ПРАКТИКУМ ПО БИОХИМИИ

В. В. Рогожин, Т. В. Рогожина
ПРАКТИКУМ ПО БИОХИМИИ
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ
ПРОДУКЦИИ
Допущено Учебно-методическим объединением вузов Российской
Федерации по агрономическому образованию в качестве учебного
пособия для подготовки бакалавров, обучающихся по направлению
110900 «Технология производства и переработки сельскохозяйственной продукции»
Санкт-Петербург
ГИОРД
2016
УДК 581.19
ББК 28.57
Р59
Рецензенты: Верхотуров В. В. – д. б. н., профессор Иркутской ГСХА;
Попов А. А. – к. х. н., доцент Якутской ГСХА
Р59
Рогожин В. В.
Практикум по биохимии сельскохозяйственной продукции : учеб. пособие для вузов / В. В. Рогожин, Т. В. Рогожина. — СПб. : ГИОРД, 2016. —
480 с.
ISBN 978-5-98879-172-0
Основные цели практикума — ознакомление студентов с практическими методами биохимических исследований растительных и животных тканей, закрепление
теоретических знаний в области биохимии сельскохозяйственной продукции, развитие экспериментальных навыков и привитие научного мировоззрения. В книге
рассматриваются биохимические методы, используемые при подготовке образцов
растительных и животных тканей к исследованию, а также способы определения
и расчета содержания биологически активных веществ в исследуемых образцах сельскохозяйственной продукции.
Учебное пособие предназначено для студентов сельскохозяйственных вузов,
обучающихся по специальности 110900 «Технология производства и переработки
сельскохозяйственной продукции», по направлению подготовки бакалавров, а также
может быть использовано студентами биологических, технических и пищевых вузов
и научными работниками.
УДК 581.19
ББК 28.57
ISBN 978-5-98879-172-0
© ООО «Издательство „ГИОРД“», 2016
Оглавление
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
ВВЕДЕНИЕ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
ГЛАВА 1. ПРАВИЛА И МЕТОДЫ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ . . . . .
1.1. Правила техники безопасности при проведении
исследований в биохимической лаборатории . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2. Физико-химические методы анализа . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3. Подготовка сельскохозяйственной продукции
для биохимических исследований . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.4. Приготовление тканей к исследованию . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.5. Методы разделения биогенных молекул . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.6. Методы выделения субклеточных фракций. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.7. Методы концентрирования . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.8. Методы приготовления, определения и расчета
концентрации вещества в растворе . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.9. Методы расчета экспериментальных данных . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.10. Порядок записи лабораторной работы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Контрольные вопросы и задания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
16
ГЛАВА 2. УГЛЕВОДЫ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.1. Определение глюкозы в биологических жидкостях
о-толуидиновым методом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2. Определение глюкозы с помощью антрона . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3. Определение содержания сиаловых кислот по реакции с резорцином. . .
2.4. Определение сиаловых кислот в биологических
жидкостях по методу Гесса . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.5. Определение целлюлозы (по Кюршнеру и Ганеку). . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.6. Определение крахмала в тканях растений . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.7. Выделение и очистка сахарозы из сахарной свеклы . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.8. Выделение крахмала из зерновок злаковых культур. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.9. Выделение крахмала из клубней картофеля. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.10. Выделение гликогена из животных тканей . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.11. Гидролиз гликогена. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.12. Ферментативный гидролиз целлюлозы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Контрольные вопросы и задания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
73
17
20
28
35
42
50
57
61
68
71
72
76
78
80
82
83
85
87
89
90
91
92
93
95
ГЛАВА 3. ЛИПИДЫ И ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ . . . . . . . . . . . . . 96
3.1. Растворимость липидов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
3.2. Количественные показатели растворения липидов
растительного масла в хлороформе и этанольнохлороформных смесях . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
3.3. Экстракция липидов из субклеточных частиц. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
5
Оглавление
3.4. Определение содержания общих липидов
в растительных тканях . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.5. Определение холестерина (метод Илька) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.6. Выделение общих липидов из мышечной ткани. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.7. Фракционирование липидов методом тонкослойной хроматографии . . .
