ВОДОРАСТВОРИМЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ АМФИФИЛЬНЫЕ

На правах рукописи
ГОРЯЧАЯ АНАСТАСИЯ ВАЛЕРЬЕВНА
ВОДОРАСТВОРИМЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ АМФИФИЛЬНЫЕ
ПОЛИМЕРЫ
Специальность: 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения
Автореферат
Диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Москва – 2009
Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете имени
Д.И.Менделеева
Научный руководитель
Официальные оппоненты
доктор химических наук,
профессор Штильман М.И.
доктор химических наук
профессор Коршак Ю.В.
доктор химических наук,
профессор Паписов И.М.
Ведущая организация
Институт нефтехимического
синтеза РАН им. А.В.Топчиева
Защита состоится «21» января 2009 г. в ___ на заседании Диссертационного
совета Д 212.204.01 в Российском химико-технологическом университете им.
Д.И.Менделеева (125047 Москва, Миусская площадь, д.9.) в ауд. 443
С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ
им. Д.И.Менделеева
Автореферат разослан «_____»____________ 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.204.01,
кандидат технических наук
Ю.М.Будницкий
1.ВВЕДЕНИЕ
Актуальность исследования. В последние несколько десятилетий заметно
вырос интерес к наноразмерным материалам, как новому поколению
фармацевтически перспективных систем.
Типичными и достаточно хорошо исследованными наноразмерными
структурами, нашедшими применение, в том числе в фармацевтической технологии,
являются липосомы, представляющие собой мицеллярные водосовместимые системы
на основе липидов. Липосомы могут быть эффективно использованы для
лиофилизации плохо растворимых в воде препаратов и пролонгирования их действия
за счет иммобилизации в липосомальных структурах.
В то же время, несмотря на свою привлекательность при использовании в
качестве носителей лекарственных препаратов, основывающуюся на безвредности
липидов и их высокой способности к самоагрегации, липосомы имеют ряд
существенных недостатков.
В первую очередь это относится к недостаточной устойчивости липосом в
среде биологических жидкостей, их склонности к захвату клетками ретикулоэндотелиальной системы, наконец, высокой стоимости липидов и их неустойчивости
при хранении.
Наиболее широко используемым методом устранения этих недостатков
липосом является модификация липосомальных мембран водорастворимыми
амфифильными полимерами, содержащими в структуре гидрофильные и
гидрофобные блоки. Такие полимеры, встраиваясь гидрофобными фрагментами в
липидные слои, образуют на поверхности липосом слой гидрофильных фрагментов,
защищающих их от разрушающих воздействий.
В настоящее время основным типом амфифильных полимеров, применяемых
для модификации липосом, являются амфифильные производные полиэтиленоксида –
относительно низкомолекулярный полиэтиленгликоль, содержащий одну или две
концевые
гидрофобные
группы,
и
блоксополимеры
полиэтилени
полипропиленоксидов (плюроники).
Существенно, что амфифильные полимеры способны образовывать
агрегированые наноразмерные структуры, которые представляют самостоятельный
интерес. Причем, варьируя химическое строение синтезируемых макромолекул,
удается эффективно управлять процессом молекулярной сборки, добиваясь
получения наносистем различного строения.
3
Можно отметить ряд областей использования наносистем на основе
амфифильных полимеров, например, фармацевтическую химию, хроматогрфию,
процессы эмульсионной полимеризации, косметологию, биотехнологию, биохимию.
Однако ряд недостатков агрегатов на основе полиэтиленоксида ограничивает
их эффективность. Среди таких недостатков можно отметить сложности
дополнительной функционализации таких полимеров, что затрудняет возможность
введения в них группировок-векторов, обеспечивающих транспорт всей системы к
пораженному органу. С другой стороны до сих пор окончательно не ясны аспекты
токсикологии полимеров этиленгликоля.
Все это определило необходимость поиска альтернативных производных
амфифильных полимеров, которые могут быть использованы для создания
функционализованных липосомальных мембран и агрегатов.
В данной работе для создания таких систем были использованы производные
поли-N-винилпирролидона, который широко используется в качестве компонента
различных лекарственных систем.
Однако, к началу данной работы функциональные амфифильные полимеры
карбоцепных водорастворимых полимеров, в первую очередь поли-Nвинилпирролидона, разработаны не были.
Поэтому данная работа была направлена на разработку метода синтеза
амфифильных производных полимеров N-винилпирролидона, содержащих
дополнительные функциональные группы, их исследование и выявление
возможности применения. Определенное внимание в работе было уделено также
синтезу и исследованию функциональных амфифильных полимеров акриламида.
Цели и задачи исследования. Целью работы является разработка методов
синтеза амфифильных полимеров винилпирролидона и акриламида, способных к
образованию самоорганизующихся в водных растворах наноразмерных систем и
содержащих боковые функциональные группы в полимерном фрагменте,
исследование их свойств и первичное изучение биологической активности
разработанных полимеров.
Научная новизна.
• Показано, что радикальная полимеризация N-винилпирролидона и акриламида в
присутствии инициатора радикальной полимеризации (азодиизобутиронитрила) и
хлорангидрида длинноцепной монокарбоновой кислоты (на примере
стеароилхлорида)
приводит
к
получению
новых
водорастворимых
низкомолекулярных амфифильных поли-N-винилпирролидона и полиакриламида,
4
содержащих один концевой стеароильный фрагмент, связанный с основной цепью
кетонной группой.
• Разработаны методы синтеза новых функциональных амфифильных полимеров,
содержащих боковые функциональные группы в полимерном фрагменте –
эпоксидные и аминокислотные – для амфифильного поли-N-винилпирролидона и
третичные аминные – для амфифильного полиакриламида. С использованием
модифицированной реакции Дарзана разработан метод синтеза амфифильных
полимеров N-винилпирролидона, содержащих боковые эпоксидные группы, на
основе которых могут быть получены биологически активные аминокислотные
производные и их комплексы с переходными металлами.
