1.1. Аспарагиновые протеазы

ГУ НИИ БМХ РАМН
Белки – молекулярные мишени
для действия лекарств
проф. А.С. Иванов
(ivanov@ibmh.msk.su)
Москва - 2008
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
1
500 известных мишеней современных лекарств
DNA
2%
Nuclear
receptors
2%
Receptors
45%
Ion
channels
5% Unknown
7%
Hormones
& factors
Enzymes 11%
28%
Proteins/peptides ~ 95%
3D структура большинства мишеней не известна
16.04.08
2
1. Протеазы
•
•
•
Селективный гидролиз амидной связи
Стабилизация переходного состояния
Конкурентные ингибиторы моделируют переходное состояние
Пептидные связи
N-конец
16.04.08
С-конец
Proteins - Molecular Targets
3
Два класса протеаз
1-й класс - прямой гидролиз амидной связи молекулой воды
 Активация H2O :
1) H2O связана c двумя Asp
(аспарагиновые протеазы);
Asp
H2O
Asp
2) H2O связана с ионом Zn
(цинковые металлопротеиназы)
Zn
H2O
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
4
Два класса протеаз
2-й класс - непрямой гидролиз амидной связи
 Нуклеофильный атом остатка серина, треонина или цистеина атакует
амидный карбоксил (сериновые, треониновые и цистеиновые протеазы)
 Разрыв связи C-N и образование ацил-ферментного интермедиата
 Интермедиат гидролизуется свободной молекулой воды
acyl enzyme
intermediate
Ser−OH
H2O
(Thr)-OH
(Cys)-SH
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
5
Специфичность протеаз
 Большинство протеаз обладают селективностью
 Селективность обусловлена комплиментарностью места связывания
одному (или больше) аминокислотному остатку субстрата
 Стандартная номенклатура обозначения аминокислотных остатков
субстрата и соответствующих им мест связывания в ферменте
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
6
1.1. Аспарагиновые протеазы
•
Классический объект - Пепсин
 Природный ингибитор Пепстатин (открыт в 1970 г.)
 Характеристический ингибитор аспарагиновых протеаз
Комплекс пепсина с пепстатином (Ki = 5,6 х 10-11 M)
Pepsin with pepstatin (1pso.ent)
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
7
1.1. Аспарагиновые протеазы
•
Катепсин D – лизосомальная протеаза
 Связь с развитием рака легких и болезни Альцгеймера
 Сконструированы ингибиторы
Cathepsin D (1lya.ent)
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
8
1.1. Аспарагиновые протеазы
•
HIV-1 protease (HIVp) – протеаза ВИЧ
 Разрезание пробелка вируса на отдельные белки
 Ингибиторы – лечение СПИД
 Сконструированы сотни конкурентных ингибиторов -пептидомиметиков
HIV-1 PROTEASE COMPLEX WITH ACETYL-PEPSTATIN
(1hvp.ent)
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
9
1.1. Аспарагиновые протеазы
•
Ренин




Вырабатывается почками и инициирует каскад реакций по регуляции кровяного давления
Ингибиторы (пептидомиметики) – антигипертензивные средства
До сих пор в клинике нет оральных ингибиторов ренина
Проблема – биодоступность препарата
*
Renin with inhibitor (1rne.ent)
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
10
1.2. Сериновые протеазы
•
Трипсин/Химотрипсин
 Ингибиторы – лечение заболеваний ЖКТ
 Комплекс трипсин/ингибитор
COMPLEX (TRYPSIN/INHIBITOR)(1taw.ent)
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
11
1.2. Сериновые протеазы
•
Тромбин - расщепляет растворимый фибриноген до
нерастворимого фибрина
(последний этап процесса коагуляции)
 Ингибиторы – антикоагулянты
Комплекс тромбина с гирудином
(из Hirudo medicinalis) Ki ~ 22 pM
Human thrombin (1a4w.ent)
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
12
1.2. Сериновые протеазы
•
Эластаза нейтрофилов человека
 Выделяется при воспалении, деградация межклеточного матрикса, миграция
нейтрофилов из сосудов в ткани
 Контролируется эндогенным белковым ингибитором, нарушение баланса – заболевания
типа эмфиземы, кистозного фиброза, ревматоидных артритов
 Ингибиторы – лечение этих заболеваний
(1hne.pdb)
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
13
1.2. Сериновые протеазы
•
Перспективные белки-мишени
1AT3
 Протеаза вируса герпеса
1A1Q
 Протеаза вируса гепатита С
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
14
1.3. Ферменты, похожие на сериновые протеазы
β–лактамазы
 Бактериальные ферменты, разрушающие β–лактамные антибиотики
 Ингибиторы – повышение эффективности и спектра действия антибиотиков
1BLC
1BC2 β-Lactamase From Bacillus Cereus
16.04.08
Inhibition of β-lactamase by clavulanate.
