МАКАРОВ Валентин Владимирович СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ N-КОНЦЕВОЙ ПОЛОВИНЫ БЕЛКА ТБГ1 ГОРДЕИВИРУСА
реклама
на правах рукописи МАКАРОВ Валентин Владимирович СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ N-КОНЦЕВОЙ ПОЛОВИНЫ БЕЛКА ТБГ1 ГОРДЕИВИРУСА 03.02.02 – Вирусология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2010 Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета и в отделе биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный руководитель: Доктор биологических наук Калинина Наталья Олеговна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Левицкий Дмитрий Иванович кандидат биологических наук Эльдаров Михаил Анатольевич Ведущая организация: Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН Защита состоится 25 июня в ______ часов на заседании совета Д501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физикохимической биологии имени А.Н. Белозерского, аудитория 536. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени Ломоносова Автореферат разослан « » мая 2010 года. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Крашенинников И.А. Актуальность проблемы. Процесс транспорта многих вирусов в растениях тесно сопряжен со способностью специфических вирусных белков, обозначаемых как транспортные белки (ТБ), формировать невирионные рибонуклеопротеидные комплексы (РНП-комплексы) с геномными РНК. Образуемая транспортная форма взаимодействует с другими вирусспецифическими белками и белками растения-хозяина, участвующими во внутриклеточном, межклеточном, а в ряде случаев и в дальнем (по проводящей системе растения - флоэме) транспорте вирусного генома. ТБ обеспечивают отбор специфических РНК и правильную структурную организацию РНП-комплекса, определяющую такие его функции, как внутриклеточный транспорт трансляционно неактивного РНП-комплекса к плазмодесмам клеточных стенок и транслокация РНП-комплексов через модифицированные плазмодесмы в соседнюю клетку, сопровождающаяся трансляционной активацией РНК в составе комплекса. Несмотря на интенсивное изучение транспорта вирусов растений, принадлежащих к различным группам, в настоящее время данные о возможной структуре и принципах образования транспортной формы вирусного генома (невирионного РНП-комплекса) весьма ограничены. До настоящего времени нет не только данных рентгеноструктурного анализа ни для одного из изученных ТБ вирусов растений, но и фактически отсутствуют сведения о структуре ТБ. В связи с этим, изучение структуры ТБ и транспортного РНПкомплекса представляется важным для понимания механизмов, вовлеченных в процессы распространения в растениях не только вирусной инфекции, но и, возможно, клеточных РНП-комплексов, регулирующих рост и развитие растений. Объектом настоящей работы является ТБ, кодируемый первым геном тройного блока транспортных генов (ТБГ) – белок ТБГ1 полулатентного гордеивируса мятлика (ПЛВМ). Этот белок является основным, если не единственным, компонентом, который формирует транспортные РНП-комплексы с геномными и субгеномными РНК гордеивирусов (Brakke et al., 1988; Lim et al., 2009; Jackson et al., 2009). В отличие от многих других вирусов с ТБГ невирионные РНП-комплексы, сформированные белком ТБГ1 гордеивирусов, участвуют как в межклеточном, так и в дальнем транспорте вирусной инфекции (Morozov and Solovyev, 2003). Участие в этих процессах предполагает наличие в данном белке нескольких различных активностей, в том числе и активности/активностей, замещающей белок оболочки, который в случае большинства вирусов с ТБГ необходим для дальнего транспорта. Белки ТБГ1 гордеивирусов содержат в своем составе НТФазно/хеликазный домен, который характерен для всех белков ТБГ1 (с потексподобным и гордеи-подобным ТБГ), и отличаются самым протяженным N-концевым районом среди вирусов с гордеи-подобным ТБГ (Morozov and Solovyev, 2003). В нашей лаборатории ранее было показано, что два кластера положительно заряженных аминокислотных остатков в составе N-концевого района белка ТБГ1 ПЛВМ отвечают как за связывание РНК in vitro, так и за дальний транспорт вирусной инфекции in vivo, но не требуются для ближнего транспорта вируса (Kalinina et al., 2001). Вместе с тем в целом Nконцевой район необходим и для ближнего транспорта вируса (Solovyev et al., 1999). Эти данные позволили высказать предположение о том, что белок ТБГ1 способен формировать два разных типа РНП-комплексов, компетентных для ближнего и для дальнего транспорта (Solovyev et al., 1999, Kalinina et al., 2001). 1 Цели и задачи исследования: Целью настоящей работы было изучение доменной организации N-концевой половины белка ТБГ1 ПЛВМ, структурных и биохимических харатеристик доменов, а также их возможной роли в формировании транспортной формы вируса. В ходе работы решали следующие основные задачи: предсказание доменной организации белка ТБГ1 ПЛВМ с использованием компьютерных сервисов и стереохимического метода, получение делеционных мутантов, соответствующих предсказанным доменам; определение вторичной структуры этих доменов методами кругового дихроизма и ИК-Фурье спектроскопии; изучение РНК-связывающих свойств с использованием различных типов нуклеиновых кислот; изучение олигомеризации доменов с применением методов динамического лазерного светорассеяния и атомно-силовой микроскопии; изучение оптическими методами физико-химических свойств доменов, составляющих N-концевую половину белка ТБГ1, и влияние на их структуру нуклеиновых кислот; исследование роли отдельных доменов в формировании невирионных нуклеопротеидных комплексов. Научная новизна работы и практическая ценность работы: Впервые показано, что в составе N-концевой половины белка ТБГ1 ПЛВМ существуют два функционально и структурно различных домена: N-концевой домен NTD и внутренний домен ID. Показано, что оба домена, входящие в состав N-концевой половины белка ТБГ1 ПЛВМ, представляют собой белки с неупорядоченными участками, причем NTD является полностью неупорядоченным доменом, а для ID характерно значительное содержание β-структуры (до 40%) и наличие спиральных участков (10-15%) при отсутствии четко выраженной третичной структуры. Показано, что и NTD, и ID взаимодействуют с оцРНК и дцРНК, причем NTD некооперативно, а ID – кооперативно. Обнаружено, что домены белка ТБГ1 ПЛВМ способны образовывать гомоолигомеры различных размеров. Показана способность домена ID, N63К и полноразмерного белка ТБГ1 к образованию нитевидных структур. Предположено, что молекулы РНК инициируют формирование подобных комплексов. Продемонстрировано влияние РНК на структуру ID и белка ТБГ1. Предложен возможный механизм формирования транспортной формы вируса. Работа имеет существенное значение для понимания молекулярных механизмов транспорта макромолекул в растениях. Материалы работы используются при чтении курсов на Биологическом факультете МГУ имени М.