Лабораторная работа № 7
реклама
Факультет молекулярной и биологической физики Московский физико-технический институт (государственный университет) ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №7 по курсу: Физические методы исследований в физико-химической биологии ЭЛЕКТРОННЫЙ ПАРАМАГНИТНЫЙ РЕЗОНАНС В БИОЛОГИИ МОСКВА 2005 Метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) служит для изучения парамагнитных центров (неспаренных электронов) в веществах и в их окружениях. Его применение связано с изучением органических свободных радикалов, комплексных ионов парамагнитных металлов и фотовозбужденных триплетных состояний. Примерами парамагнитных частиц служат свободные радикалы, возникающие как в результате повреждающего действия радиации на биологические структуры, так и при фотохимическом окислении хлорофилла. Ионы парамагнитных металлов Fe, Co, Ni, Сu, Мn являются распространенными в биологических системах парамагнитными частицами, входящими в состав энзимов. Парамагнетизм этих ионов обусловлен особенностями заполнения электронных оболочек, в результате чего энергетически выгодным оказывается наличие неспаренных электронов на некоторых внутренних орбиталях. Метод ЭПР позволяет наблюдать окислительно-восстановительные превращения этих металлов и судить, таким образом, об их функционировании. Методом ЭПР исследуют и фотобиологические реакции, так как триплетные состояния, возникающие под действием света, обладают двумя неспаренными электронами. Метод ЭПР основан на известном эффекте Зеемана, заключающемся в том, что при введении парамагнитной частицы, характеризующейся квантовым числом S , в постоянное магнитное поле, ее основной энергетический уровень расщепится на 2S + 1 подуровней, отделенными друг от друга интервалами энергии ΔE , равными ΔE = gβH , (1) где β -магнетон Бора, равный 9.2732 ⋅ 10 − 21 эрг ⎛ Дж ⎞ ⎟ , H -напряженность ⎜ Гаусс ⎝ мТл ⎠ внешнего магнитного поля, g ("g-фактор"), фактор спектроскопического расщепления, определяющий, по существу, величину эффективного магнитного момента частиц. Для свободного электрона, т.е. для электрона не обладающего орбитальным движением, g-фактор равен 2,002319. Рассмотрим наиболее простой и в то же время наиболее распространенный случай - S = 1 2 (один неспаренный электрон). В магнитном поле H магнитный момент электрона ориентируется либо по полю, либо против поля. Другими словами, возникнут два Зеемановских уровня с магнитными квантовыми числами S = ± 1 2 и с расщеплением gβH между ними. При подаче на парамагнитный образец, помещенный в постоянное магнитное поле H , высокочастотного магнитного поля с перпендикулярной к H ориентацией магнитного вектора с частотой ν= ΔE gβH = h h (2) под действием излучения происходят равновероятно переходы неспаренных электронов с более низкого на более высокий энергетический уровень, которые 2 сопровождаются поглощением энергии и индуцированная эмиссия - процесс, прямо противоположный процессу поглощения. Очевидно, что если заселённость нижнего уровня больше, то происходит поглощение энергии. Впервые это поглощение наблюдал русский ученый Завойский Е. К. в 1944 году. Отношение заселенностей, возникающих в магнитном поле уровней N1 и N 2 , в соответствии с законом Больцмана, равны − N1 =e N2 gβ H kT (3) При полях около 3 000 эрстед, когда разность энергий уровней gβH будет равна ~ 4 ⋅ 10 −5 эВ , отношение заселённостей уровней в равновесии будет отличаться примерно на 0,2%. Равновесие же устанавливается благодаря переходам между уровнями с S = + 1 2 и S = − 1 2 из-за взаимодействия спинов с фононами решетки. Для наблюдения этого явления, получившего название электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), требуется регистрация поглощаемой в образце высокочастотной мощности на частоте, удовлетворяющей соотношению (1). В принципе возможны два способа регистрации этого поглощения: а) изменять во времени частоту при фиксированном значении H , б) изменять во времени напряженность магнитного поля при фиксированном значении ν . В момент, когда будет выполняться соотношение (1), возникнет резонансное поглощение. Поскольку второй метод реализовать можно с большей точностью и относительно просто технически реализовать, во всех спектрометрах ЭПР запись спектра осуществляется в координатах I погл = f (H ) при ν = const , где I погл − интенсивность поглощения высокочастотной энергии. Если в уравнение (1) подставить численные значения констант, то резонансная частота высокочастотного поля будет равна ν = 2,8 ⋅ 10 6 H Гц, где H выражается в эрстедах. В принципе условия резонанса hν = gβH справедливы для любых частот. В частности, известны магнетометры для измерения магнитного поля земли, равного примерно 0,5 Гс. Однако выбор практически используемых частот ограничен в первую очередь требованием высокой чувствительности приборов. Величина сигнала ЭПР в первом приближении пропорциональна произведению разности заселенностей уровней и энергии поглощенных квантов. Энергия квантов прямо пропорциональна величине магнитного поля H , заселенности уровней соотносятся согласно известному выражению Максвелла-Больцмана (3). При обычных условиях наблюдения ЭПР разность заселенностей уровней примерно