• Установлено, что такие функциональные амфифильные полимеры образуют в
водных системах организованные наноразмерные агрегаты.
• Показано, что амфифильные полимеры с боковыми аминокислотными группами
обладают адъювантной активностью при комплексовании с гаптенами, а их
комплексы с переходными металлами являются индукторами интерферона.
Установлено, что аминосодержащий амфифильный полиакриламид образует
комплексы с нуклеиновыми кислотами.
Практическая значимость. Показано, что полученные функциональные
амфифильные полимеры N-винилпирролидона и акриламида могут быть
использованы в качестве носителей биологически активных веществ и систем с
собственной биологической активностью.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на
Международной конференции молодых ученых по химии и химической технологии
«МКХТ – 2004» (Москва, 2004); Всероссийской конференции «Молодые ученые и
инновационные химические технологии» (Москва, 2007); Международных
конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов2005» и «Ломоносов-2007» (Москва, 2005 и 2007); 4-ом международном конгрессе
«Biotechnology: State of the art and prospects of development» (Москва, 2007);
международных конференциях 11th W. Mejbaum-Katzenellenbogen´s Molecular Biology
Seminars on Amphiphiles and Their Supramelecular Aggregates in Basic and Applied
Science (Вроцлав, Польша, 2005); «New Polymers and Radioprotectors for Biology and
Medicine» (Ереван, Республика Армения, 2007).
Публикации. Основные положения и результаты работы изложены в 10-ти
печатных работах, в том числе, 3-х статьях в журналах и сборниках, 7-ми тезисах
докладов.
5
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 133 страницах, состоит
из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части,
выводов, списка литературы; содержит 10 таблиц, 26 рисунков, 128
библиографических ссылок.
2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
2.1. Обоснование выбора метода синтеза амфифильных полимеров Nвинилпирролидона и акриламида
Задачей данной работы явилась разработка амфифильных полимеров Nвинилпирролидона и акриламида, содержащих боковые функциональные группы,
способных образовывать наноразмерные агрегаты и пригодных для иммобилизации
различных биологически активных лигандов и создания систем, обладающих
собственной биологической активностью.
В настоящее время описано большое число различных функциональных
производных поли-N-винилпирролидона и акриламида, в основном получаемых
сополимеризацией этих мономеров с функциональными сомономерами. Однако,
функциональные производные амфифильного поли-N-винилпирролидона и
полиакриламида описаны не были.
Известные к началу данной работы амфифильные полимеры Nвинилпирролидона и акриламида были получены двухстадийным методом с
использованием на первой стадии полимеризации в присутствии функционального
меркаптана с последующим связыванием образовавшегося полимера (n=15-90) с
концевым гидрофобным алифатическим фрагментом (С6-С17) амидной группой.
Образовавшаяся в данном случае амидная группа, способная к гидролизу,
могла частично или полностью разрушиться при вступлении амфифильного полимера
в дальнейшие химические превращения, что затрудняло получение целевых
продуктов. С другой стороны, синтез функциональных полимеров сополимеризацией
соответствующих мономеров двухстадийным методом также был неприменим из-за
возможности побочных реакций и сложности регулирования молекулярной массы
полимеров.
В данной работе для получения целевых продуктов были использованы
полимераналогичные превращения заранее приготовленных амфифильных
полимеров, не содержащих распадающихся групп в основной цепи амфифильной
макромолекулы.
Конкретно, в данной работе был использован новый метод синтеза
амфифильных полимеров винилпирролидона и акриламида, заключающийся в
6
проведении полимеризации мономера в присутствии инициатора радикальной
полимеризации (в данном случае азодиизобутиронитрила) и используемого в качестве
передатчика и одновременно обрывателя цепи хлорангидрида кислоты, в данном
случае стеароилхлорида.
При этом длинноцепной алифатический фрагмент стеариновой кислоты входил
в состав радикала, инициирующего рост цепи при полимеризации по схеме,
основными реакциями которой являются распад использующегося инициатора
(азодиизобутиронитрила) с образованием двух первичных радикалов (R0·),
взаимодействие этих радикалов с молекулой хлорангидрида с отрывом атома хлора и
образованием вторичного ацильного радикала (R1·) и нитрила α-хлоризомасляной
кислоты, инициирование радикалами (R1·) полимеризации соответствующего
мономера (N-винилпирролидона и акриламида) и обрыв цепи за счет отрыва атома
хлора от молекулы хлорангидрида концевым радикалом растущей макромолекулы
(R2·):
CH3
2 N C C + N2
CH3
CH3
CH3
NC C N N C CN
CH3
CH3
.
R0 +
.
.
+
.
R0
O
Cl C C17H35
R1 + nM
R2
.
R0 Cl +
O
C
C17H35
M
.
R2
O
Cl C C17H35
.
.
O
C C17H35
.
R1
n
.
R2 Cl + R1
Таким образом, молекула хлорангидрида является в данном случае
одновременно передатчиком, т.е. источником радикалов, инициирующих рост цепи, и
обрывателем цепи. При этом атом хлора занимает место концевой группы. Вторую
концевую группу образует алкильный радикал хлорангидрида, соединенный с
основной цепью кетонной группой.
В данной схеме не учитываются реакции обрыва цепи и дезактивация
имеющихся в системе радикалов, в частности, за счет рекомбинации.
Подобные процессы описаны в литературе и их протекание в данном случае
было подтверждены радом методов.
Так, приведенная схема предполагает инициирование роста цепи радикалом
(С17Н35-СО·) (R1·) с введением на один конец цепи кетогруппы между α-углеродом
7
радикала С17Н35 и углеродом начала основной цепи. Эта кетогруппа была определена
функциональным анализом методом оксимирования. Это позволяло не только
определить количество кетогрупп в полимере, но и определить значение
среднечисловой молекулярной массы полимера, учитывая, что кетогруппа
расположена на одном конце макромолекулы.