3.8. Исследование перекисного окисления липидов (ПОЛ) . . . . . . . . . . . . . .
3.9. Определение общей антиокислительной активности (АОА) . . . . . . . . . .
3.10. Определение содержания водорастворимых антиоксидантов . . . . . . . . .
3.11. Определение общего содержания антиоксидантов. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.12. Определение содержания антиоксидантов в гомогенатах тканей
по Глевинду . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Контрольные вопросы и задания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
102
104
105
106
108
109
111
113
115
117
ГЛАВА 4. АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1. Определение аминокислот с помощью нингидрина . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2. Определение содержания глутаминовой кислоты . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3. Определение содержания белка спектрофотометрическим методом . . .
4.4. Определение общего белка по биуретовой реакции . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.5. Метод определения белка по Лоури . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.6. Метод определения белка по Брэдфорду . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.7. Определение содержания гемоглобина крови
гемоглобинцианидным методом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.8. Определение концентрации гемоглобина (по Д. Драбкину) . . . . . . . . . . .
4.9. Определение церулоплазмина (феррооксидазы) в плазме крови . . . . . . .
4.10. Метод выделения пептидов из тимуса теленка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.11. Выделение и очистка гемоглобина . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.12. Выделение фибриногена из плазмы крови. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.13. Выделение яичного альбумина. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.14. Получение кристаллического яичного альбумина . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.15. Использование метода гель-хроматографии
для определения молекулярной массы гемоглобина . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.16. Изучение кислотной денатурации белков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.17. Изучение температурной денатурации белков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.18. Кислотный гидролиз белков. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.19. Щелочной гидролиз белков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.20. Исследование взаимодействий нативной
и денатурированных форм альбумина с кальцием . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Контрольные вопросы и задания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
118
121
123
125
127
129
132
ГЛАВА 5. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1. Выделение и качественные реакции
на дезоксирибонуклеопротеин селезенки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2. Выделение ДНК из животных тканей . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.3. Метод определения содержания ДНК с помощью дифениламина . . . . .
5.4. Метод выделения ДНК растительных тканей . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.5. Выделение РНК и ДНК фенольным методом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.6. Выделение РНК из печени (по Шерреру) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.7. Определение содержания РНК с орцином (по Мейбаум) . . . . . . . . . . . . .
155
6
133
135
136
138
141
142
142
143
144
146
147
148
150
151
154
158
159
160
161
162
164
165
Оглавление
5.8. Выделение РНК из рибосом гепатоцитов печени. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.9. Гидролиз ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.10. Определение суммарного содержания нуклеиновых кислот
(по А. С. Спирину) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.11. Определение содержания пуриновых оснований . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Контрольные вопросы и задания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
166
167
168
169
170
ГЛАВА 6. ЭЛЕМЕНТЫ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.1. Определение общего азота в растительных тканях (по А. Т. Усовичу) . . .
6.2. Определение фосфора ванадо-молибдатным методом . . . . . . . . . . . . . . .
6.3. Определение неорганического фосфора методом Фиске-Суббароу . . . .
6.4. Определение марганца в растительных тканях
формальдоксимным методом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.5. Определение калия и натрия на пламенном фотометре . . . . . . . . . . . . . .
6.6. Определение железа роданидным методом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.7. Определение железа с помощью 4,7-дифенил-1,10фенатролин-3,6-дисульфоновой кислоты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.8. Определение меди в гомогенатах тканей . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.9. Определение меди в тканях методом Шмидта
в модификации А. Г. Рахманкулова и И. А. Коптевой. . . . . . . . . . . . . . . . .
6.10. Определение кальция в сыворотке крови с помощью
глиоксаль-бис-2-оксианила . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.11. Определение магния в сыворотке крови с помощью
титанового желтого. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.12. Определение ионов хлора в сыворотке крови
меркуриметрическим методом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Контрольные вопросы и задания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
171
174
176
178
ГЛАВА 7. ВИТАМИНЫ, КОФЕРМЕНТЫ И ПИГМЕНТЫ . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.1. Определение содержания аскорбиновой кислоты . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.2. Выделение и очистка дигидрокверцетина (витамина
группы Р) из лиственницы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.3. Изучение физических свойств дигидрокверцетина . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.4. Энзиматический метод получения кверцетина . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.5. Выделение убихинона (коэнзима Q) из митохондрий . . . . . . . . . . . . . . . .