пропорциональна H . Отсюда следует, что с увеличением магнитного поля чувствительность прибора ЭПР должна возрастать приблизительно пропорционально H 2 . Ряд чисто экспериментальных факторов ставят верхний предел 3 применяемых магнитных полей. Один из них -это размер образцов. Обычно спектрометры ЭПР работают в СВЧ диапазоне. Образцы помещают в резонаторы - аналоги катушек, используемых в более длинноволновых диапазонах. При магнитных полях около 10 000 э (1T) размеры резонатора оказываются порядка нескольких миллиметров, и, хотя чувствительность, рассчитанная на единицу объёма, велика, малый объём образца обычно не позволяет получить общую высокую чувствительность. Применение больших магнитных полей оправдано лишь в случае исследования образцов малого размера. Другим ограничением является необходимость изготовления оригинальных волноводов, аттенюаторов и других компонент СВЧ техники в случае выбора произвольного значения величины магнитного поля и, соответственно, частоты. Поэтому стандартным является использование лишь частот 3-сантиметрового (10 ГГц) и 8-миллиметрового диапазонов (36 ГГц), широко используемых в радиолокации и прекрасно обеспеченных микроволновой техникой. Величины магнитных полей для работы в этих диапазонах составляют примерно 3 400 и 12 000 ое. Влияние некоторых других экспериментальных факторов на чувствительность приборов ЭПР будет рассмотрено далее. ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СПЕКТРОВ ЭПР ОДИНОЧНАЯ ЛИНИЯ Одиночная линия поглощения в спектре ЭПР (как указано выше, это I погл = f (H ) ) характеризуется следующими параметрами. Максимум кривой поглощения соответствует значению H = H 0 , при котором точно выполняется уравнение (1), т.е. при заданной частоте можно по величине H определить величину g-фактора для данного соединения, имеющего не-спаренный электрон. У многих свободных радикалов, в которых неспаренный электрон находится на сильно делокали-зованной молекулярной орбитали, значения g-фактора очень близки к величине g-фактора свободного электрона, т.е. электрона, не обладающего угловым орбитальным моментом. Если же электрон движется по атомной орбитали, принадлежащей одному какому-либо атому, то его угловой орбитальный момент может быть значительным и величина g -фактора будет отличаться от g-фактора свободного электрона. Ниже приведены типичные значения g -факторов для некоторых органических радикалов (таблица 1) и ионов металлов, входящих в состав ферментов (таблица 2). 4 Таблица 1. Значения g -факторов для некоторых органических радикалов радикал значение g - фактора Метил 2,00255 Этил 2,00260 Изопропил 2,003 Винил 2,00220 Анион нафталина 2,00263 Анион антрацена 2,00266 Анион бензола 2,00276 Таблица 2. Значения g -факторов для некоторых ионов металлов, входящих в состав ферментов металл значение g - фактора 2,17(2,3) Cu 63 65 2,05 Cu 57 2,00(1,94) Fe 95 2,02 Mo 97 1,95 Mo 59 В широких пределах Co 51 2,00 Y Площадь под кривой поглощения пропорциональна, при прочих равных условиях, количеству парамагнитных частиц в образце. На практике провести вычисление абсо-. лютного содержания в образце парамагнитных частиц с разумной точностью очень трудно и вместо этого выполняется сравнение исследуемого образца со стандартом, содержащим известное заранее число парамагнитных частиц. Общепринятым стандартом для таких измерений является дифенилпикрилгидразил (С 6 H 5 )2 N − N − C 6 H 5 ( NO2 )3 , который на 100% состоит из радикалов ( 1.53 ⋅ 10 21 неспаренных электронов на 1 г вещества). Ширина и форма линий поглощения являются дополнительными параметрами, характеризующими условия поглощения. Ширина линии непосредственно определяется разбросом энергетических уровней, занимаемых неспарен-ными электронами и, следовательно, позволяет судить о взаимодействиях, которые испытывает неспаренный электрон. Различают следующие основные типы взаимодействий, определяющие ширину и положение резонансной линии ЭПР. 1. Так называемое, "спин-решеточное" взаимодействие — взаимодействие между спином неспаренного электрона и его окружением, т.е. либо кристаллической решеткой, либо остальной частью молекулы (молекулярной системы), в которой находится 5 рассматриваемый неспаренный электрон. Этот механизм обмена энергии обеспечивает непрерывность резонансного поглощения, т.к. в его отсутствии заселенность рассматриваемых двух уровней уравнялась бы и поглощение прекратилось бы. С другой стороны, если спин-решеточное взаимодействие велико, то электроны могут оставаться на верхнем уровне очень короткое время ∇t , что согласно принципу неопределенности, приведет к уширению, иногда значительному, резонансной линии. Обычно выделяют два механизма, с помощью которых осуществляется обмен энергией между системой спинов и фононами решетки: прямое резонансное и комбинационное взаимодействия. В первом случае резонансная ΔE gβ H = частота линии ЭПР ν = совпадает с собственными h 2. 