Ферментные электроды в аналитической химии Проф. Дж.Паллески Dipartimento Scienze e Tecnologie Chimiche Università di Roma Tor Vergata Italia UNIVERSITY OF ROME TOR VERGATA ГРУППА B.E.A.T. Группа биоэлектроанализа университета Тор Вергата www.uniroma2.it/dipartim/BEAT Лаборатория аналитической химии Биосенсоры Иммуносенсоры Электроанализ В медицине Пищевая Пищевой промышленность промышленности Экология Экологии l Новые материалы / Медиаторы (углеродные нанотрубки берлинская лазурь и др.) СОДЕРЖАНИЕ Î Ферменты для аналитической химии Î Клинический анализ Î Анализ продуктов питания Î Экологический мониторинг Î Заключение Аналит Биологический Преобразователь сигнала компонент (фермент) Считывающее устройство Амперометрические сенсоры Кислородный электрод Электрод Кларка: ¾ Катод (рабочий электрод): платина, золото ¾ Анод (элеткрод сравнения) Ag/AgCl, Pt = катод Анод = Ag/AgCl O2 + 4H++ 4e- → 2 H2O 4Ag + 4Cl-→ 4AgCl + 4e- Сенсоры H2O2 Реакция анодного окисления пероксида водорода: H2O2 → O2 +2H+ +2eВместо газопроницаемой мембраны кислородного электрода используется мембрана из ацетата целлюлозы, пропускающая частицы с массой 100-150 Дальтон. Это позволяет диффузию сквозь мембрану небольших молекул и уменьшает возможное мешающее влияние полимерных частиц. Сенсоры NAD(P)H NAD(P)H участвует в реакциях, катализируемых ферментами класса окисдоредокутаз. При этом образуется NAD(P)H, который может прямо окисляться на электроде или участвовать в реакции с медиаторов на поверхности электрода: Субстрат Фермент + NAD(P)+ Med.(red) Продукт Фермент+NAD(P)H Med.(ox) e- Амперометрические электрохимические биосенсоры O-кольцо Ферментная мембрана Корпус Pt Рабочий электрод Поликарбонатная Мембрана из мембрана ацетата целлюлозы Analyte O2 H2O2 Электрод сравнения (Ag/AgCl) Ферменты, наиболее часто применяемые для создания биосенсоров Аналит Фермент Амигдалин Аспарагин Холестерин Сложные эфиры Глюкозы Пероксид водорода Липиды Пенициллин G Белки Крахмал Сахароза Мочевина Мочевая кислота β-Гликохидаза Аспарагиназа Холестерол оксидаза Химотрипсин Глкозооксидаза Каталаза Липаза Пенициллиназа Трипсин Амилаза Инвертаза Уреаза Уриказа ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ Обычно проводится двумя методами: Физическая, когда фермент физически включается в носитель Химическая,когда образуется ферментом и носителем ковалентная связь между Измерения Стационарный режим Считывающее Биосенсор устройство Амперметр Ячейка Магнитная мешалка Проточная система Биосенсор помещен в электрохимическую проточную ячейку. Электрохимическая ячейка связана с перистальтическим насосом, прокачивающим буферный раствор с постоянной скоростью. Режим проточно-инжекционного анализа (ПИА) В режиме ПИА ячейка связана с потоком с помощью крана Инжектор Насос Петля Записывающее устройств Буфер Сток Электрохимическая ячейка Амперметр Режим проточно-инжекционного анализа (ПИА) Медицина Глюкоза Молочная кислота Пировиноградная кислота Экология Тяжелые металлы Пестициды Применение биосенсоров Пищевая промышленность Крахмал Лактулоза Яблочная кислота Клинический анализ Применение химических сенсоров в клиническом анализе 5% взрослых больны диабетом Они нуждаются в постоянном анализе крови. Для оценки уровня глюкозы используют высоко селективный биосенсоры на основе фермента глюкозооксидазы (GOD) Метод основан на реакции катализируемой