7.6. Определение содержания убихинона . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.7. Определение содержания НАДФ+ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.8. Определение содержания НАД+ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.9. Получение вытяжки пигментов из побегов пшеницы . . . . . . . . . . . . . . . .
7.10. Разделение пигментов по Краусу . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.11. Количественное определение хлорофиллов и каротиноидов . . . . . . . . . .
7.12. Омыление хлорофиллов щелочью . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.13. Получение хлорофилла . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.14. Разделение пигментов методом бумажной хроматографии . . . . . . . . . . .
7.15. Получение гемина с помощью органического растворителя . . . . . . . . . .
7.16. Получение гемина с помощью пепсина . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.17. Определение концентрации гемина . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Контрольные вопросы и задания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
194
197
180
181
182
184
185
187
188
190
191
193
199
201
204
206
208
209
210
212
213
214
215
216
217
220
221
222
223
7
Оглавление
ГЛАВА 8. ФЕРМЕНТЫ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.1. Физико-химические методы исследования ферментов . . . . . . . . . . . . . .
8.2. Методы очистки ферментов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Контрольные вопросы и задания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
225
229
254
269
ГЛАВА 9. МОЛЕКУЛЫ ЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ. . . . . . . . . . . . . . . . .
9.1. Определение АТФ и глюкозо-6-фосфата . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9.2. Определение АТФ с помощью люциферазы
(по Угаровой и Бровко) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9.3. Определение глутатиона в растительных тканях. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9.4. Определение содержания глутатиона методом
титрования с помощью n-хлормеркурибензоата. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9.5. Определение содержания в биогенных тканях
креатинфосфата по фосфору . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Контрольные вопросы и задания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
271
274
ГЛАВА 10. МЕТАБОЛИТЫ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10.1. Определение нитритов в растительных тканях . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10.2. Определение нитратов в растительных тканях . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10.3. Определение содержания мочевины по реакции
с диацетилмонооксимом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10.4. Определение мочевой кислоты по методу Мюллера-Зейферта . . . . . . .
10.5. Определение содержания креатинина по цветной реакции Яффе . . . .
10.6. Определение содержания креатина . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10.7. Определение содержания пировиноградной кислоты
с помощью лактатдегидрогеназы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10.8. Определение содержания пировиноградной кислоты
в животных тканях . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10.9. Определение пировиноградной кислоты в растительных тканях . . . . .
10.10. Определение содержания молочной кислоты с помощью
n-оксидифенила . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10.11. Определение содержания молочной кислоты в биогенных
тканях энзиматическим методом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10.12. Определение фосфотриоз . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10.13. Определение этанола в биологическом материале . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Контрольные вопросы и задания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
283
286
288
ГЛАВА 11. МЕТАБОЛИЗМ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.1. Определение активности пероксидазы в супернатанте
зерновок пшеницы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.2. Определение активности пероксидазы по ферроцианиду калия . . . . . .
11.3. Определение активности алкогольдегидрогеназы в реакции
окисления этанола по НАДН . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.4. Определение активности алкогольдегидрогеназы в реакции
окисления этанола по йоднитротетразолиевому фиолетовому . . . . . . .
11.5. Определение активности алкогольдегидрогеназы
в реакции восстановления ацетальдегида. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.6. Определение активности альдегиддегидрогеназы . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.7. Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
по НАДФН . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
310
8
276
278
279
281
282
290
291
292
295
295
297
299
301
303
305
307
309
314
316
318
319
322
323
324
Оглавление
11.8. Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
по йоднитротетразолиевому фиолетовому . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.9. Определение активности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы . . . . . . . . . .
11.10. Определение активности глицерол-3-фосфатдегидрогеназы . . . . . . . . .