3. h колебаниями решетки, во втором, эта частота совпадает с разностными частотами колебаний решетки. Оба механизма привлекаются для описания спин-решеточного взаимодействия, однако в большинстве случаев, представляющих интерес для химии и биологии, уширение линии, обусловленное другими факторами, превышает уширение линии за счет спин-решеточного взаимодействия. "Спин-спиновое" взаимодействие — общее название взаимодействий, посредством которых спины обмениваются энергией между собой. Обмен энергией между отдельными неспаренными электронами не изменяет энергии системы спинов в целом. Однако спин—спиновые взаимодействия приводят к изменению времени жизни данного спинового состояния. Очевидно, что этот случай может быть реализован при не слишком малой концентрации электронов в образце. В разбавленных растворах, которыми являются биологические и биохимические системы, концентрации неспаренных электронов невелики и их спин-спиновым взаимодействием обычно можно пренебрегать. "Спин-орбитальное" взаимодействие — взаимодействие спинового магнитного момента электрона с переменным магнитным полем, созданным его орбитальным движением. Орбитальное движение электрона вносит вклад в суммарный магнитный момент, что приводит к отклонению g-фактора от значения 2,0023. В тоже время, орбитальное движение электрона обычно существенно зависит от электрических полей, создаваемых окружением неспаренного электрона, в результате, орбитальный магнитный момент мал и только в некоторых случаях (например, для ионов металлов) наблюдаются отклонения величины g-фактора от чисто спинового значения. 6 СВЕРХТОНКАЯ СТРУКТУРА СПЕКТРОВ ЭПР (СТС) Если атом или молекула, обладающие неспаренным электроном, имеют парамагнитные ядра, то спектр ЭПР становится более сложным. В таком случае на электрон будет действовать магнитное поле H + ΔH i , где ΔH i дополнительные магнитные поля, созданные магнитными моментами ядра. Магнитным моментом J ядра называют максимальное значение момента этого ядра. Это взаимодействие магнитных моментов неспаренных электронов с магнитными моментами ядер, так называемое, сверхтонкое взаимодействие, приводит к расщеплению линий и появлению сверхтонкой структуры в спектрах ЭПР. Если движение неспаренного электрона ограничено атомной орбиталью какого-либо одного атома, он будет взаимодействовать с ядром именно этого атома. В магнитном поле магнитный момент ядра может принимать 2 J + 1 значений и, соответственно, дополнительное магнитное поле будет иметь столько же значений. При движении неспаренных электронов по молекулярным орбиталям, охватывающим несколько атомов, возникает сверхтонкое расщепление, обусловленное взаимодействием электронов с несколькими различными ядрами, и в этом случае спектры имеют более сложную структуру. Рассмотрим самый простой случай — взаимодействие неспаренного электрона с одним ядром, например радикал в котором неспаренный электрон взаимодействует с одним протоном. Неспаренный электрон находится в суммарном магнитном поле: внешнем и создаваемом протоном. Магнитный момент протона также ориентируется во внешнем магнитном поле. Ядерный спин протона I = 1 2 , т.е. квантовое число протона имеет значения ± 1 2 , а значит магнитный момент протона может быть ориентирован параллельно или антипараллельно по отношению к внешнему магнитному полю. Это приводит к тому, что для одних радикалов локальное поле будет больше внешнего, а для других меньше. В силу этого в спектре ЭПР рассматриваемого радикала будут наблюдаться две линии (рис. 1) при двух значениях внешнего магнитного поля: a , где a − константа сверхтонкого расщепления, равная расстоянию 2 между двумя линиями СТС; H 0 − резонансное поле при a = 0 , т.е. при отH резон = H 0 + сутствии сверхтонкого взаимодействия. Если неспаренный электрон взаимодействует более чем с одним протоном, то картина СТР усложняется. Например, при взаимодействии с двумя эквивалентными протонами (неспаренный электрон взаимодействует с ними в одинаковой степени) в спектре ЭПР будут наблюдаться три линии (рис. 2) с отношением интенсивностей 1:2:1. 7 Рис. 1. E − энергия электрона в магнитном поле с учетом сверхтонкого взаимодействия магнитного момента неспаренного электрона с протоном. Δ + 1 и Δ − 1 2 2 энергии разрешенных переходов, W − поглощение энергии СВЧ-поля. При увеличении числа протонов, с которыми может взаимодействовать неспаренный электрон, спектр будет содержать еще больше линий. В случае n эквивалентных протонов в спектре ЭПР будут наблюдаться n + 1 линий. В общем случае если в радикале содержится n эквивалентных ядер, обладающих ядерным спином I , то число компонентов сверхтонкой структуры будет равно Mcmc = 2nI + 1 . Интенсивности пиков определяются коэффициентами биномиального разложения (1 + X ) ; расстояние между пиками равно константе сверхтонкого взаимодействия a . n 8 Рис. 2. E − энергия электрона в магнитном поле с учетом сверхтонкого взаимодействия магнитного момента неспаренного электрона с протоном. Δ +1 и Δ −1 энергии разрешенных переходов, W − поглощение энергии СВЧ-поля. Таблица 3. ПРИНЦИПЫ ПОСТРОЕНИЯ СПЕКТРОМЕТРОВ ЭПР Назначением прибора является регистрация изменения поглощаемой в образце мощности микроволнового диапазона (СВЧ-диапазона) при изменении напряженности магнитного поля. Основой прибора являются: а) электромагнитная система для создания стабильного магнитного поля, которое можно плавно изменять в требуемом диапазоне напряженностей; б) система, позволяющая подвести радиочастотное (СВЧ) излучение к образцу и зарегистрировать резонансное поглощение. 