Субстратная специфичность протеолитических ферментов

Òåõíîëîãèÿ ïåðåðàáîòêè ãèäðîáèîíòîâ
УДК 664.959.5:[636.084.413:636.5]
М. Е. Цибизова, К. В. Костюрина
ÑÓÁÑÒÐÀÒÍÀß ÑÏÅÖÈÔÈ×ÍÎÑÒÜ ÏÐÎÒÅÎËÈÒÈ×ÅÑÊÈÕ ÔÅÐÌÅÍÒÎÂ
ÍÅÒÐÀÄÈÖÈÎÍÍÛÕ ÎÁÚÅÊÒÎÂ ÏÐÎÌÛÑËÀ
ÂÎËÃÎ-ÊÀÑÏÈÉÑÊÎÃÎ ÁÀÑÑÅÉÍÀ
Введение
Концепция развития рыбного хозяйства Российской Федерации на период до 2020 г.,
одобренная распоряжением Правительства Российской Федерации, предусматривает достижение устойчивого функционирования рыбохозяйственного комплекса страны на основе сохранения, воспроизводства и рационального использования водных биологических ресурсов, развития аква- и марикультуры.
Общеизвестно, что использование ферментативных технологий позволяет получать
не только пищевые продукты высокого качества, обладающие высокой биологической ценностью, но и кормовые продукты повышенной биологической доступности. Процессы биотрансформации (протеолиза) в полном объеме применимы при переработке рыбных объектов промысла, в том числе гидробионтов Волго-Каспийского бассейна, включая маломерное и малоценное рыбное сырье, ранее не использовавшееся. Поиск легкодоступных и дешевых ферментов, которые обеспечивали бы эффективный протеолитический распад белоксодержащих субстратов, является не менее важной задачей при разработке технологии белковых продуктов.
В связи с вышеизложенным целью исследований являлось изучение влияния субстратной
специфичности ферментного комплекса гидробионтов на интенсивность процесса биотрансформации рыбного белка. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
– оценка интенсивности процесса биотрансформации при получении белковых продуктов
из рыбного сырья;
– определение оптимальных условий проведения автопротеолиза и факторов оптимизации
процесса.
Материал и методы исследований
В качестве объектов исследования использовалось маломерное пресноводное сырье Волго-Каспийского бассейна весеннего вылова мороженое неразделанное в виде фаршированной
смеси (густера, синец).
Динамика процесса автобиотрансформации объектов исследования оценивалась по изменению азота концевых аминогрупп, тирозина [1, 2]. Протеолитическая активность сырья определялась модифицированным методом Ансона [3]. Константа автопротеолиза, характеризующая
скорость проведения биохимических реакций, таких как расщепление белка собственными
ферментами рыбного сырья без внесения дополнительных активаторов и ингибиторов, была
рассчитана по динамике накопления тирозина.
Математическая обработка результатов исследований осуществлялась с помощью пакета
статистических расчетов (Statistic 6).
Результаты исследований и их обсуждение
Наиболее распространенными белковыми продуктами, безусловно, являются продукты
направленного биокатализа, осуществляемого под действием ферментных комплексов, имеющих различное происхождение. Предпочтения при использовании для гидролиза протеолитических комплексов или отдельных ферментных препаратов определяются несколькими факторами: ценой, доступностью, активностью по отношению к расщепляемому субстрату. Последняя
позиция определяется желаемой степенью расщепления белков исходного сырья, которая,
в свою очередь, зависит главным образом от области применения получаемых белковых гидролизатов [4]. Основными задаваемыми параметрами процесса биотрансформации являются температура, рН, количественное соотношение ферментного препарата и субстрата. Однако фактором, лимитирующим максимальную глубину гидролиза, является субстратная специфичность
ферментных препаратов. Кроме этого, водное сырье каждого бассейна отличается своими функциональными свойствами, что практически затрудняет поиск оптимальных условий его переработки, в том числе и для получения белковых продуктов.
121
ISSN 2073-5529. Âåñòíèê ÀÃÒÓ. Ñåð.: Ðûáíîå õîçÿéñòâî. 2009. № 2
Изучение субстратной специфичности протеолитической ферментной системы нетрадиционных объектов промысла проводилось при исследовании интенсивности процесса автопротеолиза густеры и синца, близких по технологическим свойствам, при варьировании режимов
автопротеолиза (температура, рН, продолжительность, без использования гидромодуля)
в присутствии хлороформа в качестве консерванта.