В. Ломоносова. Апробация работы: Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии Биологического факультета и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова от 11 мая 2010 года. Результаты работы были доложены на международных конференциях: XIV Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» (Москва, 2007), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Современные достижения бионаноскопии 2 (Москва, 2008), XIV International Congress of Virology (Istanbul, 2008), IV Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Казань, 2009). Публикации: По материалам диссертации опубликовано семь печатных работ. Структура работы: Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы». Содержание работы 1. ИССЛЕДОВАНИЕ ДОМЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БЕЛКА ТБГ1 ПЛВМ 1.1. Ограниченный протеолиз рекомбинантного белка ТБГ1 ПЛВМ в клетках Esсherichia coli Нами было обнаружено, что при экспрессии полноразмерного белка ТБГ1 ПСЛВ (белок с мол. массой 63 кДа или 63К) в клетках E. coli наблюдается появление нескольких более низкомолекулярных полипептидов, реагирующих с антителами против белка 63К. Количество этих полипептидных фрагментов возрастало при увеличении времени индукции в присутствии ИПТГ. Вполне вероятно предположить, что фрагментация белка связана с воздействием клеточных протеаз, где протеолизу подвергаются наименее защищенные участки белка (например, экспонированные участки). Два основных фрагмента (I и II) выделялись совместно с полноразмерным белком, очищаемым аффинной хроматографией на Ni-NTA агарозе, что свидетельствует о том, что эти фрагменты содержат шесть гистидиновых остатков (His6-пептид), расположенных в Nконцевой части рекомбинантного белка 63К (рис 1а). Рис.1. Спонтанный протеолиз рекомбинантного белка ТБГ1, экспрессированного в E. coli. (А) Равные объемы культуры E. coli, экспрессирующие белок ТБГ1, инкубировали от 0,5 ч до 6 ч после внесения ИПТГ. Пробы отбирали в указанное время. Маркеры мол. масс указаны слева (кДа). Основные продукты деградации I и II вырезаны из геля после ЭФ в DS-Na ПААГ и проанализированы при помощи MALDITOF МС. (Б) Тотальный экстракт белков из E. coli, экспрессирующей белок ТБГ1, после двухчасовой индукции ИПТГ (1), и рекомбинантный белок С63К, соответствующий НТФазно/хеликазному домену (HELD) (2) анализировали при помощи Вестерн-блоттинга с антителами против С63К. Маркеры мол.масс указаны слева (кДа). Для идентификации сайтов расщепления в белке 63К, очищенные на Ni-NTA агарозе фрагменты, были фракционированы в ПААГ с DS-Na, вырезаны из геля и проанализированы при помощи масс-спектроскопии (МС). MALDI-TOF МС анализ показал, 3 что полипептид с меньшей электрофоретической подвижностью в геле (фрагмент I) с мол. массой около 50 кДа соответствует N-концевой половине белка ТБГ1 и его С-конец локализуется в районе 279-294 аминокислотных остатков (а.о.) полноразмерного белка. Фрагмент II, проявляющий при ЭФ в DS-Na ПААГ подвижность белка с мол.массой 30 кДа, также содержит а.о. с начала N-концевой половины белка до 188-202 а.о. полноразмерного белка. Интересно, что оба фрагмента имели аномальную подвижность в полиакриламидном геле существенно меньшую, чем можно было бы предположить, исходя из их расчетной молекулярной массы (34 кДа и 20 кДа, соответственно). В тотальном экстракте белков, выделенном из клеток E. coli, экспрессирующих белок 63К, методом иммуноблоттинга с антителами против С-концевой половины белка ТБГ1 был обнаружен еще один фрагмент с мол.массой примерно 35 кДа, подвижность которого в ПААГ была сходна с подвижностью рекомбинантного С63К, соответствующего HELD (рис 1б). Интересно, что для целого ряда различных мультидоменных клеточных и вирусных белков, содержащих РНК/ДНК хеликазные домены, показана устойчивость именно этого домена к протеазной деградации in vitro (O’Reilly et al., 1995; Bae et al., 2001). Кроме того, известно, что в клетках E. coli, выращенных на минимальной среде, протеазы атакуют в основном междоменные линкерные участки белков (Schlotmann and Beyreuther, 1979; Corchero et al., 1996). На основании данных по спонтанному протеолизу в клетках E. coli было предположено, что белок ТБГ1 содержит, по крайней мере, три отдельных домена: N-концевой домен NTD (N-terminal domain), внутренний домен ID (internal domain) и ранее известный С-концевой домен НТФазно/хеликазный домен (HELD). Границы доменов по всей видимости располагаются на участках 190-200 а.о. между NTD и ID и 290-321 а.о. между ID и HELD (рис.2а). Обнаружить в клеточном лизате отдельный домен ID не удалось, что может быть связано с высокой чувствительностью этого домена к протеазам. 1.2. Предсказание упорядоченных и неупорядоченных участков для доменов белка ТБГ1. Аминокислотная последовательность белка ТБГ1 была проанализирована при помощи компьютерных веб-сервисов SCRATCH (Cheng et al., 2005) и FoldIndex (Prilusky et al., 2005), способных предсказать элементы вторичной структуры в белках. В результате выяснилось, что N-концевая половина белка ТБГ1 (а.о.1-300), предшествующая HELD, характеризуется высокой долей неупорядоченных участков в своем составе. Так, по данным компьютерного анализа, NTD представляет домен, в котором полностью отсутствуют упорядоченные участки, в то время как в ID есть небольшие районы, которые могут являться глобулярными (рис 2а). Аналогичный анализ белков ТБГ1 других вирусов с ТБГ гордеивирусного типа, таких как вирус штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ, род Hordeivirus), вирус курчавости верхушек картофеля (ВКВК, род Pomovirus) и вирус комкования арахиса (ВКА, род Pecluvirus), предсказал сходные структуры для их Nконцевых половин (рис. 2б). 4 Рис. 2. Предсказание доменной организации белков ТБГ1 для вирусов с ТБГ гордеивирусного типа. (а) Предполагаемая доменная структура белка ТБГ1 ПЛВМ. (б) Предсказание упорядоченных и неупорядоченных районов для белков ТБГ1 белков ВШМЯ, ВКВК и ВКА. 1.3. Спектры кругового дихроизма делеционных мутантов белка ТБГ1 ПЛВМ. C целью проверки предположений о доменной организации белка 63К были получены следующие делеционные мутанты: мутант, соответствующий NTD – а.о. с 1 по 190; мутант, соответствующий ID – а.о.с 190 по 290, и содержащий оба этих домена мутант, включающий а.о. c 1 по 290, названный N63K (рис. 3). Все мутанты содержали на N-конце Нis6-пептид, позволяющий выделять рекомбинантные белки на Ni-NTA агарозе. 5 Также в работе использовался содержащий HELD мутант С63K (а.о. с 290 по 576), полученный ранее в нашей лаборатории (Kalinina et al., 2001, 2002). 63K 1-576 а.о. NTD 1-190 а.о. ID 190-290 а.o. N63K 1-290 а.о. C63K 290-576 а.