RU 2 533 237 C1

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
(19)
RU
(11)
(51) МПК
G01N 33/50
(13)
2 533 237
C1
(2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
(12) ОПИСАНИЕ
(21)(22) Заявка:
ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
2013131944/15, 09.07.2013
(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
09.07.2013
(72) Автор(ы):
Луценко Михаил Тимофеевич (RU),
Андриевская Ирина Анатольевна (RU)
(45) Опубликовано: 20.11.2014 Бюл. № 32
R U
(73) Патентообладатель(и):
Федеральное государственное бюджетное
учреждение "Дальневосточный научный
центр физиологии и патологии дыхания"
Сибирского отделения РАМН (RU)
Приоритет(ы):
(22) Дата подачи заявки: 09.07.2013
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: РОСКИН Г.И. Микроскопическая
C 1
2 5 3 3 2 3 7
R U
(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИСТИДИНА В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ,
ПОЗВОЛЯЮЩИЙ ОПРЕДЕЛЯТЬ СТЕПЕНЬ ОКСИГЕНАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА
(57) Реферат:
Изобретение касается способа выявления
смешивают по 1 мл каждого в пробирке и вносят
гистидина в эритроцитах периферической крови.
в смесь 200 мкл цельной крови с коагулятом.
Способ осуществляют путем приготовления
Реакция протекает в течение 10 мин при
инкубационного раствора №1, состоящего из
комнатной температуре, после чего из капли
раствора 500 мг сульфаниловой кислоты в 50 мл
взвеси изготовляют монослойный мазок на
1 М HCl, и раствора №2, состоящего из 125 мг
предметном стекле, подсушивают и изучают с
NaNO2 в 2,5 мл дистиллированной воды. Растворы
помощью компьютерной цитофотометрии. 2 ил.
Стр.: 1
C 1
Адрес для переписки:
675000, Амурская обл., г.Благовещенск, ул.
Горького, 95А, Луценко Михаил Тимофеевич
2 5 3 3 2 3 7
техника. М.: "Советская наука", 1954. 441 с.
SU 131962 A1, 10.10.1960. SU 1402866 A1,
15.06.1988. БЫКОВСКИЙ Д. В. и др.
Некоторые закономерности экстракции
гистидина поли-n-винилпирролидоном с
различной величиной молекулярной массы.
Вестник ВГУ, СЕРИЯ: ХИМИЯ.
БИОЛОГИЯ. ФАРМАЦИЯ, 2009, N 2
RUSSIAN FEDERATION
(19)
RU
(11)
(51) Int. Cl.
G01N 33/50
(13)
2 533 237
C1
(2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY
(12) ABSTRACT
(21)(22) Application:
OF INVENTION
2013131944/15, 09.07.2013
(24) Effective date for property rights:
09.07.2013
(72) Inventor(s):
Lutsenko Mikhail Timofeevich (RU),
Andrievskaja Irina Anatol'evna (RU)
(45) Date of publication: 20.11.2014 Bull. № 32
C 1
2 5 3 3 2 3 7
R U
Стр.: 2
C 1
(54) METHOD FOR MEASURING PERIPHERAL BLOOD HISTIDINE USED TO DETERMINE DEGREE
OF HAEMOGLOBIN OXYGENATION
(57) Abstract:
FIELD: medicine.
tube and added with whole blood with a coagulate 200
SUBSTANCE: method is implemented by preparing
mcl. The reaction is carried out for 10 min at a room
an incubation solution No.1 containing sulphanilic acid
temperature, and a drop of the suspension is used to
500 mg in 1 M HCl 50 ml, and solution No.2 consisting
produce a multilayer smear on a slide, dried and studied
of NaNO2 125 ml in distilled water 2.5 ml. Each
by computed cytophotometry.
EFFECT: more accurate determination.
solution is taken in an amount of 1 ml, mixed in a test
2 dwg
2 5 3 3 2 3 7
Mail address:
675000, Amurskaja obl., g.Blagoveshchensk, ul.
Gor'kogo, 95A, Lutsenko Mikhail Timofeevich
R U
(73) Proprietor(s):
Federal'noe gosudarstvennoe bjudzhetnoe
uchrezhdenie "Dal'nevostochnyj nauchnyj tsentr
fiziologii i patologii dykhanija" Sibirskogo
otdelenija RAMN (RU)
Priority:
(22) Date of filing: 09.07.2013
RU
5
2 533 237 C1
Гистидин относится к одной из 20 протеиногенных аминокислот. Его роль в организме
многогранна. Он принимает активное участие в биосинтезе гистамина [1, 3],
способствует росту и восстановлению тканей и в большом количестве содержится в
гемоглобине эритроцитов периферической крови, принимая участие в его оксигенации
[7-11].
