Влияние комбинированного введения L–триптофана и

Золотухин М.М., Дорошенко Е.М., Смирнов В.Ю.,
ГрГМУ, ЦНИЛ
Влияние комбинированного
введения L–триптофана и
вальпроевой кислоты на показатели
гидроксилазного пути обмена
триптофана в эпифизе крыс на
интактном фоне и при хронической
алкогольной интоксикации
Мы исследовали влияние внутрижелудочного введения (7 дней) комбинации
L–триптофана (100мг/кг) с вальпроевой кислотой (400мг/кг) при хронической алкогольной интоксикации (14 недель) и на интактном фоне на показатели гидроксилазного
пути обмена L–триптофана (темновая фаза нормального светового цикла) в эпифизe
крыс. Установлено, что при сочетанном введении триптофана с вальпроатом на интактном фоне, как и при алкогольной интоксикации, ингибировалось метилирование
конечного продукта обмена окислительной ветви катаболизма серотонина, что отражалось на снижении уровня 5–метоксииндолуксусной кислоты. Сочетанное введение
L–триптофана с вальпроатом на фоне ХАИ не устраняло эффектов этанола в эпифизе,
усиливало ингибирующее действие на реакции О–метилирования в железе, тогда как,
прием триптофана оказывал корригирующее действие на этот процесс и тем самым
нормализовывал показатели гидроксилазного пути обмена триптофана в эпифизе.
„ ВВЕДЕНИЕ
Гидроксилазный путь обмена L–триптофана является источником
синтеза
5–гидрокситриптамина и мелатонина, вовлекаемых в регуляцию
разнообразных нейрохимических процессов [1]. Снижение функциональной активности этого метаболического пути в ЦНС сопровождается развитием ряда психоневрологических расстройств [1, 14]. Среди лекарственных средств, зарегистрированных в РБ, способных повышать
активность этой метаболической цепи, L–триптофан обладает низкой
60
Экспериментальное исследование
токсичностью и незначительными побочными эффектами [5, 14]. Он оказывает снотворное, антиалкогольное и антинаркотическое действие,
эффективен при депрессивном синдроме, снижает острую токсичность
этанола [7,14], способен стимулировать серотонинергическую и мелатонинергическую системы головного мозга.
Так, применение зарегистрированного в PБ лекарственного средства, содержащего вальпроевую кислоту (Депакин/VaLproic acid) – соединения, являющегося эффективным противосудорожным средством
[5], способным увеличивать оборот 5–гидрокситриптамина (5–HT) в
некоторых отделах головного мозга [10], с аминокислотами оказывает
стимулирующий эффект на серотониновую систему при маниях, стрессе, аффективных расстройствах, алкогольной интоксикации и синдроме
отмены этанола [9].
Таким образом, может считаться целесообразным сочетанное использование
L–триптофана и вальпроевой кислоты (VPA), поскольку хроническая
алкогольная интоксикация (ХАИ) сопровождается угнетением функционирования серотонинергической [6] и мелатонин–продуцирующей
[13] систем головного мозга. Применение первого агента на фоне ХАИ
обосновано, так как он выступает в качестве предшественника в синтезе серотонина [1, 3], а второго – в качестве стимулятора оборота этого
моноамина [10] и нейропротектора [8] в головном мозге.
Данные, касающиеся эффектов L–триптофана и VPA в отношении
метаболизма триптофана в эпифизе, единичны и носят фрагментарный
характер, а для комбинированного введения этих веществ вовсе отсутствуют. Стоит отметить, что для оценки эффектов сочетанного введения
необходимо учитывать синхронизацию биоритмов с внешним освещением, поскольку синтез N–ацетилсеротонина и мелатонина в эпифизе
активен в ночное время.
„ ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Оценить влияние сочетанного внутрижелудочного введения L–
триптофана и вальпроевой кислоты на показатели гидроксилазного
пути обмена триптофана в эпифизе крыс на интактном фоне и при хронической интоксикации этанолом.
„ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовалось 40 белых беспородных крыс–самцов массой 150–200 г, которые содержались на стандартном рационе вивария,
после фотоадаптации (2 недели). Во время всего эксперимента крыс
содержали при нормальном световом цикле (12 ч/12 ч, 9:00 – 21:00 ч.).