этим ферментом (GOD) Глюкоза + O2 GOD → Глюконовая кислота + H2O2 Количество H2O2 , образующееся в реакции, пропорционально содержанию глюкозы Определение глюкозы, пирувата и лактата O-ring Глюкозооксидаза Корпус Pt рабочий электрод Поликарбонатная мембрана Мембрана из ацетата целлюлозы Электрод сравнения (Ag/AgCl) Глкоза + O2 GOD → Глюконовая кислота + H2O2 Искусственная поджелудочная железа Перистальтический насос Анализ глюкозы Инсулиновый инжектор Инсулин Глюкоза Разведениеl Glucose, lactate e pyruvate measurements Ультрафильтрация Анализатор глюкозы Ультрафильтрат 0.02 мл/мин Лактатный сенсор 0.25 мл/мин Пируватный сенсор Нормозол + кофакторы Нормозол + кофакторы Стандарт + Лактат 0.1 мМ Пируват 0.01 М СТОП INF INF СТОП 200 мг/дл GLU EX ГЛЮКОЗА ЕДА 100 часы СТОП EX EX 4•10-3 Моль/л STOP INF INF GLU ЛАКТАТ ЕДАL 2 1 st cal cal СТОП INF INF GLU СТОП EX 2•10-4 Моль/л EX часы st cal cal ПИРУВАТ ЕДА 1 st cal 11a.m. cal 12 13 cal 14 st часы 15 cal 16 Измерения уровня лактата у бегунов Лактат ммоль 4 Изучение функционального анаэробного режима 2 9 10 8 Скорость, км/ч 0 11 20 12 13 0 40 Время, мин. 60 Лактат, ммоль 4 2 9 10 8 Скорость, км/ч 0 11 20 12 13 0 40 Время, мин. 60 60 Лактат, мг/дл 20 200 Глюкоза, мг/дл 100 Анаэробный режим У гонщика Формулы 1 20 Скорость, км/ч 10 Время, мин 15 30 45 60 Латкта Мг/дл 20 200 Глюкоза, Мг/дл 100 20 Скорость, км/ч 10 Время, мин 15 30 45 60 Лактат, мг/дл 20 200 Глюкоза, 100 мг/дл Анаэробный режим у марафонца 20 Скорость, Км/ч 10 Время, мин 15 30 45 60 Lactate mg/dl 20 200 Glucose 100 mg/dl 20 10 Speed Km/h TIME i 15 30 45 Анаэробный режим Возраст, спорт Скорость Лактат (км/ч) (мг/дл) 24-26 Марафон 19.5 19.0 34-24 Триатлон 17.0 16.9 25-40 10000 м 15.2 16.0 24-26 Тренированный 11.0 15.0 Нетренированный 8.5 14.0 26-41 Анализ продуктов питания Определение биогенных аминов в продуктах Биогенные амины – алифатические, алициклические и гетероциклические органические основания небольшого молекулярного веса. Они синтезируются в клетках животных и растений, но также образуются микроорганизмами путем декарбоксилирования аминокислот. Анализ присутствия биогенных аминов: дает оценку безопасности и качества продукта питания; позволяет избежать риск отравления аминами. ¾ В растениях биогенные амины (путресцин, спермин и спермидин) включены в физиологические процессы. Пример – SAM, который разлагается на этилен и полиамины Созревание Рост + Путроесцин Как можно измерить биогенные амины в продуктах питания ? Определение биогенных аминов (путресцина, кадаверина, спермидина, sспермина, гистамина, тирамина, триптамина) проводят с помощью биосенсора, в котором используют фермент диаминокисдазу (DAO) и поламиноксидазу (PAO). DAO R-CH2-NH2 +O2 ¼ R-CHO + H2O2 + NH3 PAO NH2(CH2)3-NH-(CH2)4-NH2+O2+H2O ¼ NH2(CH2)3-CHO+ H2O2 + Dap (пропилендиамин) PAO NH2(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2 +O2+H2O ¼ NH2(CH2)3-NH-(CH2)3-CHO + H2O2 + Dap Определение биогенных аминов в анчоусах Биосенсоры на основе DAO использовали в определении уровня аминов в анчоусах. Полученные результаты сравнивали с хроматографическим методом. Хроматография позволяет разделять амины и определять индивидуальные соединния, биосенсор на основе DAO дает отклик на суммарное содержание биогенных аминов. Биосенсор (¦) Хроматографический метод (|) 450 Corrente (nA) 360 270 180 90 0 0 50 100 