9 Электромагнитная система прибора должна отвечать следующим, вытекающим из ранее сказанного, требованиям: обеспечивать однородное и стабильное магнитное поле значительной напряженности, до 3 000-4 000 Э при длине волны СВЧ излучения 3 см, а при 8 мм - до 13 000 Э; позволять проводить линейное и плавное изменение напряженности магнитного поля с заданной скоростью и в заданном диапазоне. СВЧ-системы, используемые в ЭПР-спектроскопии, несущественно отличаются от хорошо разработанных в радиолокации и состоят из следующих блоков: генераторы СВЧ, как правило работающие с использованием отражательных клистронов; систем автоподстройки частоты (АПЧ), поддерживающие постоянной частоты генераторов; блоков стабилизированных источников питания; блоков приемников с системами регистрации. Для передачи СВЧ-излучения к образцу используется стандартный волноводный тракт. Образец помещается в объемный резонатор, расположенный между полюсными наконечниками электромагнита. Объемные резонаторы, используемые в ЭПР-спектрометрах, различаются по конструкции. Чаще всего применяют цилиндрические или прямоугольные резонаторы. В цилиндрических резонаторах используют тип колебаний у которых напряженность магнитной составляющей СВЧ-волны максимальна в центре резонатора; в прямоугольных — область максимальной напряженности магнитной составляющей представляет собой плоскость, проходящую через центр резонатора. Исследуемый образец помещают в резонатор ЭПР-спектрометра таким образом, чтобы он находился в области максимальной напряженности магнитной составляющей СВЧ-поля. По этой причине в цилиндрические резонаторы образцы помещают обычно в тонких капиллярах, а в прямоугольные — в плоских кюветах. Регистрацию резонансного поглощения СВЧ-излучения в образце производят с помощью регистрации поглощения в резонаторе или изменения отражения СВЧ-мощности от резонатора, в зависимости от конкретной схемы спектрометра. Возможно использование как гетеродинной схемы СВЧприемника, так и схем прямого усиления в простейших приборах. Выход СВЧ-приемника в старых приборах классически подключался к осциллографу и параллельно к самописцу. Современные схемы регистрации ЭПР-сигналов включают аналого-цифровой преобразователь и компьютер. Такая схема позволяет накапливать информацию в памяти ЭВМ и проводить цифровую обработку по самым разным программам. Принципиальным является то, что с помощью цифровой обработки ЭПРсигналов можно, применяя режим накопления, повысить чувствительность и временное разрешение пробора. При повторном сканировании когерентные сигналы растут пропорционально числу проходов n, а шум растет как 1 nm . Таким образом, отношение сигнал/шум растет пропорционально n . Для получения спектра сигнала ЭПР нужно в некоторых пределах произвести изменение величины магнитного поля H (осуществить развертку 10 2 поля). Обычно развертка поля осуществляется в течение десятков секунд или минут, другими словами, изменение сигнала в СВЧ-приемнике будет низкочастотным, что вызывает ухудшение отношения сигнал/шум из-за низкочастотных шумов приёмника (мощность низкочастотного шума приемника от частоты F зависит как 1 F ). Выходом является наложение дополнительного высокочастотного магнитного поля (обычно с частотой 100 кГц, удобной с точки зрения радиотехники). В этом случае амплитуда переменного высокочастотного сигнала определяется крутизной сигнала ЭПР, т.е. пропорциональна производной сигнала ЭПР при данном значении постоянного (медленно разворачиваемого) магнитного поля (рис. 3). Рис. 3. Принцип высокочастотной модуляции магнитного поля. Общая схема широко применяемых ЭПР-спектрометров уже давно устоялась и включает перечисленные выше системы (рис. 4 ). Нужно отметить, что сегодня все научные (да и технологические) достижения связаны с более современными вариантами структурных схем ЭПР-спектрометров, как более сложными, так и совсем упрощенными, но максимально специализированными. Например, для технологических целей (контроля качества и состава некоторых пищевых и лекарственных продуктов), созданы специализированные, предельно простые и не слишком чувствительные. Для конкретных научных исследований разрабатываются специализированные ЭПР-спектрометры например ЭПР-релаксометры, имеющие напротив весьма сложные структурные схемы и предельно возможную чувствительность. 11 Рис. 4. Структурная схема радиоспектрометра ЭПР. Вариант с отражательным резонатором: 1 - магнит, 2 - модулятор, 3 - детекторная секция, 4 - предусили-тель, 5 резонансный усилитель, 6 - синхронный детектор, 7 - усилитель постоянного тока, 8 - резонатор с образцом, 9 - со-гласователь, 10 - циркулятор, 11 фазовращатель, 12 - система автоподстройки частоты, 13 - осциллограф, 14 самописец, 15 - аттенюатор, 16 - ферритовый вентиль, 17 - клистрон, 18 ферритовый вентиль. Генератор СВЧ построен на отражательном клистроне. СВЧ-мощность от генератора через аттенюатор и циркулятор по волноводному тракту поступает в объемный резонатор с образцом. Образец находится в пучности магнитного поля СВЧ. Сам резонатор помещен в зазор электромагнита. Векторы магнитного поля и СВЧ-магнитного поля ортогональны друг другу. На тонких стенках резонатора находятся также катушки, служащие для ВЧ модуляции магнитного поля. Модуляционные катушки питаются отдельным генератором. Сигнал от СВЧ-детекторной секции поступает через усилитель на узкополосный усилитель, синхронный детектор, усилитель постоянного тока и двухкоординатный самописец. На вход X усилителя двухкоординатного самописца поступает сигнал с блока медленной линейной развертки магнитного поля, а на вход Y- сигнал от синхронного детектора. ПРИМЕНЕНИЕ ЭПР В БИОЛОГИИ Метод ЭПР начал применяться в биологических исследования почти сразу после его открытия. Первоначально биологические эксперименты проводили с лиофильно высушенными или замороженными образцами, т.