Хроническую алкогольную интоксикацию моделировали в течение
14 недель, используя 20% раствор этанола в качестве единственного
источника питья [4]. Средняя доза этанола за весь период алкоголизации составила 8,3 ± 0,3 г/кг (по данным регистрации потребления).
Опытным группам в течение 7 дней внутрижелудочно вводили 0,5%
раствор L–триптофана (100 мг/кг) [1] в 11:00 ч, а группе, получавшей
дополнительно вальпроевую кислоту (400 мг/кг) [1] ее вводили в 20:00
ч. Интактному контролю и контролю, получавшему этанол, вводили эквиобъемные количества изотонического раствора хлорида натрия. Де«Рецепт» № 1 (63), 2009
61
Перспективным
направлением
является
комбинированное
использование
аминокислот с
препаратами,
способными изменять
функциональное
состояние
гидроксилазного пути
обмена триптофана.
Влияние комбинированного введения L–триптофана и вальпроевой кислоты на показатели гидроксилазного
пути обмена триптофана в эпифизе крыс на интактном фоне и при хронической алкогольной интоксикации
капитацию проводили в 23:00 ч, спустя 3 ч после последнего введения
VPA. Эпифизы быстро извлекали и помещали в жидкий азот. Гомогенизацию биологического материала производили тефлоновым пестиком
в фиксированном объеме 100 мкл экстракционной среды, содержащей
0,2 М хлорную кислоту, 25 мг/л ЭДТА и 1 мкМ ванилиновую кислоту (VA)
(внутренний стандарт). Центрифугировали 15 мин при 20000 g (4ºС). Супернатанты замораживали и хранили при –78°С.
В работе использовали L–триптофан (Sigma, США), препарат
«Орфирил», содержащий 60 мг/мл вальпроевой кислоты (Pharmacia).
Для приготовления подвижных фаз использовали ацетонитрил, метанол (Merсk, Германия), КН2РО4, ЭДТА (ReanaL, Венгрия), октилсульфонат
натрия, гептилсульфонат натрия (Элсико, Россия), уксусную кислоту,
хлорную кислоту хч (НеваРеактив, Россия) и этанол квалификации не
ниже хч.
В качестве стандартов применяли серотонин креатинин–сульфат
(5–HT), триптамин (Trn), N–ацетилтриптофан (NAT) (ReanaL, Венгрия),
L–триптофан (Trp), мелатонин (MeL), 5–гидроксииндолуксусную кислоту (5–HIAA), N–ацетилсеротонин (NAS), ванилиновую кислоту (VA),
5–метоксииндолуксусную кислоту (5–MIAA), 5–гидрокситриптофан
(5–HTP) (Sigma, США). Тридистиллированную воду для подвижных фаз
пропускали через патрон «Norganic» (MiLLipore, США), подвижные фазы
Таблица 1
Содержание триптофана и его метаболитов в эпифизе крыс после введения L–триптофана
(100 мг/кг) и его сочетания с вальпроевой кислотой (400 мг/кг) при хронической алкогольной
интоксикации и на интактном фоне (нмоль/эпифиз), среднее ± средняя ошибка среднего
Показатели
Trp
5–HTP
5–HT
5–HIAA
NAS
MeL
Trn
NAT
5–MIAA
Контроль
Trp+ VPA
ХАИ
0,0224 ±
0,0026
0,0014 ±
0,0004
0,0635 ±
0,0215
0,0036 ±
0,001
0,00070 ±
0,00018
0,00031 ±
0,00007
0,00014 ±
0,00003
0,00013 ±
0,00002
0,0051 ±
0,0011
0,01845 ±
0,00275
0,00118 ±
0,00024
0,10525 ±
0,02725
0,00593 ±
0,00125
0,00037 ±
0,00005
0,00019 ±
0,00005
0,00010 ±
0,00003
0,00011 ±
0,00003
0,003 ±
0,0007*
0,0256 ±
0,0047
0,0012 ±
0,0003
0,061 ±
0,019
0,0043 ±
0,0013
0,0010 ±
0,0005
0,00033 ±
0,00013
0,00016 ±
0,00007
0,00014 ±
0,00005
0,0029 ±
0,0004*
П р и м е ч а н и е : p<0,05, * – в сравнении с контролем, † – в сравнении с ХАИ
62
ХАИ +
Trp
0,0239 ±
0,0030
