. 1842–1853, Oct. 2002. [57] C. Hofsäß, E. Lindahl, and O. Edholm, “Molecular Dynamics Simulations of Phospholipid Bilayers with Cholesterol,” Biophys. J., vol. 84, no. 4, pp. 2192–2206, Jan. 2003. 84 [58] P. Jedlovszky and M. Mezei, “Effect of cholesterol on the properties of phospholipid membranes - 1. Structural features,” J. Phys. Chem. B, vol. 107, no. 22, pp. 5311–5321, 2003. [59] T. Róg and M. Pasenkiewicz-Gierula, “Effects of Epicholesterol on the Phosphatidylcholine Bilayer: A Molecular Simulation Study,” Biophys. J., vol. 84, no. 3, pp. 1818–1826, Mar. 2003. [60] L. Koubi, M. Tarek, S. Bandyopadhyay, M. L. Klein, and D. Scharf, “Membrane Structural Perturbations Caused by Anesthetics and Nonimmobilizers: A Molecular Dynamics Investigation,” Biophys. J., vol. 81, no. 6, pp. 3339–3345, Dec. 2001. [61] P. Tang and Y. Xu, “Large-scale molecular dynamics simulations of general anesthetic effects on the ion channel in the fully hydrated membrane: The implication of molecular mechanisms of general anesthesia,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 99, no. 25, pp. 16035–16040, 2002. [62] A. Grossfield and T. B. Woolf, “Interaction of tryptophan analogs with POPC lipid bilayers investigated by molecular dynamics calculations,” Langmuir, vol. 18, no. 1, pp. 198–210, 2002. [63] P. Jedlovszky and M. Mezei, “Calculation of the free energy profile of H2O, O2, CO, CO2, NO, and CHCl3 in a lipid bilayer with a cavity insertion variant of the Widom method,” J. Am. Chem. Soc., vol. 122, no. 21, pp. 5125–5131, 2000. [64] S. E. Feller, C. A. Brown, D. T. Nizza, and K. Gawrisch, “Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy Cross-Relaxation Rates and Ethanol Distribution across Membranes,” Biophys. J., vol. 82, no. 3, pp. 1396–1404, Mar. 2002. [65] M. L. Berkowitz, D. L. Bostick, and S. Pandit, “Aqueous Solutions next to Phospholipid Membrane Surfaces: Insights from Simulations,” Chem. Rev., vol. 106, no. 4, pp. 1527– 1539, Apr. 2006. [66] F. Castro-Román, R. W. Benz, S. H. White, and D. J. Tobias, “Investigation of Finite System-Size Effects in Molecular Dynamics Simulations of Lipid Bilayers,” J. Phys. Chem. B, vol. 110, no. 47, pp. 24157–24164, Nov. 2006. [67] O. Guvench and A. D. M. Jr, “Comparison of Protein Force Fields for Molecular Dynamics Simulations,” in Molecular Modeling of Proteins, A. Kukol, Ed. Humana Press, 2008, pp. 63–88. [68] V. Hornak, R. Abel, A. Okur, B. Strockbine, A. Roitberg, and C. Simmerling, “Comparison of multiple Amber force fields and development of improved protein backbone parameters,” Proteins, vol. 65, no. 3, pp. 712–725, Nov. 2006. [69] S. W. I. Siu, R. Vácha, P. Jungwirth, and R. A. Böckmann, “Biomolecular simulations of membranes: Physical properties from different force fields,” J. Chem. Phys., vol. 128, no. 12, p. 125103, Mar. 2008. [70] J. Wang, R. M. Wolf, J. W. Caldwell, P. A. Kollman, and D. A. Case, “Development and testing of a general amber force field,” J. Comput. Chem., vol. 25, no. 9, pp. 1157–1174, Jul. 2004. [71] S. W. Chiu, M. Clark, V. Balaji, S. Subramaniam, H. L. Scott, and E. Jakobsson, “Incorporation of surface tension into molecular dynamics simulation of an interface: a fluid phase lipid bilayer membrane,” Biophys. J., vol. 69, no. 4, pp. 1230–1245, Jan. 1995. [72] O. Berger, O. Edholm, and F. Jähnig, “Molecular dynamics simulations of a fluid bilayer of dipalmitoylphosphatidylcholine at full hydration, constant pressure, and constant temperature,” Biophys. J., vol. 72, no. 5, pp. 2002–2013, Jan. 1997. [73] S. E. Feller and A. D. MacKerell, “An Improved Empirical Potential Energy Function for Molecular Simulations of Phospholipids,” J. Phys. Chem. B, vol. 104, no. 31, pp. 7510– 7515, Aug. 2000. [74] B. Jójárt and T. A. Martinek, “Performance of the general amber force field in modeling aqueous POPC membrane bilayers,” J. Comput. Chem., vol. 28, no. 12, pp. 2051–2058, Sep. 2007. 85 [75] W. L. Jorgensen and J. Tirado-Rives, “The OPLS [optimized potentials for liquid simulations] potential functions for proteins, energy minimizations for crystals of cyclic peptides and crambin,” J. Am. Chem. Soc., vol. 110, no. 6, pp. 1657–1666, Mar. 1988. [76] R. W. Benz, F. Castro-Roman, D. J. Tobias, and S. H. White, “Experimental Validation of Molecular Dynamics Simulations of Lipid Bilayers: A New Approach,” Biophys. J., vol. 88, no. 2, pp. 805–817, Feb. 2005. [77] M. Patra, M. Karttunen, M. T. Hyvonen, E. Falck, P. Lindqvist, and I. Vattulainen, “Molecular Dynamics Simulations of Lipid Bilayers: Major Artifacts Due to Truncating Electrostatic Interactions,” Biophys. J., vol. 84, no. 6, pp. 3636–3645, Jun. 2003. [78] A. P. Lyubartsev and A. L. Rabinovich, “Recent development in computer simulations of lipid bilayers,” Soft Matter, vol. 7, no. 1, pp. 25–39, Dec. 2010. [79] J. Seelig and N. Waespe-Sarcevic, “Molecular order in cis and trans unsaturated phospholipid bilayers,” Biochemistry (Mosc.), vol. 17, no. 16, pp. 3310–3315, Aug. 1978. [80] D. E. Warschawski and P. F. Devaux, “Order parameters of unsaturated phospholipids in membranes and the effect of cholesterol: a 1H–13C solid-state NMR study at natural abundance,” Eur. Biophys. J., vol. 34, no. 8, pp. 987–996, Nov. 2005. [81] A. Filippov, G. Orädd, and G. Lindblom, “Influence of Cholesterol and Water Content on Phospholipid Lateral Diffusion in Bilayers†,” Langmuir, vol. 19, no. 16, pp. 6397–6400, Aug. 2003. [82] S. H. White, “The progress of membrane protein structure determination,” Protein Sci., vol. 13, no. 7, pp. 1948–1949, Jul. 2004. [83] C. Kandt, W. L. Ash, and D. Peter Tieleman, “Setting up and running molecular dynamics simulations of membrane proteins,” Methods, vol. 41, no. 4, pp. 475–488, Apr. 2007. [84] C. Bouzat, F. Gumilar, G. Spitzmaul, H.