к. сильное падение 12 чувствительности ЭПР-спектрометров из-за большого содержания жидкой воды не позволяло работать с водосо-держащими образцами. По мере развития техники ЭПР ограничения на содержание воды в образцах постепенно смягчаются. Сигналы ЭПР различных растительных и животных тканей были обнаружены в самых первых экспериментах. Парамагнитными центрами, ответственными за сигналы ЭПР тканей, являются свободные радикалы и целый ряд парамагнитных металлов. Содержание свободных радикалов в различных тканях изменяется в пределах 1016 ÷ 1018 на 1 г сухой массы. Сигналы ЭПР различных тканей представляют собой несколько асимметричные синглеты с g-фактором 2,003-2,005 и шириной 1-2 мТл. Сигнал может быть обусловлен целым рядом свободно-радикальных продуктов, вклад могут вносить витамины, гормоны, флавины и т.д. Накоплен обширный экспериментальный материал о связи сигналов ЭПР тканей с метаболизмом и патологическими состояниями клеток и тканей. Помимо сигналов свободных радикалов в тканях наблюдается целый ряд сигналов металлов (Fe, Cu, Mn, Ni, Co). Эти металлы входят в состав металлопротеинов, принимающих участие в целом ряде ферментативных процессов. Комплексы металлов обладают гораздо более широкими сигналами, чем сигналы свободных радикалов, за счет сильного спин-орбитального взаимодействия, что приводит к коротким временам спин-решеточной релаксации, анизотропии g-фактора и сверхтонкого взаимодействия, отличиям значения g-фактора от g-фактора свободных радикалов. Кроме того, в связи с малыми временами спин-решеточной релаксации, характеризующей скорость установления равновесных значений заселенностей уровней, сигналы многих металло-комплексов не удаётся наблюдать при обычных температурах. Для исследования этих металлокомплексов применяют охлаждение образцов до температур, близких к температуре жидкого гелия. Для исследований свободнорадикальных интермедиатов ферментативных реакций используется метод матричной изоляции, основанный на том, что из реакционной смеси через определенные промежутки времени после начала реакции отбирают пробы, которые быстро замораживают. Сигнал ЭПР замороженных образцов в этом случае отражает состояние в исследуемой системе на момент взятия пробы. Метод ЭПР широко применяют в исследованиях фотосинтеза для изучения механизма первичных стадий разделения зарядов в реакционных центрах и процессов переноса электрона по цепи электронного транспорта. Помимо изучения механизмов реакций, протекающих с участием парамагнитных частиц, метод ЭПР широко используют и для исследования структурно-динамических свойств макромолекул и биомембран. Для этих целей разработан метод спиновых зондов и меток, заключающийся в том, что в исследуемую систему вводят стабильный радикал, который либо ковалентно связывается с макромолекулой (спиновая метка), либо удерживается в системе за счет физических взаимодействий (спиновый зонд). Спектр этого радикала чувствителен к свойствам среды, в которую он внедрен. Разработанные 13 теоретические подходы позволяют связать параметры спектра ЭПР с физическими параметрами системы: характером и скоростями движения молекул, конформационными изменениями структуры макромолекул и т.д. В качестве спиновых зондов часто используют нитроксильные радикалы, содержащие группировку, на которой локализован неспаренный электрон. С помощью спиновых меток изучают пространственное расположение отдельных групп в белках и нуклеиновых кислотах, конформационные переходы, связанные с функционированием ферментов, и целый ряд других проблем молекулярной динамики. Диапазон времен молекулярных движений, измеряемых с помощью спиновых меток и зондов в настоящее время расширен до 10 −3 с , т.е. до характерных времён движения интегральных мембранных белков. Метод ЭПР открыл возможности глубокого изучения свободных радикалов, возникающих в биологических объектах под действием ионизирующего излучения. При облучении некоторых аминокислот образуются свободные радикалы, дающие весьма характерные спектры ЭПР со сложной СТС, за счет взаимодействия не-спаренного электрона с протонами и с ядрами N 14 . Такие спектры характерны для глицина, аланина, валина, лизина, лейцина и др. аминокислот (14 аминокислот). Радиационный выход свободных радикалов для многих аминокислот по данным разных авторов составляет от 1 до 10 радикалов на 100 эв поглощенной энергии. Рис. 5. Спектр ЭПР γ − облученного поликристаллического аланина при комнатной температуре. В облученных ароматических аминокислотах (тирозине, триптофане) наблюдаются значительно более узкие синглетные сигналы ЭПР с гораздо более низким выходом. 