ИССЛЕДОВАНИЕ СТЕРИНОВ СЛИВОЧНОГО МАСЛА И СПРЕДА

 УДК 541.18.05/.052:547.67
ИССЛЕДОВАНИЕ СТЕРИНОВ СЛИВОЧНОГО МАСЛА И СПРЕДА
МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
© 2014 А. В. Карташева1, С. А. Ефанов2 , Е. В. Грехнева3, И. Б. Кометиани4
1
магистрант каф. химии
e-mail: exotdel@kursktelecom.ru
Курский государственный университет
2
начальник экспертно-исследовательского отдела №1
e-mail: exotdel@kursktelecom.ru
филиал ЭКС ЦЭКТУ
3
канд. хим. наук, доцент каф. химии
e-mail: grekhnyovaev@yandex.ru
4
канд. биол. наук, зав.каф. химии
e-mail: grekhnyovaev@yandex.ru
Курский государственный университет
Приведен анализ литературных источников, составлена обобщенная схема,
позволяющая наглядно представить примеры пробоподготовки, используемой для анализа
стеринов методом газовой хроматографии. Сопоставлены два способа пробоподготовки и
возможность их использования для анализа смеси жиров. Методом хромато-массспектрометрии в
составе сливочного масла идентифицированы: холестерин, 7дегидрохолестерин, ланостерин; в составе спреда обнаружены: холестерин, β-ситостерин,
кампастерин, стигмастерин.
Ключевые слова: омыление, стерины, холестерин, 7-дегидрохолестерин,
ланостерин, β-ситостерин, кампастерин, стигмастерин, хромато-масс-спектрометрия.
Введение
Исследования стеринов в биологических объектах методом газовой
хроматографии довольно широко представлены в литературе и, как правило,
отличаются длительной пробоподготовкой. Наиболее сложной задачей представляется
выделение и очистка стеринов из природных жиров и масел по причине их
относительно невысокого содержания. Анализ литературных данных позволяет
составить схему, отражающую основные этапы и пути проведения подобных
исследований.
Использование конкретного алгоритма во многом зависит от материальнотехнической базы, поставленных задач, желаемой количественной точности и пр.
Наиболее важным этапом во всей этой схеме является отделение стеринов от
основной матрицы, главным образом представленной триглициридами жирных кислот.
Классическим вариантом подготовки образца жира для исследования является
омыление со спиртовым раствором щелочи [ГОСТ Р 51471-99; Чмиленко и др. 2009;
Зиновьев 1952], в результате чего появляется возможность отделить неомыляемые
вещества жира (стерины, высокомолекулярные спирты, углеводороды и пр.). В
последнее время часто предпринимаются попытки упростить данный метод
посредством использования твердофазной экстракции, позволяющей сэкономить время
и реактивы [MV Russo 2005], а в ряде случаев используется даже прямое введение
раствора жира (или после его встряхивания с раствором щелочи) в хроматограф
[Alonso 1995: 11]. Последующие этапы используются для отделения фракции стеринов
от других неомыляемых веществ [Toivo 1998].
ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ
Жир или раствор
жира в
подходящем
растворителе
Твердофазная
экстракция
Омыление со
спиртовым
раствором щелочи
Экстракция
Очистка методом
тонкослойной
хроматографии
Добавление
внутреннего стандарта
(α-холестан, бетулин)
Получение
дигитонидов
стеринов
Последовательное
встряхивание с
концентрированным
раствором щелочи и
водой
Получение
триметилсилильных
производных
ГХ анализ
Получение триметилсилильных производных не является обязательным в случае
качественного анализа, в то время как при количественном анализе это позволяет
получить более правильные пики [Герег 1985].
Выбранный алгоритм для идентификации растительных стеринов в спредах
должен обладать простотой и доступностью, но в то же время быть достаточно
чувствительным. Для реализации этой задачи было решено использовать классическую
пробоподготовку (омыление со щелочью) и ускоренную (встряхивание со щелочью) с
последующим анализом методом капиллярной газовой хроматографии с массдетектированием без получения триметилсилильных производных.
Экспериментальная часть
В качестве образцов для анализа с применением омыления были взяты
растительно-сливочный спред с содержанием молочного жира 20,0% (образец №1),
растительно-сливочный спред с содержанием молочного жира 19,5% (образец №2) и
сливочное масло с содержанием жира 72,5% (образец №3), жирнокислотный состав
которого не противоречил требованиям действующего стандарта [ГОСТ Р 52253-2004].