Proteins - Molecular Targets
15
1.4. Треониновые протеазы
•
20S протеосома
 Деградация большинства
регуляторных белков в
клетках
 Широкий спектр заболеваний (от иммунных до
рака)
 Необратимые природные
ингибиторы –
лактацистин (SP-59) и
его β-лактонный аналог
(SP-60)
1pma.ent
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
16
1.5. Цистеиновые протеазы
•
Класс Папаина
 Активный центр содержит каталитическую триаду Cys-25, His-159, Asn-175
(подобно химотрипсину)
Папаин
(1pad.pdb)
16.04.08
Катепсин В
1CSB
Proteins - Molecular Targets
17
1.5. Цистеиновые протеазы
•
Класс ICE - (Interleukin Converting Enzyme)
 Интерлейкин-конвертирующий фермент - продукция интерлейкина
в моноцитах
 Субстратная селективность - аспартат в позиции Р1
 Воспалительные заболевания (ревматоидные артриты)
(1ice.pdb)
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
18
1.5. Цистеиновые протеазы
•
Класс ICE
 CED-3 – апоптоз у Caenorhabditis elegans
 CPP32 – апоптоз у млекопитающих (?)
(1cp3.pdb)
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
19
1.5. Цистеиновые протеазы
•
3С протеиназа пикорновирусов
(гепатит А, полиовирусы, риновирусы)
HEPATITIS A VIRUS 3C PROTEINASE
SYNONYM: PICORNAIN 3C (1hav.ent)
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
20
1.6. Цинковые металлопротеиназы
•
Angiotensin-Converting Enzyme, ACE
Ангиотензин-превращающий фермент, АПФ
 АПФ был открыт в ГУ НИИ БМХ РАМН
 Ингибиторы – гипотензивное действие
Nature, 2003
*
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
21
1.6. Цинковые металлопротеиназы
•
Endothelin-Converting Enzyme, ECE
Эндотелин-конвертирующий фермент
 Структуры фермента нет
 Сердечно-сосудистые заболевания
1edn.pdb
Эндотелин
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
22
MMPs
•
Matrix metallo-proteinases (MMPs)
семейство цинковых металлопротеиназ
 Всевозрастающая роль в качестве мишеней
• Деградация и изменения соединительной ткани
• Протеолиз и разрушение межклеточного матрикса
 Регуляция MMPs цитокинами и факторами роста через
транскрипцию
 Секреция неактивного проферемента, специфическая активация
 Эндогенные тканевые ингибиторы MMPs (TIMPs)
 Нарушение регуляции – деградация соединительной ткани
(артриты, инвазия опухолей, метастазы)
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
23
MMP catalysis
“metallo” in MMP = zinc
→ catalytic domain contains 2 zinc atoms
Whittaker et al. Chem. Rev. 1999, 99, 2735-2776
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
24
MMPs
Есть 3D структуры
16.04.08
Whittaker et al. Chem. Rev. 1999, 99, 2735-2776
Proteins - Molecular Targets
25
2. Иммунофилины
•
Циклофилин (Cyclophilin, peptidylprolyl cis-trans isomerase)
 Ингибитор - Циклоспорин А блокирует образование цитокина IL-2 (иммуносупрессор,
терапия после пересадки органов)
2RMA
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
26
2. Иммунофилины
•
FKBP12
 Ингибитор – FK506 также блокирует образование цитокина IL-2
(иммуносупрессор)
FK506 from 1tco.pdb
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
27
2. Иммунофилины
•
FKBP12
 Рапамицин - блокирует клеточный ответ на цитокин IL-2 (иммуносупрессор)
Rapamycin from 1nsg.pdb
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
28
2. Иммунофилины
•
FKBP12
1TCO
16.04.08
FK506 в комплексе с FKBP12 связывается и ингибирует
серин/треониновую фосфатазу Сalcineurin
Complex of Calcineurin,
Fkbp12 and
immunosuppressant drug Fk506
Proteins - Molecular Targets
29
2. Иммунофилины
•
FKBP12
• Комплекс rapamycin/FKBP12 связывается с новой мишенью
FRAP (FBBP12 rapamycin associated protein)
• Ни rapamycin, ни FKBP12 не связываются по одиночке с FRAP
Immunophilin-FKBP12-Rapamycin Complex Interacting With Human Frap
1NSG
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
30
3. Фолат-содержащие ферменты
•
•
•
•
Фолиевая кислота – витамин, кофактор многих метаболических ферментов.