Исследование протеолитических процессов, протекающих в гидробионтах, представляет
особую трудность вследствие разнообразия белкового состава и наличия у них полиферментной
системы [4–6]. Поэтому для изучения субстратной специфичности протеолитического комплекса рыбного сырья проводилось исследование динамики накопления азота концевых аминогрупп
(рис. 1), азота тирозина (рис. 2), характеризующих соответственно интенсивность расщепления
белковой глобулы на крупные осколки и интенсивность накопления низкомолекулярных
продуктов гидролиза.
При изучении зависимости изменения содержания азотистых веществ в гидролизуемой
массе в качестве варьируемых факторов учитывались температура, рН и продолжительность
процесса. Функциями отклика являлись обобщенные численные характеристики глубины
процесса дезагрегации азотистых соединений смеси.
На рис. 1. представлена зависимость изменения содержания азота концевых аминогрупп
в гидролизуемой массе.
26
24
22
20
продолжительность, час
18
16
14
12
10
8
6
4
500
400
300
200
100
0
2
0
-2
25
30
35
40
45
50
55
60
65
500
400
300
200
100
0
t0C
Рис. 1. Зависимость изменения содержания азота концевых аминогрупп в гидролизуемой массе
при различных значениях температуры и продолжительности процесса:
а – поверхность отклика; б – изолинии сечений поверхности отклика
В начале автопротеолиза наблюдается относительно высокая скорость образования низкомолекулярных продуктов гидролиза, затем она снижается и остается практически неизменной при
дальнейшем проведении процесса. Таким образом, первая фаза процесса биотрансформации характеризуется относительно высокой скоростью, т. к. дезагрегированные белки подвергаются
дальнейшему превращению до низкомолекулярных продуктов гидролиза последовательно и одновременно, и в начальных продуктах автопротеолиза присутствует сложная смесь крупных белковых осколков и низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот. Дальнейшее протекание автопротеолиза характеризуется ростом глубины гидролиза, но интенсивность данного
процесса остается практически неизменной, т. к. в этот период происходит дальнейшее дезагрегирование белковых веществ до низкомолекулярных продуктов гидролиза [4, 6, 7].
На рис. 2 представлена зависимость изменения содержания азота тирозина в гидролизуемой массе.
122
Òåõíîëîãèÿ ïåðåðàáîòêè ãèäðîáèîíòîâ
26
24
22
продолжительность, час
20
18
16
14
12
10
8
6
4
300
250
200
150
100
2
0
-2
25
30
35
40
45
50
55
60
65
300
250
200
150
100
t0C
Рис. 2. Зависимость изменения содержания тирозина в гидролизуемой массе
при различных значениях температуры и продолжительности процесса:
а – поверхность отклика; б – изолинии сечений поверхности отклика
Согласно представленным данным, при анализе кривизны поверхности отклика и изолиний сечений оптимум процесса наблюдается в интервале от 50 до 55 ºС при максимальной продолжительности процесса 24–26 часов. В начале автопротеолиза наблюдается относительно высокая скорость образования тирозина, затем она снижается и остается практически неизменной
при дальнейшем проведении процесса. Снижение скорости ферментативной реакции происходит вследствие ингибирования низкомолекулярных продуктов гидролиза, а также протекания
обратных (синтетических) реакций в системах с ферментами, имеющими высокое сродство
к продуктам реакции, что приводит к снижению скорости расщепления субстрата на поздних
стадиях процесса [4, 7]. Этому способствует и исчерпание наиболее реакционноспособных связей в субстрате по мере его расщепления. Названные факторы ограничивают возможности ферментативного гидролиза субстратов в закрытой системе, т. е. в системе, где продукты гидролиза
не удаляются из ее сферы.
Таким образом, изучаемая фаршевая смесь представляет собой лабильную систему,
активность которой обусловлена комплексом протеолитических ферментов, относящихся как
к классу экзоферментов, так и эндоферментов. Установлено, что эндоферменты катализируют
неупорядоченное расщепление внутримолекулярных связей полимерной молекулы с образованием в начальной стадии гидролиза крупных фрагментов различной величины. Каталитическая
активность может проявляться в точках, удаленных от концов молекул, возможна как единичная, так и множественная атака субстрата, приводящая к быстрому снижению молекулярной
массы субстрата и вязкости его растворов. Экзоферменты катализируют последовательное
отщепление фрагментов равной величины, чаще мономеров или димеров, от определенного
конца полимерной молекулы. При этом молекулярная масса субстрата и его вязкость снижаются достаточно медленно [4, 7].