-L. Wang, D. Rayes, S. B. Hansen, P. Taylor, and S. M. Sine, “Coupling of agonist binding to channel gating in an ACh-binding protein linked to an ion channel,” Nature, vol. 430, no. 7002, pp. 896–900, Aug. 2004. [85] A. Robinson, G. A. Huttley, H. S. Booth, and P. G. Board, “Modelling and bioinformatics studies of the human Kappa-class glutathione transferase predict a novel third glutathione transferase family with similarity to prokaryotic 2-hydroxychromene-2-carboxylate isomerases,” Biochem. J., vol. 379, no. 3, p. 541, May 2004. [86] M. O’Mara, B. Cromer, M. Parker, and S.-H. Chung, “Homology Model of the GABAA Receptor Examined Using Brownian Dynamics,” Biophys. J., vol. 88, no. 5, pp. 3286– 3299, May 2005. [87] A. Warshel, “Molecular Dynamics Simulations of Biological Reactions,” Acc. Chem. Res., vol. 35, no. 6, pp. 385–395, Jun. 2002. [88] A. Shurki and A. Warshel, “Structure⧸Function Correlations of Proteins using MM, QM⧸MM, and Related Approaches: Methods, Concepts, Pitfalls, and Current Progress,” in Advances in Protein Chemistry, vol. Volume 66, Valerie Daggett, Ed. Academic Press, 2003, pp. 249–313. [89] R. Zhou, X. Huang, C. J. Margulis, and B. J. Berne, “Hydrophobic Collapse in Multidomain Protein Folding,” Science, vol. 305, no. 5690, pp. 1605–1609, Sep. 2004. [90] M. Vendruscolo and C. M. Dobson, “Towards complete descriptions of the free–energy landscapes of proteins,” Philos. Trans. R. Soc. Math. Phys. Eng. Sci., vol. 363, no. 1827, pp. 433–452, Feb. 2005. [91] B. L. de Groot and H. Grubmüller, “Water Permeation Across Biological Membranes: Mechanism and Dynamics of Aquaporin-1 and GlpF,” Science, vol. 294, no. 5550, pp. 2353–2357, Dec. 2001. [92] F. Zhu, E. Tajkhorshid, and K. Schulten, “Theory and Simulation of Water Permeation in Aquaporin-1,” Biophys. J., vol. 86, no. 1, pp. 50–57, Jan. 2004. [93] O. Beckstein and M. S. P. Sansom, “Liquid–vapor oscillations of water in hydrophobic nanopores,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 100, no. 12, pp. 7063–7068, Jun. 2003. 86 [94] T. Okada and K. Palczewski, “Crystal structure of rhodopsin: implications for vision and beyond,” Curr. Opin. Struct. Biol., vol. 11, no. 4, pp. 420–426, Aug. 2001. [95] M. Garavelli, F. Bernardi, M. A. Roob, and M. Olivucci, “Computer simulation of photoinduced molecular motion and reactivity,” Int. J. Photoenergy, vol. 4, no. 2, pp. 57– 68, 2002. [96] A. D. Albert and P. L. Yeagle, “Structural studies on rhodopsin,” Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr., vol. 1565, no. 2, pp. 183–195, Oct. 2002. [97] S. Filipek, R. E. Stenkamp, D. C. Teller, and K. Palczewski, G Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: A Prospectus, vol. 65. 2003. [98] S. Filipek, D. C. Teller, K. Palczewski, and R. Stenkamp, The crystallographic model of rhodopsin and its use in studies of other G protein-coupled receptors, vol. 32. 2003. [99] J. Klein-Seetharaman, “Dynamics in rhodopsin,” ChemBioChem, vol. 3, no. 10, pp. 981– 986, 2002. [100] S. Moro, F. Deflorian, G. Spalluto, G. Pastorin, B. Cacciari, S.-K. Kim, and K. A. Jacobson, “Demystifying the three dimensional structure of G protein-coupled receptors (GPCRs) with the aid of molecular modeling,” Chem. Commun., vol. 9, no. 24, pp. 2949– 2956, 2003. [101] L. R. Forrest and T. B. Woolf, “Discrimination of native loop conformations in membrane proteins: Decoy library design and evaluation of effective energy scoring functions,” Proteins Struct. Funct. Genet., vol. 52, no. 4, pp. 492–509, 2003. [102] P. S. Crozier, M. J. Stevens, L. R. Forrest, and T. B. Woolf, “Molecular Dynamics Simulation of Dark-adapted Rhodopsin in an Explicit Membrane Bilayer: Coupling between Local Retinal and Larger Scale Conformational Change,” J. Mol. Biol., vol. 333, no. 3, pp. 493–514, Oct. 2003. [103] P. Goyal, N. Ghosh, P. Phatak, M. Clemens, M. Gaus, M. Elstner, and Q. Cui, “Proton Storage Site in Bacteriorhodopsin: New Insights from Quantum Mechanics/Molecular Mechanics Simulations of Microscopic pKa and Infrared Spectra,” J. Am. Chem. Soc., vol. 133, no. 38, pp. 14981–14997, Sep. 2011. [104] U. F. Röhrig, L. Guidoni, and U. Rothlisberger, “Early steps of the intramolecular signal transduction in rhodopsin explored by molecular dynamics simulations,” Biochemistry (Mosc.), vol. 41, no. 35, pp. 10799–10809, 2002. [105] J. Saam, E. Tajkhorshid, S. Hayashi, and K. Schulten, “Molecular Dynamics Investigation of Primary Photoinduced Eventsin the Activation of Rhodopsin,” Biophys. J., vol. 83, no. 6, pp. 3097–3112, Dec. 2002. [106] R. Henderson, J. M. Baldwin, T. A. Ceska, F. Zemlin, E. Beckmann, and K. H. Downing, “Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high-resolution electron cryomicroscopy,” J. Mol. Biol., vol. 213, no. 4, pp. 899–929, Jun. 1990. [107] M. Nonella, A. Wlndemuth, and K. Schulten, “STRUCTURE OF BACTERIORHODOPSIN and in situ ISOMERIZATION OF RETINAL: A MOLECULAR DYNAMICS STUDY*,” Photochem. Photobiol., vol. 54, no. 6, pp. 937– 948, Dec. 1991. [108] O. Edholm, O. Berger, and F. Jähnig, “Structure and Fluctuations of Bacteriorhodopsin in the Purple Membrane: A Molecular Dynamics Study,” J. Mol. Biol., vol. 250, no. 1, pp. 94– 111, Jun. 1995. [109] S. Hayashi, E. Tajkhorshid, and K. Schulten, “Molecular Dynamics Simulation of Bacteriorhodopsin’s Photoisomerization Using Ab Initio Forces for the Excited Chromophore,” Biophys. J., vol. 85, no. 3, pp. 1440–1449, Sep. 2003. [110] K. Murata, K. Mitsuoka, T. Hiral, T. Walz, P. Agre, J. B. Heymann, A. Engel, and Y. Fujiyoshi, “Structural determinants of water permeation through aquaporin-1,” Nature, vol. 407, no. 6804, pp. 599–605, 2000. 