Многие фолат-зависимые ферменты являются ключевыми в клеточном цикле
Ингибиторы – противоопухолевые средства (напр. метотрексат)
Дигидрофолат-редуктуза (DHFR)
Methotrexate from 1ra3.pdb
1ra3.pdb
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
31
4. Карбоангидраза
•
Карбоангидраза человека (HCA) – катализирует диффузионно-контролируемое
превращение СО2 в бикарбонат
•
Ингибиторы – лечение глаукомы (контроль потока жидкости в глазах)
•
Активный центр содержит атом цинка, соединенный координационными связями с 3
остатками гистидина
•
Исследовательская группа фирмы Merck создала (structure-based design) ингибиторы HCA
1azm.pdb
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
1bzm.pdb
32
5. Фосфолипаза А2
 Фосфолипаза А2 (ФЛ) - гидролиз фосфолипидов по sn-2 положению с
образованием лизоформ и жирных кислот
 Ca2+ в активном центре
 Ингибиторы ФЛ - противовоспалительные средства
1POE
1a3d
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
33
6. Гемагглютинин
•
Гемагглютинин вируса гриппа
2viu
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
34
7. Сиалидаза
•
Сиалидаза (нейраминидаза) вируса гриппа
 Отщепляет концевую сиаловую кислоту от гликопротеинов, гликолипидов и
олигосахаридов
 Участвует в освобождении новых вирионов из инфицированной клетки
1ivb
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
35
8. Топоизомеразы
•
•
Топоизомеразы необходимы для решения различных
топологических проблем, возникающих при репликации и
транскрипции кольцевых замкнутых ДНК.
Тип II (ДНК-гираза) и тип IV
Ингибиторы – фторхинолоны
(антибактериальные препараты)
ципрофлоксацин,
офлоксацин,
ломефлоксацин,
норфлоксацин
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
1EI1
36
9. ДНК-зависимая РНК-полимераза
•
Антибиотик Рифампицин
(туберкулез)
RNA Polymerase-Rifampicin Complex
1I6V
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
37
10. Рибосомальные субъединицы
•
30S субъединица
Тетрациклины
ингибируют мРНК –
1FJG
зависимое связывание
аминоацил-тРНК с
А-сайтом и угнетают
начальную стадию
белкового синтеза.
30S ribosomal subunit in
complex with the antibiotics
Streptomycin
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
38
10. Рибосомальные субъединицы
•
50S субъединица
Макролиды ингибируют
реакцию переноса полипептидной
цепи на аминоацил-тРНК и
перемещение пептидил-тРНК
из сайта А в сайт П.
В результате тормозится
формирование полипептидной
цепи
1NWY
Сomplex of 50S ribosomal subunit with
Azithromycin
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
39
Проблема создания средств борьбы с РНК-содержащими вирусами
Жизненный цикл ВИЧ
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
40
Мишени для создания лекарств против
ВИЧ-инфекции
???
Обратная транскриптаза
Протеаза
Интеграза
Мишени ВИЧ
Протеаза (аспарагиновая)
HIV-1 PROTEASE COMPLEX WITH ACETYL-PEPSTATIN
(1hvp.ent)
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
42
Пример анти-ВИЧ лекарства
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
43
HIV drug resistance
 The drug-resistant protease modification is a result of the point mutation in both
identical enzyme subunits.
 HIVp operates in homodimeric form, each of identical subunits being consisted of
99 amino acid residues.
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
44
HIV protease
Active protease – homodimer
Mutation
Mutation
competitive
ACTIVE SITE
SUBSTRATE
inhibitor
Mutation
Mutation
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
45
HIV protease
Mutation
Mutation
substrate
Mutation
Mutation
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
46
12. Новые перспективные мишени
•
Сравнительная геномика и протеомика – поиск новых
мишеней и лигандов
•
Рецепторы (надсемейство G-сопряженных белков, ядерные
рецепторы)
•
Киназы (фосфорилирование белков) и фосфатазы
(дефосфорилирование белков) - передача сигналов,
у человека идентифицировано > 500 киназ
•
Мембранные каналы
•
Мембранные транспортные белки
•
Белок-белковые взаимодействия (димеризация, фолдинг)
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
47
New Drug Targets Expected from the
Human Genome Project
Number of Drug Targets
12,000
5,000–10,000
10,000
8,000
6,000
4,000
2,000
Approx. 500
0
Cumulative Number of
Targets Known Today
New Targets Expected from
Human Genome Project
Source: Drews J. Nat Biotechnol 1996;14.
Montreal-Kingston Bacterial SG Initiative (BSGI)
Structural Proteomics in Europe (SPINE)
Target DB
http://targetdb.pdb.org
Bacterial Targets IGS (BIGS)
Yeast SG (YSG)
Canada
Europe
France
Marseille SG Platform (MSGP)
Protein Structure Factory (PSF)
German M. tuberculosis SG Consortium
Germany
Japan
RIKEN SG/Proteomics Initiative
Israel Structural Proteomics Center (ISPC)
Oxford Protein Production Facility (OPPF)
Israel
UK
New York SG Research Consortium (NYSGRC)
Midwest Center for SG (MCSG)
Berkeley SG Center (BSGC)
Northeast SG Consortium (NESG)
USA
M. tuberculosis SG Consortium (TB)
Southeast Collaboratory for SG (SECSG)
Joint Center for SG (JCSG)
SG of Pathogenic Protozoa Consortium (SGPP)
Center for Eukaryotic SG (CESG)
Structure 2 Function Project (S2F)
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
49
Спасибо за внимание
16.04.08
Proteins - Molecular Targets
50