Последнее было подтверждено совпадением значений Мn, определенных по
этой концевой группе и альтернативным методом – осмометрией и элементным
анализом на содержание хлора, встающего по предложенной схеме на другой конец
полимерной цепи, что было вполне достоверно показано для более
низкомолекулярных полимеров.
Протекание реакции полимеризации с участием хлорангидрида стеариновой
кислоты как передатчика и обрывателя цепи косвенно было подтверждено также
исследованием
кинетики
реакции
полимеризации
N-винилпирролидона
дилатометрическим методом, позволяющим определить скорость полимеризации
исходя из объема реакционной смеси.
В этом случае исследование зависимости усадки реакционной системы в
капилляре от количества, введенного в реакцию азодиизобутиронитрила, в
присутствии хлорангидрида стеариновой кислоты показало, что увеличение
количества азодиизобутиронитрила, как и ожидалось, приводит в этих условиях к
повышению скорости образования полимера. С другой стороны, при изменении
количества вводимого в реакцию хлорангидрида его небольшие количества
повышают наблюдаемую скорость процесса. При дальнейшем увеличении
концентрации хлорангидрида скорость полимеризации падает.
Наблюдаемая картина может быть объяснена рассмотрением суммарной схемы
основных реакций.
В этом случае константа передачи цепи на регулятор Cs для хлорангидрида
стеариновой кислоты, найденная графически по тангенсу угла наклона из
зависимости обратной степени полимеризации от концентрации хлорангидрида
стеариновой кислоты оказалась равной 379.
При этом, так как константа передачи цепи на регулятор описывается
известным уравнением:
Cs = kПS/kР,
где kПS – константа скорости передачи цепи на регулятор, а kР – константа скорости
роста цепи, то полученные значения Cs показывают, что для хлорангидрида
стеариновой кислоты скорость передачи цепи во много раз превосходит скорость
роста цепи, и, следовательно, в процессе полимеризации N-винилпирролидона на
8
стадии обрыва цепи превалирует реакция отрыва растущим макрорадикалом атома
хлора от молекулы хлорангидрида с образованием нового радикала, содержащего
группу, входящую в состав хлорангидрида, который инициирует полимеризацию.
Таким образом, в данном случае требуемые продукты, не содержащие амидной
группы между полимерным фрагментом и концевой гидрофобной группой, были
синтезированы одностадийным методом, причем между указанными фрагментами в
цепи полимера содержалась негидролизуемая кетонная группа.
2.2. Синтез амфифильных полимеров N-винилпирролидона и акриламида
Для выявления оптимальных условий синтеза полимеров N-винилпирролидона
и акриламида с заданными характеристиками была проведена полимеризация этих
мономеров с варьированием основных условий полимеризации (концентрация
мономеров, инициатора и регулятора, температура реакции).
Основываясь на полученных данных, рассмотренных в предыдущем разделе,
суммарная схема получения полимеров может быть представлена следующим
образом:
O
O
ДАК
H2C CH
Cl
n H2C CH
+ Cl C C17H35 диоксан C17H35 C
n
N
N
O
O
n H2C CH
C
+
O
O
ДАК
Cl C C17H35 диоксан
C17H35
O
C
H2C CH
C
NH2
Cl
O n
NH2
Существенно, что во всех случаях полимеры на последней стадии были
очищены диализом. Имеющиеся диализные мешки не позволяют удержать в своем
объеме низкомолекулярные полимеры (до 5-8 тыс.), которые достаточно легко
проникают через диализные мембраны. Это было выяснено ранее при синтезе
низкомолекулярных неамфифильных полимеров N-винилпирролидона и акриламида.
Очистка полимеров N-винилпирролидона и акриламида методом диализа в
случае амфифильных полимеров оказалась возможной потому, что в водной среде,
как это будет показано далее, они образуют достаточно крупные агрегаты размером
до нескольких сотен нм. Такие агрегаты не проходят через диализные мембраны и
могут быть отделены от неассоциированных полимерных макромолекул и
низкомолекулярных примесей.
9
Хотя, вероятно, при более высоких соотношениях азодиизобутиронитрила и
хлорангидрида часть радикалов, инициирующих цепь, будут являться первичными
радикалами распада азодиизобутиронитрила, а обрыв цепи будет протекать не только
с участием атомов хлора, но и по обычным механизмам. Однако образующиеся в
данном случае неамфифильные полимеры проходят через использующуюся
диализную мембрану и для исследования и дальнейших химических превращений
используются только амфифильные полимеры, вошедшие в состав агрегатов.
2.2.1. Полимеризация N-винилпирролидона
При синтезе амфифильного поли-N-винилпирролидона реакцию проводили в
среде сухого диоксана в пробирках с притертыми пробками, заполненных аргоном.
После проведения реакции образовавшийся полимер осаждали в диэтиловый эфир,
отмывали осадителем, сушили в вакууме. После этого очистку амфифильного
полимера проводили диализом в течение суток. По окончании диализа содержимое
диализных мешков сушили лиофильно, а затем в вакуумном пистолете.
Влияние концентрации мономеров в растворе на выход и молекулярную массу
поли-N-винилпирролидона при постоянном соотношении мономера, инициатора (1
масс.% от количества мономера) и регулятора (2 масс.% от количества мономера)
представлено на рис. 1.
Как видно, зависимость имеет экстремальный характер. Возрастание выхода и
молекулярной массы при увеличении концентрации мономера до оптимальной
определяется большей возможностью соударения растущей полимерной цепи и
молекул мономера в условиях наличия конкурирующих процессов обрыва цепи.
Дальнейшее повышение концентрации мономера приводит к возрастанию
вязкости реакционной среды, уменьшению подвижности растущих радикалов,
затруднению диффузии молекул мономера, а также к возрастанию роли процессов,
приводящих к обрыву цепи.
