Термостабильность и эффективность DnaK
реклама
Министерство образования и науки Российской Федерации МОСКОВСКИЙ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ (государственный университет) ФАКУЛЬТЕТ ОБЩЕЙ И ПРИКЛАДНОЙ ФИЗИКИ КАФЕДРА ФИЗИКИ И ТЕХНОЛОГИИ НАНОСТРУКТУР Гордиенко Екатерина Александровна Термостабильность и эффективность DnaK-зависимого рефолдинга люцифераз психрофильных и мезофильных бактерий Aliivibrio logei и Aliivibrio fischeri Выпускная квалификационная работа на соискание степени бакалавра научный руководитель г.н.с., д.б.н. Манухов И.В. Работа выполнена в лаборатории генетики бактерий ФГУП «ГосНИИгенетика», г. Москва, 2014 1 Оглавление 1. Список сокращений ............................................................................................ 3 2. Литературный обзор ........................................................................................... 4 2.1. Люцифераза ................................................................................................. 4 2.2. Молекулярные шапероны........................................................................... 4 2.3. Структура lux-оперонов морских бактерий Aliivibrio fischeri и Aliivibrio logei. ...................................................................................................................... 5 2.4. Участие бишаперонной системы DnaKJE-ClpB в рефолдинге термоинактивированных люцифераз (LuxAB). ................................................................ 7 3. 4. Материалы и методы ........................................................................................ 11 3.1. Бактериальные штаммы и плазмиды....................................................... 11 3.2. Питательные среды и условия роста ....................................................... 12 3.3. Методы молекулярного клонирования ................................................... 12 3.4. Методы измерения инактивации и рефолдинга люцифераз. ................ 15 3.5. Програмное обеспечение. ......................................................................... 16 Результаты и обсуждение. ............................................................................... 17 4.1. Инактивация люцифераз Aliivibrio fischeri и Aliivibrio logei................. 17 4.2. DnaK-зависимый рефолдинг люцифераз Aliivibrio fischeri и Aliivibrio logei. .................................................................................................................... 17 4.3. Фолдинг люцифераз Alliivibrio fischeri и Alliivibrio logei. ..................... 18 4.4. Анализ количества синтезированных люцифераз Aliivibrio fischeri и Aliivibrio logei. .................................................................................................................... 20 4.5. Конструирование люциферазы Alliivibrio logei с заменой L48K. ........ 21 4.6. DnaK-зависимый рефолдинг люциферазы Aliivibrio logei с заменой L48Kв клетках Escherichia coli. ........................................................................................ 22 4.7. Инактивация люциферазы Aliivibrio logei с заменой L48K в клетках Escherichia coli. .................................................................................................................. 23 5. Выводы. ............................................................................................................. 25 6. Список литературы. .......................................................................................... 