14 Серосодержащие аминокислоты (цистин, цистеин) дают после облучения характерные сигналы ЭПР с резко выраженной анизотропией g-фактора, среднее значение g-фактора 2,025. В спектрах облученных белков, представляющих собой полимеры аминокислот, можно было бы ожидать появления сложного аддитивного спектра резонансного поглощения, однако экспериментально показано, что все белки дают после облучения один из трех типов сигналов: узкий асимметричный синглет шириной 5-10 эВ; симметричный дублет с ΔH = 15 − 16 эВ и g-фактором близким к g-фактору свободного электрона или асимметричный смешанный "цистеиновый" сигнал при высоком содержании цистеина в белке. Выход свободных радикалов в белках на один — два порядка ниже по сравнению с аминокислотами. Рис. 6. Спектр ЭПР γ − облученного яичного альбумина. То обстоятельство, что в спектрах ЭПР облученных белков не наблюдаются линии радикалов отдельных аминокислот привело к предположению о наличии некоторой схемы миграции энергии возбуждения с одних остатков аминокислот на другие и на образовавшиеся в результате ионизации радикалы. Малая ширина сигнала ЭПР, отсутствие СТО и пониженный выход радикалов для многих нативных белков привели исследователей к заключению, что в натив-ной белковой структуре неспаренный электрон в значительной степени делокализован по белковой структуре. МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИЗМЕРЕНИЙ 1. ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ При измерениях сигналов ЭПР образцы помещают в цилиндрические ампулы или плоские кюветы в зависимости от типа резонатора. Образцы могут быть лиофильно высушены, заморожены либо находиться в водном или другом растворе. Наибольшие затруднения вызывают измерения сигналов ЭПР образцов, содержащих большое количество жидкой воды, 15 поскольку присутствие "свободной" воды в образце приводит к падению чувствительности спектрометра из-за больших диэлектрических потерь воды. Общих рекомендаций в данном случае нет. Обычным является экспериментальный выбор размера образца (диаметр ампулы, высота ее заполнения) с тем, чтобы получить максимальный по величине сигнал. 2. МОЩНОСТЬ СВЧ-ИЗЛУЧЕНИЯ Если увеличивать мощность СВЧ-излучения, падающего на образец, то амплитуда сигнала возрастает до "насыщения", затем по достижении максимума может уменьшиться. Эффект насыщения вызывается тем, что при больших мощностях СВЧ процессы релаксации не могут поддерживать больцмановское распределение в системе спинов. Это приводит к выравниванию заселенностей верхнего и нижнего уровней и падению сигнала. В условиях насыщения происходит и некоторое уширение линий. При измерении сигналов ЭПР мощность СВЧ подбирают экспериментальным путем. Регистрируют зависимость амплитуды сигнала от СВЧ-мощности, а затем выбирают уровень мощности СВЧ, при котором не происходит искажения формы линии ЭПР. 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСТАНТ СВЕРХТОНКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ И g-ФАКТОРА Для определения констант сверхтонкого расщепления и определения gфактора сигнала ЭПР, обусловленного содержанием в образце какого-либо типа парамагнитных частиц, необходимо точно определить величину магнитного поля H при которой происходит ЭПР (при точно известном значении рабочей частоты СВЧ). Провести прямые одновременные измерения этих величин весьма затруднительно. Обычный метод заключается в сравнении сигналов ЭПР эталонного образца (с заранее точно известным значением gфактора) с сигналом исследуемого образца. В качестве эталона удобно использовать образцы, спектр ЭПР которых состоит из нескольких линий, например, Mn 55 в кристаллической решетке MgO . Спектр ЭПР этого эталона состоит из шести линий, далеко отстоящих друг от друга (у Mn 55 спин ядра J = 5 ). Сигналы ЭПР свободных радикалов при одновременной записи этого 2 эталона с исследуемым образцом располагаются между третьей и четвертой линиями в спектре иона двухвалентного марганца. Расстояние между этими линиями равно 86,7 эрстеда. Значения g-факторов третьей и четвертой линии этого эталона получены с высокой точностью из специальных измерений и являются табличными: G3 ( Mn 55 ) = 2.0314, G4 ( Mn +2 ) = 1.9812. Для определения g-фактора производят запись сигнала ЭПР Mn +2 исследуемого образца, в виде смеси веществ или одновременном введении в рабочий резонатор образца и эталона (в виде наклейки, содержащей на ампулу 16 с образцом). Расчетная формула: x1 + x 2 , g 3 x1 + g 4 x 2 где x1 и x 2 − расстояния в мм между компонентами полученного сигнала ЭПР (рис. 7). g x = g3 g Рис. 7. При этих измерениях необходимо учитывать, что ширина компонент сигналов ЭПР Mn +2 не более 1 э, и точные измерения g-фактора возможны только при соответствующей величине амплитуды модуляции (не более 1/3 э). 4. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМПЛИТУД МОДУЛЯЦИИ Величина амплитуды модуляции определяет форму записываемого сигнала ЭПР, т.