Место маркировки образца

2.2.1. Иммуноцитохимия.
Иммуноцитохимический
метод
выявления
поверхностных
маркеров лимфоцитов основан на специфичности иммунологической
реакции антиген-антитело и чувствительности световой микроскопии.
Для выявления антигена на клетке использованы немеченые антитела, а
образующийся иммунный комплекс выявлен с помощью антител,
конъюгированных с ферментом-меткой. Использование одного фермента
пероксидазы хрена создавало возможность выявления на клетке только
одного антигена. Для реализации этого метода на подготовленные
предметные стекла наносят суспензию мононуклеаров, полученную
путем градиентного центрифугирования.
Для хранения чистых предметных (Menzel-Glaser, 76х26 мм) и
покровных (18х18 мм или 24х24 мм) стекол был использован
изопропиловый спирт или смесь Никифорова (смесь 96˚ этилового спирта
и эфира для наркоза в соотношении объем/объем). Для получения
возможности выявления на одном предметном стекле (с нанесенной
суспензией
мононуклеаров)
различных
клеточных
антигенов
был
использован парафильм (ParafilmM, Serva, Feinbiochemica) (рис. 1),
нарезанный в соответствии с размером предметного стекла. Затем в нем
были
пробиты
отверстия,
и
каждый
такой
прямоугольник
был
освобожден от бумажной основы и наложен на предметное стекло.
Плотное прикрепление
парафильма
к
предметному
стеклу
осуществлено с помощью нагревания над пламенем спиртовки.
Место
маркировки
образца
Рис.1. Предметное стекло с лунками для нанесения суспензии клеток
было
Для увеличения адгезирующей способности предметных стекол, на
которые предполагалось наносить суспензию мононуклеаров, были
использованы различные вещества, самыми надежными из которых в
рамках нашего исследования были поли-L-лизин и производные силана.
Для нанесения на лунки предметных стекол концентрированный раствор
поли-L-лизина (1 мг на 10 мл раствора Хэнкса) (Poly-L-lysin,
молекулярный вес более 70 КД, ICN) разведен бидистиллированной
водой в соотношении 1:20 для получения раствора рабочей концентрации.
Рабочий раствор поли-L-лизина был нанесен на лунки в объеме 20 мкл,
после чего стекла были инкубированы до полного высыхания при 37ºС.
Рабочий раствор Novobond Slide Tissue Adhesive (Novocastra) был
подготовлен согласно рекомендациям фирмы-производителя: 7 мл
концентрата были разведены в 350 мл ацетона. Полученный объем
адгезива позволил обработать до 500 предметных стекол.
Для фиксации суспензии мононуклеаров на предметных стеклах
был использован холодный ацетон (+4ºС) марки ЧДА (Реактив, СПб, РФ).
Для выявления поверхностных маркеров иммунокомпетентных
клеток использованы различные варианты буферов рН 7,2-7,4:
• PBS (phosphate buffered saline, DAKO), при разведении которого
бидистиллированной водой (1 л) получаемый раствор соответствовал
50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl и был готов к использованию;
• TBST (Tris Buffered Saline Containing Tween, 10x concentrate, DAKO),
при
разведении
которого
бидистиллированной
водой
(1:10)
получаемый раствор соответствовал 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl,
0,1% Tween 20 и был готов к использованию;
• Трис-буфер концентрированный (NaCl 5,8 г; Tris 6,0 г; ac.bidest ad
1000 мл с последующим доведением рН до 7,2-7,4 25% раствором
HCl), при разведении которого физиологическим раствором (1:4)
получаемый раствор соответствовал 50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl и
был готов к использованию.
При использовании пероксидазной метки для выявления продукта
реакции в качестве хромогенов были применены диаминобензидин (ДАБ)
и аминоэтилкарбозол (АЭК). Для приготовления ДАБ, формирующего
коричнево-черное окрашивание конечного продукта на месте целевого
антигена, были использованы следующие варианты подготовки рабочего
раствора:
• ДАБ (SERVA Gmb; 3,3-Diamino-benzidine4HCl, research grade) 6 мг в
10 мл 0,05М Трис-буфера (рН 7,6), раствор профильтрован и
соединен со 100 мкл свежеприготовленной 3% перекиси водорода.