11.11. Определение активности триозофосфатизомеразы . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.12. Определение активности глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.13. Определение активности лактатдегидрогеназы. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.14. Определение активности ферментов пируватдегидрогеназного
комплекса. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.15. Определение активности ферментов ПДК с помощью
йоднитротетразолиевого фиолетового . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.16. Определение активности ферментов
кетоглутаратдегидрогеназного комплекса . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.17. Определение активности глутаматдегидрогеназы. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.18. Определение активности цитохромоксидазы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.19. Определение активности сукцинатдегидрогеназы . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.20. Определение активности НАД+-зависимой малатдегидрогеназы . . . . .
11.21. Определение активности НАДФ+-зависимой
малатдегидрогеназы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.22. Определение активности нитратредуктазы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.23. Определение активности аскорбатоксидазы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.24. Определение активности полифенолоксидазы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.25. Определение активности НАДФ+-зависимой
изоцитратдегидрогеназы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.26. Определение активности каталазы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.27. Определение активности аминотрансфераз. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.28. Определение активности гексокиназы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.29. Определение активности пируваткиназы с помощью
лактатдегидрогеназы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.30. Определение активности 3-фосфоглицераткиназы
с помощью глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы . . . . . . . . . . . . . . .
11.31. Определение активности креатинкиназы с помощью
сложной энзиматической системы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.32. Определение активности фосфоглюкомутазы
с помощью Г6ФДГ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.33. Определение активности щелочной фосфатазы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.34. Определение активности аргиназы печени . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11.35. Определение активности фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы . . . . . . . . .
11.36. Определение активности глюкозофосфатизомеразы
с помощью Г6ФДГ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Контрольные вопросы и задания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
326
327
329
331
332
334
336
338
339
341
343
345
346
348
350
352
353
354
356
357
360
361
363
366
368
370
372
375
377
379
ГЛАВА 12. ВТОРИЧНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .381
12.1. Определение алкалоидов. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 384
12.2. Определение стероидных гликоалкалоидов. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 385
12.3. Определение стероидных (сердечных) гликозидов. . . . . . . . . . . . . . . . . . 388
12.4. Выделение и определение капсаицинов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 391
9
Оглавление
12.5. Выделение и определение сапонинов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12.6. Определение флавоноидов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12.7. Определение алкилрезорцинолов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12.8. Определение госсипола . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12.9. Определение дубильных веществ в семенах. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Контрольные вопросы и задания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
393
394
396
398
401
403
ГЛАВА 13. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛОКА . . . . . .
13.1. Определение плотности молока и молочных продуктов . . . . . . . . . . . . .
13.2. Определение титруемой кислотности молока
и молочных продуктов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13.3. Определение рН молока . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13.4. Определение массовой доли влаги и сухого вещества в молоке,
сметане, мороженом, сырах, твороге и творожных изделиях . . . . . . . . .
13.5. Методы осаждения белково-липидных комплексов молока . . . . . . . . .
13.6. Выделение казеина из молока . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13.7. Методы растворения липидов сливочного масла
в этиловом спирте и хлороформе . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13.8. Активность химозина или ферментативного сычужного комплекса. . .
13.9. Качественные реакции на присутствие посторонних
соединений в молоке . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13.10. Выделение лактозы из молочной сыворотки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13.11. Метод определения содержания аскорбиновой кислоты в молоке . . . .
Контрольные вопросы и задания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
404
407
ГЛАВА 14 БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫИССЛЕДОВАНИЯ МЫШЦ . . . . . . .
14.1. Выделение митохондрий скелетных мышц . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14.2. Выделение митохондрий сердечной мышцы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14.3. Выделение белков мышечной ткани . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14.4. Выделение и очистка миоглобина мышц . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Контрольные вопросы и задания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
429
430
431
432
433
435
ПРИЛОЖЕНИЯ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Приложение 1. Способы расчета содержания биогенных соединений
в исследуемых жидкостях и тканях . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Приложение 2. Величины рН буферных растворов и их кислотные
и щелочные компоненты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Приложение 3. Значения молекулярных масс основных соединений. . . . . . . . .
Приложение 4. Основные приборы, необходимые для выполнения
биохимических исследований . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
436
409
411
412
413
418
419
420
422
424
426
428
436
439
441
448
СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 453
ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 477
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ААС
АДГ
АК
АлТ
АльДГ
АО
АОС
АсТ
АТФ
БАВ
б. в.