Tempo (giorni) 150 200 Определение L-лактата в сыре моцарелла Молочная кислота (лактат) – основной продукт ферментации. Определение лактата дает информацию о том, как протекает ферментация 7 0,8 0,55 pH 6 5,5 0,3 5 0,05 4,5 4 0 50 100 150 Время (мин) 200 -0,2 250 L-лактат (г/100 г) 6,5 L-Лактат: быстрое накоплние в начале процесса pH: быстрый спад до рН 5.5, потом медленное снижение Определение L-лактата в моцарелле с помощью проточно-инжекционного анализа В ПИА использовали лактатный биосенсор на основе лактатоксидазы (фермент иммобилизован на нейлоновой сетке) и платинового электрода для измерения H2O2 . Реакция, протекающая на электроде: L-Лактат + O2 + H2O → Пируват + H2O2 ПИА система позволяет проводить определение L-лактата за 30 секунд при воспроизводимости около 1% Биосенсор на яблочную кислоту L-малат + 2 NADP+ EM ⇒ Пируват + 2 NADPH + CO2 NADPH (образуется малатоксидазой (ЕМ)) восстанавливает медиатор, который затем окисляется кислородом с образованием пероксида водорода H2O2: Пируватоксидаза Пируват + HPO4- + O2 Мл/мин a 0.3 b 0.3 Инжекторная петля Ферментный реактор Ацетилфосфат + H2O2 + CO2 Самописец Петля 62 см Электрохимическая ячейка Перистальтический насос a= буферный раствор MOPS 0.05 M pH 7.4 b= медиатор феназинметилсульфат (PMS) в 1 мМ MOPS Определение яблочной и молочной кислот в вине Эти два метаболита играют важную роль в контроле качества вина, поскольку отвечают за многие реакции, обусловливающие «букет» вина Обычно анализ яблочной и молочной кислот проводят спектрофотометрически Альтернативным методом является измерение активности соответствующих ферментов с помощью электрохимических сенсоров Такие методы просты и позволяют проводить измерение уровня яблочной и молочной кислот в вине в реальном масштабе времени Ферментативные реакции могут включать: L-лактат + O2 + H2O Лактатоксидаза Пируват + H2O2 маладегидрогеназа Оксалоацетат + NADH + H+ L-малат + NAD+ L-малат + NADP+ Малатоксидаза Пируватe + NADPH + CO2 + H+ Пируватоксидаза Пируват + HPO4- + O2 Ацетилфосфат + H2O2 + CO2 Метод иммобилизации M M P M P P 1. Мембрана с предактивированными группами 2. Мембрана после присоединения пируватоксидазы 3. Мембрана после присоединения пируватоксидазы и малатоксидазы O-кольцо Асимметричная ферментная мембрана МЕ Пируватоксидаза Поликарбонатная мембрана Мембрана из ацетата целлюлозы Pt проволока Внешний электрод Стекло Ag/AgCl К амперметру KCl 0.1 М внутр.раствор Изменение содержания яблочной кислоты в процессе созревания вина СРАВНЕНИЕ СО СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ Сорт Trebbiano Trebbiano Trebbiano Trebbiano Tintilia Tintilia Tintilia Tintilia Tintilia Дата 07.сен 13.сен 22.сен 28.сен 08.сен 14.сен 22.сен 28.сен 05.окт Спектрофотометрия Амперометрия (г/л) (г/л) 8.75 6.05 4.55 2.57 4.54 4.12 3.52 3.05 2.38 8.65 5.85 4.53 2.83 4.29 4.28 3.57 2.65 2.15 E (%) 3 1 0 10 6 4 1 15 10 Определение малата и лактата в красных винах Накопление молочной кислоты относительно присутствия Oenococcus oeni starters 3 Накопление яблочной кислоты относительно присутствия Oenococcus oeni L25 4 L25 L50 г/л U50 г/л L50 3 U25 2 1 U25 2 U50 1 0 0 0 2 4 Дни 6 8 0 2 4 Дни 6 8 МОНИТОРИНГ МЕТАБОЛИТОВ В ПРОЦЕССЕ АЛКОГОЛЬНОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ Электрохимические биосенсоры (режим ПИА) в измерении уровня глюкозы, фруктозы, глицерина и