УДК 581.1 ВЛИЯНИЕ ГИПЕРТЕРМИИ НА СООТНОШЕНИЕ ПРОТЕИНАЗ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ В ПРОРАСТАЮЩИХ ЗЕРНОВКАХ ПШЕНИЦЫ И.Ф. Александрова, Т.И. Николаева, А.А. Веселова Нижегородский госуниверситет Изучена активность кислых (pH 3.5) и щелочных (pH 7.8) протеиназ у 4-дневных прорастающих зерновок пшеницы при гипертермическом воздействии (42оС, 2 часа). Тепловой стресс приводил к снижению протеолитической активности как при кислом, так и при щелочном значениях pH на фоне существенно более высокой активности при pH 3.5. Использование ингибиторов и активаторов протеиназ позволило предположить, что при тепловом воздействии падение скорости протеолиза при кислом pH происходит в основном в результате снижения активности аспартатных протеиназ, а при щелочном — металлопротеиназ, что приводит к изменению соотношения различных типов протеиназ в прорастающих зерновках. Тепловой стресс сопровождается изменением активности катаболических процессов в растениях. Как правило, указывается на повышение скорости гидролитического расщепления биополимеров, приводящее к возрастанию осмотического давления и удержанию воды в клетках (Блехман, Шеламова, 1992). Однако такая довольно чёткая зависимость не обнаруживается при исследовании протеолитических ферментов, типы которых и функции, выполняемые ими, весьма разнообразны (Sanjeev, Malik, 1988; Шишова и др., 1997; Александрова и др., 1999). Отмечено также, что при стрессе изменяется и содержание ингибиторов протеиназ (Мосолов, 1998), что ещё более усложняет ответную реакцию растений на действие стрессорных факторов. Цель данной работы изучить влияние гипертермии на активность кислых и щелочных протеиназ в 4-дневных прорастающих зерновках пшеницы и проследить изменение соотношения различных типов протеиназ у контрольных и опытных проростков с использованием ингибиторного анализа. В качестве объекта исследования использовали зерновки пшеницы сорта Московская 35, пророщенные в течение четырёх дней в термостате без освещения при 25оС на растворе 2 мМ CaSO4. Опытные проростки подвергали 2-часовой гипертермии при 42о С. Активность протеиназ определяли по методу Ансона, субстратом служил 0.5%-ный гемоглобин на цитрат-фосфатном буфере (pH 3.5) или 0.25%-ный казеин на том же буфере (pH 7.8). Зерновки гомогенизировали в 0.9%-ной NaCl в соотношении 1:10. Инкубационная среда: 1 мл гомогената, 1 мл субстрата, 1 мл буфера или дополнительных реагентов, влияющих на протеолитическую активность. Конечные концентрации: ПХМБ, ЭДТА, цистеин — 1⋅10-3 М; иодацетамид — 1⋅10-4 М; пепстатин — 2⋅10-5 М. Время инкубации 1 ч при 37оС. Повторность опытов 3–5-кратная. Статистическую обработку проводили методом парных сравнений для связанных выборок с использованием критерия Стьюдента. 172 Из приведённых в таблице 1 результатов исследования видно, что в 4-дневных прорастающих зерновках пшеницы основной вклад в расщепление белков вносили кислые протеиназы; их активность как в контроле, так и в опыте была в несколько раз выше (в 16.2 и 18.7 раз, соответственно). Высокотемпературное воздействие приводило к достоверному снижению интенсивности распада белков при участии кислых и щелочных протеаз. Таблица 1 Активность кислых и щелочных протеиназ в 4-дневных прорастающих зерновках пшеницы, мкмоль тир ⋅ мин-1 ⋅ г сыр. массы-1 рН 3.5 7.8 контроль 9.08 0.56 Х тепловой стресс 7.50 0.40 Sd p 0.53 0.06 0.02 < p < 0.05 0.05 % к контр. 82 71 Обозначения: X — средняя арифметическая выборки, sd — стандартная ошибка разницы в парах сравнений, р — уровень значимости. Известно, что в распаде белков в семенах при прорастании участвуют различные типы протеиназ. Для выяснения уровня активности некоторых типов протеиназ при используемых значениях pH нами была проведена самостоятельная серия опытов с применением ингибиторов и активаторов протеиназ. Результаты этих опытов представлены в таблицах 2 и 3. Таблица 2 Активность щелочных протеиназ в присутствии модуляторов Модулятор активности Без добавок + Цистеин + ЭДТА + ПХМБ Контроль мкмоль тир ⋅ мин-1 ⋅ г сыр. массы-1 0.60 1.72 0.20 не ингибировал % 195 34 Тепловой стресс мкмоль тир ⋅ мин-1 ⋅ г сыр. массы-1 0.48 0.85 0.46 не ингибировал % 176 96 Анализ таблицы 2 показал, что под влиянием