Подготовленный таким образом раствор хранению не подлежал и был
использован в течение 2-х часов после приготовления;
• Liquid DAB Substarte-Chromogen System (DAKO) был приготовлен
согласно
рекомендациям
фирмы-производителя
и
мог
быть
использован в течение 2-х недель после приготовления при условии
хранения при +4ºС.
АЭК формирует красно-коричневый конечный продукт реакции в
месте целевого антигена. Так как N,N-диметилформамид, используемый
для растворения АЭК опасен при вдыхании и при попадании внутрь, нами
был использован готовый к использованию раствор АЭК: AEC substratechromogen (DAKO), содержавший содержит 0,75 мг/мл 3-амино-9этилкарбозола в 2,5% растворе N,N-диметилформамида и 50 мМ
ацетатного буфера, рН 5,07.
В качестве водорастворимой среды для заключения препаратов
были
применены
водные
смеси
глицерина
и
желатина,
перед
использованием нагретые до 50-60ºС: глицерин-желатин (смесь 20%
водного раствора желатина с равным объемом глицерина) либо Glycergel
(DAKO).
При иммуноцитохимическом выявлении поверхностных маркеров
лимфоцитов были использованы:
• специфические моноклональные антитела к CD3 (UCHT1), CD4
(MT310), CD8 (DK25), CD20 (B-Ly1), CD22 (4KB128), CD25 (ACT-1),
CD56 (T199, MOC-1), HLA-DP,DQ,DR (CR3/43), соответствующий
изотипический IgG1 (DAKO) и положительный контроли CD45 (HLe1) (BD);
• системы визуализации LSAB, LSAB Plus, EnVision с пероксидазой
хрена в качестве фермента-метки (DAKO);
• хромогены ДАБ или АЭК;
• водорастворимая заключающая среда.
Подготовка предметных стекол для визуализации мембранных маркеров
лимфоцитов:
• нанесение 20 мкл суспензии мононуклеаров в каждую лунку
подготовленных предметных стекол, инкубация в термостате (37ºС)
до полного высыхания (45-90 мин);
• фиксация клеток холодным (+4ºС) ацетоном в течение 10 минут.
Для хранения каждые два стекла были помещены в контейнер
(микрокамеры для иммунологических исследований Терасаки), края
которых затем были заклеены парафильмом. Такая подготовка позволяла
хранить фиксированные на стеклах мононуклеары при -20ºС до трех
месяцев.
Собственно выявление специфических антигенов на поверхностной
мембране
клеток
было
осуществлено
с
помощью
стрептавидин-
биотиновых или декстрановых систем визуализации (LSAB, LSAB Plus,
EnVision). Стрептавидин-биотиновый метод включало в себя несколько
этапов:
1. Размораживание без доступа открытого воздуха (не вынимая из
контейнера) в течение 20 минут при комнатной температуре (18-22ºС).
2. Повторная фиксация холодным ацетоном (+4ºС) в течение двух минут.
Все последующие инкубации были проведены во влажной камере при
комнатной температуре 18-22ºС.
3. Нанесение раствора моноклональных антител в рабочем разведении в
объеме 20 мкл, длительность инкубации 30 минут.
4. Отмывка несвязавшихся белков была осуществлена при инкубации с
трис-буфером (рН 7,2-7,4) трижды по три минуты с обязательной сменой
раствора.
5.
Нанесение
раствора
биотинилированныех
антимышиных
иммуноглобулинов на каждую лунку в объеме 20 мкл, длительность
инкубации 10 минут.
6. Отмывка несвязавшихся белков была проведена аналогично п.4.
7. Нанесение раствора стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой
на каждую лунку в объеме 20 мкл, длительность инкубации 10 мин.
8. Отмывка несвязавшихся белков была проведена аналогично п.4.
9. Хромоген был нанесен в избытке (до 30 мкл на каждую лунку),
длительность инкубации 5-10 минут под контролем зрения.