Кроме того, повышение концентрации нарушает изотермичность процесса,
затрудняет отвод тепла из реакционной смеси, что приводит к появлению местных
перегревов и деструкционных процессов. Эти факторы понижают молекулярную
массу и выход. Влияние концентрации азодиизобутиронитрила на молекулярную
массу и выход полимеров показано на рис.2.
Повышение концентрации инициатора приводит к возрастанию выхода
полимера до оптимальных количеств инициатора (1-1,5 мол.%). Дальнейшее
повышение количества введённого инициатора приводит к снижению выхода
полимера. Уменьшение выхода полимера при сравнительно высоких концентрациях
10
20
16
12
8
молекулярная масса
4
-3
0
0
выход, %
24
выход
молекулярная масса ×10
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
20
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
40
60
[ВП], мас. %
80
100
-3
20
16
12
8
молекулярная масса
4
0
0
0,4
0,8
1,2
[ДАК], мол. %
Рис. 1. Зависимость выхода и
молекулярной массы поли-Nвинилпирролидона
от
концентрации
мономера
в
реакционной смеси.
([ДАК] = 1 масс.%, [ХАСК] = 2
масс.%, температура 70○С, время
– 3 часа, растворитель – диоксан)
24
выход
молекулярная масса ×10
выход, %
инициатора, возможно, объясняется образованием в системе некоторого количества
неамфифильного полимера, который уходит через диализную мембрану.
Молекулярная масса полимера при увеличении количества инициатора, как и
следовало ожидать, снижается.
1,6
Рис. 2. Зависимость выхода и
молекулярной массы поли-Nвинилпирролидона
от
концентрации инициатора.
([ВП] = 25 масс.%, [ХАСК] = 2
масс.%, температура 70○С, время
– 3 часа, растворитель – диоксан)
2
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
-3
24
20
выход
16
12
8
4
молекулярная масса
0
50
60
70
80
Температура, °С
90
100
11
молекулярная масса ×10
выход, %
Проведение реакции полимеризации при различных температурах показало,
что выход выделяемых продуктов с повышением температуры растёт до 70-90%
(рис.3). С другой стороны, их молекулярная масса при этом падает.
Рис. 3. Зависимость выхода и
молекулярной массы полимеров
от температуры полимеризации.
([ВП] = 25 масс.%, [ХАСК] = 2
масс.%, [ДАК] = 1 масс.%, время –
3 часа, растворитель – диоксан)
100
90
24
молекулярная масса 10
выход, %
20
-3
Рис. 4. Зависимость выхода и
70
молекулярной массы полимера от
16
выход
60
соотношения
N50
12
винилпирролидона
(ВП)
и
40
8
30
хлорангидрида
стеариновой
20
кислоты (ХАСК).
4
10
молекулярная масса
([ВП]= 25 масс.%, [ДАК] = 1
0
0
масс.%, температура 70○С, время
0
4
8
12
16
ХАСК/ВП, мол. %
– 3 часа растворитель – диоксан)
Повышение выхода полимера в начальном диапазоне температур объясняется
стандартными причинами. Так, в связи с тем, что энергия активации реакции
инициирования велика по сравнению с энергией активации реакции роста и обрыва
цепи, повышение температуры значительно больше влияет на инициирование, чем на
рост и обрыв. Вследствие этого скорость инициирования возрастает.
Увеличение
скорости
инициирования
сопровождается
возрастанием
концентрации свободных радикалов, что приводит к ускорению всех элементарных
актов полимеризации, в том числе и скоростей обрыва. Кроме того, повышение
температуры усиливает реакции передачи цепи, реакции деструкции. Это находит
отражение в увеличении доли низкомолекулярных фракций.
Влияние количества введенного регулятора по отношению к мономеру
приведено на рис.4. В этом случае молекулярная масса полимера для опытов,
проведенных в отсутствии регулятора (3 параллельных опыта) и при его небольшом
количестве (1 мол.%, равный ~ 2,7 масс.%) определяли вискозиметрически. Как
видно, при увеличении введённого количества хлорангидрида и выход и
молекулярная масса уменьшаются, что связано с увеличением скорости обрыва цепи.
Аналогичные исследования были проведены для полимеризации в присутствии
хлорангидрида стеариновой кислоты акриламида. Эти данные приведены в тексте
диссертации.
Таким образом, результаты, приведенные в этом разделе, позволили выявить
условия получения требуемых полимеров с заданной молекулярной массой и
наиболее высокими выходами.
80
2.2.2. Строение полученных амфифильных полимеров
Строение полученных полимеров было подтверждено функциональным
анализом концевых групп, а также определением молекулярной массы
осмометрическим методом. Совпадение элементов функционального анализа
концевых групп и данных паровой осмометрии подтвердили, что полученные
12
соединения представляют собой относительно низкомолекулярные продукты
полимеризации, содержащие в каждой макромолекуле две различные концевые
группы, одна из которых является гидрофобным стеарильным фрагментом (таблица
1).
Таблица 1.
Молекулярные массы амфифильных полимеров
*
Mn
среднечисловая
молекулярная
масса,
определенная
методом
потенциометрического титрования
Mn** - среднечисловая молекулярная масса, определенная, методом паровой
осмометрии
Строение полимера
Mn*
Mn**
Cl
Cl
CH CH2
N
O
CH CH2
O
C
NH2
O
C C17H35
n
O
C C17H35
n
9700
9500
6300
6400
4200
4100
2150
2100
2050
1950
9500
9600
8350
8200
7400
7550
5200
5300
4100
3950
Все эти полимеры были очищены диализом.
Из данных приведенных в таблице 1 видно, что среднечисловые молекулярные
массы, определенные независимыми методами, практически совпадают во всех
случаях. Это является подтверждением, что во всех этих случаях образуются
полимеры, содержащие одну концевую гидрофобную группу.