о. Рис 3. Схема делеционных мутантов белка 63К. Прямоугольниками в С-концевой части белка обозначены консервативные мотивы НТФаз/хеликаз суперсемейства I. Для анализа структуры предполагаемых доменов N-концевой половины белка ТБГ1 были измерены спектры кругового дихроизма (КД) мутантных рекомбинантных белков в дальнем ультрафиолетовом диапазоне (190–260 нм). Спектр КД NTD имел отрицательный максимум в районе 202 нм с коэффициентом молярной эллиптичности равным -13000 град*см2*дмоль-1 и слабым сигналом в более длинноволновой области. Сходной формой спектра и положением отрицательного максимума обладал и спектр КД N63K, но в отличие от NTD, значение этого отрицательного максимума было ниже: коэффициент молярной эллиптичности для него составил примерно -8000 град*см2*дмоль-1, вероятно из-за присутствия ID в составе N63K. Подобный тип спектров характерен для полностью неупорядоченных белков (Adler et al., 1973; Johnson, 1988; Uversky, 2002). В отличие от NTD ID давал спектр, характерный для белков со значительным содержанием β-структуры Рис. 4. Спектры кругового дихроизма N63K, NTD и ID. Спектры рекомбинантных белков измерены в дальнем ультрафиолетовом диапазоне при комнатной температуре. и небольшой долей α-спиралей, о чем можно судить по наличию отдельного пика в районе 220 нм и сравнительно небольших отрицательного пика при 206 нм и положительного при 190 нм (рис. 4) (Sreerama and Woody, 2004). Следует отметить, что метод КД позволяет количественно определить лишь содержание α-спиралей, в то время как точный процент β-структуры достоверно рассчитать из спектров КД не удается (Sreerama and Woody, 2004). Содержание α-спиралей в белке было рассчитано по формуле Гринфилда-Фасмана 6 и составило 10-15% (Greenfield and Fasman, 1969). Таким образом, спектры КД подтвердили предположение о том, что NTD и ID имеют разную вторичную структуру: NTD является полностью природно неупорядоченным белком, в то время как ID обладает хорошо выраженной вторичной структурой. 1.4. Изучение вторичной структуры домена ID с помощью метода ИК-Фурье спектроскопии. Поскольку измерение спектров КД не дает адекватной оценки содержания βструктуры в составе белка, мы использовали ИК-Фурье спектроскопический анализ пленок белков. Оценивали поглощение в инфракрасной части диапазона электромагнитного излучения в области от 1600 до 1700 см-1, соответствующей амидной полосе I. Адекватность использованной методики была подтверждена с использованием белков с известным из данных рентгеноструктурного анализа содержанием структурных элементов. На рис.5 приведен ИК спектры доменов ID ПЛВМ и родственного гордеивируса ВШМЯ. Разложение исходного спектра на отдельные компоненты показало значительное содержание β-структуры: 38% в составе ID ПЛВМ и 41 % в составе ID ВШМЯ. Полученные данные о количестве β-структуры хорошо согласуются с предсказаниями, сделанными при помощи «стереохимического метода» Ефимова (Efimov, 1994; 1997). (а) (б) Рис. 5. ИК-Фурье спектры ID ПЛВМ (а) и ВШМЯ (б). Верхная кривая на обоих рисунках представляет собой исходный инфракрасный спектр белка, нижние гауссовские кривые являются результатом разложения исходного спектра в ряд Фурье. 2. БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДОМЕНОВ N-КОНЦЕВОЙ ПОЛОВИНЫ БЕЛКА ТБГ1. 2.1. Анализ РНК-связывающей активности NTD и ID Ранее в нашей лаборатории методом Норт-Вестерн была показана способность белка 63К и некоторых его делеционных мутантов неспецифически связывать РНК. В частности, полноразмерный белок 63К связывал РНК при концентрациях NaCl от 50 до 500 мM практически с одинаковой эффективностью (Kalinina et al, 2001). Для проверки РНКсвязывающей активности трех полученных делеционных мутантов белки, разделенные ЭФ в ПААГ с DS-Na и перенесенные на нитроцеллюлозную мембрану (НЦ), инкубировали с [32Р]меченой РНК, полученной транскрипцией in vitro участка плазмиды pGEM7. Как видно из рис. 7а, NTD и N63K, содержащий NTD и ID домены, связывают РНК с 7 Рис. 6. оцРНКсвязывающая активность NTD и ID. (а) Анализ РНК-связывающей активности методом НортВестерн. После ЭФ в ПААГ с DS-Na рекомбинантные белки переносили на НЦ, окрашивали понциановым красным, ренатурировали и инкубировали с радиоактивно меченным транскриптом в растворах и различной ионной силой (концентрацией NaCl). (б) Оценка оцРНКсвязывающей активности методом «сдвига в геле» для NTD, ID, N63K и эквимолярной смеси NTD и ID. Белки инкубировали с 0,2 мкг РНК ВТМ и анализировали ЭФ в 1% агарозном геле, содержащем EtBr. практически одинаковой эффективностью в диапазоне концентраций NaCl в растворе от 50 до 300 мM и не связывают РНК при 500 мM NaCl. ID взаимодействовал с РНК с несколько меньшей эффективностью по сравнению с NTD и N63K при концентрации 50 мM NaCl в растворе, и его связывание с РНК отличается меньшей устойчивостью к повышению ионной силы раствора. При 150 мM NaCl эффективность связывания падает, а при 300 мM NaCl связывание РНК с ID практически отсутствовало (рис. 6а). Способность NTD, ID и N63K связывать одноцепочечную РНК (оцРНК) также изучалась при помощи метода «задержки в геле» в геле агарозы в неденатурирующих условиях. Белки инкубировали с немеченной РНК ВТМ (ранее нами было показано, что взаимодействие белка 63К с РНК носит неспецифический характер, Kalinina et al., 2001) и затем подвергали ЭФ в 1% геле агарозы, содержащем EtBr. В этих экспериментах NTD, как и N63K, формировал РНК-белковые комплексы, входящие в агарозный гель, причем с увеличением количества белка подвижность комплекса белок:РНК в геле уменьшалась, однако, даже при очень больших соотношениях белок:РНК он входил в гель агарозы. Комплексы, образованные ID, были не способны входить в гель. С увеличением соотношения белок (ID):РНК количество "задержанной" в геле РНК увеличивалось и при определенном соотношении вся РНК переходила в состав РНП-комплекса. Подобный характер связывания белков и нуклеиновых кислот в опытах по сдвигу в геле считается указанием на кооперативность их взаимодействия. Действительно, применение преобразований Хилла для обсчета полученных данных (Marcos et al., 1999) показало, что 8 коэффициент Хилла для комплексов ID c РНК составляет около 2,9, что свидетельствует о том, что ID взаимодействует с оцРНК кооперативным способом. Сходным образом ID и NTD связывали и дцРНК. Как говорилось ранее, N63K, включающий в себя и NTD и ID, образует комплексы, способные мигрировать в гель (рис. 6б; Kalinina et al., 2001)., что является доказательством того, что в составе N63K свойство ID образовывать РНП-комплексы, не способные входить в гель, маскируется, и, возможно, для его проявления требуются конформационная перестройка N-концевой половины белка ТБГ1. Для того чтобы оценить взаимное влияние РНК-связывающих свойств NTD и ID, эти два домена, взятые в эквимолярных соотношениях, смешивали с РНК и тестировали методом «задержки в геле» (рис. 6б). В отличие от N63K в случае смеси этих двух полипетидов