87 [111] G. Ren, V. S. Reddy, A. Cheng, P. Melnyk, and A. K. Mitra, “Visualization of a waterselective pore by electron crystallography in vitreous ice,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 98, no. 4, pp. 1398–1403, 2001. [112] D. Fu, A. Libson, L. J. W. Miercke, C. Weitzman, P. Nollert, J. Krucinski, and R. M. Stroud, “Structure of a glycerol-conducting channel and the basis for its selectivity,” Science, vol. 290, no. 5491, pp. 481–486, 2000. [113] B. L. de Groot, A. Engel, and H. Grubmüller, “The Structure of the Aquaporin-1 Water Channel: A Comparison between Cryo-electron Microscopy and X-ray Crystallography,” J. Mol. Biol., vol. 325, no. 3, pp. 485–493, Jan. 2003. [114] Y. Fujiyoshi, K. Mitsuoka, B. L. de Groot, A. Philippsen, H. Grubmüller, P. Agre, and A. Engel, “Structure and Function of Water Channels,” Curr. Opin. Struct. Biol., vol. 12, no. 4, pp. 509–515, Aug. 2002. [115] R. J. Law and M. S. P. Sansom, “Water Transporters: How So Fast Yet So Selective?,” Curr. Biol., vol. 12, no. 7, pp. R250–R252, Apr. 2002. [116] R. M. Stroud, L. J. Miercke, J. O’Connell, S. Khademi, J. K. Lee, J. Remis, W. Harries, Y. Robles, and D. Akhavan, “Glycerol facilitator GlpF and the associated aquaporin family of channels,” Curr. Opin. Struct. Biol., vol. 13, no. 4, pp. 424–431, Aug. 2003. [117] B. L. de Groot, T. Frigato, V. Helms, and H. Grubmüller, “The Mechanism of Proton Exclusion in the Aquaporin-1 Water Channel,” J. Mol. Biol., vol. 333, no. 2, pp. 279–293, Oct. 2003. [118] B. L. de Groot, A. Engel, and H. Grubmüller, “A refined structure of human aquaporin1,” FEBS Lett., vol. 504, no. 3, pp. 206–211, Aug. 2001. [119] F. Zhu, E. Tajkhorshid, and K. Schulten, “Molecular dynamics study of aquaporin-1 water channel in a lipid bilayer,” FEBS Lett., vol. 504, no. 3, pp. 212–218, Aug. 2001. [120] B. L. De Groot and H. Grubmüller, “Water permeation across biological membranes: Mechanism and dynamics of aquaporin-1 and GlpF,” Science, vol. 294, no. 5550, pp. 2353–2357, 2001. [121] E. Tajkhorshid, P. Nollert, M. Ø. Jensen, L. J. W. Miercke, J. O’Connell, R. M. Stroud, and K. Schulten, “Control of the selectivity of the aquaporin water channel family by global orientational tuning,” Science, vol. 296, no. 5567, pp. 525–530, 2002. [122] M. Ø. Jensen, E. Tajkhorshid, and K. Schulten, “Electrostatic Tuning of Permeation and Selectivity in Aquaporin Water Channels,” Biophys. J., vol. 85, no. 5, pp. 2884–2899, Nov. 2003. [123] F. Zhu, E. Tajkhorshid, and K. Schulten, “Pressure-Induced Water Transport in Membrane Channels Studied by Molecular Dynamics,” Biophys. J., vol. 83, no. 1, pp. 154– 160, Jul. 2002. [124] M. Ø. Jensen, E. Tajkhorshid, and K. Schulten, “The Mechanism of Glycerol Conduction in Aquaglyceroporins,” Structure, vol. 9, no. 11, pp. 1083–1093, Nov. 2001. [125] M. Ø. Jensen, S. Park, E. Tajkhorshid, and K. Schulten, “Energetics of glycerol conduction through aquaglyceroporin GlpF,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 99, no. 10, pp. 6731–6736, 2002. [126] D. A. Doyle, J. M. Cabral, R. A. Pfuetzner, A. Kuo, J. M. Gulbis, S. L. Cohen, B. T. Chait, and R. MacKinnon, “The structure of the potassium channel: Molecular basis of K+ conduction and selectivity,” Science, vol. 280, no. 5360, pp. 69–77, 1998. [127] C. Domene and M. S. P. Sansom, “Potassium Channel, Ions, and Water: Simulation Studies Based on the High Resolution X-Ray Structure of KcsA,” Biophys. J., vol. 85, no. 5, pp. 2787–2800, Nov. 2003. [128] Y. Zhou, J. H. Morais-Cabral, A. Kaufman, and R. Mackinnon, “Chemistry of ion coordination and hydration revealed by a K+ channel-Fab complex at 2.0 Å resolution,” Nature, vol. 414, no. 6859, pp. 43–48, 2001. [129] Y. Jiang, A. Lee, J. Chen, M. Cadene, B. T. Chait, and R. MacKinnon, “The open pore conformation of potassium channels,” Nature, vol. 417, no. 6888, pp. 523–526, 2002. 88 [130] J. Cohen and K. Schulten, “Mechanism of Anionic Conduction across ClC,” Biophys. J., vol. 86, no. 2, pp. 836–845, Feb. 2004. [131] B. Corry, M. O’Mara, and S.-H. Chung, “Conduction Mechanisms of Chloride Ions in ClC-Type Channels,” Biophys. J., vol. 86, no. 2, pp. 846–860, Feb. 2004. [132] R. Dutzler, E. B. Campbell, M. Cadene, B. T. Chait, and R. MacKinnon, “X-ray structure of a CIC chloride channel at 3.0 Å reveals the molecular basis of anion selectivity,” Nature, vol. 415, no. 6869, pp. 287–294, 2002. [133] G. V. Miloshevsky and P. C. Jordan, “Anion Pathway and Potential Energy Profiles along Curvilinear Bacterial ClC Cl− Pores: Electrostatic Effects of Charged Residues,” Biophys. J., vol. 86, no. 2, pp. 825–835, Feb. 2004. [134] Y. Jiang, A. Lee, J. Chen, V. Ruta, M. Cadene, B. T. Chait, and R. MacKinnon, “X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel,” Nature, vol. 423, no. 6935, pp. 33–41, 2003. [135] Y. Jiang, V. Ruta, J. Chen, A. Lee, and R. MacKinnon, “The principle of gating charge movement in a voltage-dependent K+ channel,” Nature, vol. 423, no. 6935, pp. 42–48, 2003. [136] L. Monticelli, K. M. Robertson, J. L. MacCallum, and D. P. Tieleman, “Computer simulation of the KvAP