Строение полученных амфифильных полимеров было подтверждено ИК- и ЯМРспектральными анализами.
Так, на ИК-спектре амфифильных полимеров (таблетки в КВг) различима
область поглощения кетогруппы (1616 см-1), проявляется близко от поглощения
карбонила амидной группы (1660 см-1), интенсивность которой повышается с
уменьшением молекулярной массы полимера. Также наблюдалось увеличение
интенсивности поглощения метиленовых групп из-за введения концевых стеарильных
фрагментов.
Например, для амфифильного полиакриламида при увеличении количеств
вводимого в реакционную систему хлорангидрида увеличивается соотношение
13
интенсивности поглощения полос, соответствующих метиленовым группам (полоса
2936) по отношению к аминогруппам незамещенного амида (полоса 3174). Для
немодифицированного полиакриламида соотношение этих полос составляет
примерно 0,5, для амфифильного полимера, содержащего 0,5 масс.% ХАСК 0,58, для
полимера, содержащего 1 масс.% ХАСК – 0,71, что указывает на увеличение
количеств СН2-групп, и, следовательно, на уменьшение молекулярной массы
полимера при возрастающем содержании хлорангидрида в системе.
Строение полученных полимеров было подтверждено также методом ЯМР
13
спектроскопии.
Так,
на
С-ЯМР
спектре
амфифильного
полимера
N-винилпирролидона, видны пики, соответствующие атомам углерода CH2-групп
октадецильного радикала (химические сдвиги в области, соответствующей
алифатическим СН2-группам, 17,59 и 15,43 м.д.), а также сигналы, отвечающие
карбонильным атомам углерода в молекуле амфифильного ПВП (химический сдвиг
178,34 м.д.), а также атомам углерода CH2-групп ПВП, соответствующих
гидрофильной части молекулы, в частности пирролидоновому кольцу (химический
сдвиг 18,27; 31,66 и 43,18 м.д.) и винильным атомам углерода (химический сдвиг
34,36 и 45,46 м. д.).
2.3. Синтез функциональных производных амфифильных полимеров Nвинилпирролидона и акриламида
2.3.1. Синтез амфифильных полимеров N-винилпирролидона, содержащих
боковые эпоксидные группы
Введение эпоксидных групп в амфифильные полимеры N-винилпирролидона
позволило проводить с участием получаемых при этом продуктов дальнейшие
химические превращения. Для введения в поли-N-винилпирролидон эпоксидных
групп была использована модифицированная реакция Дарзана, применительно для
данного случая, заключающаяся во взаимодействии карбонила пирролидонового
кольца ПВП с хлорацетамидом в присутствии этилата натрия.
Общая схема реакции может быть представлена следующим образом:
C17H35
O
C
ClCH2 C
CH2 CH
Cl
x
N
C17H35 C
O
O
HC
O C
NH2
O
NH2
C2H5ONa, C2H5OH
- NaCl
CH2 CH
N
CH2 CH
m
N
O
14
C
n
Cl
x
CH C NH2
O
O
В работе согласно данному процессу были получены амфифильные полимеры
N-винилпирролидона, содержащие в поли-N-винилпирролидоновом фрагменте
8,7 мол.% звеньев с эпоксидными группами.
Реакцию проводили при концентрации полимера 15 % масс. при 10оС в течение
5,5 часов. В качестве растворителя использовали абсолютированный этанол. Для
связывания выделяющегося в ходе реакции HCl использовали раствор этилата натрия
или метилат натрия. Выделившийся полимер отделяли центрифугированием,
промывали холодным абсолютированным этанолом и высушивали в вакууме при
комнатной температуре.
2.3.2. Синтез амфифильных полимеров N-винилпирролидона, содержащих
аминокислотные остатки
Наличие в полученных полимерах эпоксидных групп было использовано для
введения в них фрагментов аминокислот, что позволяло получать продукты,
обладающие собственной биологической активностью и способностью к
комплексованию с биогенными переходными металлами. Для получения полимеров с
иммобилизованными остатками аминокислот проводилась дальнейшая модификация
эпоксидсодержащих полимеров аминокислотами различного строения, содержащих
между амино и карбоксильной группами н-алкиленовые радикалы различной длины глицином, β-аланином, γ-аминомасляной кислотой.
При этом ранее было показано, что при взаимодействии аминокислот с
используемыми в данном случае дизамещенными эпоксидами реакция протекает с
присоединением остатка кислоты к спиро-атому углерода и процесс может быть
представлен следующим образом:
C17H35 C
CH2 CH
O
HC
O C
NH2
C17H35
N
C
m
CH2
N
C O
CH2 CH
HO CH NH
O C
R
NH2 COOH
R=
CH2 CH
CH2
N
2
n x
C CH C NH2
O
O
CH2 CH
m
N
C O
CH2
Cl + H2N R COOH
3
15
n-k
H2O
NaOH
CH2 CH
CH C NH2
C
NH OH O
R
COOH
N
Cl
k
x
C CH C NH2
OH OH O
С целью синтеза модифицированных полимеров была применена методика, по
которой ЭПВП (содержание эпоксидных групп примерно 8-9 мол.%) и
соответствующую аминокислоту (соотношение 1:20) растворяли в дистиллированной
воде и при перемешивании вводили водный раствор гидроксида натрия.
Таблица 2.
Продукты реакции амфифильного полимера N-винилпирролидона
(Мn = 6000) с аминокислотами
(Температура 25 °С, [Амф.ПВП] = 5 масс.%, растворитель – вода, соотношение
АК/Амф.ПВП = 1,8 моль/осново-моль, содержание эпоксидных групп 8,9 мол.%)
Глицин
Содержание в
полимере остатков
аминокислот, мол.%
6,9
Степень превращения
эпоксидных групп,
мол.%
77,5
β-Аланин
7,5
84,3
γ-Аминомасляная кислота
7,9
88,7
Аминокислота
Реакцию проводили в течение 4 часов при комнатной температуре.