Присоединяя кислород, гемоглобин превращается в оксигемоглобин. Валентность
железа (Fe2++) при этом не изменяется, поэтому эту реакцию называют оксигенацией,
а не окислением. Связь гемоглобина с гистидином влияет на присоединение кислорода
10
15
20
25
30
35
40
45
к Fe2++ гема [12]. Гистидин как сильный донатор фиксирует гем в глобине, повышая
основность Fe2++, и тем самым способствует образованию связи с акцептором, которым
является молекула кислорода с практически сохраненным эффектом H. Бора [2, 6].
Цель работы найти способ, позволяющий выявлять содержание гистидина в
эритроцитах периферической крови и по измерению реакции на содержание гистидина
прогнозировать содержание оксигемоглобина.
Прототипом выявления гистидина в клеточных элементах мы взяли реакции,
предложенные в пятидесятые годы XX столетия [5]. Однако от предложенных методов
наши исследования существенно отличаются.
1. Реакцию в те годы проводили только на гистологических срезах. В отличие от
этого мы разработали гистохимическим методом выявлять гистидин в отдельно взятых
эритроцитах периферической крови.
2. Предложенный ранее метод основан на обязательной обработке тканевых срезов
33% раствором азотной кислоты, что не приемлемо для применения к взвеси
эритроцитов, поскольку это приводит к немедленному их гемолизу.
3. Обработанные слабым раствором соляной кислоты эритроциты помещались в
инкубационный раствор для определения гистидина, после чего из капли
прореагированной на гистидин взвеси изготовляли монослойный мазок.
4. Предложенный способ выявления гистидина в эритроцитах чувствителен и стоек,
что позволяет мазки крови длительно сохранять для исследования.
5. До настоящего времени способа выявления гистидина в эритроцитах в литературе
не описано, как и не предложено микрофотографий эритроцитов, содержащих продукты
реакции на гистидин.
Заявленный способ имеет следующие приемы.
1. Исследование проводилось на базе акушерского отделения ФГБУ Дальневосточный
научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН. Обследовано 25 здоровых
беременных в возрасте 18-25 лет. Контролем служили 10 беременных с признаками
анемии при обострении цитомегаловирусной инфекции.
2. Исследования проводились с учетом требований Хельсинской декларации
Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных
исследований с учетом человека» с поправками 2000 г. и правилами клинической
практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Министерства
здравоохранения РФ №266 от 19.06.2003 г.
3. Верификация цитомегаловирусной инфекции выполнялась путем определения
типоспецифических антител и индекса авидности методом ИФА на спектрофотометре
Stat-Fax-2100 (USA) с использование наборов ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск).
4. Гистидин в эритроцитах периферической крови определяли гистохимическим
методом путем помещения в инкубационный раствор эритроцитов, взятых у здоровых
лиц. Контролем служили беременные с признаками анемии.
Стр.: 3
RU
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2 533 237 C1
Приготовление инкубационного раствора проводилось следующим образом.
Раствор 1: 500 мг сульфаниловой кислоты растворяют в 50 мл 1 М HCl (2,218 мл до
50 мл дистиллированной воды).
Раствор 2: 125 мг NaNO2 растворяют в 2,5 мл дистиллированной воды.
В пробирку вносят 200 мкл цельной крови с коагулянтом и добавляют равные объемы
(по 1 мл) растворов 1 и 2. При комнатной температуре инкубационный раствор
выдерживают 10 мин. После чего каплю инкубационного раствора наносят на
предметное стекло и изготовляют с помощью центрифуги Diff Spin Slide Spinner M 70022 (USA) монослойный мазок, который подсушивают и изучают под цифровым
фотомикроскопом МТ (Япония).
5. Компьютерным цитофотометрическим методом определяют содержание гистидина,
приходящегося на 1 эритроцит в условных единицах, денситометрируя 100 эритроцитов
у каждого пациента. Содержание HbO2 у этих же пациентов определяли по методу
Эвелина и Мэллой [4].