к. при ее малой величине регистрируется сигнал малой амплитуды, по форме близкой к первой производной зависимости поглощения СВЧ от магнитного поля, в противном случае, когда амплитуда модуляции превышает собственную ширину линии ЭПР, регистрируемый сигнал велик, но по форме не соответствует первой производной сигнала ЭПР. Его ширина и форма определяются амплитудой модуляции, и при амплитуде модуляции большей ширины линии, ширина сигнала ЭПР приблизительно равна 2 Ам. Это обстоятельство используется для оценки амплитуды модуляции конкретного прибора Ам. Для определения значения Ам используется образец, содержащий Mn +2 , производится запись третьей и четвертой компонент сигнала ЭПР при максимальной амплитуде модуляции (рис. 8а), затем амплитуду модуляции уменьшают в заданное число раз (3, 10 и т.д.) и получают новый спектр сигнала ЭПР (Рис. 8 б). Значение 2 Ам может быть получено из x y очевидного соотношения: 2 AM = 86.7 [ э]. 17 Рис. 8. 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ПАРАМАГНИТНЫХ ЧАСТИЦ Концентрацию парамагнитных частиц определяют путем сравнения исследуемого сигнала с сигналом стандарта в тех же условиях. Площадь под кривой поглощения пропорциональна концентрации парамагнитных частиц. При ВЧ модуляции записываемый сигнал — первая производная поглощения. Подсчитав площади под кривыми поглощения, т.е. дважды проинтегрировав кривые исследуемого сигнала S x и стандарта S ст , можно определить концентрацию парамагнитных частиц в исследуемом образце: С x − C ст Sx . S ст В качестве стандартов обычно применяют стабильные радикалы: уже упомянутый дифинилпикрилгидразил, нитроксильные радикалы. Можно использовать и парамагнитные ионы в виде солей: MnSO4 , CuSO4 ⋅ 5H 2 O. При определении концентрации парамагнитных частиц, измерения сигналов исследуемого образца и стандарта нужно проводить в отсутствии насыщения и при одинаковой температуре. Амплитуду модуляции выбирают такой, чтобы получить максимальную величину сигнала, особенно при регистрации слабых сигналов. Условия измерения — положение ампулы или капилляра в резонаторе, материал и размеры ампулы или капилляра, растворители — у стандарта и образца должны быть одинаковыми. Но и при выполнении указанных условий необходимо учитывать, что причиной основной погрешности при этих измерениях может оказаться изменение добротности резонатора при последовательном помещении в него стандарта и образца. Одним из выходов из этого положения может служить использование еще одного эталонного образца, постоянно размещенного в (или на) ампуле для образца и стандарта. В методе "бокового эталона" (рис. 9 ), в толстую ампулу с 18 закрепленным на ней эталоном ( Mn +2 ) последовательно помещают исследуемый и стандартный образцы и производят запись двух спектров ЭПР. Этот приём позволяет учесть изменение общего усиления прибора, вызванное изменением добротности резонатора. Рис.9. Метод "бокового эталона" Площадь под кривой записанного сигнала (первой производной сигнала поглощения) для определения числа парамагнитных частиц необходимо дважды проинтегрировать. Это делают или графическим способом, точность которого весьма мала и может дать удовлетворительный результат только в случае тщательного соблюдения оговоренных выше условий и значительного по величине сигнала от исследуемого образца или при цифровой обработке сигналов ЭПР, используемой в современных компьютеризированных спектрометрах. ПОРЯДОК РАБОТЫ С ЭПР-СПЕКТРОМЕТРОМ РЭ-1306 ОРГАНЫ УПРАВЛЕНИЯ И РЕГУЛИРОВКИ 1. 2. 3. Кнопки переключателя на передней панели приемника "Постоянная времени" изменяют постоянную времени оконечного усилителя (изменяется полоса пропускания ΔF = 1τ ), после которого отфильтрованный от высокочастотной состаляющей (и от высокочастотных шумов) сигнал поступает на осциллограф и самописец. Кнопочный переключатель на передней панели приемника "зона—1, зона—2, зона—3" позволяет подать на отражатель клистрона три различных по амплитуде напряжения частоты 50 Гц и переключить осциллограф в режим наблюдения зоны генерации клистрона. Кнопочный переключатель на передней панели приемника "Настройка" предназначен для подключения выхода усилителей сигнала ЭПР на вход осциллографа при горизонтальной развертке 50 Гц. 19 4. 5. 6. Кнопочный переключатель на передней панели приемника "f—ВЧ" включает канал регистрации первой производной сигнала ЭПР при ВЧ-модуляции (частота 100 кГц). Кнопочный переключатель на передней панели приемника "Сигнал, усиление" позволяет ослаблять сигнал на входе приемника. Каждая кнопка переключателя ослабляет сигнал в 10 раз. Полное ослабление сигнала составляет 104. Ручки переключателей ВЧ и НЧ на модуляторе (модулятор выполнен в виде отдельного блока и закреплен на блоке электромагнита) дискретно изменяют амплитуду низкочастотной и высокочастотной модуляции магнитного поля, а ручка фазовращателя плавно изменяет фазу ВЧ модулирующего напряжения в пределах 0-360°. Настройка прибора: Перед включением радиоспектрометра — установите тумблер "Развертка поля" в положение "откл(ючено)"; — установите ручкой аттенюатора "Мощность СВЧ" на передней панели блока СВЧ по его шкале затухание около 15-10дб; — установите переключатель "Магнитное поле" x1000 в крайнее левое положение ("О"). Настройка радиоспектрометра производится следующим образом: 1. Нажмите кнопку "Зона—3" на приемнике и вращайте ручку "Отражатель клистрона, грубо" до появления на экране осциллографа характеристики зоны генерации клистрона — кривой, напоминающей перевернутую параболу и свидетельствующей о генерации клистрона. 