При действии экзогидролаз соотношение скорости прироста низкомолекулярных продуктов реакции и снижения вязкости раствора субстрата (в данном случае – разжижения гидролизуемой смеси) значительно выше, чем при действии эндоферментов. Измерение этого соотношения позволяет сделать заключение о характере процесса гидролитического расщепления
и отнести исследуемый комплекс ферментов к эндо- или экзосистемам. Исследованиями ряда
ученых установлено, что карбоксильные протеиназы (эндопептидазы), такие как пепсиногены
и синтезируемые из них пепсины, проявляют специфичность в отношении связей, образованных
аминогруппами тирозина или фенилаланина. Сериновые протеиназы, также относящиеся
к группе эндопептидаз (трипсин, химотрипсины А и В, химотрипсин С), которые первоначально
образуются также в виде предшественников (трипсиногена и химотрипсиногена), тоже катализируют неупорядоченное расщепление внутримолекулярных связей полимерной молекулы с образованием в начальной стадии гидролиза крупных фрагментов различной величины. Катепсины,
123
ISSN 2073-5529. Âåñòíèê ÀÃÒÓ. Ñåð.: Ðûáíîå õîçÿéñòâî. 2009. № 2
относящиеся к классу аспартильных эндопептидаз, активных в кислой среде и обеспечивающих
около 90 % общей протеолитической активности мышечной ткани гидробионтов. Кроме этого,
в процессе ферментативного гидролиза происходит образование фермент-субстратного комплекса, который претерпевает внутримолекулярную перегруппировку под влиянием активного центра
фермента. Катализированный разрыв ангидридной связи субстрата приводит к выделению
из фермент-субстратного комплекса одного из продуктов реакции. Второй продукт выделяется
после перегруппировок, связанных с присоединением молекул воды [4, 7]. Происходящие фермент-субстратные превращения оказывают свое влияние и на скорость ферментативной реакции.
Константа автопротеолиза рассчитывалась по уравнению первого порядка для начального
периода протеолиза, когда скорость реакции пропорциональна концентрации субстрата,
т. е. количеству непрореагировавшего вещества, а все прочие факторы еще не успели проявить
своего действия (рис. 3).
65
60
55
50
0
t ,C
45
40
35
30
25
0,04
0,03
0,02
0,01
0
20
15
0
2
4
6
8
10
12
14
0,04
0,03
0,02
0,01
0
рН
Рис.3. Динамика начальной скорости автопротеолиза (Ктир, с–1)
при различных значениях температуры, рН и продолжительности процесса:
а – поверхность отклика; б – изолинии сечений поверхности отклика
Анализ полученных данных показывает зависимость начальной скорости автопротеолиза
от рН и температуры, что согласуется с литературными данными [2, 4, 8]. Установлено, что для
комплекса протеолитических ферментов неразделанного маломерного сырья весеннего вылова
оптимальным при проведении процесса является естественное значение рН, которое фактически
создается для данного комплекса за счет ферментов мышечной ткани и ферментов желудочнокишечного тракта, оптимумы действия которых составляют соответственно 3,5–4,0 и 7,0–8,0.
Температурный оптимум для данной ферментативной системы составляет 50–55 ºС. При температуре выше 55 ºС денатурация ферментного белка резко усиливается, и, хотя скорость преобразования субстрата продолжает расти, активность ферментов, выражаемая количеством превращенного субстрата, снижается. Безусловно, температурный оптимум данной системы
обусловлен концентрацией и специфичностью субстрата, рН среды, гидромодулем.
Для изучения субстратной специфичности комплекса протеолитических ферментов и определения оптимума ферментативной реакции была изучена протеолитическая активность фаршевой системы при различных значениях концентрации водородных ионов. Динамика протеолитической активности фаршевой смеси при различных значениях рН представлена на рис. 4.