26 2 1. Список сокращений ПЦР – полимеразная цепная реакция ДНК – Дезоксирибонуклеиновая кислота АТФ – аденозинтрифосфат Amp – ампицилин Kn – каномицин Cm – хлорамофеникол ПААГ – Полиакриламидный гель 3 2. Литературный обзор 2.1.Люцифераза Бактериальные люциферазы являются гетеродимерами и катализируют реакцию окисления алифатического альдегида (RCHO) кислородом воздуха (О2) при участии восстановленного флавин-мононуклеотида (FMNH2): FMNH2 + RCHO + O2 = FMN + RCOOH + H2O + квант света (λmax = 490 нм). [1; 2] Это дает возможность измерять активность люциферазы, не разрушая бактериальную клетку. Бактериальные люциферазы – термолабильные белки, инактивирующиеся при температуре 35-42 С°. и состоящие из α- и β-субъединиц весом в 40 и 35 килодальтон соответственно. Эти субъединицы гомологичны, но активный центр находится в αсубъединице. Роль β-субъединицы не ясна, но она необходима для увеличения квантового выхода реакции [3]. Был получен кристалл и проведён рентген структурный анализ белков бактериальных люцифераз Vibrio harveyi. Авторами были определены ключевые аминокислоты образующие водородные связи при формировании гетеродимерной структуры белка. Оказалось, что 15 аминокислот задействованы в интерфейсе субъединиц. [4] 2.2. Молекулярные шапероны В процессе роста в клетках образуются неправильно собранные (misfolded) и денатурированные (unfolded) белки, количество которых значительно нарастает при стрессовых ситуациях, а также при суперпродукциии гетерологичных белков. В результате в клетке образуются нерастворимые белковые агрегаты и даже «тела включения», что приводит к инактивации бактерий [5]. Процессы дезагрегации (solubilization), рефолдинга и сборки белков de novo связаны с активностью системы клеточных шаперонов. Основную роль в правильном фолдинге примерно 25% клеточных белков играют шаперонины семейства HSP60 (GroEL/GroES) [6]. В клетках Escherichia coli основной системой, ответственной за рефолдинг денатурированных белков является DnaKJ бишаперонная система [7]. 4 Молекулярные шапероны составляют в клетке основную линию защиты против агрегации и стресс-индуцируемых частично денатурированных (misfolded) белковых структур. Молекулярные шапероны участвуют во многих процессах в клетке, связанных с правильной сборкой синтезирующихся полипептидных цепей как в течение, так и после трансляции (фолдинг), с восстановлением нативной структуры частично денатурированных белков (рефолдинг), с дезагрегацией белковых надмолекулярных структур, образующихся в клетке при «тепловом шоке», а также с транслокацией белков через мембраны и др. [8–12]. Впервые идентифицированные как белки, синтез которых нарастает при «тепловом шоке», шапероны получили соответствующее наименование - HSPs, т. е. «heat shock proteins». Однако в дальнейшем было обнаружено, что не все белки «теплового шока» – шапероны, и не все шапероны относятся к группе белков «теплового шока» [10; 13]. Пять основных семейств с характерными консервативными аминокислотными последовательностями описаны в настоящее время: Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60, sHsp. Ортологи в E. Coli : ClpB, HtpG, DnaK, GroEL , IbpAB соответственно. Все группы шаперонов – АТФ-зависимые, за исключением АТФ-независимых малых шаперонов sHsp [14]. Особое место в ряду шаперонов занимает АТФ-независимый триггер фактор, который формирует тесный комплекс с рибосомой и участвует в фолдинге практически всех синтезируемых белков [15; 16]. 2.3.