БСА
ВЖК
Г6ФДГ
Галь3ФДГ
д. в.
ДГ
ДГКВ
ДМСО
ДНК
2,4-ДНФ
ДФПГ
ИК
ИНТФ
КДК
КРС
ЛДГ
МДА
МДГ
НАД+
НАДН
НАДФ+
НАДФН
НЖК
ОДН
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
атомно-абсорбционная спектроскопия
алкогольдегидрогеназа
аскорбиновая кислота
аланинаминотрансфераза
альдегиддегидрогеназа
антиоксиданты
антиокислительная активность
аспартатаминотрансфераза
аденозинтрифосфорная кислота
биологически активные вещества
бидистиллированная вода
бычий сывороточный альбумин
высшие жирные кислоты
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа
глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа
дистиллированная вода
дигоксин
дигидрокверцетин
диметилсульфоксид
дезоксирибонуклеиновая кислота
2,4-динитрофенол
дифенилпикрилгидразил
инфракрасный
йоднитротетразолий фиолетовый
кетоглутаратдегидрогеназный комплекс
крупный рогатый скот
лактатдегидрогеназа
малоновый диальдегид
малатдегидрогеназа
никотинамидадениндинуклеотид окисленный
никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный
никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный
ненасыщенные жирные кислоты
о-дианизидин (3,3′-диметоксибензидин)
11
Принятые сокращения
ПДК —
ПОЛ —
ПХ
—
РНК —
СДГ —
СФ
—
ТБК —
α-ТК —
ФЭК —
ЭДПК —
ЭФП —
пируватдегидрогеназный комплекс
перекисное окисление липидов
пероксидаза корней хрена
рибонуклеиновая кислота
сукцинатдегидрогеназа
спектрофотометр
тиобарбитуровая кислота
α-токоферол
фотоэлектроколориметр
1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид
эмиссионная фотометрия пламени
Кд
Ka
Ki
Km
Vm
kcat
v0
RZ
константа диссоциации
константа активирования
константа ингибирования
константа Михаэлиса
максимальная скорость ферментативной реакции
каталитическая константа
начальная скорость ферментативной реакции
показатель чистоты пероксидазы [равен отношению величин
светопоглощения (D403 /D280)]
—
—
—
—
—
—
—
—
ВВЕДЕНИЕ
Биохимия сельскохозяйственной продукции относится к наукам, изучающим химический состав, структуру и свойства биогенных молекул
растительных и животных тканей. Предметом исследования биохимии
являются метаболические процессы в клетках растений и животных,
а также регуляторные механизмы, обеспечивающие функционирование
целостного организма.
Биохимия сельскохозяйственной продукции в настоящее время является динамично развивающейся наукой, поэтому для понимания новых
методов исследования требуются высококвалифицированные лаборанты,
способные не только освоить современное оборудование и высокоточные
приборы, но и проанализировать полученные данные биохимических исследований. Биохимия занимает достойное место среди фундаментальных
наук, изучающих жизнедеятельность растений в период их роста и развития, а также во время созревания, плодоношения и хранения. Поэтому
предлагаемый практикум может быть полезен специалистам, занимающимся аналитическими исследованиями в современных биохимических
лабораториях. Особое внимание в книге уделяется изучению состава биогенных молекул, исследованию биохимических процессов в растительных
и животных тканях в период их длительного хранения и переработки.
В настоящее время постоянно совершенствуются методы биохимических исследований, создаются высокоточные приборы, позволяющие
получать в большом объеме новую информацию о структуре и свойствах
биогенных молекул, обеспечивающих участие и синхронность протекания метаболических процессов в живых организмах. Поэтому назрела необходимость в пособии, отражающем современные методы исследования
в биохимии растений и возможность их практического использования
лаборантами биохимических лабораторий.
Современному аналитику требуются знания основ физико-химических методов исследования, умение работать на современных высокоточных приборах и владеть средствами обработки результатов эксперимента.