A u d i t o r i u m : э л е к т р о н н ы й н а у ч н ы й ж у р н а л К у р с к о г о г о с у д а р с т в е н н о г о
университета. 2014. № 3
Карташева А. В., Ефанов С. А., Грехнева Е. В., Кометиани И. Б.
Исследование стеринов сливочного масла и спреда методом хромато-массспектрометрии
Извлечение неомыляемых веществ проводили при помощи щелочного гидролиза
с использованием спиртового раствора гидроксида калия с концентрацией 1 моль/л.
Для анализа брали навеску массой около 10 г. Получение достоверных результатов при
отсутствии возможности сделать жирнокислотный состав или в случае его
сомнительных результатов напрямую зависит от массы навески, взятой для анализа.
Соответственно для анализа в этих случаях рекомендуется брать навеску образца
массой 50 г [ГОСТ Р 51471-99].
В колбу для кипячения с навеской вносят «кипелки», 50 мл раствора щелочи и
кипятят с обратным холодильником 1 час, охлаждают, добавляют 100 см3
дистиллированной воды и экстрагируют в делительной воронке неомыляемые вещества
гексаном (трижды по 50 см3). Гексановый экстракт упаривают до 1 мл и вводят в
газовый хроматограф Agilent 6850 c масс-селективным детектором Agilent 5975С в
следующем режиме: колонка – кварцевая капиллярная НР – 5MS; начальная
температура колонки 100 0С, подъем до 280 0С со скоростью 15 град/мин; выдержка
40 мин.; температура интерфейса – 290 0С; температура инжектора 290 0С; газ носитель
– гелий; расход газа через колонку 1,0 мл/мин. Экстракт вводили в хроматограф в
количестве 2 мкл с делением потока 1:20. Запись хроматограммы и регистрацию массспектров проводили в режиме по полному ионному току в диапазоне масс 50 – 450
атомных единиц.
Для исследования без омыления образец № 1 массой 0,3 г помещали в пробирку
с пришлифованной пробкой. После полного растворения навески продукта в пробирку
добавляли 5 мл спиртового раствора щелочи (2 н), встряхивали в течение 1 мин. Затем
в пробирку добавляли 5 мл дистиллированной воды, встряхивали 10 сек. После
разделения слоев верхний гексановый слой использовали для анализа. Хромато-массспектрометрическое исследование образца без предварительного омыления проводили
в условиях, описанных выше, но с отсрочкой включения масс-детектора на 15 мин.
Обсуждение результатов
Исследование образца №1 показало, что последовательное встряхивание
раствора жира в гексане со спиртовым раствором щелочи и водой позволит
идентифицировать холестерин и ситостерин в смеси жиров. Однако, с учетом того что
массовая доля молочного жира в образце № 1 составляет лишь 20%, достоверно
идентифицировать ситостерин при более высоком содержании молочного жира путем
пробоподготовки без омыления будет невозможно. Кроме того, использование таким
образом подготовленной пробы отрицательно сказывается на работе хроматографа –
малолетучие и тяжелые триглицериды не переводятся в легкие эфиры жирных кислот и
оседают на частях прибора, требуя дополнительных мер его очистки.
Намного лучше оказались результаты после омыления проб даже без
использования дополнительной очистки.
Исследование неомыляемых веществ методом хромато-масс-спектрометрии
позволило выявить в составе образцов № 1 и 2 наряду с наличием холестерина (время
выхода ≈ 19,2 мин.), характерного для молочного жира, также присутствие
кампастерина (время выхода ≈ 21,4 мин.), стигмастерина (время выхода ≈ 22,1 мин.), βситостерина (время выхода ≈ 23,5 мин.), характерных для растительных жиров (рис. 2,
3). β-ситостерин, кампастерин и стигмастерин являются типичными представителями
растительных стеринов [Тютюнников 1992]. В наибольшем количестве в растительных
маслах встречается β-ситостерин.
Исследование неомыляемых веществ образца № 3 наряду с наличием
холестерина позволило выявить ланостерин (время выхода ≈ 24 мин.) и 7 ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ
дегидрохолестерин (время выхода ≈ 20,1 мин.) (рис. 4). 7-дегидрохолестерин и
ланостерин [Твердохлеб, Раманаускас 2006] являются составными звеньями цепочки по
биосинтезу и дальнейшему преобразованию холестерина. Ланостерин является
предшественником холестерина у животных (у растений циклоартенол), а 7дегидрохолестерин при УФ облучении холестерина преобразуется в витамин D3 [П. де
Майо 1963].
