010098 - 1 - Область изобретения Настоящее изобретение

010098
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к новым неперевариваемым in vivo пептидам, которые являются
хорошо абсорбируемыми и почти неперевариваемыми в живых организмах при введении перорально или
другими путями, и к ингибиторам ангиотензинпревращающего фермента, содержащим пептиды в качестве активных ингредиентов, и к лекарственным средствам и функциональным пищевым продуктам, таким как пищевые продукты для специфического оздоровительного применения, содержащим ингибитор
и имеющим гипотензивный эффект.
Состояние области, к которой относится изобретение
Сообщалось о множестве пептидов, имеющих разнообразные функции, такие как ингибирующая
активность по отношению к ангиотензинпревращающему ферменту (сокращенно обозначенному здесь
далее как АСЕ), гипотензивный эффект, антибактериальная активность, эффект солюбилизации кальция
и иммуномодулирующий эффект, и эти пептиды используются в пищевых продуктах и лекарственных
средствах.
АСЕ превращает предшественник, ангиотензин I, в ангиотензин II, имеющий сосудосуживающую
активность в живых организмах, поднимая в результате кровяное давление. Таким образом, ожидается,
что пептиды, имеющие ингибирующую АСЕ активность, оказывают гипотензивное действие, ингибируя
АСЕ, чтобы подавить образование ангиотензина II в живом организме. О таких пептидах, имеющих ингибирующую АСЕ активность, сообщалось во многих публикациях, включая следующие патентные публикации 1-3.
Поскольку пептиды абсорбируются через пищеварительный тракт в кровь, чтобы осуществить свои
функции в живом организме, ожидается, что неперевариваемые in vivo пептиды будут обладать такими
преимуществами, как высокая абсорбируемость и резистентность к перевариванию различными пищеварительными ферментами в живом организме. Например, в патентной публикации 4 указано, что пептиды
с низким молекулярным весом, состоящие, главным образом, из дипептидов и трипептидов и имеющие
среднюю длину цепи не больше 3, имеют превосходную кишечную абсорбируемость. Однако неизвестно
в деталях, какие пептиды способствуют усилению резистентности к перевариванию in vivo.
Таким образом, желательна разработка пептидов, которые имеют высокую абсорбируемость и резистентность к перевариванию в живом организме и способны эффективно проявлять полезные функции,
такие как ингибирующая АСЕ активность в живом организме.
Патентная публикация 1: JP-2-62828-A.
Патентная публикация 2: JP-3-120225-A.
Патентная публикация 3: JP-6-40944-A.
Патентная публикация 4: JP-5-252979-A.
Сущность изобретения
Цель настоящего изобретения - предложить новые неперевариваемые in vivo пептиды, которые являются высокоабсорбируемыми и плохоперевариваемыми в живом организме, когда они вводятся перорально или другим путем, и предположительно будут эффективно проявлять такие функции, как гипотензивный эффект в живом организме.
Другая цель настоящего изобретения - предложить ингибитор ангиотензинпревращающего фермента, содержащий в качестве активных ингредиентов неперевариваемые in vivo пептиды, которые являются
высокоабсорбируемыми и плохоперевариваемыми в живом организме и эффективно проявляющими ингибирующую активность по отношению к ангиотензинпревращающему ферменту I в живом организме.
Еще одна цель настоящего изобретения - предложить лекарственное средство или функциональный
пищевой продукт, содержащие в качестве активных ингредиентов неперевариваемые in vivo пептиды,
которые являются высокоабсорбируемыми и плохоперевариваемыми в живом организме и эффективно
проявляющими гипотензивный эффект в живом организме.
Авторы настоящего изобретения в ходе интенсивных исследований выяснили, что среди дипептидов и трипептидов, имеющих хорошую абсорбируемость in vivo, пептиды, имеющие дипептидную последовательность Хаа-Pro или трипептидную последовательность Хаа-Pro-Pro (Хаа может быть любой
аминокислотой) с Pro на карбоксильных концах, являются неперевариваемыми в живом организме и
способны эффективно осуществлять свои функции в живом организме. Авторы изобретения также обнаружили, что среди дипептидов и трипептидов, имеющих такие последовательности, те, которые имеют
определенные последовательности, являются особо превосходными в ингибирующей АСЕ активности
или подобных свойствах, завершив тем самым настоящее изобретение.
Согласно настоящему изобретению предложен неперевариваемый in vivo пептид, имеющий Pro на
карбоксильном конце, выбранный из группы, состоящей из Glu-Pro, Gln-Pro, Met-Pro и Ser-Pro-Pro, и
имеющий активность ингибитора ангиотензинпревращающего фермента.
Согласно настоящему изобретению предложено лекарственное средство или функциональный пищевой продукт, обладающие гипотензивным эффектом, включающие ингибитор АСЕ.
Согласно настоящему изобретению предложено также применение ингибитора АСЕ при получении
функционального пищевого продукта или лекарственного средства, обладающих гипотензивным эффектом.