Для проведения исследований необходимо на основании анализа литературы по исследуемой проблеме выдвинуть гипотезу и предложить путь
и способы ее решения. Доказательная база исследований должна быть
основана на достоверности полученных результатов, связанных между
собой единством взаимодополняющих решений и в совокупности дока13
Введение
зывающих наличие выявленных процессов и закономерностей их протекания. Подтверждением гипотезы является возможность управления
выявленными процессами в живых организмах. Уже сейчас знание устройства биогенных систем позволяет создавать искусственные живые
организмы, а также получать трансгенные растительные организмы, устойчивые к действию различных стрессирующих факторов и обладающие
высокой продуктивностью.
В данном практикуме представлены работы, позволяющие изучить химический состав тканей растений, а также их семян и плодов. Кроме того,
объектом аналитических исследований служат продукты жизнедеятельности животных и продукты их переработки — мясо, молоко и молочные продукты. Поэтому в пособии представлены работы по изучению химического
состава молока и молочных продуктов (сыр, масло, мороженое, сметана,
творог и др.), а также исследования процессов в молочной железе, основу
которой составляют железистая и соединительная ткани. Изучается химический состав мяса и процессы, протекающие при его созревании.
В книге приводятся методы статистического обсчета экспериментальных данных, описание основных аналитических приборов и оборудования.
Особое внимание уделяется приемам и методам правильного использования аналитических приборов, позволяющим избежать ошибок при выполнении биохимических исследований. Подробно рассмотрены методы обсчета экспериментальных данных, приводятся различные способы расчета
концентраций вещества в растворе. В качестве практических задач студентам предлагается определить концентрацию вещества в растворе, максимум
его светопоглощения и рассчитать молярный коэффициент светопоглощения. Подробно описаны методы сбора растительного сырья и способы его
сушки. Студенты познакомятся с методами подготовки образцов растительных тканей к различным биохимическим исследованиям.
В практикум включены работы, знакомящие студентов с современными методами исследования и проблемами биохимии, такими как ионообменная хроматография, гель-фильтрация, определение каталитических
свойств ферментов, методы титрования активных центров ферментов
и др. Приводятся работы по выделению ферментов и изучению механизмов их действия.
В целом, аналитические работы приспособлены для исследования
различных биологических объектов и предназначены для качественноколичественной оценки содержания исследуемых биогенных соединений. Анализ полученных данных позволит студенту прогнозировать ход
биохимических процессов в соответствии с принципами биохимической
энергетики и в зависимости от условий окружающей среды, а также применять знания о химическом составе при оценке пищевой и кормовой
ценности растительной продукции и пригодности ее к переработке.
14
Введение
Аналитические исследования дают возможность студентам обосновывать изменения химического состава растительной продукции в зависимости от фазы развития, природно-климатических условий, плодородия
почвы, влагообеспеченности и режима питания растений, различных приемов агротехники. Освоение современных методов исследований позволит применять знания о химическом составе и биохимических процессах
при обосновании технологий производства, послеуборочной обработки,
хранения и переработки растительной продукции, а также использовать
биохимические показатели при оценке качества и безопасности молочной
и мясной продукции, применять знания о биохимических процессах при
обосновании технологий производства, хранения и переработки продукции животноводства.
В издание включен словарь терминов, что поможет студентам ознакомиться с основными терминами и понятиями биохимии.
Практикум предназначен для студентов технических факультетов сельскохозяйственных вузов и по своему содержанию соответствует программе курса «Биохимия сельскохозяйственной продукции».
Освоение практических знаний и навыков по биохимии позволит студенту использовать их при изучении других предметов на старших курсах
(биотехнология, биоинженерия, энзимология, агрохимия, кормопроизводство, растениеводство и др.).
Перед выполнением каждой лабораторной работы приводится краткий
теоретический курс по исследуемой теме, а также дано описание принципа
метода исследования, приводятся подробные методики приготовления рабочих растворов и проведения лабораторной работы. По завершению выполнения работы студентам предлагается написать основные выводы по проведенному исследованию и ответить на некоторые теоретические вопросы.
Практикум может быть интересен и работникам, занимающимся научными исследованиями, так как в него включены работы повышенной
сложности, связанные с изучением активности ферментов, определением содержания антиоксидантов, перекисного окисления липидов и др.