Полученные полимеры очищали диализом.
Хотя полного замещения эпоксидных групп на аминокислотные остатки не
происходит, степень их превращения была высокая – 77-89 мол.% (Таблица 2). При
этом функциональный анализ на эпоксидную группу показывает, что в
модифицированных полимерах отсутствуют реакционноспособные эпоксидные
группы.
2.3.3. Синтез полимерных металлокомплексов
Водорастворимые полимерные металлокомплексы представляют интерес как
основа для создания препаратов с различной биологической активностью. В данной
работе, основываясь на литературных данных, для получения полимерных
комплексов были выбраны два элемента – кобальт и медь (оба металла являются d
элементами). Такие полимеры были получены на основе модифицированного
эпоксидированного поливинилпирролидона, содержащего аминокислотные остатки
β-аланина, с последующим получением полимерных металлокомплексов.
Полимерные металлокомплексы были получены путем смешения ацетоновых
растворов хлорида кобальта и хлорида меди с разбавленными растворами полимеров
в смеси растворителе этанол-ацетон (3:1). Смесь перемешивали и концентрировали на
роторном испарителе до выпадения осадка, который экстрагировали ацетоном на
16
приборе Сокслета и высушивали в вакууме. При этом ранее было установлено, что
полимерные металлокомплексы для аминокислот с коротким радикалом между
аминной и карбоксильной группами образуются с участием двух аминокислотных
остатков.
Содержание металла в полученных полимерах было определено атомноадсорбционной спектроскопией (табл. 3).
Таблица 3.
Содержание металла в металлокомплексах на основе амфифильного поли-Nвинилпирролидона с концевой стеароильной группой (ЭПВП-СК) и боковыми
фрагментами β-аланина (М =6000)
Содержание Co2+
Cодержание Cu2+
Полимерный
Степень
Степень
металлокомплекс Масс.%
Масс.%
превращения, %
превращения, %
ЭПВП-СК-β-
5,44
аланин
62,53
7,91
90,92
При растворении в воде комплексов, полученных при взаимодействии
полимеров, содержащих остатки β-аланина, с CoCl2 образуются растворы розового
цвета, тогда как в сухом виде образцы имели голубую окраску. Комплекс,
полученный с участием CuCl2, в сухом виде имеет светло-зеленую окраску, а в
растворе
бледно-зелено-голубую.
Изменение
окраски
при
растворении
свидетельствует об образовании аква-комплексов.
2.3.4. Синтез амфифильных полимеров акриламида, содержащих боковые
аминогруппы
Амфифильные полимеры, способные образовывать агрегаты и содержащие
третичные аминогруппы, представляют интерес как носители различных кислых
биологически активных лигандов.
C 17H 35 C
O
CH 2 CH
C 17H 35 C
O
C O
NH 2
n
Cl + H 2NCH 2CH 2N(CH 3)2
CH 2 CH
CH 2 CH
C Om
NH 2
17
DMSO
- NH 3
Cl
C Ok
NHCH 2CH 2N(CH 3)2
В работе такие полимеры были получены реакцией полиакриламида,
содержащего одну концевую гидрофобную стеароильную группу, с N,Nдиметилэтилендиамином. В результате переамидирования с выделением аммиака
образовывались растворимые системы, способные к агрегации с образованием
мицелл, содержащих третичные аминогруппы.
В рассматриваемой реакции использовали амфифильный полиакриламид с
молекулярной массой 5200. Реакцию проводили в течение 6 часов в среде сухого
диметилсульфоксида при температуре 80 оС. Полученный полимер осаждали в
абсолютированный этанол. Затем полимер декантировали и растворяли в
дистиллированной воде, и доводили рН раствора до нейтрального значения.
Полученный раствор диализовали против воды в течение четырех суток и сушили
лиофильно. Выход модифицированного полимера составил 68%. Методом
потенциометрического титрования было определено количество аминогрупп в
полученном полимере, оно составило 7% мол.
2.4. Исследование свойств синтезированных амфифильных полимеров
2.4.1. Определение критической концентрации агрегации амфифильных
полимеров N-винилпирролидона
В работе были изучены поведение синтезированных полимеров в водных
средах, процессы самоассоциации и образования полимерных агрегатов такими
полимерами, и основные свойства образующихся полимерных наночастиц.
Т.к. полученные амфифильные производные водорастворимых поли-Nвинилпирролидона и полиакриламида содержат гидрофобные и гидрофильные
фрагменты они образуют в воде наноразмерные частицы по типу «ядро-оболочка», в
которых гидрофобный концевой фрагмент полимеров направлен к ядру, а
гидрофильные фрагменты направлены в сторону внешней оболочки наночастиц.
Способность синтезированных амфифильных полимеров образовывать
агрегаты в водных растворах была подтверждена на примере амфифильных
полимеров N-винилпирролидона с различной молекулярной массой и амфифильного
полимера, содержащего боковую группу аминокислоты глицина.
Для этих полимеров были определены критические концентрации
мицеллобразования (ККМ) стандартным методом, основанным на солюбилизации
амфифильными
полимерами
водонерастворимого
флуоресцентного
зонда,
флуоресценция которого увеличивалась при переносе из воды в мицеллярную фазу.
В качестве флуоресцентного зонда в данной работе использовали 1,3,5дифенилгексатриен (ДФГТ). Значения ККМ были определены из зависимости
18
интенсивности флуоресценции включенной в полимерные частицы флуоресцентной
метки от концентрации исследованных амфифильных полимеров в буферном
растворе.
Как следует из данных таблицы 4, величины ККМ для всех полимеров лежат в
интервале 0,2-0,3 масс. % и возрастают с увеличением молекулярной массы. Видно,
что значения ККМ для всех образцов полимеров составляют десятые доли массовых
процентов, т.е. синтезированные полимеры образуют агрегаты при относительно
небольших концентрациях.