этанола в процессе алкогольной ферментации Ферментативные реакции ¾Глюкоза + O2 ⎯GOD→ Глконовая кислота + H2O2 ¾Фруктоза + 2 PMS+⎯FDH→ кетофруктоза + 2 PMSH PMSH----->2 PMS+ + 2e ¾Этанол + O2 ⎯AO→ Ацетальдегид + H2O2 ¾Глицерин + АТФ (Mg2+) ⎯GK→ Глицерол-3-фосфат + ADP Глицерол-3-фофат +O2 + H2O ⎯GPO→ Глицерон-3-ф+ H2O2 120 12 100 10 80 8 Svinatura glucosio fruttosio etanolo 60 40 6 Delestage X Ферментация за 75 часов % vol 4 20 2 0 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 X Ферментация за 115 часов g/L “rimontaggi ripetuti” (150 Hl) 120 12 100 10 80 8 fruttosio glucosio etanolo 60 40 6 Svinatura Rimontaggi 20 4 2 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Время (час)+ 90 100 110 0 120 % vol g/L “unico delestage” (300 Hl) Анализ объектов окружающей среды Биосенсор на основе холина и ацетилхолинэстеразы: применение в анализе вод Цель Быстрый и недорогой метод для определения суммы антихолинэстеразных соединений в образце, важный токсикологический показатель – процент ингибирования активности фермента или эквивалентная концентрация эталонного соединения (параоксон) Ацетилхолин Ацетилхолинэстераза Ингибируется пестицидами Холин + O2 + H2O H2O2 Электрод Холин + уксусная кислота Холиноксидаза Не ингибируется Бетаин + H2O2 O2 + 2H+ + 2e- Передача нервного импульса Ацетилхолинэстераза Ингибирование ацетилхолинэстеразы параоксоном 6 Холостая проба 2 мкг/кг 6 мкг/кг 4 10 мкг/кг 2 0 0 1 2 3 4 Время (минут) Анализ искусственных образцов и мешающее влияние тяжелых металлов Соединение, добавленное в образец Параоксион Диметоат S P Ометоат O P Азинфос-Et S P Пиримифос S P Тяжелые металлы Концентрация в образце (мкг/кг) 7.5 19.0 3.0 8.6 17.0 100 Эквивалентная концентрация параоксона (мкг/кг) 7.0 4.0 1.5 5.0 4.5 0.5 Амперометрические биосенсоры для определения тяжелых металлов Поступление тяжелых металлов в окружающую среду является причиной многих системных нарушений Помимо других биологических последствий, ионы тяжелых металлов оказывают ингибирующее действие на ферменты, связываясь с тиольными группами белков Традиционные методы определения металлов требуют сложной пробоподготовки, дорогостоящего оборудования и обученного персонала Биосенсоры позволяют решать задачи быстрого и чувствительного определения ионов металлов в полевых условиях Была проведена оценка влияния 15 ионов металлов на активность 12 оксидоредуктаз Для построения калибровочных кривых использовали растворы ферментов (ингибирование в гомогенных условиях) и препараты ковалентно иммобилизованных ферментов Были получены калибровочные кривые для Hg(II), Se(IV), Ni(II), V(V), Cu(II) и Cd(II) Активность ферментов контролировали амперометрически с помощью сенсора на пероксид водорода Общая реакция: Субстрат + O2 Продукт + H2O2 Относительная активность оксидоредуктаз после их инкубирования в течение 30 минут с 1- мг/л раствором металла фермент, Е/мл Отн.активность (%) Определение тяжелых металлов по ингибированию инвертазы Реакции Сахароза E1 E1= Инвертаза + H2O E2 = Глюкозооксидаза D-Глюкоза + D-фруктоза D-Глюкоза E2 + O2 Глюконовая кислота + H2O2 H2O2 Биосенсор O2 + 2H++ 2e- Измерение ингибирования I1 Сахароза INV B Сахароза INV + ингибитор A I2 Время реакции Время Проточно-инжекционное определение с 10 мМ сахарозой 80 60 40 20 0 0 20 40 60 [Hg2+] (мкг/кг) 80 100 Благодарность членам группы университета Тор Вергата