наблюдались как комплексы, входящие в гель, так и не входящие в него. Интересно, что в этом случае комплексы, не способные войти в гель, образуются лишь при значительно больших соотношениях белок:РНК (300:1), чем в случае, когда в пробе присутствует только один ID (более 40:1). Таким образом, связывание РНК в составе N63K осуществляется по некооперативному NTD-типу, что, указывает на то, что именно NTD является тем доменом, который обеспечивает первоначальное взаимодействие белка с РНК в составе N-концевой половины белка ТБГ1. Маскирование РНК-связывающих свойств ID может быть связано с непосредственным взаимодействием с NTD или с агрегационным состоянием ID (например, олигомеризацией), что будет продемонстрировано ниже. 2.2. Анализ олигомерных комплексов, образуемых доменами белка ТБГ1, методом ультрацентрифугирования в градиентах концентрации сахарозы Для того, чтобы оценить возможность гомологичных взаимодействий для изолированных доменов NTD и ID, а также для целой N-концевой половины белка 63К (N63K), препараты соответствующих рекомбинантных белков фракционировали ультрацентрифугированием в 10-40%-ных градиентах концентрации сахарозы. В параллельном градиенте фракционировали маркерные белки с известной мол.массой. Полученные фракции градиентов анализировали с помощью иммуноблоттинга с использованием антител против N- или С-концевых половин белка 63К. Изолированный рекомбинантный HELD был использован в качестве контроля. Ранее в нашей лаборатории было показано, что домен HELD белка ТБГ1 ПЛВМ вовлечен в гомологичные белок-белковые взаимодействия (Leshchiner et al., 2006). HELD обнаруживается в градиенте сахарозы в основном как гексамер (средняя мол.масса комплекса 160-200 кДа). Кроме того, было показано, что HELD формирует димеры, стабильные при нагревании в DS-Na-содержащем буфере и последующем ЭФ в ПААГ в денатурирующих условиях (рис 9, Leshchiner et al., 2006). Оба предполагаемых домена: NTD и ID были также оказались способны образовывать олигомеры различных размеров (рис. 7). Так седиментационный профиль NTD был сходен с таковым для HELD, в то время как ID предпочтительно формировал комплексы мол. массой до 150 кДа. Однако в отличие от препаратов NTD в препаратах ID выявлялось значительное количество более высокомолекулярных комплексов с мол. массой свыше 440 кДа. Интересно, что ID также формировал стабильные димеры, не разрушающиеся при нагревании в буферах с DS-Na аналогично HELD. N63K, подобно ID, 9 был способен к формированию высокомолекулярных мультимеров, что может быть объясняться наличием в его составе ID. Рис. 7. Фракционирование делеционных мутантов белка ТБГ1 ультрацентрифугировани ем в градиентах концентрации сахарозы. Препараты рекомбинантных белков фракционировали ультрацентрифигированием в 10-40% градиентах концентрации сахарозы. Полученные фракции анализировали при помощи иммуноблоттинга. Положение белковмаркеров, фракционированных в параллельном градиенте сахарозы, отмечено стрелками: БСА (67 кДа), альдолаза (158 кДа), каталаза (232 кДа) и апоферитин (440 кДа). D – димер, M – мономер. С помощью этого метода также была изучена возможность взаимодействий между доменами. Анализ эквимолярной смеси NTD и ID ультрацентрифугированием в градиенте концентрации сахарозы, показал, что седиментационный профиль ID не изменялся и соответствовал профилю, наблюдаемому в экспериментах с индивидуальным ID. Напротив, седиментационное поведение NTD в смеси сильно отличалось от поведения индивидуального белка: его седиментационный профиль становился аналогичным профилю ID. Сходные свойства продемонстрировал HELD: при анализе смеси ID и HELD: характер седиментационного профиля HELD менялся и становился похожим на седиментационный профиль ID. Эти данные свидетельствуют о том, что ID в растворе способен взаимодействовать как с доменом NTD, так и доменом HELD, причем в обоих случаях формируются крупные мультимерные комплексы. Анализ взаимодействия NTD с HELD не проводился вследствие схожести их седиментационных характеристик. 10 3. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДОМЕНОВ N-КОНЦЕВОЙ ПОЛОВИНЫ БЕЛКА ТБГ1 ПЛВМ. 3.1. Анализ поведения олигомерных комплексов доменов N-концевой половины белка 63К методом динамического лазерного светорассеяния (ДЛС). Мы изучили свойства комплексов, формируемых доменами N-концевой половины белка 63К, методом ДЛС. Этот метод используется для оценки размеров как индивидуальных молекул белка, так и белковых комплексов в растворах (Schmitz, 1990; Barilla et al., 2005; Nemykh et al 2008). Полученные методом ДЛС результаты обычно представляют как число частиц определенного размера, где размер частицы является ее гидродинамическим диаметром, апроксимированным к параметрам глобулярной частицы, и как объем, занимаемый частицами данного размера. Средние размеры комплексов, формируемых делеционным мутантом ID при 25оС, составляют около 50±15 нм (рис. 8а). В препарате белка также выявляются крупные комплексы размером 350±100 нм, занимающие заметный объем в анализируемом образце (рис. 8б), хотя их количество незначительно - менее 0,1% (рис. 8а). Размеры крупных комплексов несколько варьируют от опыта к опыту и могут составлять для некоторых препаратов около 500 нм. При понижении температуры до 4оС крупные комплексы (300±150 нм) становятся основным компонентом препарата (до 99%) (рис. 8а,б). Напротив, при повышении температуры до 37оС основным компонентом препарата ID являются небольшие частицы размером около 15 нм. Добавление к препарату DS-Na в концентрации 0,01%, не вызывающей формирования мицелл, сопровождается разрушением комплексов до частиц размером 5,0±2,0 нм (рис. 8в,г). Эти частицы, возможно, представляют собой димеры ID, поскольку, как уже отмечалось, стабильные димеры, образованные этим доменом, выявляются и при ЭФ в денатурирующем DS-Na -ПААГ. Таким образом, внутренний домен белка 63К обладает способностью формировать мультимерные комплексы, склонные к агрегации при пониженных температурах. При повышении температуры и в присутствии низких концентраций ионного детергента происходит их диссоциация до частиц, которые, видимо, представляют собой низкомолекулярные олигомеры. Свойства белка N63K (а.о. с 1 по 290) в целом сходны со свойствами внутреннего домена. Фракционирование в градиентах концентрации сахарозы препаратов N63K также демонстрирует присутствие в препаратах N63K значительного количества высокомолекулярных комплексов (рис.9). При анализе методом ДЛС в препаратах N63K выявляются два типа частиц с размерами 60±20 нм (более 99%) и 250-300±100 нм (менее 0,1%) (рис. 9а). Внесение 0,01% DS-Na разрушает комплексы до частиц с размерами 4,0±1,5 нм (рис. 9а). Понижение температуры до 40С также сопровождается агрегацией белка, при этом основным компонентом препарата становятся комплексы размером 350±150 нм. В тоже время при 370С, в отличие от внутреннего домена, частицы с размерами 60±20 нм сохраняются, а крупные комплексы полностью исчезают. В свою очередь NTD образует небольшие комплексы размером 7±3 нм. Эти результаты хорошо соответствуют данным, полученным методами ультрацентифугирования в градиентах концентрации сахарозы, и подтверждают сходство характера олигомеризации ID и N63K, но не NTD (рис 9б). 