Проведенные исследования показали, что составление инкубационной смеси из
следующих растворов: 1. - 500 мг сульфаниловой кислоты в 50 мл 1 М HCl и 2. - 125 мг
NaNO2 в 2,5 мл дистиллированной воды после смешения каждого из них по 1 мл и
введения в смесь 200 мкл цельной крови с коагулянтом позволяет выполнять реакцию
на выявление гистидина в эритроцитах в течение 10 мин при комнатной температуре.
Из капли взвеси после проведения реакции изготовляется монослойный мазок и
после его подсушивания изучают содержание гистидина в эритроцитах компьютерным
цитофотометрическим методом. В эритроцитах четко выделяются гранулы реакции на
гистидин. У здоровых беременных цитофотометрические исследования позволяют
установить, что на 1 эритроцит приходится 62,17±2,5 усл. ед. гистидина (фигура 1). При
обострении цитомегаловирусной инфекции до титра 1:800, если количество гистидина
на 1 эритроцит снижается до 34,3±1,85 усл. ед. (фигура 2), уменьшается оксигенация
гемоглобина до 94,5±1,9%, что создает угрозу формирования гипоксии в организме.
ЛИТЕРАТУРА
1. Коржуев П.А. Гемоглобин: сравнительная физиология и биохимия. 1964. М:
«Наука».
2. Коробов В.Н., Федорович И.П., Климишин Н.И. Физико-химические и
функциональные свойства гемоглобина мышей, зараженных карциномой Эрлиха //
Бюлл. экс. биол. и мед. 1992. т.113, №6. с.640-642.
3. Луценко М.Т. Влияние активности аргининдегидрогеназы на уровень гистамина
в периферической крови беременных с герпес-вирусной инфекцией // Бюлл. физиол. и
патол. дых. СО РАМН. 2012. Вып.44. С.62-66.
4. Покровский А.А. Биохимические методы исследования: Справочник. М.:
«Медицина». 1969. 337 с.
5. Роскин Г.И. Микроскопическая техника. М.: «Советская наука», 1954. 441 с.
6. Федорова Н.А. Нормальное кроветворение и его регуляция. 1976. М.: «Медицина».
541 с.
7. Christian J.E., Unno М., et. al. Spectroscopic effects of polarity and hydration in the distal
heme pocket of deoxymyoglobin // Biochemistry. 1997. 36 (37). P.11198-11204.
8. Ferguson R.A., Sehdev N., Bagatto B. In vitro interactions between oxygen and carbon
dioxide transport in the blood of the sea lamprey // J. Exp. Biol'. 11992. №2. P.10-15.
9. Jkeda-Saito M., Hon H., Anderson L.A. Coordination structure of the ferric hemme iron in
engineered distal hisdine myoglobin mutants // J. Biol. Chem. 1992. 267 (32). P.22843-22852.
Стр.: 4
RU
5
10
15
2 533 237 C1
10. Kopec W., Jamroz D., Wiliczkiewicz A. Antioxidation status and histidine dipeptides
content in broiler blood and muscules depending on protein sources in feed // J. Anim. Physiol.
Anim. Nutr. (Berl). 2012. 10. 1111/j. P.1439-0396.
11. Nikinmaa M., Airaksinen S., Vikki L. Hemoglobin function in intact lamprey erythrocytes:
interactions with membrane function in the regulation of gas transport and acid-base balance // J.
Exp. Biol. 1995. №3. P.12-16.
12. Perutz M.F., Mazzarella L. A preliminary x-ray analysis of haemoglobin H. «Nature».
1963. V.4. P.2.
Формула изобретения
Способ определения гистидина в эритроцитах периферической крови, включающий
выполнение гистохимической реакции в инкубационном растворе, состоящем из смеси
растворов по 1 мл каждого: раствор №1 - 500 мг сульфаниловой кислотой растворяют
в 50 мл 1M HCl и раствор №2 - 125 мг NaNO2 растворяют в 2,5 мл дистиллированной
воды, в который вносят 200 мкл цельной крови с коагулянтом и после 10 мин
прохождения реакции при комнатной температуре из капли взвеси изготовляется мазок,
на котором изучают компьютерным цитофотометрическим методом содержание
гистидина в эритроцитах.
20
25
30
35
40
45
Стр.: 5
RU
2 533 237 C1
Стр.: 6
RU
2 533 237 C1
Стр.: 7