В приложении приводится краткий перечень и описание современных
отечественных и лучших зарубежных приборов и оборудования, необходимых для оснащения биохимических лабораторий.
ГЛАВА 1
ПРАВИЛА И МЕТОДЫ
БИОХИМИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЙ
Современные биохимические исследования проводятся на основе тщательного анализа всех этапов лабораторного процесса, начиная
от пробоподготовки до обработки результатов. При выполнении биохимических работ используют современные аналитические приборы и оборудование, приспособленные для работы практически с любыми видами
биологического материала. Для автоматизации биохимических исследований разработаны анализаторы, которые предназначены для проведения
всех основных биохимических исследований, в том числе: определение
электролитов, субстратов, ферментов, специфических белков, фитогормонов, вторичных метаболитов и других веществ. Биохимические анализаторы используют меню тестов, обновляемые программные обеспечения
и в перспективе планируется создание полностью автоматизированных
лабораторий. Биохимические анализаторы способны выполнять в автоматическом режиме как специальные, так и традиционные биохимические
исследования. Биохимические анализаторы могут быть укомплектованы
роботами-манипуляторами, высокопроизводительными лабораторными
центрифугами, системами обработки информации и другими вспомогательными устройствами, позволяющими полностью автоматизировать
процессы пробоподготовки, получения, сбора, выдачи и хранения информации.
Освоение этих сложных лабораторных приборов требует от специалистов как теоретических, так и практических знаний в области биохимии. Поэтому начинающему аналитику необходимо освоить основы
лабораторных исследований по подготовке образцов, овладеть навыками
построения калибровочных графиков, понять принципы методов исследования качественного и количественного состава биогенных молекул
в различных сельскохозяйственных продуктах, уметь рассчитать концентрацию раствора, точно взять навеску вещества, освоив методы работы
с высокоточными аналитическими весами, правильно пользоваться автоматической пипеткой.
Выполнение биохимических исследований требует от студента знаний
по приготовлению гомогената и супернатанта биогенных тканей, а это значит, что студент должен уметь работать с гомогенизаторами и центрифугами,
16
1.1. Правила техники безопасности при проведении исследований
приготавливать растворы с заданным значением рН, измерять светопоглощение анализируемых образцов и изучать активность ферментов на спектрофотометре, люминометре и ИК-спектрофотометре, определять содержание
элементов с помощью пламенного фотометра и атомно-абсорбционного
спектрометра, использовать для разделения веществ методы высокоэффективной жидкостной хроматографии, анализировать состав веществ на газовом хроматографе, изучать состав аминокислот на аминокислотном анализаторе, а белков — с помощью системы проведения и анализа результатов
электрофореза, овладеть методами концентрирования низкомолекулярных
веществ на роторном испарителе, а белков — способом лиофилизации, изучать состав неорганических и органических веществ на рентгенофлюоресцентном анализаторе, ИК-Фурье спектрофотометре и масс-спектрометре.
Исследования нуклеиновых кислот необходимо проводить, используя
секвенатор ДНК, а для изучения полимеразной цепной реакции необходимо освоить работу на амплификаторе. В настоящее время разрабатываются высокоавтоматизированные роботизированные комплексы, которые
в будущем должны избавить исследователя от рутинной работы по подготовке биогенного материала к исследованию, способные провести качественный и количественный анализ соединений в исследуемом образце.
Однако для работы на этих приборах необходимо овладеть элементарными
навыками лабораторных исследований и научиться методам работы на высокоточных отечественных приборах и аналитическом оборудовании.
1.1. ПРАВИЛА ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ
ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ИССЛЕДОВАНИЙ
В БИОХИМИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
В биохимической лаборатории проводят анализы по изучению качественного и количественного состава биогенных соединений физикохимическими методами. Работы выполняются с применением спектрофотометрических, кондуктометрических, потенциометрических и других
методов исследования. Использование в работах химических реактивов
и электрических приборов требует от студентов соблюдения определенных правил техники безопасности.
1.1.1. Меры безопасности при работе с огнеопасными
и легковоспламеняющимися жидкостями
Легковоспламеняющиеся вещества должны храниться в специально
приспособленном для этого хранилище и использоваться только по мере
17