11 Рис. 8. Характеристика препарата ID методом ДЛС. Препарат рекомбинантного белка анализировали на установке «Zetasizer Nano ZS» (Malvern Instruments Ltd., Великобритания) в концентрации 0,05-0,15 мг/мл. Распределение частиц по размеру в препаратах ID, инкубированного при различных температурах (а), распределение частиц по занимаемому ими объему при различных температурах (б). Характеристика препарата ID после обработки 0,01% DS-Na: распределение по числу (в) и занимаемому объему частиц (г). Рис. 9. Характеристика препарата N63K(а) и NTD (б) методом ДЛС. 12 3.2. Визуализация мультимерных комплексов, образуемых N63K, NTD и ID методом АСМ. Для визуализации олигомеров, образуемых N-концевой половиной и доменами NTD и ID, был использован метод атомно-силовой микроскопии (АСМ). Препарат ID представляет собой гетерогенную популяцию частиц и структур разных типов и размеров. Препарат содержит значительное количество глобул различного размера: глобулы высотой 1,5±0,2 нм и глобулярные частицы как меньшего (от 0,4 нм), так и большего (до 3,8 нм) размера (данные не представлены). Наряду с глобулами, в препарате присутствуют нитевидные структуры с высотой 1,4±0,4 нм, видимой шириной (диаметром), измеренной на половине высоты, около 25,0±7,0 нм с длиной до 300 нм, показанные на рис.10а. Комплексы, выявляемые методом ДЛС как структуры со средним размером около 50 нм, вероятнее всего, визуализируются как нитевидные структуры. В пользу такого предположения свидетельствует тот факт, что нитевидные вирионы Х-вируса картофеля длиной 550 нм оцениваются методом ДЛС как частицы с гидродинамическим диаметром 40-50 нм (Nemykh et al., 2008). АСМ препаратов N63K показала, что они содержат глобулы высотой от 1,2±0,2 нм до 3,0±0,6 нм и нитевидные структуры длиной до 500 нм с высотой 1,2±0,5 нм и видимым диаметром около 35,0±10,0 нм, часто разветвленные (рис. 10б). На рис. 14б приведено полученное методом АСМ изображение препарата NTD. В препарате NTD обнаруживаются только небольшие глобулы с высотой 1,5±0,2 нм и видимым диаметром, измеренным на половине высоты, около 15,0±2,0 нм (рис. 10в). Таким образом, Nконцевая половина белка 63К ПЛВМ также способна формировать нитевидные структуры, и эта способность определяется внутренним доменом, но не доменом NTD. Рис. 10. Изображения частиц, содержащихся в препарате ID (а), N63K (б) и NTD (в)полученное с помощью атомно-силового микроскопии. Образцы после анализа методом ДЛС разводили в 10 раз 10 мM Tris-HCl (pH 7,5) и 5,0-10,0 мкл раствора помещали на поверхность слюды на 10-15 мин для адсорбции, затем поверхность слюды промывали дистиллированной водой и высушивали при комнатной температуре. Топографические изображения частиц получены на атомно-силовом микроскопе Nanoscope III в моде прерывистого контакта зонда с поверхностью образца. Размер кадра 0,8х0,8 мкм2. 13 3.3. Роль РНК в формировании высокомолекулярных комплексов в препаратах внутреннего домена. Известно, что в процессе выделения препаратов многих рекомбинантных РНКсвязывающих белков наблюдается их контаминация нуклеиновыми кислотами. В связи с этим мы оценили возможное присутствие РНК в препаратах ID. В составе ID имеются только два остатка ароматических кислот, а именно остатки тирозина в положениях 268 и 285 полноразмерного белка ТБГ1 ПЛВМ и совсем отсутствует триптофан. Такие белки обычно имеют адсорбционный максимум при 275 нм, что соответствует адсорбционному максимуму тирозина, и отношение 260/280 нм близкое к 1. Поэтому присутствие даже незначительных количеств нуклеиновой кислоты в препаратах таких белков приводит к сдвигу адсорбционного максимума в сторону 260 нм - максимума адсорбции, характерного для нуклеиновых кислот. Анализ нескольких препаратов ID выявил, что их адсорбционный максимум действительно сдвинут к 260 нм, а соотношение 260/280 нм варьирует от 1,1 до 1,35. На основании калибровочной кривой зависимости количества РНК от соотношения 260/280 нм было установлено, что среднее содержание РНК в препаратах ID составляет около 0,2-0,3% от массы белка. Таким образом, препараты внутреннего домена содержат минорное количество РНК, видимо, захваченных белком из лизатов E. coli и сохранившихся в комплексе с этим основным белком в процессе его выделения и очистки. Рис. 11. Выявление присутствия РНК в препаратах ID. Анализ методом ДЛС препарата ID до (сплошная кривая) и после (пунктирная кривая) обработки РНКазами (инкубация при 250С в течение 30 мин со смесью РНКазы А - 0,25 мкг и РНКазы Т1- 2 ед. на 1 мкг белка): объем частиц (а) и число частиц (б). Препараты ID также инкубировали со смесью РНКазы A и РНКазы T1 в течение 30 мин при 25ºC и анализировали методами ДЛС и АСМ. Как видно на рис. 11а, обработка РНКазами препаратов ID сопровождается уменьшением среднего размера крупных комплексов с 500 нм до 250 нм, тогда как средний размер, выявляемых в препаратах, небольших комплексов, остается без изменений. Другой эффект обработки РНКазами состоит в незначительном перераспределении между популяциями крупных и небольших комплексов: большая доля ID выявляется как небольшие комплексы (рис. 11б). Эти 14 данные согласуются с предположением, что препараты ID содержат некоторое количество РНК. С другой стороны, так как оба типа комплексов сохраняются после обработки РНКазами, можно предположить, что молекулы РНК не являются их структурной основой. Данные ДЛС анализа подтверждаются данными АСМ: препарат после обработки РНКазами практически не отличается от препарата необработанного белка. В качестве комплементарного подхода было изучено влияние экзогенной РНК на формируемые ID структуры. Препараты ID инкубировали в присутствии суммарного препарата тРНК (молярное соотношение РНК:белок cоставляло 1:500). Методом ДЛС показано, что в этом случае формируются гетерогенные комплексы с размерами от 90 нм до 200 нм (средний размер около 150 нм) (рис. 12). АСМ показала, что число глобул белка в препаратах заметно уменьшается, а число нитевидных структур возрастает. Образование протяженных нитевидных структур в присутствии короткой РНК предполагает, что РНК, хотя, и не является структурной основой для формирования комплексов, она может выполнять роль праймера при мультимеризации белка. Интересно, что сходные результаты были получены с использованием одноцепочечного олигодезоксинуклеотида длиной 20 оснований. Средний размер образуемых в этом случае комплексов составил