voltage-gated potassium channel: steered molecular dynamics of the voltage sensor,” FEBS Lett., vol. 564, no. 3, pp. 325–332, Apr. 2004. [137] A. Kuo, J. M. Gulbis, J. F. Antcliff, T. Rahman, E. D. Lowe, J. Zimmer, J. Cuthbertson, F. M. Ashcroft, T. Ezaki, and D. A. Doyle, “Crystal structure of the potassium channel KirBac1.1 in the closed state,” Science, vol. 300, no. 5627, pp. 1922–1926, 2003. [138] D. P. Tieleman, P. C. Biggin, G. R. Smith, and M. S. P. Sansom, “Simulation approaches to ion channel structure-function relationships,” Q. Rev. Biophys., vol. 34, no. 4, pp. 473– 561, 2001. [139] M. S. P. Sansom, I. H. Shrivastava, J. N. Bright, J. Tate, C. E. Capener, and P. C. Biggin, “Potassium channels: structures, models, simulations,” Biochim. Biophys. Acta BBA Biomembr., vol. 1565, no. 2, pp. 294–307, Oct. 2002. [140] M. S. P. Sansom, I. H. Shrivastava, K. M. Ranatunga, and G. R. Smith, “Simulations of ion channels – watching ions and water move,” Trends Biochem. Sci., vol. 25, no. 8, pp. 368–374, Aug. 2000. [141] B. Roux, S. Berneche, and W. Im, “Ion channels, permeation, and electrostatics: Insight into the function of KcsA,” Biochemistry (Mosc.), vol. 39, no. 44, pp. 13295–13306, 2000. [142] B. Roux, “Theoretical and computational models of ion channels,” Curr. Opin. Struct. Biol., vol. 12, no. 2, pp. 182–189, Apr. 2002. [143] B. Hille, “Ionic channels in excitable membranes. Current problems and biophysical approaches,” Biophys. J., vol. 22, no. 2, pp. 283–294, Jan. 1978. [144] S. Kuyucak, O. S. Andersen, and S.-H. Chung, “Models of permeation in ion channels,” Rep. Prog. Phys., vol. 64, no. 11, pp. 1427–1472, 2001. [145] B. Roux, “Computational studies of the gramicidin channel,” Acc. Chem. Res., vol. 35, no. 6, pp. 366–375, 2002. [146] G. V. Miloshevsky and P. C. Jordan, “Gating Gramicidin Channels in Lipid Bilayers: Reaction Coordinates and the Mechanism of Dissociation,” Biophys. J., vol. 86, no. 1, pp. 92–104, Jan. 2004. [147] T. W. Allen, O. S. Andersen, and B. Roux, “Structure of gramicidin a in a lipid bilayer environment determined using molecular dynamics simulations and solid-state NMR data,” J. Am. Chem. Soc., vol. 125, no. 32, pp. 9868–9877, 2003. [148] R. Ketchem, B. Roux, and T. Cross, “High-resolution polypeptide structure in a lamellar phase lipid environment from solid state NMR derived orientational constraints,” Structure, vol. 5, no. 12, pp. 1655–1669, Dec. 1997. [149] L. E. Townsley, W. A. Tucker, S. Sham, and J. F. Hinton, “Structures of gramicidins A, B, and C incorporated into sodium dodecyl sulfate micelles,” Biochemistry (Mosc.), vol. 40, no. 39, pp. 11676–11686, 2001. 89 [150] S. Edwards, B. Corry, S. Kuyucak, and S.-H. Chung, “Continuum Electrostatics Fails to Describe Ion Permeation in the Gramicidin Channel,” Biophys. J., vol. 83, no. 3, pp. 1348– 1360, Sep. 2002. [151] B. Corry, S. Kuyucak, and S.-H. Chung, “Dielectric Self-Energy in Poisson-Boltzmann and Poisson-Nernst-Planck Models of Ion Channels,” Biophys. J., vol. 84, no. 6, pp. 3594– 3606, Jun. 2003. [152] A. B. Mamonov, R. D. Coalson, A. Nitzan, and M. G. Kurnikova, “The Role of the Dielectric Barrier in Narrow Biological Channels: A Novel Composite Approach to Modeling Single-Channel Currents,” Biophys. J., vol. 84, no. 6, pp. 3646–3661, Jun. 2003. [153] E. Perozo and D. C. Rees, “Structure and mechanism in prokaryotic mechanosensitive channels,” Curr. Opin. Struct. Biol., vol. 13, no. 4, pp. 432–442, Aug. 2003. [154] R. B. Bass, K. P. Locher, E. Borths, Y. Poon, P. Strop, A. Lee, and D. C. Rees, “The structures of BtuCD and MscS and their implications for transporter and channel function,” FEBS Lett., vol. 555, no. 1, pp. 111–115, Nov. 2003. [155] F. Bezanilla and E. Perozo, “The voltage sensor and the gate in ion channels,” in Advances in Protein Chemistry, vol. Volume 63, Douglas C. Rees, Ed. Academic Press, 2003, pp. 211–241. [156] A. Anishkin, V. Gendel, N. A. Sharifi, C.-S. Chiang, L. Shirinian, H. R. Guy, and S. Sukharev, “On the conformation of the COOH-terminal domain of the large mechanosensitive channel MscL,” J. Gen. Physiol., vol. 121, no. 3, pp. 227–244, 2003. [157] D. E. Elmore and D. A. Dougherty, “Molecular Dynamics Simulations of Wild-Type and Mutant Forms of the Mycobacterium tuberculosis MscL Channel,” Biophys. J., vol. 81, no. 3, pp. 1345–1359, Sep. 2001. [158] J. Gullingsrud, D. Kosztin, and K. Schulten, “Structural Determinants of MscL Gating Studied by Molecular Dynamics Simulations,” Biophys. J., vol. 80, no. 5, pp. 2074–2081, May 2001. [159] L. E. Bilston and K. Mylvaganam, “Molecular simulations of the large conductance mechanosensitive (MscL) channel under mechanical loading,” FEBS Lett., vol. 512, no. 1– 3, pp. 185–190, Feb. 2002. [160] G. Colombo, S. J. Marrink, and A. E. Mark, “Simulation of MscL Gating in a Bilayer under Stress,” Biophys. J., vol. 84, no. 4, pp. 2331–2337, Apr. 2003. [161] M. Betanzos, C.