Структура lux-оперонов морских бактерий Aliivibrio fischeri и Aliivibrio logei. У морских люминесцирующих бактерий Aliivibrio fischeri и Aliivibrio logei экспрессия lux-генов регулируется системой "LuxI-LuxR", которая определяет интенсивность биолюминесценции растущих клеток в зависимости от плотности популяции ("quorum sensing"): отсутствие свечения при малых концентрациях клеток и резкое усиление свечения при достижении популяцией критической плотности [17–19] На рис. 1 представлена структура lux-оперонов A. fischeri и A. logei. 5 Pl Pr luxI luxR luxC luxD luxA luxB luxE luxG A. fischeri P l 1 Pr 1 luxR1 Pl 2 luxC luxD luxA luxB luxE luxG Pr 2 luxR2 luxI A. logei Рисунок 1. Сравнение lux-оперонов A. fischeri и A. logei KCh1 Lux-регулон A. fischeri luxRICDABEG состоит из двух оперонов: luxR с промотором Pl, и luxICDABEG с промотором Pr [20; 21] Гены luxAB кодируют α и β субъединицы люциферазы, а гены luxCDE кодируют субъединицы редуктазы, синтезирующей тетрадеканаль, субстрат люциферазы. Гены luxI и luxR кодируют регуляторные белки LuxI и LuxR. Ацилсинтаза LuxI осуществляет синтез аутоиндуктора (АИ), ацильного производного лактона L-гомосерина, - N-(3оксогексаноил) лактон L-гомосерина [22], который играет ключевую роль в «общении» бактерий, так как свободно диффундирует через клеточные мембраны [23]. Белок LuxR – положительный регулятор (активатор) транскрипции оперона luxICDABEG. Связываясь с АИ, белок LuxR приобретает способность образовывать комплекс c luxбоксом, представляющим собой инвертированный повтор из 20 п.н. в области промотора Pr, и активировать транскрипцию оперона luxICDABEG [24–26]. Сравнение структуры lux-оперона A. logei со структурой lux-оперона бактерий A. fischeri показывает значительные отличия структур этих lux-оперонов (см. рис. 2) В структуре lux-оперона A. logei отсутствует ген luxI перед геном luxC, а непосредственно за геном luxG расположен фрагмент с генами luxR2 –luxI. Кроме того, спейсер между первым геном luxR1 и промотором Pr значительно превышает таковой у A. fischeri (более 500 н.п. против 200 н.п.). Принципиальным отличием является наличие в luxопероне психрофильных бактерий A. logei двух копий регуляторного гена luxR1 и luxR2 [27]. Чувствительность к АИ регуляторной области luxR1-Pr1 A. logei значительно ниже приблизительно равных регуляторных областей luxR2-Pr2 A. logei и luxR-Pr A. fischeri. 6 Интенсивность биолюминесценции, отн. ед. 100000 10000 1000 100 10 1 0.01 0.1 1 10 100 Концентрация АИ, нМ 1000 10000 Рисунок 2. Сравнение регуляторных областей luxR1-Pr1 (×)и luxR2-Pr2 (▲) A. logei и luxRPr A. fischeri (■) по чувствительности к АИ. 2.4.Участие бишаперонной системы DnaKJE-ClpB в рефолдинге термоинактивированных люцифераз (LuxAB). В 1999 г. бактериальные люциферазы были впервые использованы в качестве субстратов для изучения активности шаперонных систем [28] Было показано, что термоинактивированная люцифераза A. fischeri эффективно ренатурирует in vivo (в клетках E. coli) при непосредственном участии шаперонов системы DnaK-DnaJ-GrpE (DnaKJE). При исследовании эффективности действия шаперонов DnaKJE на субстратах – люциферазах, характеризующихся различной термостабильнотью, было показано, что чем выше термостабильность люциферазы, тем менее эффективен процесс DnaKJE-зависимой ренатурации [29]. На рисунке 3 представлены кривые термоинактивации изолированных из нескольких видов люминесцирующих бактерий. люцифераз, Из сравнения тангенса угла наклона кривых термоинактивации можно заключить, что при 36 °С люцифераза Photobacterium phosphoreum примерно в 10 раз термолабильнее люциферазы A. fischeri (рис. 3а) то время как люцифераза наземных бактерий Photorhabdus luminescens (при 43,5 °С) примерно в 15 раз термостабильнее люциферазы 7 морских бактерий A. fischeri (рис. 3б). Промежуточное положение по термостабильности