Таблица 4.
Величины ККМ для полимеров в водно-солевом растворе.
Строение
полимера*
Критическая
Молекулярная
концентрация
масса
мицеллополимерного
образования,
фрагмента
% масс
Гидродинамический
радиус,
нм
ПВП-CO-C17H35
2200
0,2
15
ПВП-CO-C17H35
4500
0,24
43
ПВП-CO-C17H35
6000
0,3
65
ЭПВП-CO-C17H35Глицин
5800
0,21
72
* ПВП-CO-C17H35 – амфифильные полимеры N-винилпирролидона с одной
стеарильной группой. ЭПВП-CO-C17H35-Глицин – амфифильный полимер Nвинилпирролидона с одной стеарильной группой, содержащий боковую
глицильную группировку (6,9 мол.%), полученный на основе амфифильного
эпоксидсодержащего поли-N-винилпирролидона
Способность амфифильных полимеров к образованию организованных
структур с увеличением молекулярной массы несколько снижается при одинаковой
длине гидрофобного фрагмента. Следует отметить, что полимеры с более низкими
молекулярными массами плохо растворимы в воде. Снижение молекулярной массы в
рассмотренном ряду полимеров не только уменьшает критическую концентрацию
мицеллообразования, но и приводит к образованию мицелл меньшего размера. Также
как и в случае оценки значений ККМ, исследование размеров образующихся мицелл
показывает, что введение в полимер боковых аминокислотных остатков при
одинаковых молекулярных массах приводит к образованию более компактных
мицелл.
19
2.4.2. Возможность модификации липидных слоев
Для подтверждения способности синтезированных полимеров к встраиванию в
липидные слои были проанализированы изотермы сжатия ленгмюровских пленок,
полученных при нанесении на поверхность водной фазы спиртовых растворов
полимер-липидных смесей. Как известно, встраивание полимеров в липидные слои в
этом случае подтверждается сдвигом изотермы в область меньших значений степеней
сжатия слоя. В работе факт встраивания подтвержден исследованием поведения
системы фосфатидилхолин – амфифильный поли-N-винилпирролидон (М = 4000).
Эти результаты подтверждают известные данные о повышении устойчивости
липосом при включении в их оболочки амфифильных полимеров Nвинилпирролидона.
2.5. Исследование токсичности полимеров и возможности их применения в
медико-биологических областях
Цитотоксичность. С целью предварительной оценки уровня безвредности
синтезированных полимеров было проведено определение цитотоксичности образцов
амфифильных полимеров различного строения. Исследования проводили в НИИ
эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалея.
Исследование цитотоксичности полимеров проводили на клетках карциномы
молочной железы человека MCF7/R. Уровень токсичности определяли по количеству
выживших клеток.
Как было показано, синтезированные амфифильные полимеры Nвинилпирролидона не проявляют заметной цитотоксичности в рассмотренном
диапазоне концентраций (вплоть до концентрации 2%).
Подтверждение низкого уровня токсичности синтезированных полимеров
получено
также
в
предварительных
опытах
по
исследованию
их
интерферонстимулирующей активности.
Интерферонстимулирующая и антивирусная активность. В данном случае
было исследовано действие водорастворимых производных полимеров на основе
амфифильного поли-N-винилпирролидона и металлокомплексов на его основе на
определенные культуры ткани. В качестве культуры ткани использовались клетки,
полученные из музея клеточных культур им. Д.И. Ивановского РАМН.
Было установлено, что полимерные производные аминокислот и их комплексы
с металлами на всех клеточных культурах показали или отсутствие токсичности или
обладали низкой токсичностью. Показано, что полимеры, содержащие
аминокислотные остатки, способны стимулировать индукцию интерферона и
20
обладают явно выраженным антивирусным эффектом, выражающимся в выживании
инфицированных клеток, на уровне лучших из используемых в настоящее время
лекарственных интерферонстимулирующих препаратов Ридостина и Циклоферона.
При этом в предварительных исследованиях было показано, что наибольшей
активностью обладают полимерные производные β-аланина. Поэтому дальнейшие
опыты были проведены с использованием производных именно этой аминокислоты.
Использование полимеров в качестве носителей ДНК. Полимеры различной
структуры представляют значительный интерес для использования с целью доставки
терапевтических биополимеров, таких как ДНК, в область их непосредственного
действия. В связи с этим, интересным аспектом применения синтезированных
полимеров является их использование в качестве комплексов с ДНК.
Как следует из полученных в работе данных в случае амфифильного полимера,
содержащего остатки глицина добавление раствора ДНК к мицеллярному раствору
амфифильного полимера N-винилпирролидона с концевой стеароильной группой и
боковыми группировками глицина (содержание звеньев с аминокислотными
фрагментами 7,9 мол.%, М = 5800), сопровождается возрастанием размера частиц в
системе. В данном случае - от 72 нм до 104 нм. (1,5-кратное возрастание). Эти
результаты определенно указывают на связывание молекул ДНК с полимерными
мицеллами.
Адъювантная активность. Была исследована возможность использования
полученных полимеров в качестве адъювантов, т.е. соединений, усиливающих
иммунный ответ антигенов. Исследования проводились в Университете Крита.
В данном случае влияние полимеров на антиген- стимулированную
пролиферацию Т-лимфоцитов было исследовано в присутствии столбнячного токсина
(СТ) в качестве антигена. Эксперименты для каждой группы полимеров проводили по
два раза с клетками периферийных лимфоцитов крови (ПЛК) от двух различных
доноров.
В качестве полимерных объектов исследования были рассмотрены
неамфифильные производные поли-N-винилпирролидона, содержащие боковые
группировки глицина и β-аланина (получены по ранее описанной методике), и их
амфифильные аналоги, синтезированные в данной работе. Содержание звеньев с
аминокислотными фрагментами во всех полимерах было около 7 мол.%.