Поскольку неперевариваемые in vivo пептиды по настоящему изобретению являются дипептидами
-1-
010098
или трипептидами, имеющими особые последовательности с Pro на карбоксильных концах, настоящие
пептиды являются высокоабсорбируемыми и плохоперевариваемыми в живом организме и ожидаемо
эффективно проявляют такие функции, как гипотензивный эффект, в живом организме.
Поскольку ингибитор АСЕ по настоящему изобретению содержит в качестве активного ингредиента вышеуказанные неперевариваемые in vivo пептиды, ожидается, что настоящий ингибитор эффективно
проявляет ингибиторную активность по отношению к АСЕ в живом организме.
Поскольку лекарственное средство и функциональный пищевой продукт по настоящему изобретению содержат ингибитор АСЕ, ожидается, что настоящие лекарственное средство и функциональный
пищевой продукт эффективно проявляют гипотензивный эффект в живом организме.
Краткое описание фигур
Чертеж представляет график, показывающий результаты оценки in vivo абсорбируемости и резистентности к перевариванию Хаа-Pro и Хаа-Pro-Pro, осуществленной в ссылочном примере 1.
Предпочтительные варианты осуществления изобретения
Настоящее изобретение будет теперь объяснено подробно.
Неперевариваемый in vivo пептид по настоящему изобретению является дипептидом или трипептидом, имеющим Pro на карбоксильном конце, состоящим по меньшей мере из одного из Glu-Pro, Gln-Pro,
Met-Pro и Ser-Pro-Pro.
Термин "неперевариваемый in vivo пептид" в рамках настоящей заявки означает дипептид Хаа-Pro
или Хаа-Pro-Pro, имеющий Pro на карбоксильном конце, который имеет высокую резистентность к перевариванию in vivo пептидазами, когда он абсорбируется из кишечника в живом организме.
Неперевариваемый in vivo пептид по настоящему изобретению может быть получен, например, из
соответствующих аминокислот обычным органическим синтезом или подобными методами. Альтернативно настоящий пептид может быть также получен, например, разложением пищевого протеина, такого
как казеин животного молока, путем ферментации молочнокислыми бактериями с последующей очисткой или гидролизом пищевого протеина ферментативным методом с должным сочетанием протеиназ и
пептидаз с последующей очисткой.
Целью очистки является выделение дипептида или трипептида, и она может представлять собой концентрацию и очистку подходящей комбинацией методов очистки для повышения концентрации пептида.
Казеином молока животных может быть, например, казеин из коровьего молока, лошадиного молока, козьего молока и овечьего молока, причем коровье молоко является особо предпочтительным.
Ингибитор АСЕ по настоящему изобретению содержит в качестве активных ингредиентов неперевариваемые in vivo пептиды, имеющие Pro на карбоксильных концах и состоящие по меньшей мере из
одной из последовательностей Glu-Pro, Gln-Pro, Met-Pro и Ser-Prp-Pro, т.е. неперевариваемые in vivo пептиды по настоящему изобретению или их соли.
Солью пептида предпочтительно является фармацевтически приемлемая соль, такая как соли неорганической кислоты, включающие гидрохлорид, сульфат или фосфат, или органической кислоты, включающие ацетат, трифторацетат, цитрат, малеат, фумарат, лактат или тартрат.
Ингибитор АСЕ по настоящему изобретению может необязательно содержать различные вспомогательные добавки для улучшения баланса питательных веществ или вкуса. Примеры таких вспомогательных добавок могут включать различные углеводы, липиды, витамины, минералы, подсластители, вкусовые агенты, пигменты и улучшатели текстуры.
Количество ингибитора АСЕ для использования может предпочтительно быть выбрано в зависимости от вида пептидов и их солей, содержащихся в виде активных ингредиентов, и не особенно лимитировано. Например, когда ингибитор АСЕ добавляют к функциональному пищевому продукту или подобному для регулярного использования человеком, количество ингибитора в расчете на пептиды может
предпочтительно составлять приблизительно от 0,01 до 100 мг/кг за один прием без конкретного верхнего предела.
Для использования в лекарственном средстве, оказывающем гипотензивный эффект, ингибитор
АСЕ по настоящему изобретению может быть введен в композицию с фармацевтически приемлемым
носителем в различных дозировочных формах в соответствии с обычными методами. Например, для
твердой композиции для перорального введения настоящий ингибитор может быть смешан с носителем,
и, необязательно, связующим, разрыхлителем, лубрикантом, красителем, корректором вкуса, корректором аромата или подобным, как требуется, и приготовлен в форме таблеток, таблеток с покрытием, гранул, порошков, капсул и т.п.
Такое лекарственное средство может необязательно содержать другие компоненты, такие как пептиды, обладающие ингибиторной активностью к АСЕ или гипотензивным эффектом, отличные от активных ингредиентов настоящего ингибитора АСЕ.
Ингибитор АСЕ по настоящему изобретению может быть использован путем подмешивания в
функциональный пищевой продукт, такой как пищевые продукты для определенного диетического применения, требующего гипотензивного эффекта. Примеры такого пищевого продукта могут включать напитки, йогурт, жидкий пищевой продукт, желе, конфеты, продукт для приготовления в автоклаве, конфеты в таблетках, печенье, лепешки из опарного теста, хлеб, бисквиты и шоколад. Ингибитор может быть
-2-
010098
также введен в капсулы или таблетки для использования в качестве пищевых добавок.