занимает люцифераза V. harveyi (рис. 3б). Рисунок 3. Кинетика термоинактивации бактериальных люцифераз in vitro. По оси ординат указана активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс – время термоинактивации. а. – Люциферазы P. phosphoreum (1) и A. fischeri (2), температура инактивации 36°C; б. – люциферазы A. fischeri (1), V. harveyi (2) и P. luminescens (3), температура инактивации 43,5°C. 8 Рисунок 4. Кинетика рефолдинга термоинактивированных люцифераз в клетках E. coli. а) люциферазы P. phosphoreum (круги), и A. fischeri (треугольники); б) люциферазы V. harveyi (круги), P. luminescens (треугольники). Светлые символы – рефолдинг в клетках штамма MG1655, тёмные символы в клетках штамма PK202 ΔdnaKJ. Клетки подвергали «тепловому шоку» 42 °С 30 мин, затем для блокирования синтеза белков добавляли Cm 167 мкг/мл и проводили термоинактивацию люцифераз (5 мин при 42 °С). По оси ординат указана активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс – время выдерживания образца при температуре, оптимальной для данного вида люциферазы (20 °С – P. phosphoreum, 25 °С – A. fischeri, 28 °С – V. harveyi, 34 °С – P. luminescens). На рис. 4 приведены зависимости степени ренатурации люцифераз (%% от исходного уровня) от времени инкубации при температуре рефолдинга. В клетках мутантного штамма PK202 ΔdnaKJ рефолдинг полностью отсутствует. В клетках E. coli MG1655 dnaKJ+ наблюдается рефолдинг всех люцифераз, однако, термолабильные люциферазы P. phosphoreum и A. fischeri ренатурируют значительно полнее (до 80-90% от исходного уровня), в то время как термостабильные люциферазы ренатурируют значительно слабее (25% – V. harveyi, 7-8% – P. luminescens). В этой же работе было показано, что DnaKJE-зависимый рефолдинг значительно (почти на порядок) снижается, если клетки E. coli несут мутацию в гене clpB, что непосредственно доказывает важность ко-шаперона ClpB для активности шаперона DnaKJE. В работе [30] в качестве белков-субстратов в опыте in vivo использовали бактериальную (гетеродимерную) V. harveyi и светлячковую (мономерную) Photinus pyralis люциферазы для определения функции ко-шаперона Sse1p (содержится в 9 цитозоле дрожжей) в качестве фактора нуклеотидного обмена (nucleotide exchange factor, NEF) (аналог бактериального фактора GrpE) для Hsp70. Показано, что делеция гена SSE1 практически термоинактивированной не влияла на мономерной светлячковой эффективность рефолдинга люциферазы и значительно снижала уровень рефолдинга бактериальной гетеродимерной люциферазы. Однако причина столь значительной разницы в уровнях рефолдинга осталась не выясненной. Ранее также было показано, что белки шаперонины GroEL/ES участвуют в сборке и деградации регуляторного белка LuxR, активатора транскрипции генов luxоперона A. fischeri [31]. В работах [32; 33] было показано, что протеаза Lon проводит деградацию белка – активатора LuxR и тем самым участвует в негативной регуляции системы «quorum sensing» V. fischeri (в настоящее время, A. fischeri). 10 3. Материалы и методы 3.1.Бактериальные штаммы и плазмиды В работе использованы следующие штаммы E. coli K-12: Таблица 1. Штаммы, использовавшиеся в данной работе Название штамма MG1655 PK202 Генотип Источник F- λ- ilvG- rfb-50 rph-1 E. Craig (США)/ВКПМ dnaK14 dnaJ14 dksA::kan (остальные генетические маркеры как у MG1655) E.A. Craig, (США) В работе использованы следующие плазмиды: Таблица 2. Плазмиды, использовавшиеся в данной работе Название плазмиды Конструкция Источник С генами luxAB Aliivibrio fischeri, pF2 расположенными под lac промотором, была Наша лаборатория сконструирована в результате [Чернова Т.