ингибитора цистеиновых протеиназ — ПХМБ ферментативная активность не снижалась ни в контроле, ни в опыте, что должно говорить об отсутствии или очень незначительном вкладе этого типа протеиназ в расщепление белков при слабощелочном значении pH. В то же время в присутствии цистеина отмечено возрастание активности. Можно предположить, что создание более восстановленных условий и, в частности, возможное восстановление в белках-субстратах дисульфидных групп в сульфгидрильные делает их более доступными для протеолиза. В присутствии ЭДТА существенно (на 66%) снижалась активность в контрольном варианте и мало изменялась в опыте. Очевидно, падение активности, вызванное тепловым воздействием, происходит в значительной степени за счёт уменьшения активности металлопротеиназ. Не исключено также, что суммарное падание активности при щелочном значении pH наблюдалось и за счёт изменения активности пептидаз, среди которых есть и металлсодержащие (Сарбаканова и др., 1987). 173 Таблица 3 Влияние модуляторов на активность кислых протеиназ Модулятор активности Без добавок + Иодацетамид + ПХМБ + Цистеин Без добавок + Пепстатин + ЭДТА Контроль мкмоль тир ⋅ мин-1 ⋅ г сыр. массы-1 9.08 7.61 8.22 7.86 7.72 0.56 не ингибировал % 84 90 87 28 Тепловой стресс мкмоль тир ⋅ мин-1 ⋅ г сыр. массы-1 7.50 8.05 6.81 10.80 6.43 4.98 не ингибировал % 107 90 144 77 ЭДТА при кислом значении pH в обоих вариантах опыта не снижал протеолиза. Основной вклад в уменьшение активности при тепловом стрессе, как видно из таблицы 3, вносили аспартатные протеиназы: в присутствии пепстатина в контроле активность снижалась на 72%. В варианте с тепловым воздействием процент ингибирования был значительно ниже. Можно предположить, что снижение суммарной активности протеиназ при гипертермии происходило за счет падения активности именно этого типа протеолитических ферментов. Аспартатные протеиназы, синтезирующиеся и локализованные в основном в зародыше, щитке, алейроновом слое, выполняют важную роль в процессинге и активации различных белков — предшественников гидролаз перед их секрецией в эндосперме. В эндосперме аспартатные протеиназы локализованы в участке, прилегающем к щитку (Kervinen et al., 1995). Менее четкие данные получены при использовании иодацетамида, ПХМБ и цистеина: они позволяют предположить наличие небольшой доли цистеиновых протеиназ. Таким образом, представленные результаты свидетельствуют об уменьшении протеазной активности в 4-дневных прорастающих семенах пшеницы под влиянием высокотемпературного воздействия как при кислом (3.5), так и при щелочном (7.8) значениях pH. Наиболее существенные изменения при тепловом стрессе происходят за счёт падения активности кислых аспартатных протеиназ. Вклад металлопротеиназ в этот процесс сравнительно невелик, как и в целом их активность при слабощелочном значении pH. Вследствие этих изменений должно происходить смещение соотношения активностей протеиназ различных типов, направленное на повышение адаптивных возможностей организма в условиях стресса. ЛИТЕРАТУРА Александрова И.Ф., Веселов А.П., Зайцева И.В., Хесина О.В. Влияние гипертермии на активность кислых протеиназ в семенах пшеницы при прорастании // Вестник Нижегор. ун-та, сер. биол.. 1999. С. 105–108. Блехман Г.И., Шеламова Н.А. Синтез и распад макромолекул в условиях стресса // Успехи современной биологии. 1992. Т. 112, вып. 2. С. 281–294. Мосолов В.В. Новое о природных ингибиторах протеолитических ферментов // Биоорганическая химия. 1998. Т. 26. С. 273–278. Сарбаканова Ш.Т., Дунаевский Я.Е., Белозерский М.А., Руденская Г.Н. Карбоксипептидаза семян пшеницы // Биохимия. 1987. Т. 52, вып. 8. С. 1167–1171. 174 Шишова Т.К., Руденская Ю.А., Лихолат Т.В., Мосолов В.В. Восстановление жизнеспособности зерна пшеницы, подвергнутого стрессовому воздействию под влиянием ризосферных микроорганизмов // ДАН. 1997. Т. 356. С. 285–286. Kervinen J., Tormakangas K., Runeberg-Roos P. et al. Structure and possible function of aspartic proteinases in barley and other plants // Adv. Exp. Med. Biol. 1995. V. 362. P. 241–254. Sanjeev K., Malik C. Correlated changes of some amino acids and protease in wheat seedling subjected of water and temperature stresses // Phyton. 1988. V. 28. P. 261–269. 175