Стимулирование иммунного ответа (антиген-стимулированной пролиферации
Т-лимфоцитов) в случае амфифильных полимеров наблюдалось в значительно
большей степени, чем в случае неагрегирующих полимеров при близком строении
21
полимерного фрагмента и боковых аминокислотных группировок и сохранялось в
течение большего времени.
Таким образом, данные, приведенные в этом разделе, показывают, что
полученные функциональные амфифильные полимеры не проявляют токсичности и
обладают различной биологической активностью.
1.
2.
3.
4.
5.
3. ВЫВОДЫ
Впервые синтезированы амфифильные полимеры N-винилпирролидона и
акриламида, содержащие одну концевую стеароильную группу и боковые
функциональные группы в полимерном фрагменте, показана их способность
образовывать наноразмерные агрегаты и установлено, что такие полимеры
могут являться носителями биологически активных веществ и обладают
собственной биологической активностью.
Разработан новый одностадийный метод синтеза низкомолекулярных (Mn = 212 тыс.) амфифильных полимеров N-винилпирролидона и акриламида путем
полимеризации
мономеров
в
присутствии
инициатора
(азодиизобутиронитрила) и хлорангидрида длинноцепной монокарбоновой
кислоты (стеариновой). При этом хлорангидрид является передатчиком и
обрывателем цепи. Установлено, что в этих полимерах радикал кислоты связан
с концом полимерной цепи кетонной группой.
Показано, что в синтезированные таким путем амфифильные полимеры Nвинилпирролидона с использованием модифицированной реакции Дарзана
могут быть введены боковые эпоксидные группы, а затем взаимодействием с
аминокислотами – боковые аминокислотные группировки. Установлено, что
реакцией
взаимодействия
амфифильного
полиакриламида
с
N,Nдиметилэтилендиамином в полимер могут быть введены звенья 2-(N’,N’диметил)-N-этилакриламида.
С использованием флуоресцентного зонда и метода динамического
светорассеяния выявлена способность синтезированных амфифильных
полимеров образовывать в водной среде устойчивые наноразмерные (30150 нм) агрегаты с критической концентрацией мицеллообразования 0,2-0,3
% масс., которые могут быть отделены диализом.
Показано, что амфифильные полимеры с боковыми аминокислотными
группами обладают адъювантной активностью по отношению к гаптенами, а их
комплексы с переходными металлами являются индукторами интерферона.
Установлено, что аминосодержащий амфифильный полиакриламид образует
22
комплексы с нуклеиновыми кислотами. При этом в опытах на клетках
подтверждена невысокая токсичность синтезированных полимеров.
Публикации по теме диссертации
1. Kuskov A.N., Shtilman M.I., Goryachaya A.V., Tashmuhamedov R.I., Yaroslavov
A.A., Torchilin V.P., Tsatsakis A.M., Rizos A.K. Polymeric Nanoscaled Drug Carriers
Composed of Amphiphilic Poly-N-vinylpyrrolidones // Journal of Non-Crystalline
Solids.- 2007. - v.353, N.41-43. - p.3969-3975.
2. Rizos A.K., Ташмухамедов Р.И., Tsatsakis A.M., Клягина М.В., Горячая А.В.,
Штильман М.И. Агрегация в водном растворе аминокислотных производных
поли-N-винилпирролидона // Пластические массы. - 2007. - № 5. - с.19-21.
3. Кусков А.Н., Горячая А.В., Штильман М.И. Микроагрегаты на основе
амфифильных полимеров N-винилпирролидона // Успехи в химии и химической
технологии. - 2004.- т.18, N. 2(42)- с.34-36.
4. Kuskov A.N., Shtilman M.I., Goryachaya A.V., Tsatsakis A M., Torchilin V.P.
Amphiphilic poly-N-vinylpyrrolidones – promising basis for novel drug delivery
systems // Materials of 11th W. Mejbaum-Katzenellenbogen´s Molecular Biology
Seminars on Amphiphiles and Their Supramelecular Aggregates in Basic and Applied
Science. - Wroclaw, 2005. - Cellular & Molecular Biology Letters, v. 10, Supplement,
p. 83.
5. Кусков А.Н., Горячая А.В., Штильман М.И. Новые наноразмерные полимерные
носители лекарственных веществ // Материалы Международной конференции
студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005». Москва, 2005. - т. 1, c. 86.
6. Штильман М.И., Ташмухамедов Р.И., Кусков А.Н., Горячая А.В. Амфифильные
полимеры – новые материалы для медицины // Actual problems of polymer
chemistry and physics. - Tashkent, 2006. - с.23-27.
7. Горячая А.В., Штильман М.И., Кусков А.Н., Ван Дуань, Ташмухамедов Р.И.
Полимерные мицеллы – новое поколение носителей лекарственных веществ //
Биотехнология: Состояние и перспективы развития. - Москва, 2007. - с.59.
(Goryachaya A.V., Shtilman M.I., Kuskov A.N., Wang Duan, Tashmuhamedov R.I.
Polymeric micells – new generation of drug carriers // Biotechnology: State of the art
and prospects of development. – Moscow, 2007. - р.59.
8. Горячая А.В., Штильман М.И. Самоорганизующиеся биологически активные
системы на основе аминокислотных производных поливинилпирролидона //
Всероссийская конференция «Молодые ученые и инновационные химические
технологии». - Москва, 2007. - с.84-85.
9. Горячая А.В., Мазуревич В.В., Кусков А.Н., Штильман М.И. Получение новых
амфифильных полимеров и применение их в качестве систем доставки
биологически активных веществ // Международная конференция студентов и
аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2007». - Москва, 2007. - т.
1, с. 91.
10. Shtilman M.I., Kuskov A.N., Goryachaya A.V., Tsatsakis A.M. Polymers in bioactive
systems // Proceeding of International Conference “New Polymers and Radioprotectors
for Biology and Medicine”. - Yerevan, 2007. - p. 173-174.
23