Примеры
Настоящее изобретение будет теперь объяснено более подробно со ссылками на примеры, которые
являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.
Пример 1.
Из числа пептидов, имеющих последовательность Хаа-Pro или Хаа-Pro-Pro, присутствующих в казеине коровьего молока, Ile-Pro, Glu-Pro, Arg-Pro, Gln-Pro, Met-Pro и Ser-Pro-Pro были синтезированы
химически (произведены Toray Research Center, Inc. чистотой не ниже 85%). Были приготовлены растворы каждого из этих пептидов с различными концентрациями и измерена ингибиторная активность по
отношению к АСЕ в соответствии с методом, обсужденным ниже. Концентрация пептида (мкМ), при
которой эффект ингибирования АСЕ составляла 50%, был принят за величину IC50. Результаты показаны
в таблице ниже.
Оценка ингибиторной активности по отношению к АСЕ
АСЕ, полученный из бычьего легкого (произведен Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), растворяли
в 0,1М боратном буфере при рН 8,3 в количестве 0,1 ед., чтобы получить раствор АСЕ. 80 мкл разбавленного раствора, полученного разведением 5 мг/мл раствора каждого пептида, показанного в таблице ниже,
дистиллированной водой согласно величине IC50 для данного пептида, 200 мкл 5 мМ раствора гиппурилгистидиллейцина (произведенного SIGMA), содержащего 300 мМ NaCl, и 20 мкл раствора АСЕ, приготовленного, как указано выше, вводили в пробирку и давали прореагировать при 37°С в течение 30 мин.
После этого реакцию обрывали добавлением 250 мкл 1н. хлористо-водородной кислоты (произведенной Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Затем добавляли 1,7 мл этилацетата (произведен Wako Pure
Chemical Industries, Ltd.) и перемешивали. 1,4 мл этилацетатного слоя отбирали, помещали в другую
пробирку и выпаривали при 120°С в течение примерно 60 мин, чтобы получить высушенный продукт.
Высушенный продукт растворяли в 1 мл дистиллированной воды и измеряли оптическую плотность при
228 нм экстрагированной этилацетатом гиппуровой кислоты. В качестве контроля измеряли оптическую
плотность раствора без разбавленного раствора и раствора без разбавленного раствора и без раствора
АСЕ. Из полученных данных по оптической плотности рассчитывали ингибиторную активность к АСЕ в
соответствии со следующей формулой:
ингибиторная активность к АСЕ (%)=[(А-В)/А]×100
А: (оптическая плотность раствора без разбавленного раствора, но с раствором АСЕ) - (оптическая
плотность раствора без разбавленного раствора и раствора АСЕ).
В: (оптическая плотность раствора с разбавленным раствором и раствором АСЕ) - (оптическая
плотность раствора с разбавленным раствором, но без раствора АСЕ).
Сравнительный пример 1. Оценка абсорбируемости и резистентности к перевариванию Хаа-Pro и
Хаа-Pro-Pro в живом организме.
Для того чтобы оценить абсорбируемость и резистентность к перевариванию в живом организме
пептидов, имеющих последовательность Хаа-Pro и Хаа-Pro-Pro, присутствующих в казеине, анализировали абсорбцию пептидов в кровь после перорального введения у крыс, как описано ниже.
Двум крысам SD (Sprague Dawley) шестинедельного возраста вводили перорально 500 мг/животное
каждой Val-Pro-Pro как пример Хаа-Pro-Pro и Gly-Gly как дипептид, не имеющий Pro. Пробы крови отбирали из воротной вены с интервалами и определяли абсорбцию каждого пептида в кровь. Результаты
показаны на чертеже ниже.
Чертеж подтверждает, что Gly-Gly легко переваривается in vivo, так что детектируется Gly, в то
время как Val-Pro-Pro абсорбировался в кровь относительно стабильно. Из этих результатов можно ожидать, что дипептиды и трипептиды, имеющие последовательности Хаа-Pro и Хаа-Pro-Pro, соответственно, проявляют высокую абсорбируемость и резистентность к перевариванию в живом организме. Таким
образом, принято, что Ile-Pro, Glu-Pro, Arg-Pro, Gln-Pro, Met-Pro и Ser-Pro-Pro по настоящему изобретению также имеют высокую абсорбируемость и резистентность к перевариванию в живом организме.
-3-
010098
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Неперевариваемый in vivo пептид, имеющий Pro на карбоксильном конце, выбранный из группы,
состоящей из Glu-Pro, Gln-Pro, Met-Pro и Ser-Pro-Pro, имеющий активность ингибитора ангиотензинпревращающего фермента.
2. Лекарственное средство, обладающее гипотензивным эффектом, включающее по меньшей мере
один неперевариваемый in vivo пептид по п.1.
3. Пищевой продукт, обладающий гипотензивным эффектом, включающий по меньшей мере один
неперевариваемый in vivo пептид по п.1.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
-4-