0,00109±
0,00020
0,08823 ±
0,01825
0,005 ±
0,001
0,00059 ±
0,00025
0,00022 ±
0,00005
0,00010 ±
0,00002
0,0025 ±
0,00003
0,00418 ±
0,00123 †
ХАИ +
Trp + VPA
0,029 ±
0,002
0,00118 ±
0,00014
0,105 ±
0,0233
0,0057 ±
0,001
0,00043 ±
0,00011
0,00012 ±
0,00003* †
0,000052 ±
0,000009
0,000077 ±
0,000012
0,0019 ±
0,00018*
Экспериментальное исследование
фильтровали через мембранный фильтр 0,22 мкм. Определения проводили методом изократической обращено–фазовой ВЭЖХ на хроматографе AgiLent 1100. Колонка 3 х 250 мм Separon SGX C18, 8 мкм (Элсико,
Россия) термостатировалась при 30°С, скорость потока 0,5 мл/мин. Введение образцов осуществлялось автосамплером, объем 20 мкл. Детектирование по природной флуоресценции 280/340 нм. Для определения
Trp, 5–HTP, 5–HT и 5–HIAA использовали подвижную фазу, содержащую
0,1 М KH2PO4, 17 мМ уксусной кислоты, 25 мг/л ЭДTA, 1 мМ гептилсульфоната натрия, 0,8 мМ октилсульфоната натрия и 11 % метанола (об.) [3].
Определение NAS, NAT, Trn, 5–MIAA и MeL проводили по методу [2]. Интегрирование и расчет содержания триптофана и его метаболитов проводили с помощью программы ChemStation версии А.10.01. Статистическая обработка данных (описательная статистика, корреляционный,
дисперсионный (LSD – test) и дискриминантный анализы) проводилась
с помощью пакета Statistica 7.0.
„ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Сочетанное введение Trp и VPA на интактном фоне, подобно хронической алкогольной интоксикации, приводило к снижению уровня
5–MIAA в эпифизе относительно контроля. Введение Trp на фоне ХАИ
повышало содержание 5–MIAA в железе относительно группы ХАИ, тогда как комбинация этой аминокислоты с вальпроатом снижала концентрацию MeL в сравнении с контролем и ХАИ, а уровень 5–MIAA оставался сниженным относительно контроля (таблица 1).
В эпифизе после сочетанного введения Trp с VPA имело место снижение содержания 5–MIAA и тенденция к снижению уровня NAS, сопровождавшееся появлением корреляционных связей Trp–5–HT (r
=0,71), 5–HTP–5–HT (r = 0,79), 5–HTP–5–HIAA (r = 0,79), 5–HT–5–HIAA (r
= 0,82, р< 0,05 ) с параллельно отмечаемой тенденцией к увеличению
уровня 5–HIAA. Отмечаемая тенденция снижения N–ацетилирования
5–гидрокситриптамина и торможение О–метилирования конечного
продукта окисления этого моноамина, возможно, может объясняться
опосредованным действием L–триптофана потенцированное VPA на
активность арилалкиламин–N–ацетилтрансферазы через вовлечение
5–HT в аутокринный механизм частичного ингибирования [15]. О регуляции активности гидроксииндол–О–метилтрансферазы известно
очень мало, однако, точно установлено, что превращение индоламинов в метоксииндолы регулируется изменением экспрессии ее мРНК,
либо через изменение кинетических характеристик метилтрансферазы [12, 11]. Возможно, в нашем случае мог иметь место один из этих
механизмов.
Хроническая алкогольная интоксикация сопровождалась появлением корреляционной связи между уровнями 5–HT и NAS в эпифизе (r =
0,92) и ослаблением связи Trn–5–MIAA (r = 0,82 против r = 0,90) на фоне
снижения содержания 5–MIAA. Такие изменения свидетельствуют о перераспределении потока 5–HT между ацетилирующей и окислительной
ветвями, снижая метилирование конечного продукта последней.