-S. Chiang, H. R. Guy, and S. Sukharev, “A large iris-like expansion of a mechanosensitive channel protein induced by membrane tension,” Nat. Struct. Biol., vol. 9, no. 9, pp. 704–710, 2002. [162] S. Sukharev, S. R. Durell, and H. R. Guy, “Structural Models of the MscL Gating Mechanism,” Biophys. J., vol. 81, no. 2, pp. 917–936, Aug. 2001. [163] I. H. Shrivastava, D. Peter Tieleman, P. C. Biggin, and M. S. P. Sansom, “K+ versus Na+ Ions in a K Channel Selectivity Filter: A Simulation Study,” Biophys. J., vol. 83, no. 2, pp. 633–645, Aug. 2002. [164] B. Roux and S. Bernèche, “On the Potential Functions used in Molecular Dynamics Simulations of Ion Channels,” Biophys. J., vol. 82, no. 3, pp. 1681–1684, Mar. 2002. [165] P. C. Biggin and M. S. P. Sansom, “Open-State Models of a Potassium Channel,” Biophys. J., vol. 83, no. 4, pp. 1867–1876, Oct. 2002. [166] A. Burykin, C. N. Schutz, J. Villá, and A. Warshel, “Simulations of ion current in realistic models of ion channels: The KcsA potassium channel,” Proteins Struct. Funct. Genet., vol. 47, no. 3, pp. 265–280, 2002. [167] R. J. Mashl, Y. Tang, J. Schnitzer, and E. Jakobsson, “Hierarchical Approach to Predicting Permeation in Ion Channels,” Biophys. J., vol. 81, no. 5, pp. 2473–2483, Nov. 2001. [168] I. H. Shrivastava and M. S. Sansom, “Molecular dynamics simulations and KcsA channel gating,” Eur. Biophys. J., vol. 31, no. 3, pp. 207–216, 2002. 90 [169] E. Perozo, D. Marien Cortes, and L. G. Cuello, “Three-dimensional architecture and gating mechanism of a K+ channel studied by EPR spectroscopy,” Nat. Struct. Biol., vol. 5, no. 6, pp. 459–469, 1998. [170] Y. Liu, M. Holmgren, M. E. Jurman, and G. Yellen, “Gated Access to the Pore of a Voltage-Dependent K+ Channel,” Neuron, vol. 19, no. 1, pp. 175–184, Jul. 1997. [171] M. Zhou, J. H. Morais-Cabral, S. Mann, and R. MacKinnon, “Potassium channel receptor site for the inactivation gate and quaternary amine inhibitors,” Nature, vol. 411, no. 6838, pp. 657–661, 2001. [172] Y. Jiang, A. Lee, J. Chen, M. Cadene, B. T. Chait, and R. MacKinnon, “Crystal structure and mechanism of a calcium-gated potassium channel,” Nature, vol. 417, no. 6888, pp. 515–522, 2002. [173] C. F. Higgins, “ABC Transporters: From microorganisms to man,” Annu. Rev. Cell Biol., vol. 8, pp. 67–113, 1992. [174] L.-W. Hung, I. X. Wang, K. Nikaido, P.-Q. Liu, G. F.-L. Ames, and S.-H. Kim, “Crystal structure of the ATP-binding subunit of an ABC transporter,” Nature, vol. 396, no. 6712, pp. 703–707, 1998. [175] M. A. Bianchet, Y. H. Ko, L. M. Amzel, and P. L. Pedersen, “Modeling of nucleotide binding domains of ABC transporter proteins based on a F1-ATPase/recA topology: Structural model of the nucleotide binding domains of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR),” J. Bioenerg. Biomembr., vol. 29, no. 5, pp. 503–524, 1997. [176] P. M. Jones and A. M. George, “Subunit interactions in ABC transporters: towards a functional architecture,” FEMS Microbiol. Lett., vol. 179, no. 2, pp. 187–202, Oct. 1999. [177] K.-P. Hopfner, A. Karcher, D. S. Shin, L. Craig, L. M. Arthur, J. P. Carney, and J. A. Tainer, “Structural Biology of Rad50 ATPase: ATP-Driven Conformational Control in DNA Double-Strand Break Repair and the ABC-ATPase Superfamily,” Cell, vol. 101, no. 7, pp. 789–800, Jun. 2000. [178] J. Chen, G. Lu, J. Lin, A. L. Davidson, and F. A. Quiocho, “A Tweezers-like Motion of the ATP-Binding Cassette Dimer in an ABC Transport Cycle,” Mol. Cell, vol. 12, no. 3, pp. 651–661, Sep. 2003. [179] P. C. Smith, N. Karpowich, L. Millen, J. E. Moody, J. Rosen, P. J. Thomas, and J. F. Hunt, “ATP Binding to the Motor Domain from an ABC Transporter Drives Formation of a Nucleotide Sandwich Dimer,” Mol. Cell, vol. 10, no. 1, pp. 139–149, Jul. 2002. [180] J. D. Campbell, K. Koike, C. Moreau, M. S. P. Sansom, R. G. Deeley, and S. P. C. Cole, “Molecular Modeling Correctly Predicts the Functional Importance of Phe 594 in Transmembrane Helix 11 of the Multidrug Resistance Protein, MRP1 (ABCC1),” J. Biol. Chem., vol. 279, no. 1, pp. 463–468, 2004. [181] M. Seigneuret and A. Garnier-Suillerot, “A structural model for the open conformation of the mdr1 P-glycoprotein based on the MsbA crystal structure,” J. Biol. Chem., vol. 278, no. 32, pp. 30115–30124, 2003. [182] D. R. Stenham, J. D. Campbell, M. S. P. Sansom, C. F. Higgins, I. D. Kerr, and K. J. Linton, “An atomic detail model for the human ATP binding cassette transporter Pglycoprotein derived from disulfide cross-linking and homology modeling,” FASEB J., vol. 17, no. 15, pp. 2287–2289, 2003. [183] J. D. Campbell, P. C. Biggin, M. Baaden, and M. S. P. Sansom, “Extending the structure of an ABC transporter to atomic resolution: Modeling and simulation studies of MsbA,” Biochemistry (Mosc.), vol. 42, no. 13, pp. 3666–3673, 2003. [184] P. M. Jones and A. M. George, “Mechanism of ABC transporters: A molecular dynamics simulation of a well characterized nucleotide-binding subunit,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 99, no. 20, pp. 12639–12644, 2002. 91 [185] E. O. Oloo and D. P. Tieleman, “Conformational transitions induced by the binding of MgATP to the vitamin B12 ATP-binding cassette (ABC) transporter BtuCD,” J. Biol. Chem., vol. 279, no. 43, pp. 45013–45019, Oct. 2004. [186] A. E. Senior, S. Nadanaciva, and J. Weber, “The molecular mechanism of ATP synthesis by F1F0-ATP synthase,” Biochim. Biophys. Acta BBA - Bioenerg., vol. 1553, no. 3, pp. 188–211, Feb. 2002. [187] J. Weber and A. E. Senior, “ATP synthesis driven by proton transport in F1F0-ATP synthase,” FEBS Lett., vol. 545, no. 1, pp. 61–70, Jun. 2003. [188] M. Yoshida, E. Muneyuki, and T. Hisabori, “ATP synthase - A marvellous rotary engine of the cell,” Nat. Rev. Mol. Cell Biol., vol. 2, no. 9, pp. 669–677, 2001. [189] R. Yasuda, H. Noji, K. Kinosita Jr, and M. Yoshida, “F1-ATPase Is a Highly Efficient Molecular Motor that Rotates with Discrete 120° Steps,” Cell, vol. 93, no. 7, pp. 1117– 1124, Jun. 1998. [190] J. P. Abrahams, A. G. W. Leslie, R. Lutter, and J. E. Walker, “Structure at 2.8 Å resolution of F1-ATPase