около 100 нм (рис. 12). Таким образом, нитевидные структуры, обнаруженные в препаратах ID, вероятно, формируются за счет белок-белковых взаимодействий. Морфология нитевидных комплексов в целом сходна с таковой для рибонуклеопротеидных комплексов, полученных in vitro в присутствии транспортных вирусных белков и РНК (Kiselyova et al., 2001; Kim et al., 2004, 2007). Известным классом вирусных белков, способных формировать протяженные нитевидные структуры, являются так называемые нуклеопротеиды, формирующие внутренний нуклеокапсид у ряда вирусов животных с РНК-геномом негативной полярности, в том числе нуклеопротеины вирусов гриппа и бешенства (Ruigrok and Baudin, 1995; Iseni et al., 1998). Образование in vitro протяженных структур, не отличимых по морфологии от вирусных рибонуклеопротеидных комплексов (нуклеокапсидов), наблюдали как в препаратах белков, выделенных из состава нуклеокапсида, так и в препаратах рекомбинантных нуклеопротеинов (Ruigrok and Baudin, 1995; Iseni et al., 1998). Предполагается, что образование РНП-подобных комплексов определяется способностью нуклеопротеинов данных вирусов к самополимеризации/самосборке. Свойства ID и N-концевой половины белка 63К ПЛВМ во многом сходны со свойствами этих вирусных нуклеопротеинов: белки агрегируют при понижении температуры инкубации препарата, напротив, при повышении температуры наблюдается диссоциация агрегатов. Обработка РНКазами практически не влияет на размер этих комплексов. Препараты белков содержат минорные количества РНК. Для нуклепротеида вируса бешенства показано, что такой РНК может быть клеточная тРНК (Iseni et al., 1998). Эти данные позволяют предположить, что ID обладает способностью к самосборке, и это свойство домена проявляется в составе N-концевой половины белка. Существенно, что для многих вирусных белков, способных к самосборке в большие мультимерные комплексы, такие как вирусные капсиды и нуклеокапсиды, характерно присутствие природно неупорядоченных доменов (Namba, 2001; Longhi et al., 2003; IvanyiNagy et al., 2008). 15 Рис. 12. Образование комплексов при добавлении низкомолекулярной РНК и олигодезоксинуклеотида к препаратам ID. Анализ методом ДЛС препарата ID до внесения экзогенной РНК (1), после добавления тРНК (2) и олигодезоксинуклеотида (3). 3.4. Поиск глобулярных участков в составе ID. C помощью компьютерных сервисов FoldIndex, SCRATCH и FoldUnFold было предсказано, что в составе ID имеется (выявляется) область, а.о. которой (а.о. с 215 по 275) способны образовывать "слабую" третичную структуру. Для проверки этого предположения был применен метод ограниченного трипсинолиза, основанный на том, что неупорядоченные структуры в составе белка менее устойчивы к протеолизу. К препаратам ID были добавлены небольшие количества трипсина (из расчета 0,05 мкг трипсина на 3 мкг белка). Полученные препараты инкубировали при 370С в течение различных временных интервалов - 2, 10, 20 и 30 минут и продукты протеолиза анализировали методом ЭФ в ПААГ с DS-Na. В препаратах после 10-ти минутной инкубации с трипсином в геле были четко видны два продукта по мол.массе меньшие, чем исходный белок (рис. 13). Дальнейший анализ этих продуктов методом MALDI-TOF МС показал, что N-конец этих полипептидов совпадает с N-концом рекомбинантного ID (190 а.о. белка 63К), в то время как С-конец соответствует 254-му а.о. белка 63K в случае продукта с большей электрофоретической подвижностью и 266-му а.о. в случае продукта с меньшей электрофоретической подвижностью (большей мол. массой). Сопоставив экспериментальные данные, с данными, полученными при помощи компьютерного анализа, можно предположить, что упорядоченный участок располагается между 215 и 266 а.о. полноразмерного белка 63К. Рис. 13. Поиск глобулярных элементов в составе ID. Протеолитическая деградация ID. Мажорные продукты деградации были вырезаны из ПААГ и проанализированы методом MALDITOF МС. С-концевые аминокислоты: * -TALVNEFVAQIHK ** - FCIEQGFEPTGR 16 Известно, что белки, обладающие фиксированной третичной структурой, обычно необратимо денатурируют в процессе нагревания, в то время как природно неупорядоченные белки, плавятся некооперативно и обратимо (Uversky, 2009). Как уже говорилось выше, домен ID, о Рис. 14. Зависимость спектра КД препарата ID от температуры. согласно данным оптических методов и компьютерного анализа, содержит около 10-15 % процентов α-спиральных участков. При его плавлении в интервале 20-900С наблюдалось значительное уменьшение отрицательного пика при 206 нм (-4000 до -2800 град*см2*дмоль), что свидетельствует о 0 разрушении структуры белка в ходе нагревания до 90 С (рис. 14). В то же время охлаждение белка до 200С не приводит к полному восстановлению спектра до исходных значений, что указывает на наличие в составе ID глобулярных элементов. В отличие от ID процесс плавления NTD и N63K носил полностью обратимый характер. 3.5. Структура ID в составе N-концевой половины ТБГ1 белка. Интересно, что по всей видимости ID в составе N-концевой половины не имеет упорядоченных элементов структуры, и его конформация в составе N63K может значительно отличаться от его конформации в виде изолированного домена. В подтверждение этой гипотезы спектр КД N63K сравнили с расчетным спектром, полученным путем сложения спектров NTD и ID, пересчитанных на долю остатков, занимаемых ими в N63K, оказалось, что расчетный спектр отличается почти вдвое большим значением коэффициента молярной Рис. 15. Сравнение реального (N63K 1) и расчетного (N63K 2) спектров КД N-концевой половины белка ТБГ1. эллиптичности на 220 нм (рис. 15), что свидетельствует о том, что доля βструктуры в N63K значительно меньше расчетной, что в свою очередь подтверждает предположение о том, что ID в составе 17 N-концевой половины имеет иную конформацию, чем свободный ID. Поскольку тепловая денатурация ID является лишь частично необратимой, это подтверждает наше предположение о наличии в ID неупорядоченных участков. Чтобы получить дополнительные указания на их наличие в составе ID, исследовали влияние трифторэтанола (ТФЭ) на вторичную структуру ID. Известно, что ТФЭ обладает свойством стабилизировать α-спирали в составе Рис. 16. Влияние ТФЭ на структуру N63K и ID. К препаратам N63K и ID был добавлен 33% ТФЭ, спектры измерялись в дальнем ультрафиолетовом диапазоне белка, а также стимулировать переход в α-спирали потенциально способных к этому неупорядоченных участков. Так, добавление к ID 33% ТФЭ изменило положение отрицательного максимума – с 206 нм он переместился на 208 нм и увеличился с -4200 град*см2*дмоль-1 до -7600 град*см2*дмоль-1 , помимо этого при увеличении доли α-спиралей в белке наблюдается увеличение положительного максимума в районе 190 нм: в данном случае максимум при 190 нм увеличился 1000 град*см2*дмоль-1 до 13000 град*см2*дмоль-1 (рис. 16). Интересно, что сходные изменения произошли и с N63K: его отрицательный максимум сместился с 200 нм на 206 нм, а на 190 нм появился положительный максимум, отражающий вклад в спектр КД сформированных α-спиральных элементов. Итак, и ID, и N63K имеют неупорядоченные участки способные образовывать α-спирали. Вероятно, что способность N63K к формированию α-элементов в значительной степени определяется наличием в нем ID (рис. 16). 