Рис. 1. Хроматограмма образца № 1(без омыления)
Рис. 2. Хроматограмма образца № 1
A u d i t o r i u m : э л е к т р о н н ы й н а у ч н ы й ж у р н а л К у р с к о г о г о с у д а р с т в е н н о г о
университета. 2014. № 3
Карташева А. В., Ефанов С. А., Грехнева Е. В., Кометиани И. Б.
Исследование стеринов сливочного масла и спреда методом хромато-массспектрометрии
Рис. 3. Хроматограмма образца № 2
Рис. 4. Хроматограмма образца № 3
Во всех образцах также обнаружен сквален (время выхода ≈ 15,1 мин.), который
является предшественником стеринов в живых организмах.
Визуальная разница соотношения высоты пиков холестерина и ситостерина при
почти равном количестве молочного жира на хроматограммах образца № 1 и № 2
(рис. 2, 3) может быть вызвана разной природой масла или смеси масел,
использованных для производства заменителей молочного жира, входящих в состав
этих образцов. Другой причиной этого может быть и разная степень рафинации, при
которой происходит уменьшение количества стеринов [Phillips 2002].
Важно обратить также внимание на малую разницу во времени выхода
ситостерина и ланостерина, что при отсутствии масс-детектора и стандарта
ситостерина может привести к неверной интерпретации полученных результатов.
Таким образом, ускоренная пробоподготовка дает менее удовлетворительные
результаты по сравнению с классическим подходом, заключающимся в омылении
жира, и отрицательно влияет на работу оборудования. Омыление жира со спиртовым
ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ
раствором щелочи, дальнейшее концентрирование неомыляемых веществ и
использование масс-детектора повышает достоверность полученных результатов.
Кроме того, масс-детектирование позволяет идентифицировать в молочном
жире ланостерин, который может служить дополнительным идентификационным
признаком животного жира.
Библиографический список
Alonso L, Lozada L, Fontecha J, Juárez M Determination of cholesterol in milk fat by
gas chromatography with direct injection and sample saponification // Chromatographia.
1995. Vol. 41. No 1–2. P. 23–28.
Phillips K. M., Ruggio D. M., Toivo JI, Swank M. Free and esterified sterol
composition of edible oils and fats // Journal of Food Composition and Analysis. 2002. No15.
P. 123–142.
Russo M.V., A De Leonardis, Macciola V. Solid phase extraction—Gaschromatographic method to determine free cholesterol in animal fats // Journal of Food
Composition and Analysis. 2005. No 18. P. 617–624.
Toivo J., Piironen V., Kalo P., Varo P. Gas chromatographic determination of major
sterols in edible oils and fats using solid-phase extraction in sample preparation //
Chromatographia. 1998. Vol. 48. N 11–12. P. 745–746.
ГОСТ Р 51471-99 «Жир молочный. Метод обнаружения растительных жиров
газожидкостной хроматографией стеринов».
ГОСТ Р 52253-2004 «Масло и паста масляная из коровьего молока. Общие
технические условия».
Герег Ш. Количественный анализ стероидов: пер. с англ. М.: Мир, 1985. 504 с.
Зиновьев А. А. Химия жиров. М.: Пищепромиздат, 1952. 119 с.
П. де Майо Терпеноиды / пер. с англ. под ред. В.Ф. Кучерова. М.: Изд. иностр.
лит., 1963. 455 с.
Твердохлеб Г. В., Раманаускас Р. И. Химия и физика молока и молочных
продуктов. М.: Де Ли принт, 2006. 360 с.
Тимофеева О. Н, Вашкевич. Е. В, Буневич. Н. В. Определение фитостеринов и
холестерина в масложировой продукции методом капиллярной газожидкостной
хроматографии
[Электронный
ресурс].
URL:
http://
www.gendocs.ru›docs/7/6320/conv_5/file5.pdf (дата обращения: 12. 04.2014).
Тютюнников Б. Н., Бухштаб З. И., Гладкий Ф. Ф. и др Химия жиров. М.: Колос,
1992. 448 с.
Чмиленко Ф. А. Установление фальсификации молочной продукции методами
газовой хроматографии / Ф.А. Чмиленко, Н.П. Минаева, А.В. Сандомирский,
Л.П. Сидорова // Методы и объекты химического анализа. 2009. Т. 4. № 1. С. 60–66.
A u d i t o r i u m : э л е к т р о н н ы й н а у ч н ы й ж у р н а л К у р с к о г о г о с у д а р с т в е н н о г о
университета. 2014. № 3