10. Хромоген был смыт дистиллированной водой, после чего для
контрастирующего докрашивания препаратов на лунки была нанесена
водорастворимая краска: при использовании метиленового зеленого
инкубация составляла 20 минут, при использовании гематоксилина
Каррацци - 2 минуты.
Краска была смыта в двух последовательных сменах проточной воды.
11. Заключение препаратов в водорастворимую заключающую среду
было осуществлено после удаления парафильма, избегая высыхания
лунок.
Выявление специфических антигенов на поверхностной мембране
клеток с помощью системы визуализации EnVision было осуществлено
аналогично, но вместо биотинилированных антител и стрептавидина,
соединенного с пероксидазой, была нанесена синтетическая молекула,
несущая на себе антитела к иммуноглобулинам мыши и молекулы
пероксидазы. Длительность инкубации составила 10 минут. Отмывка
несвязавшихся
реагентов
была
осуществлена
аналогично
п.4,
а
дальнейшая реализация метода была осуществлена согласно пунктам 912.
При иммуноцитохимическом методе выявления поверхностных
антигенов рабочее разведение специфических антител было подобрано
таким образом, чтобы визуализировать целевые антигены в отсутствие
неспецифического
оптимального
фонового
разведения
окрашивания.
антител
При
определении
специфичность
выявления
определяемого антигена и выраженность фонового окрашивания была
оценена с помощью балльной шкалы (от отрицательной до ярко
выраженной) (табл. 21).
Таблица 21
Балльная оценка специфического и фонового окрашивания
Специфическое
Баллы
Фоновое окрашивание
окрашивание
Яркое, отчетливое
4
Выраженное,
не
позволяет
учитывать
специфическое окрашивание
Достаточно
3
интенсивное
Хорошее
Выраженное,
позволяет
выявлять
специфическое окрашивание
2
Слабое, не мешает оценивать специфическое
окрашивание
Очень слабое
1
Очень слабое
Отсутствует
0
Отсутствует
Титрование каждого специфического антитела было осуществлено
отдельно и включало:
• подготовку предметных стекол-образцов с суспензией клеток со
сквозной нумерацией (№ 1-5);
• определение диапазона разведения конкретного антитела, наиболее
перспективного в диагностическом плане, например, 1:50, 1:100,
1:200;
• инкубацию первого, второго и третьего образцов с антителами в
разведении 1:50, 1:100, и 1:200 соответственно. Образцы №4 и №5
были использованы для проведения положительного (CD45) и
отрицательного (изотипического) контроля постановки;
• дальнейшее
проведение
использования
выявления
системы
антигенов
визуализации
для
по
протоколу
всех
образцов
одновременно.
Учет результатов титрования был проведен только в случае
положительного окрашивания практически все клеток образца №4 и
отсутствия положительно окрашенных клеток в образце №5.
При микроскопии был идентифицирован окрашенный продукт
иммуноферментной реакции, образовавшийся в местах связывания
выявляемых
антигенов. Учет результатов был проведен в световом
микроскопе при суммарном увеличении х900 (окуляры х15, объектив
х60). Окрашивание было расценено как положительное, если окрашенный
продукт реакции занимает не менее трети окружности клетки (рис.2). В
каждом препарате было учтено не менее 200 лимфоцитов и определен
процент положительно окрашенных клеток.
А
Б
В
Г
Рис.2. Схематическое изображение результатов иммуноцитохимического
выявления
поверхностных
маркеров
лимфоцитов
при
световой
микроскопии.
А – отсутствие специфического связывания: на поверхностной мембране
отсутствует окрашенный продукт реакции. Б – окрашенный продукт
реакции занимает не менее трети длины окружности клетки. В – при
низкой плотности рецептора окрашенный продукт реакции располагается
в виде гранул по поверхностной мембране клетки. Суммарно продукт
реакции занимает не менее трети длины окружности клетки. Г – при
кэппировании рецептора окрашенный продукт реакции расположен
концентрировано на одной стороне мембраны клетки.