3.6. Изменение структуры внутреннего домена белка ТБГ1 при взаимодействии с нуклеиновыми кислотами. Другим важным направлением исследования было изучение изменений в структуре ID, появляющихся в результате взаимодействия домена с нуклеиновой кислотой (НК). Добавление НК в соотношении белок:НК (200:1) приводило к изменениям спектра КД домена ID: доля α-спиралей уменьшалось до 8%, в то время как доля β-стуктуры возрастала до 43%, также незначительно уменьшалось доля неупорядоченных структур (49%) (рис. 17в). Расчет процентного содержания вторичных структур в белке по спектру КД проводился при помощи веб-сервиса K2D2 (www.ogic.ca/projects/k2d2/). Наибольший эффект влияния НК на спектр кругового дихроизма ID наблюдался при соотношении белок:НК (50:1), при этом содержание β-структуры увеличивалось до 48%, количество αспиралей уменьшалось до 5%, а содержание неупорядоченных структур составляло 48%. Поскольку при таких соотношениях вклад НК в изменение КД мал, им можно пренебречь, и, таким образом, все произошедшие изменения можно отнести к изменению структуры белка. Также любопытным является тот факт, что происходящие изменения фактически не зависят от типа НК. Сходные изменения мы наблюдали при добавлении тРНК (80 н.), 18 Рис. 17. Влияние тРНК на вторичную структуру белка. (а) N63K, (б) NTD, (в) ID. Молярные соотношения белок:РНК указаны для каждого эксперимента. 19 РНК вируса табачной мозаики (6500 н.), короткой РНК (25 н.), олигодезоксинуклеотида (22 н.). В тоже время добавление аналогичных количеств НК к NTD и N63K не приводило к заметным изменениям структуры белков (рис. 17а и б). Мы оценили изменение третичной структуры НК при взаимодействии с ID. Добавление тРНК к белку в соотношении примерно 1:100 вызывало увеличение сигнала в области 270 нм в спектрах КД (рис. 18). Поскольку как было сказано выше ID имеет в своем составе всего два остатка тирозина и ни одного триптофана, спектр КД этого белка в районе от 260 нм до 320 нм не имеет сигнала, для многих других белков, обозначающего наличие третичной структуры, а следовательно, единственным объяснением увеличения сигнала на 270 нм может служить изменение структуры тРНК, то эти данные могут указывать на наличие у ID РНК-шаперонной активности. Интересно, что многие РНК-шапероны, белки, неспецифически взаимодействующие с РНК и изменяющие ее вторичную структуру в АТФ-независимой манере (Rajkowitsch et al., 2007; Russell, 2008), имеют неупорядоченные участки, необходимые для связывания РНК субстратов (Tompa and Csermely, 2004). В соответствии с моделью переноса энтропии расплетание вторичной структуры РНК при таких взаимодействиях может сопровождаться сворачиванием неупорядоченных районов в РНК-шаперонах (Tompa and Csermely, 2004). Cтоит отметить, что многие нуклеокапсидные вирусные белки имеют неупорядоченные участки, участвующие в функционировании белка, как РНК-шаперона (Ivanyi-Nagy et al., 2008). Интересно, что подобный эффект – увеличение структурированности белка (по данным спекторов КД в дальнем УФ) и изменение третичной структуры РНК (по данным спектров КД в ближней УФ области) мы наблюдали в случае ID, что может указывать на наличие у домена ID активности РНК-шаперона. Некоторые хорошо изученные РНК-шапероны такие как белок Рис. 18. Влияние ID на структуру РНК. Спектры YB-1, главный белок матричных КД сняты в ближнем ультрафиолете в диапазоне от нетранслируемых РНП240 до 320 нм комплексов, имеют структуру из двух доменов. Один, из которых структурирован, представляет собой CSD, и характеризуется РНК-связывающей и олигомеризующей активностями, в то время как другой внутренне неупорядочен, способен взаимодействовать с РНК и содержит чередующиеся положительно и отрицательно заряженные участки (Овчинников и др., 2001). N-концевая половина белка ТБГ1 ПЛВМ организована сходным образом. Она включает два различных РНК-связывающих домена (неупорядоченный с чередующимися участками с противоположными зарядами и частично 20 структурированный), из которых последний (ID) способен к олигомеризации. C-концевая половина белка ТБГ1 представлена доменом с активностью НТФазы/РНК-хеликазы (Kalinina et al., 2002). Следует отметить, что помимо структурного сходства, оба белка участвуют в формировании трансляционно неактивного РНП-комплекса. 3.7. Свойства ID не маскируются в составе полноразмерного белка ТБГ1. Спектр КД полноразмерного белка ТБГ1 имеет форму, характерную для белков со значительной долей внутренней неупорядоченности с отрицательным максимумом молярной эллиптичности на 203 нм равным примерно 5500 град*см2*дмоль-1 (рис. 19а). Однако, изучение тепловой денатурации белка показало, что с изменением температуры с 200С до 900С отрицательный максимум уменьшается до 3700 град*см2*дмоль-1, и после охлаждения до комнатной температуры спектр белка ТБГ1 не возвращается к исходной интенсивности, что свидетельствует о наличии в его составе упорядоченных участков, которые могут приходиться на HELD и, частично, ID (рис 20а). При взаимодействии с нуклеиновыми кислотами белок 63K ведет себя подобно ID: на спектре хорошо видно, что уже при значении белок:тРНК, равном 200:1 спектр значительно менялся, точно также как и в случае ID, увеличивалось плечо на 220 нм, свидетельствующее об увеличении доли βструктуры в составе белка, уменьшался пик на 203 нм, говорящий об уменьшении неупорядоченных структур в составе белка (рис. 19б). Другим интересным свойством белка ТБГ1 является способность подобно N63K и ID образовывать комплексы по типу «бусины-на-нити», визуализированные методом АСМ (рис. 21). Таким образом свойства ID в составе полноразмерного белка ТБГ1, в отличие от N-концевой половины не только не маскируются, но и в значительной степени определяют способность белка ТБГ1 к олигомеризации. Проявление этих свойств может быть связано с тем, что в составе полноразмерного белка ID имеет конформацию, сходную с той, которую имеет изолированный ID. Рис. 20. Спектры КД белка ТБГ1. (а) Зависимость спектра КД от температуры. (б) Влияние тРНК на вторичную структуру белка ТБГ1. 