from bovine heart mitochondria,” Nature, vol. 370, no. 6491, pp. 621–628, 1994. [191] H. Wang and G. Oster, “Energy transduction in the F1 motor of ATP synthase,” Nature, vol. 396, no. 6708, pp. 279–282, 1998. [192] R. A. Böckmann and H. Grubmüller, “Conformational Dynamics of the F1-ATPase βSubunit: A Molecular Dynamics Study,” Biophys. J., vol. 85, no. 3, pp. 1482–1491, Sep. 2003. [193] R. A. Böckmann and H. Grubmüller, “Nanoseconds molecular dynamics simulation of primary mechanical energy transfer steps in F1-ATP synthase,” Nat. Struct. Biol., vol. 9, no. 3, pp. 198–202, 2002. [194] W. Yang, Y. Q. Gao, Q. Cui, J. Ma, and M. Karplus, “The missing link between thermodynamics and structure in F1-ATPase,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 100, no. 3, pp. 874–879, 2003. [195] M. Dittrich, S. Hayashi, and K. Schulten, “On the Mechanism of ATP Hydrolysis in F1ATPase,” Biophys. J., vol. 85, no. 4, pp. 2253–2266, Oct. 2003. [196] A. Aksimentiev, I. A. Balabin, R. H. Fillingame, and K. Schulten, “Insights into the Molecular Mechanism of Rotation in the Fo Sector of ATP Synthase,” Biophys. J., vol. 86, no. 3, pp. 1332–1344, Mar. 2004. [197] A. D. MacKerell, D. Bashford, M. Bellott, R. L. Dunbrack, J. D. Evanseck, M. J. Field, S. Fischer, J. Gao, H. Guo, S. Ha, D. Joseph-McCarthy, L. Kuchnir, K. Kuczera, F. T. K. Lau, C. Mattos, S. Michnick, T. Ngo, D. T. Nguyen, B. Prodhom, W. E. Reiher, B. Roux, M. Schlenkrich, J. C. Smith, R. Stote, J. Straub, M. Watanabe, J. Wiórkiewicz-Kuczera, D. Yin, and M. Karplus, “All-Atom Empirical Potential for Molecular Modeling and Dynamics Studies of Proteins†,” J. Phys. Chem. B, vol. 102, no. 18, pp. 3586–3616, Apr. 1998. [198] D. A. Case, T. E. Cheatham, T. Darden, H. Gohlke, R. Luo, K. M. Merz, A. Onufriev, C. Simmerling, B. Wang, and R. J. Woods, “The Amber biomolecular simulation programs,” J. Comput. Chem., vol. 26, no. 16, pp. 1668–1688, Dec. 2005. [199] W. R. P. Scott, P. H. Hünenberger, I. G. Tironi, A. E. Mark, S. R. Billeter, J. Fennen, A. E. Torda, T. Huber, P. Krüger, and W. F. van Gunsteren, “The GROMOS Biomolecular Simulation Program Package,” J. Phys. Chem. A, vol. 103, no. 19, pp. 3596–3607, May 1999. [200] W. L. Jorgensen, D. S. Maxwell, and J. Tirado-Rives, “Development and Testing of the OPLS All-Atom Force Field on Conformational Energetics and Properties of Organic Liquids,” J. Am. Chem. Soc., vol. 118, no. 45, pp. 11225–11236, Jan. 1996. [201] W. L. Jorgensen, J. Chandrasekhar, J. D. Madura, R. W. Impey, and M. L. Klein, “Comparison of simple potential functions for simulating liquid water,” J. Chem. Phys., vol. 79, no. 2, pp. 926–935, Jul. 1983. 92 [202] H. J. C. Berendsen, J. P. M. Postma, W. F. van Gunsteren, and J. Hermans, “Interaction Models for Water in Relation to Protein Hydration,” in Intermolecular Forces, B. Pullman, Ed. Springer Netherlands, 1981, pp. 331–342. [203] F. C. Bernstein, T. F. Koetzle, G. J. B. Williams, E. F. Meyer, M. D. Brice, J. R. Rodgers, O. Kennard, T. Shimanouchi, and M. Tasumi, “The Protein Data Bank,” Eur. J. Biochem., vol. 80, no. 2, pp. 319–324, Nov. 1977. [204] A. Šali and T. L. Blundell, “Comparative Protein Modelling by Satisfaction of Spatial Restraints,” J. Mol. Biol., vol. 234, no. 3, pp. 779–815, Dec. 1993. [205] F. Kiefer, K. Arnold, M. Künzli, L. Bordoli, and T. Schwede, “The SWISS-MODEL Repository and associated resources,” Nucleic Acids Res., vol. 37, no. suppl 1, pp. D387– D392, Jan. 2009. [206] C. R. Søndergaard, M. H. M. Olsson, M. Rostkowski, and J. H. Jensen, “Improved Treatment of Ligands and Coupling Effects in Empirical Calculation and Rationalization of pKa Values,” J. Chem. Theory Comput., vol. 7, no. 7, pp. 2284–2295, Jul. 2011. [207] R. Anandakrishnan, B. Aguilar, and A. V. Onufriev, “H++ 3.0: automating pK prediction and the preparation of biomolecular structures for atomistic molecular modeling and simulations,” Nucleic Acids Res., vol. 40, no. Web Server issue, pp. W537–W541, Jul. 2012. [208] J. Domański, P. J. Stansfeld, M. S. P. Sansom, and O. Beckstein, “Lipidbook: A Public Repository for Force-Field Parameters Used in Membrane Simulations,” J. Membr. Biol., vol. 236, no. 3, pp. 255–258, Aug. 2010. [209] K. A. Scott, P. J. Bond, A. Ivetac, A. P. Chetwynd, S. Khalid, and M. S. P. Sansom, “Coarse-Grained MD Simulations of Membrane Protein-Bilayer Self-Assembly,” Structure, vol. 16, no. 4, pp. 621–630, Apr. 2008. [210] M. A. Lomize, A. L. Lomize, I. D. Pogozheva, and H. I. Mosberg, “OPM: orientations of proteins in membranes database,” Bioinforma. Oxf. Engl., vol. 22, no. 5, pp. 623–625, Mar. 2006. [211] J.-P. Ryckaert, G. Ciccotti, and H. J. C. Berendsen, “Numerical integration of the cartesian equations of motion of a system with constraints: molecular dynamics of nalkanes,” J. Comput. Phys., vol. 23, no. 3, pp. 327–341, Mar. 1977. [212] D. Fincham, “Parallel Computers and Molecular Simulation,” Mol. Simul., vol. 1, no. 1– 2, pp. 1–45, 1987. [213] A. R. C. Raine, D. Fincham, and W. Smith, “Systolic loop methods for molecular dynamics simulation using multiple transputers,” Comput. Phys. Commun., vol. 55, no. 1, pp. 13–30, Aug. 1989. [214] K. J. Bowers, R. O. Dror, and D. E. Shaw, “Zonal methods for the parallel execution of range-limited N-body simulations,” J. Comput. Phys., vol. 221, no. 1, pp. 303–329, Jan. 2007. [215] K. J. Bowers, R. O. Dror, and D. E. Shaw, “Overview of neutral territory methods for the parallel evaluation of pairwise particle interactions,” J. Phys. Conf. Ser., vol. 16, no. 1, p. 300, Jan. 2005. [216] K. J. Bowers, R. O. Dror, and D. E. Shaw, “The midpoint method for parallelization of particle simulations,” J. Chem. Phys., vol. 124, no. 18, p. 184109, May 2006. [217] B. Hess, H. Bekker, H. J. C. Berendsen, and J. G. E. M. Fraaije, “LINCS: A linear constraint solver for molecular simulations,” J. Comput. Chem., vol. 18, no. 12, pp. 1463– 1472, Sep. 1997. [218] B. Hess, “P-LINCS: A Parallel Linear Constraint Solver for Molecular Simulation,” J. Chem. Theory Comput., vol. 4, no. 1, pp. 116–122, Jan. 2008. [219] S. Miyamoto and P. A. Kollman, “Settle: An analytical version of the SHAKE and RATTLE algorithm for rigid water models,” J. Comput. Chem., vol. 13, no. 8, pp. 952–962, Oct. 1992. 