2. Поворачивая ручку вертикального отклонения луча осциллографа, отрегулируйте местоположение зоны генерации на экране. 3. Поместите исследуемый образец в капилляре в рабочий резонатор. 4. Настройте частоту клистрона на частоту рабочего резонатора, вращая ручку "Частота клистрона" (ручка механической перестройки клистрона) на верхней панели блока СВЧ до появления на характеристике зоны генерации клистрона "выреза" от резонатора (см. рис. 10) и установите "вырез" посреди зоны генерации. Рис. 10. Кривые зоны генерации клистрона с "вырезом" рабочего резонатора при регулировке фазы s колебания СВЧ. 20 5. При необходимости: вращая ручку "Опорный канал фаза" на верхней панели блока СВЧ, добейтесь вида кривой, изображенной на рис. 106. 6. Регулируя связь рабочего резонатора с трактом СВЧ ручкой, размещенной на резонаторе, добейтесь совпадения острия "выреза" с осевой линией у основания зоны (рис. 11 в). Рис. 11. Кривые зоны генерации клистрона при регулировке связи резонатора с трактом СВЧ. 7. Нажимая кнопку "Зона-2", а затем кнопку "Зона-1" на приемнике, уменьшите амплитуду напряжения частоты 50 Гц, подаваемого на отражатель клистрона. Одновременно, поворачивая ручку "Отражатель клистрона, плавно" на приемнике, установите "вырез" от резонатора в центре экрана осциллографа; при этом ширина "выреза" должна ступенями увеличиваться, а глубина его уменьшаться, как показано на рис. 12 - кривые а, б, в. Рис. 12. Характеристики зоны генерации клистрона. 8. Нажмите кнопку "Настр." на приемнике, при этом на отражатель клистрона вместо напряжения с частотой 50 Гц будет подано напряжение частоты 10 кГц, необходимое для работы системы АПЧ; стрелка прибора "Ошибка АПЧ" на-блоке СВЧ отклонится от нулевого положения и на экране осциллографа будут видны шумы тракта усилителя при развертке 50 Гц. 9. Произведите точную настройку тракта СВЧ, для чего: 21 — ручкой "Отражатель клистрона, плавно " установите на нуль стрелку прибора "Ошибка АПЧ", — регулируя связь рабочего резонатора с трактом СВЧ ручкой на резонаторе добейтесь нулевых показателей прибора "Ток смесителя". 10. Нажмите кнопку "Работа" на приемнике, при необходимости: регулировка мощности СВЧ. — Увеличивайте мощность СВЧ, поворачивая ручку "Мощность СВЧ" на блоке СВЧ, и наблюдайте за показаниями прибора "Ток смесителя ". При отклонениях стрелки более, чем на 2 больших деления, вращая ручку "Опорный сигнал, фаза" на верхней панели блока СВЧ, добейтесь максимальных показаний прибора. — Регулируйте связь рабочего резонатора с трактом СВЧ ручкой на резонаторе и добейтесь нулевых показаний прибора "Ток смесителя". При необходимости следует подстраивать фазу СВЧ. — При снятии спектров в диапазоне мощностей рекомендуется начинать с максимального уровня, уменьшая мощность ступенями по 6 дб и при необходимости подстраивая фазу ручкой "Опорвый канал, фаза". ВЫПОЛНЕНИЕ РАБОТЫ 1. Ознакомиться с инструкцией о порядке работы с ЭПР-спектрометром. 2. Выбрать условия регистрации сигналов ЭПР и записать сигналы ЭПР эталонного образца Mn +2 в MgO: — провести измерения и построить график зависимости ширины третьей компоненты сигнала Mn +2 от величины амплитуды модуляции; — оценить максимальную амплитуду модуляции спектрометра; — исследовать зависимость амплитуды третьей компоненты сигнала ЭПР Mn +2 в MgO от уровня мощности СВЧ. Уровень мощности СВЧ менять через 6 дб. Построить график зависимости амплитуды третьей компоненты сигнала от уровня мощности СВЧ. 3. Изучить зависимость параметров сигнала ЭПР Мп+2 от концентрации водного раствора МпС12 и амплитуды модуляции. Воспользоваться готовыми растворами МпСЬ различной молярности (0,01 М; 0,05 М; 0,1 М; 0,2 М). ВОПРОСЫ 1. 2. Как можно объяснить явление ЭПР на основе классических представлений. Как зависит предел по чувствительности для обнаружения радикалов от числа линий в сигнале ЭПР этих радикалов. 22 3. 4. 5. 6. 7. Нарисовать жидкофазные спектры ЭПР радикаловCH 3 ,−CH 2 − CH 3 , анион-радикала атома бензола. Объяснить различия спектров ЭПР иона Mn +2 в MgO и в водном растворе MnCl 2 . Нарисовать теоретическую зависиость амплитуды сигнала ЭПР иона Mn +2 от мощности СВЧ. Как зависит ширина линии и амплитуда сигнала ЭПР от амплитуды модуляции. Как чувствительность ЭПР изменяется с увеличением используемого магнитного поля. РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 1. Ингрем Д. Электронный парамагнитный резонанс в биологии. -М: Мир, 1972. 2. ВертцДж., Болтон Дж. Теория и практические приложения метода ЭПР. - М.: Мир., 1975. 3. Блюменфельд Л.А., Воеводский В. В., Семенов А. Г. Применение электронного парамагнитного резонанса в химии. -Новосибирск, 1962. 4. Лихтенштейн Г. И. Метод спиновых меток в молекулярной биологии.М.: 1974. 5. Свободные радикалы в биологии. Под ред. У. Прайора-М.: 1979 Т. 1,2. 6. Методические указания к лабораторным работам по курсу: Физические методы исследования в физико-химической биологии. "Элементы СВЧтехники", МФТИ. - М.: 1989, 36 с. 7.Современные методы биофизических исследований: Практикум по биофизики. Под ред. А. Б. Рубина. - М.: Высш. шк., 1988,359с. 23