Введение триптофана на фоне ХАИ повышало значение коэффициента корреляции уровней 5–HT и NAS в эпифизе (r = 0,97 против 0,92 при
ХАИ). Ослабевали корреляционные связи NAT–Trn (r = 0,86), MeL–Trn (r =
«Рецепт» № 1 (63), 2009
63
Это свидетельствует
об увеличении
потока триптофана
по гидроксилазному
пути, сопровождаемое
снижением
относительной
значимости
N–ацетилирующей
ветви катаболизма
серотонина.
Влияние комбинированного введения L–триптофана и вальпроевой кислоты на показатели гидроксилазного
пути обмена триптофана в эпифизе крыс на интактном фоне и при хронической алкогольной интоксикации
Таким образом, данные
дискриминантного
анализа подтверждают
гипотезу, что введение
триптофана при ХАИ
и его комбинация
при интоксикации
этанолом и вводимая
на интактном фоне
модифицирует
метилирование
5–HIAA.
0,87), MeL–NAT (r = 0,90), против 0,99, 0,91 и 0,94 соответственно. Увеличивалось содержание 5–MIAA и появлялась связь уровней Trp–5–MIAA
(r = 0,83). Это означает, что происходило перераспределение потока Trp
между гидроксилазным и минорными путями, сопровождаемое увеличением О– метилирования 5–HIAA. В целом, триптофан оказывал корригирующее действие при ХАИ в отношении уровня 5–MIAA.
После комбинированного введения Trp с VPA на фоне ХАИ в эпифизе снижение уровня 5–MIAA, возможно, было связано с угнетением
метилирования 5–HIAA. Кроме того, в эпифизе снижалось содержание MeL, которое, возможно, могло быть связанно с угнетением его
синтеза через вовлечение в ингибирующий механизм 5–HT [15].После
введения комбинации Trp c VPA при ХАИ и интактном фоне, линейно–
дискрименантный анализ показал, что наиболее информативным показателем был уровень 5–HIAA (Fиксл = 4,393435, р = 0,012151), тогда как
наиболее значимыми показателями в эпифизе при оценке эффектов в
группах, получавших триптофан и его комбинацию с VPA на фоне ХАИ
были 5– HIAA (Fискл = 3,155288, р = 0,041656) и 5–MIAA ( Fискл = 4,913549, р
= 0,007770 соответственно).
„ ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Хроническая алкогольная интоксикация (14 недель, 8,3 ± 0,3 г/
кг) сопровождается в темновую фазу нормального светового цикла в
эпифизе крыс, перераспределением потока 5–гидрокситриптамина
между N–ацетилирующей и окислительной ветвями, угнетая метилирование конечного продукта последней, приводя к снижению уровня
5–метоксииндолуксусной кислоты.
Внутрижелудочное введение раствора L– триптофана (7 дней, 100
мг/кг) на фоне хронической алкогольной интоксикации в эпифизе крыс,
приводит в темновую фазу к перераспределению потока триптофана
между гидроксилазным и минорными путями его обмена, сопровождаемое увеличением О–метилирования 5–гидроксииндолацетата, приводящее к повышению уровня 5–метоксииндолуксусной кислоты, оказывая тем самым корригирующее действие в отношении последней.
Сочетанное внутрижелудочное введение L–триптофана (100 мг/
кг) с вальпроевой кислотой (400мг/кг) в течение 7 дней на фоне продолжительной интоксикации этанолом в эпифизе сопровождается в
темновую фазу снижением уровней 5–метоксииндолуксусной кислоты
и мелатонина, связанная с угнетением активности гидроксииндол–О–
метилтрансферазы и/или арилалкиламин–N–ацетилтрансферазы потенцированное вальпроевой кислотой.
Внутрижелудочное сочетанное введение триптофана с вальпроевой
кислотой (7 дней, в тех же дозах) на интактном фоне снижает содержание 5–метоксииндолуксусной кислоты в эпифизе крыс в темновую фазу,
ввиду потенцирования эффектов триптофана вальпроевой кислотой.