93 [220] S. Meloni, M. Rosati, and L. Colombo, “Efficient particle labeling in atomistic simulations,” J. Chem. Phys., vol. 126, no. 12, p. 121102, Mar. 2007. [221] C. Kutzner, D. Van Der Spoel, M. Fechner, E. Lindahl, U. W. Schmitt, B. L. De Groot, and H. Grubmüller, “Speeding up parallel GROMACS on high-latency networks,” J. Comput. Chem., vol. 28, no. 12, pp. 2075–2084, Sep. 2007. [222] K. Lindorff-Larsen, S. Piana, R. O. Dror, and D. E. Shaw, “How Fast-Folding Proteins Fold,” Science, vol. 334, no. 6055, pp. 517–520, Oct. 2011. [223] D. Baker, “Protein folding, structure prediction and design,” Biochem. Soc. Trans., vol. 42, no. 2, pp. 225–229, Apr. 2014. [224] V. S. Pande, K. Beauchamp, and G. R. Bowman, “Everything you wanted to know about Markov State Models but were afraid to ask,” Methods, vol. 52, no. 1, pp. 99–105, Sep. 2010. [225] I. Bahar and A. Rader, “Coarse-grained normal mode analysis in structural biology,” Curr. Opin. Struct. Biol., vol. 15, no. 5, pp. 586–592, Oct. 2005. [226] I. Bahar, T. R. Lezon, A. Bakan, and I. H. Shrivastava, “Normal mode analysis of biomolecular structures: functional mechanisms of membrane proteins,” Chem. Rev., vol. 110, no. 3, pp. 1463–1497, Mar. 2010. [227] Jolliffe, Principal Component Analysis, 2nd ed. Springer. [228] C. C. David and D. J. Jacobs, “Principal component analysis: a method for determining the essential dynamics of proteins,” Methods Mol. Biol. Clifton NJ, vol. 1084, pp. 193–226, 2014. [229] D. L. Ensign, P. M. Kasson, and V. S. Pande, “Heterogeneity Even at the Speed Limit of Folding: Large-scale Molecular Dynamics Study of a Fast-folding Variant of the Villin Headpiece,” J. Mol. Biol., vol. 374, no. 3, pp. 806–816, Nov. 2007. [230] S. Gnanakaran, H. Nymeyer, J. Portman, K. Y. Sanbonmatsu, and A. E. Garc a, “Peptide folding simulations,” Curr. Opin. Struct. Biol., vol. 13, no. 2, pp. 168–174, Apr. 2003. [231] A. Mitsutake and Y. Okamoto, “Replica-exchange extensions of simulated tempering method,” J. Chem. Phys., vol. 121, no. 6, pp. 2491–2504, Aug. 2004. [232] A. Mitsutake, Y. Sugita, and Y. Okamoto, “Generalized-ensemble algorithms for molecular simulations of biopolymers,” Pept. Sci., vol. 60, no. 2, pp. 96–123, Jan. 2001. [233] Y. Okamoto, “Generalized-ensemble algorithms: enhanced sampling techniques for Monte Carlo and molecular dynamics simulations,” J. Mol. Graph. Model., vol. 22, no. 5, pp. 425–439, May 2004. [234] N.-V. Buchete and G. Hummer, “Peptide folding kinetics from replica exchange molecular dynamics,” Phys. Rev. E, vol. 77, no. 3, p. 030902, Mar. 2008. [235] M. E. Karpen, D. J. Tobias, and C. L. Brooks, “Statistical clustering techniques for the analysis of long molecular dynamics trajectories: analysis of 2.2-ns trajectories of YPGDV,” Biochemistry (Mosc.), vol. 32, no. 2, pp. 412–420, Jan. 1993. [236] J. Shao, S. W. Tanner, N. Thompson, and T. E. Cheatham, “Clustering Molecular Dynamics Trajectories: 1. Characterizing the Performance of Different Clustering Algorithms,” J. Chem. Theory Comput., vol. 3, no. 6, pp. 2312–2334, Nov. 2007. [237] G. R. Bowman, K. A. Beauchamp, G. Boxer, and V. S. Pande, “Progress and challenges in the automated construction of Markov state models for full protein systems,” J. Chem. Phys., vol. 131, no. 12, p. 124101, Sep. 2009. [238] V. A. Voelz, G. R. Bowman, K. Beauchamp, and V. S. Pande, “Molecular Simulation of ab Initio Protein Folding for a Millisecond Folder NTL9(1−39),” J. Am. Chem. Soc., vol. 132, no. 5, pp. 1526–1528, Feb. 2010. [239] N. Singhal and V. S. Pande, “Error analysis and efficient sampling in Markovian state models for molecular dynamics,” J. Chem. Phys., vol. 123, no. 20, p. 204909, Nov. 2005. [240] S. Bacallado, J. D. Chodera, and V. Pande, “Bayesian comparison of Markov models of molecular dynamics with detailed balance constraint,” J. Chem. Phys., vol. 131, no. 4, p. 045106, Jul. 2009. 94 [241] F. Noé, “Probability distributions of molecular observables computed from Markov models,” J. Chem. Phys., vol. 128, no. 24, p. 244103, Jun. 2008. [242] C. Schütte, A. Fischer, W. Huisinga, and P. Deuflhard, “A Direct Approach to Conformational Dynamics Based on Hybrid Monte Carlo,” J. Comput. Phys., vol. 151, no. 1, pp. 146–168, May 1999. [243] P. Deuflhard, W. Huisinga, A. Fischer, and C. Schütte, “Identification of almost invariant aggregates in reversible nearly uncoupled Markov chains,” Linear Algebra Its Appl., vol. 315, no. 1–3, pp. 39–59, Aug. 2000. [244] P. Deuflhard and M. Weber, “Robust Perron cluster analysis in conformation dynamics,” Linear Algebra Its Appl., vol. 398, pp. 161–184, Mar. 2005. [245] N. Go, T. Noguti, and T. Nishikawa, “Dynamics of a small globular protein in terms of low-frequency vibrational modes,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 