21 Рис. 21. Изображение частиц, содержащихся в препарате белка ТБГ1, полученное с помощью атомно-силового микроскопа. Полученные результаты позволили нам высказать предположения о возможной структурной организации транспортного вирусного рибонуклеопротеида. Предположено, что основой для формирования РНП-частицы является внутренний домен ID, который, образует структурный остов РНП-частицы. Взаимодействие с РНК инициирует этот процесс. Домен NTD и С-концевой субдомен домена HELD, возможно, располагаются на поверхности РНП-частицы. Эти участки белка ТБГ1 являются неструктурированными: NTD – полностью неупорядоченным, а С-концевой субдомен HELD - c высокой долей неупорядоченных структур, и могут быть вовлечены во взаимодействия с различными вирусными и клеточными белками, что обеспечивает функционирование невирионного РНП-комплекса на различных этапах транспорта в растениях. Очевидно, что N-концевая половина играет важную роль в процессе формирования вирусной транспортной формы, и в случае гордеивирусов, вероятно, является функциональным аналогом белка облочки. Интересно было проанализировать, как различная длина N-концевой половины cоотносится с биологическими свойствами вирусов. Так, например, ВНПЖС и ВКА характеризуются коротким N-концевым участком, включающим полный ID и укороченный NTD. Важно, что в межклеточный и дальний транспорт вовлечены различные транспортные формы этих вирусов: межклеточный транспорт ВНПЖС и ВКА не зависит от белка оболочки вируса (как у гордеивирусов), в то время как для дальнего транспорта по флоэме нужен белок оболочки (как у потексвирусов). Другим интересным примером является транспортная система помовирусов. Белок ТБГ1 ВКВК имеет NTD сходного размера с ВКА (Morozov and Solovyev, 2003). Но несмотря на это, белок ТБГ1 ВКВК способен функционировать подобно белку ТБГ1 гордеивирусов: две геномных РНК ВКВК, кодирующие репликазу и белки ТБГ, способны к межклеточному и дальнему транспорту в отсутствие белка оболочки (Savenkov et al., 2003). Однако, белок ТБГ1 может выполнять еще одну функцию в распространение системной вирусной инфекции: в случае инфекции дикого типа, геномная РНК, кодирующая белок оболочки и его более длинный аналог, получающийся в результате проскока слабого терминатора, перемещаются по флоэме в форме вирусной частицы, один конец которой ассоциирован с длинным аналогом белка оболочки и белком ТБГ1 (Torrance et al., 2009). Итак, для помовирусов существуют два варианта транспортной формы вируса, участвующей в системном транспорте по растению: либо РНП-комплексы, образованные белком ТБГ1 как в случае гордеивирусов, либо 22 модифицированные вирионы, как в случае потексвирусов. Это может означать, что именно протяженный NTD вовлечен в дальний транспорт и необходим для стабилизации и защиты геномной РНК, в то время, как ID необходим и для ближнего, и для дальнего транспорта, так как, согласно нашим данным, участвует в формировании структурной основы РНП-частицы. В отличие от NTD, длина которого значительно варьирует у различных вирусов, ID присутствует у всех вирусов с ТБГ гордеивирусного типа. Выводы 1. На основании компьютерного анализа и «стереохимического метода» предсказано существование в транспортном белке ТБГ1 (63 кДа) гордеивируса полулатентного вируса мятлика (ПЛВМ) трех доменов: неструктурированного N-концевого домена (NTD); внутреннего домена с выраженной вторичной структурой (ID) и С-концевого домена с /структурой, соответствующего ранее охарактеризованному НТФазно/хеликазному домену (HELD). В пользу этого предсказания свидетельствует образование в клетках E. сoli в результате спонтанного ограниченного протеолиза рекомбинантного белка 63 кДа протеолитических фрагментов, соответствующих N63K, NTD и HELD. 2. С помощью набора физико-химических методов для делеционных мутантов белка 63 кДа, соответствующих NTD, ID и N63K, определена вторичная структура доменов: NTD является полностью неупорядоченным доменом, а для ID характерно высокое (до 40%) содержание β-структуры и наличие 10-15% α-спиралей при отсутствии четко выраженной третичной структуры. Для N-концевой половины, включающей NTD и ID, как и для белка 63 кДа, характерна высокая структурная неупорядоченность. 3. Домены NTD и ID взаимодействуют с оцРНК и с дцРНК, причем NTD связывается некооперативно, а ID – кооперативно. В составе N63K проявляется только некооперативное связывание с РНК по NTD-типу. 4. NTD образует низкомолекулярные гомоолигомеры. ID и N63K способны образовывать высокомолекулярные мультимерные комплексы. Методом атомно-силовой микроскопии в препаратах NTD выявлены небольшие глобулы, тогда как в препаратах ID, N63K наряду с глобулами обнаруживаются протяженные нитевидные структуры. 5. Показано, что в присутствии РНК ID меняет свою конформацию, становясь βструктурным белком. Предполагается, что ID обладает способностью к мультимеризации (самосборке), которая инициируется в присутствии РНК. 6. Полноразмерный белок 63 кДа ПЛВМ также характеризуется высокой структурной неупорядоченностью, способен образовывать протяженные нитевидные структуры и изменять свою конформацию в присутствии РНК. Список работ опубликованных по теме диссертации. 1. Makarov, V.V., Rybakova, E.N., Efimov, A.V., Dobrov, E.N., Serebryakova, M.V. Solovyev, A.G., Yaminsky, I.V., Taliansky, M.E., Morozov, S.Yu. and Kalinina N.O. Domain organization of the N-terminal portion of hordeivirus movement protein TGBp1.// J. Gen. Virol.- 2009 – V.90 P.3022-3032. 2. Макаров В.В., Образцова Е.А., Соловьев А.Г., Морозов С.Ю., Тальянский М.Э., Яминский И.В., Калинина Н.О. Внутренний домен транспортного белка ТБГ1 гордеивируса образует in vitro нитевидные структуры.// Биохимия. - 2010 – Т.75 – С. 348-356. 23 3. Макаров В.В., Рыбакова Е.Н.. Структурно-функциональный анализ ТБГ1 белка гордеивирусов, образующего транспортную форму вирусного генома.// XIV Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2007". – 2007 – Сборник тезисов - Секция биология - С. 152. 4. Калинина Н. О., Макаров В. В., Образцова Е. А., Семашко М. А., Ракитина Д.В., Ивановская М. Г., Добров Е. Н., Яминский И. В., Морозов С. Ю. Структурнофункциональная характеристика N-концевой половины транспортного белка ТБГ1 гордеивируса.// IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. – Сборник тезисов - 11-15 мая 2008 - С. 81. 5. Макаров В.В., Образцова Е.А., Яминский И.В., Калинина Н.О. Атомная силовая микроскопия доменов неструктурного белка гордеивируса.// Современные достижения бионаноскопии. Вторая международная конференция. – Сборник тезисов - 17-19 июня 2008 - С.36. 6. Kalinina N., Yaminsky I., Dobrov E., Morozov S., Makarov V., Obraztsova E. N-terminal portion of hordeivirus TGB1 movement protein: properties of predicted domains.// XIV International Congress of Virology. – Abstract Book - 10-15 August 2008 - P. 391. 7. Макаров В.В., Молочков Н.В., Кутушенко В.П., Калинина Н.О. N-концевая половина неструктурного транспортного белка гордеивируса характеризуется высокой степенью пространственной неупорядоченности полипептидной цепи.// IV Российский симпозиум Белки и пептиды. – Сборник тезисов - 23-27 июня 2009 - С. 172. 24