64
Экспериментальное исследование
„ ЛИТЕРАТУРА
1. Влияние комбинированного введения L– триптофана и вальпроевой кислоты на уровни
триптофана и метаболитов гидроксилазного пути его обмена в структурах головного мозга крыс в темновую фазу нормального светового цикла / М.М. Золотухин [ и др.] // Вестник
Фармации. – 2008. – Т. 40, № 2. – С. 83 – 88.
2. Золотухин, М.М. Метод определения метаболитов гидроксилазного пути обмена триптофана в эпифизе крысы с помощью ион – парной хроматографии с детектированием по
флуоресценции / М.М. Золотухин, Е.М. Дорошенко // Журнал ГрГМУ. – 2007.– № 2.– С.25–28.
3. Золотухин, М.М. Эффекты триптофана вводимого в темновую фазу на содержание метаболитов гидроксилазного пути обмена триптофана в плазме крови и в головном мозге крыс
/ M.M. Золотухин, Е.М. Дорошенко, В.Ю. Смирнов // Журнал ГрГМУ . – 2008.– Т.23, № 3. –
С.57–61.
4. Островский, Ю.М. Аминокислоты в патогенезе, диагностике и лечении алкоголизма / Ю.М.
Островский, С.Ю. Островский. – Мн.: Навука i тэхнiка, 1995. – С. 62–63.
5. Справочник ВИДАЛЬ Лекарственные препараты в Беларуси: Справочник М.: АстраФармСервис, 2007.– С. 235, 548.
6. Badawy, A.A.–B. Tryptophan metaboLism in aLcohoLism / A.A.–B. Badawy // Adv. Exp. Med. BioL.
– 1999. – VoL. 467. – P. 265–274.
7. BakaLian, M.J. Effects of L–tryptophan and other amino acids on eLectroencephaLographic
sLeep in the rat / M.J. BakaLian, J.D. Fernstrom // Brain. Res. – 1990. – VoL. 528, N 2. – Р. 300–307.
8. Castro, L M. NoveL targets for vaLproic acid: up–reguLation of meLatonin receptors and
neurotrophic factors in C6 gLioma ceLLs/ L.M. GaLLant, L.P.NiLes //.J Neurochem. – 2005. – VoL.
95, N 5. – P.1227–1236.
9. Effects of subchronic treatment with vaLproate on L–5–HTP–induced cortisoL responses in
mania: evidence for increased centraL serotonergic / M. Maes [et aL.] // Psychiatry. Res. – 1997.
– VoL. 71, N 2. – P. 67–76.
10. Loscher, W. VaLproate and its major metaboLite E–2–en–vaLproate induce different effects on
behaviour and brain monoamine metaboLism in rats / W. Loscher, D. Honack // Eur. J. PharmacoL.
– 1996. – VoL. 299, N 1–3. – P. 61–67.
11. Morton, D.J. HydroxyindoLe–O–methyLtransferase cataLyses production of methoxyindoLes in
rat pineaL gLand dependent on the concentration of hydroxy precursors and their affinity for
the enzyme / D.J. Morton // J. EndocrinoL. – 1987. – VoL.115, N 3. – P. 455–458.
12. PhotoneuraL reguLation of rat pineaL hydroxyindoLe–O–methyLtransferase (HIOMT) messenger
ribonucLeic acid expression: an anaLysis of its compLex reLationship with HIOMT activity/ C.
RibeLayga [et aL.] // EndocrinoLogy. – 1999. – VoL.140, N 3. – P. 1375– 1384.
13. PineaL function during ethanoL intoxication, dependence, and withdrawaL / H.B. Moss [et aL.] //
Life Sci. – 1986. – VoL.39, N23. – 2209 –2214.
14. Sandyk,R. L–tryptophan in neuropsychiatry disorders: a review / R. Sandyk // Int. J. Neurosci.–
1992.– VoL.67, N1– 4.– P.127– 144.
15. Tryptophan administration inhibits nocturnaL N–acetyLtransferase activity and mеLatonin
content in the rat pineaL gLand. Evidence that serotonin moduLates meLatonin production via
a receptor–mediated mechanism / R.J. Reiter [et aL.] // NeuroendocrinoLogy. – 1990. – VoL. 52,
N 3. – Р.291–296.
«Рецепт» № 1 (63), 2009
65