124
Òåõíîëîãèÿ ïåðåðàáîòêè ãèäðîáèîíòîâ
65
60
55
50
t 0,C
45
40
35
30
25
4
3
2
1
0
-1
20
15
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
4
3
2
1
0
-1
рН
Рис. 4. Динамика протеолитической активности неразделанного сырья
при различных значениях рН: а – поверхность отклика;
б – изолинии сечений поверхности отклика
Графическая зависимость протеолитической активности от рН фаршевой смеси показывает,
что максимальная протеолитическая активность ферментов фаршевой смеси проявляется при рН
8–10. Но проведение процесса биотрансформации при данном оптимальном значении рН не представляется возможным: хотя проведение щелочного гидролиза способствует сохранению ароматических аминокислот, разрушающее действие щелочи на незаменимые кислоты сырья цистин,
цистеин и метионин настолько велико, что снижает ценность щелочных гидролизатов.
Именно поэтому рекомендуемыми значениями рН при получении белковых продуктов
из густеры и синца, имеющих близкие технологические свойства, является естественное
значение рН – 6,3 ± 0,2.
Заключение
Таким образом, количественная оценка интенсивности ферментативного процесса по динамике содержания азота концевых аминогрупп, тирозина, изучение протеолитической активности рыбного сырья при различных значениях концентрации водородных ионов позволяет
предполагать определенную специфичность собственных пептидгидролаз рыбного неразделанного сырья, которые обладают несколькими каталитическими функциями. Трипсины рыбного
сырья гидролизуют не только белки, но и пептиды, пепсины расщепляют пептидные связи, образованные ароматическими аминокислотами (тирозин, фенилаланин), катепсины обнаруживают сходную субстратную специфичность с пепсинами, но в отличие от них медленно расщепляют мелкие пептиды.
В связи с этим при разработке режимов биотрансформации рыбного белка необходимо
учитывать субстратную специфичность собственных протеолитических ферментов как мышечной ткани, так и внутренних органов, получая таким образом ферментный комплекс, обладающий относительной специфичностью и широким спектром действия. Анализируя количественное соотношение полученных значений тирозина и азота концевых аминогрупп, можно рекомендовать конкретные технологические режимы получения белковых продуктов из определенной группы сырья, в частности густеры и синца, имеющих близкие технологические свойства.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
2.
3.
4.
Лазаревский А. А. Техно-химический контроль в рыбообрабатывающей промышленности. – М.: Пищепромиздат, 1955. – 512 с.
Черногорцев А. П., Разумовская Р. Г. Технология получения новых белковых продуктов: учеб. пособие для вузов. – Мурманск, 1999. – 76 с.
Полыгалина Г. В., Чередниченко В. С., Римарева Л. В. Определение активности ферментов: справ. –
М.: ДеЛи принт, 2003. – 375 с.
Мухин В. А. Разработка стратегии получения ферментативных белковых гидролизатов из тканей
морских гидробионтов: дис. ... д-ра биол. наук. – М., 2003. – 246 с.
125
ISSN 2073-5529. Âåñòíèê ÀÃÒÓ. Ñåð.: Ðûáíîå õîçÿéñòâî. 2009. № 2
5.
6.
7.
8.
Биотехнология морепродуктов / Л. С. Байдалинова, А. С. Лысова, О. Я. Мезенова и др. – М.: Мир,
2006. – 560 с.
Кизеветтер В. И. Биохимия сырья водного происхождения. – М.: Пищ. пром-сть, 1973. – 424 с.
Кислухина О. В. Ферменты в производстве пищи и кормов. – М.: ДеЛи принт, 2002. – 336 с.
Разумовская Р. Г., Цибизова М. Е. Биотехнологические процессы в создании продуктов различного
назначения из водного сырья: моногр. – Астрахань: Изд-во АГТУ, 2008. – 132 с.
Статья поступила в редакцию 2.11.2009
SUBSTRATUM SPECIFICITY
OF PROTEOLYTIC ENZYMES
OF UNTRADITIONAL TRADE OBJECTS
OF VOLGO-CASPIAN BASIN
M. E. Tsibizova, K. V. Kostyurina
The present stage of development of applied biotechnology is characterized by the development and perfection of biotechnological ways of processing
of raw material in food and fodder products for receiving albuminous products
of new generation. The quantitative estimation of dynamics of enzymatic process
and studying of proteolytic activity of fish raw materials allow to assume
a certain specificity of fish enzymes and to regulate the biotransformation process.
Key words: hydrobionts, biotransformation, hydrolysis depth, factors
of variation.
126