80, no. 12, pp. 3696–3700, Jun. 1983. [246] B. Brooks and M. Karplus, “Harmonic dynamics of proteins: normal modes and fluctuations in bovine pancreatic trypsin inhibitor,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 80, no. 21, pp. 6571–6575, Nov. 1983. [247] M. Levitt, C. Sander, and P. S. Stern, “Protein normal-mode dynamics: Trypsin inhibitor, crambin, ribonuclease and lysozyme,” J. Mol. Biol., vol. 181, no. 3, pp. 423–447, Feb. 1985. [248] V. m. Naik, S. Krimm, J. b. Denton, G. Némethy, and H. a. Scheraga, “Vibrational analysis of peptides, polypeptides and proteins,” Int. J. Pept. Protein Res., vol. 24, no. 6, pp. 613–626, Dec. 1984. [249] M. M. Tirion, “Large Amplitude Elastic Motions in Proteins from a Single-Parameter, Atomic Analysis,” Phys. Rev. Lett., vol. 77, no. 9, pp. 1905–1908, Aug. 1996. [250] T. R. Lezon, J. R. Banavar, A. M. Lesk, and A. Maritan, “What determines the spectrum of protein native state structures?,” Proteins Struct. Funct. Bioinforma., vol. 63, no. 2, pp. 273–277, May 2006. [251] Goldstein, Classical Mechanics. Cambridge: Addison-Wesley, 1953. [252] G. Song and R. L. Jernigan, “An enhanced elastic network model to represent the motions of domain-swapped proteins,” Proteins Struct. Funct. Bioinforma., vol. 63, no. 1, pp. 197–209, Apr. 2006. [253] L. Yang, G. Song, and R. L. Jernigan, “How Well Can We Understand Large-Scale Protein Motions Using Normal Modes of Elastic Network Models?,” Biophys. J., vol. 93, no. 3, pp. 920–929, Jan. 2007. [254] W. Zheng and S. Doniach, “A comparative study of motor-protein motions by using a simple elastic-network model,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 100, no. 23, pp. 13253– 13258, Nov. 2003. [255] K. Pearson, “LIII. On lines and planes of closest fit to systems of points in space,” Philos. Mag. Ser. 6, vol. 2, no. 11, pp. 559–572, 1901. [256] H. Hotelling, “Analysis of a complex of statistical variables into principal components,” J. Educ. Psychol., vol. 24, no. 6, pp. 417–441, 1933. [257] M. A. Balsera, W. Wriggers, Y. Oono, and K. Schulten, “Principal Component Analysis and Long Time Protein Dynamics,” J. Phys. Chem., vol. 100, no. 7, pp. 2567–2572, Jan. 1996. [258] I. Gushchin, V. Gordeliy, and S. Grudinin, “Two Distinct States of the HAMP Domain from Sensory Rhodopsin Transducer Observed in Unbiased Molecular Dynamics Simulations,” PLoS ONE, vol. 8, no. 7, p. e66917, Jul. 2013. [259] R. Brüschweiler, “Collective protein dynamics and nuclear spin relaxation,” J. Chem. Phys., vol. 102, no. 8, pp. 3396–3403, Feb. 1995. [260] H. J. Berendsen and S. Hayward, “Collective protein dynamics in relation to function,” Curr. Opin. Struct. Biol., vol. 10, no. 2, pp. 165–169, Apr. 2000. 95 [261] A. Amadei, A. B. M. Linssen, B. L. de Groot, D. M. F. van Aalten, and H. J. C. Berendsen, “An Efficient Method for Sampling the Essential Subspace of Proteins,” J. Biomol. Struct. Dyn., vol. 13, no. 4, pp. 615–625, 1996. [262] A. Amadei, A. B. M. Linssen, and H. J. C. Berendsen, “Essential dynamics of proteins,” Proteins Struct. Funct. Bioinforma., vol. 17, no. 4, pp. 412–425, Dec. 1993. [263] C. C. David and D. J. Jacobs, “Characterizing protein motions from structure,” J. Mol. Graph. Model., vol. 31, pp. 41–56, Nov. 2011. [264] D. M. F. Van Aalten, B. L. De Groot, J. B. C. Findlay, H. J. C. Berendsen, and A. Amadei, “A comparison of techniques for calculating protein essential dynamics,” J. Comput. Chem., vol. 18, no. 2, pp. 169–181, Jan. 1997. [265] M. Rueda, P. Chacón, and M. Orozco, “Thorough Validation of Protein Normal Mode Analysis: A Comparative Study with Essential Dynamics,” Structure, vol. 15, no. 5, pp. 565–575, May 2007. [266] A. Kitao and N. Go, “Investigating protein dynamics in collective coordinate space,” Curr. Opin. Struct. Biol., vol. 9, no. 2, pp. 164–169, Apr. 1999. [267] J. Ma, “Usefulness and Limitations of Normal Mode Analysis in Modeling Dynamics of Biomolecular Complexes,” Structure, vol. 13, no. 3, pp. 373–380, Jan. 2005. [268] S. Hayward, A. Kitao, and N. Gō, “Harmonicity and anharmonicity in protein dynamics: A normal mode analysis and principal component analysis,” Proteins Struct. Funct. Bioinforma., vol. 23, no. 2, pp. 177–186, Oct. 1995. [269] S. Hayward, A. Kitao, and N. Gō, “Harmonic and anharmonic aspects in the dynamics of BPTI: A normal mode analysis and principal component analysis,” Protein Sci., vol. 3, no. 6, pp. 936–943, Jun. 1994. [270] R. B. Cattell, “The Scree Test For The Number Of Factors,” Multivar. Behav. Res., vol. 1, no. 2, pp. 245–276, 1966. [271] R. B. Cattell and S. Vogelmann, “A Comprehensive Trial Of The Scree And Kg Criteria For Determining The Number Of Factors,” Multivar. Behav. Res., vol. 12, no. 3, pp. 289– 325, 1977. [272] S. Tristram-Nagle, H. I. Petrache, and J. F. Nagle, “Structure and Interactions of Fully Hydrated Dioleoylphosphatidylcholine Bilayers,” Biophys. J., vol. 75, no. 2, pp. 917–925, Jan. 1998. [273] H. J. C. Berendsen, J. R. Grigera, and T. P. Straatsma, “The missing term in effective pair potentials,” J. Phys. Chem., vol. 91, no. 24, pp. 6269–6271, Nov. 1987. [274] H. J. C. Berendsen, J. P. M. Postma, W. F. van Gunsteren, A. DiNola, and J. R. Haak, “Molecular dynamics with coupling to an external bath,” J. Chem. Phys., vol. 81, no. 8, pp. 3684–3690, Oct. 1984. [275] M. A. Stephens, “Tests of fit for the logistic distribution based on the empirical distribution function,” Biometrika, vol. 66, no. 3, pp. 591–595, Dec. 1979. 96