А., переклонирования фрагмента ДНК XhoI-SalI из Завильгельский Г.Б., плазмиды pF1, содержащей полный lux-оперон 1991] A. fischeri, Apr pSVAB Гены luxAB A. logei Kch1, расположенные под Наша лаборатория контролем lac промотора. [Хрульнова С.А] Гены luxAB A. logei Kch1, расположенные под pL48K контролем lac промотора, с мутацией L48K: Настоящая работа CTT -> AAA Наша лаборатория. p2015 Гены luxAB Photobacterium phosphoreum, расположенные под контролем lac промотора. [Завильгельский Г. Б., Котова В. Ю., Мажуль М. М., Манухов И. В. 2004.] 11 3.2.Питательные среды и условия роста Клетки E.coli были культивированы в среде LB: бактотриптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, NaCl 10 г/л, рН 7,5. Для получения твёрдой среды был добавлен агар до концентрации 1,5%. К клеткам добавляли антибиотики в следующих концентрациях: Таблица 3. Использование антибиотиков PK 202 Kn 5μl/10ml Клетки с плазмидами pF2, pSVAB, pL48K Amp 20μl/10 ml 3.3.Методы молекулярного клонирования Трансформация клеток в E. coli методом электропорации. Ночную культуру выращивали в LB, разводили в 100 раз и растили на качалке в LB до OD600=0.5-0.8. Дальнейшие действия производили при температуре 4 °C. Центрифугировали в эппендорфах 3 мин при 4500 об/мин, удаляли супернатант. Промывали 1,5 мл H2OsQ, после этого центрифугировали 3 мин при 4500 об/мин. Повторяли последнее действие 3 раза. К осаждённым клеткам добавляли 20μl воды. Добавляли раствор ДНК (1μl), переносили полученную смесь в ячейку электропоратора. Электропорацию проводили на 1700 V, 10 мсек, затем клетки инкубировали в LB на 37 °C 30 мин и высевали на чашки Петри с агаризованной LB средой с соответствующими антибиотиками. Мутантную плазмиду люциферазы A. logei L48K получили сайт-направленным мутагенезом. 12 pSVAB 1. ПЦР 4. Рестрикция NcoI и ClaI 2. Вставка в T-вектор T 5. Лигирование 3. Рестрикция по NcoI и ClaI pL48K Рисунок 5. Порядок действий для получения люциферазы A. logei с мутацией L48K. Клонирование происходило по следующей схеме (см. рис. 5): 1. Сайт-направленный мутагенез проводился с помощью ПЦР (см. схему на рис. 6). В первой ПЦР использовались праймеры 887L48Kf, L48KR (см. нуклеотидные последовательности праймеров в табл. 4) и плазмида pSVAB в качестве матрицы. Во второй ПЦР – праймеры L48K671r, ClIluxBR и матрица pSVAB. ПЦР-продукты разделяли в агарозном геле и эюлировали нужные ДНК. В результате этих двух реакций получились последовательности ДНК с комплиментарными концами, содержащими 3хнуклеотидную замену. ПЦР-продукты помещали в одну пробирку и проводили на их основе третью ПЦР с праймерами 887L48Kf, L48K671r. Конечный ПЦР-продукт – вырезанная из плазмиды pSVAB последовательность ДНК с мутацией. ПЦР-продукты разделяли в агарозном геле и эюлировали нужные ДНК. 13 2. Полученный ПЦР-продукт был вставлен в T-вектор. 3. С данным T-вектором проводили рестрикцию по сайтам Ncol и ClaI. 4. Плазмиду pSVAB разрезали по сайтам рестрикции Ncol и ClaI. 5. Мутантный ПЦР продукт лигировали в разрезанную плазмиду pSVAB. Рисунок 6. Схема сайт-направленного мутагенеза, проведенного с помощью ПЦР (картинка взята из [28]) 1я ПЦР: праймеры 887L48Kf, L48KR; 2я ПЦР: праймеры L48KF, L48K671r; Зя ПЦР: праймеры 887L48Kf, L48K671r. В качестве матрицы для первых двух опытов использовалась плазмида pSVAB 14 Таблица 4. Праймеры, использованные для ПЦР Название праймера Последовательность нуклеотидов 887L48Kf 5’- gaagattcacgcgaaataacacaacat - 3’ L48KR 5’- ccaacgataccatttttagaaaagtggtgttca -3’ L48KF 5’- tgaacaccacttttctaaaaatggtatcgttgg -3’ L48K671r 5’- gcgttttctttaatgattgtctttattttttc -3’ ПЦР проводили на приборе «Терцик». Секвенирование ПЦР-продуктов проводилось по методу Сэнгера. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле Анализ фрагментов ДНК проводили в 1% агарозном геле (на буфере TAE с содержанием 1 мкг/мл бромистого этидия). В работе использовались маркеры длин фрагментов ДНК фирмы “Fermentas”. Фрагменты ДНК детектировали в геле при его облучении УФ светом с длиной волны 280-340 нм. Выделение и очистка ПЦР продукта осуществлялась с помощью набора DNA extraction kit (“Fermentas”). 3.4. Методы измерения инактивации и рефолдинга люцифераз. Термоинактивацию люцифераз in vivo проводили в водяной бане при фиксированной температуре. К суспензии клеток E. coli для ингибирования синтеза белка добавляли хлорамфеникол в концентрации 167 мкг/мл. Рефолдинг люцифераз проводили при 23 °C. Через определенные интервалы времени отбирали пробу (200 мкл) и через 60 с после добавления n-деканаля (субстрат люциферазной реакции) измеряли интенсивность биолюминесценции. Рефолдинг люцифераз in vivo проводили на столе. Предварительный «тепловой шок» проводили, инкубируя клетки E. coli в LB в термостате при 42 °C 30 мин без добавления хлорамфеникола. Для дальнейшего ингибирования синтеза белка добавляли Cm в концентрации 167 мкг/мл. Инактивацию проводили в водяной бане при температуре 46 °C. Через определенные интервалы времени отбирали пробу (200 мкл) и через 60 с после добавления n-деканаля (субстрат люциферазной реакции) измеряли интенсивность биолюминесценции. 15 Измерение интенсивности биолюминесценции суспензии клеток (200 мкл) проводили на люминометре Biotox 7 (OOO “Ekon”, Россия) с добавлением в качестве субстрата реакции 2 мкл 0,001% -го спиртового раствора n-деканаля (Sigma). Измерение интенсивности биолюминесценции (в мкВ) проводили при комнатной температуре. Измерение оптической плотности проводилось на фотоколориметре КФК-2МР на 600нм. 3.5.Програмное обеспечение. Статистическая обработка результатов экспериментов проводилась в среде R (http://www.r-project.org/) Обработка графических данных электрофоретического разделения белков в денатурирующих условиях в ПААГ проводилась с помощью программы Total Lab (http://www.totallab.com/) 16 4. Результаты и обсуждение. 4.1.Инактивация люцифераз Aliivibrio fischeri и Aliivibrio logei. Клетки E.coli K12 PK202 с плазмидами с генами luxAB (pF2, pSVAB, p2015) выращивали ночь при температуре 25 °C без перемешивания. Инактивацию проводили при 33 °С с добавлением Cm (167мкг/мл). Рисунок 7. Инактивация люцифераз при 330С. Клетки E. coli MG1655 с плазмидами, содержащими гены люцифераз A. logei (•); A. fischeri (•); P. phosphoreum (•) выращивали ночь при температуре 24 0С без перемешивания. Инактивацию проводили с предшествующим ингибированием синтеза белка. Из рисунка 7 видно, что кинетика инактивации люциферазы психрофильной бактерии A. logei совпадает с кинетикой инактивации люциферазы психрофильной бактерии A. fischeri (за час люциферазы инактивируются до уровня 20%) и существенно термостабильней инактивации психрофильной бактерии P. phosphoreum (3% за час). 4.2.DnaK-зависимый рефолдинг люцифераз Aliivibrio fischeri и Aliivibrio logei. Клетки E.coli K12 MG1655 с плазмидами с генами luxAB (pF2, pSVAB, p2015) и PK202 pSVAB выращивали при температуре 25 °С, выдерживали 30 мин при 42 °С для 17 индукции теплового шока, добавляли Cm (167мкг/мл) для ингибирования синтеза белка, инактивировали люциферазу 5 мин при 46 °С. Рисунок 8. Рефолдинг термоинактивированных люцифераз при 24 °С. Клетки E. coli MG1655 с плазмидами, содержащими гены люцифераз A. logei (•); A. fischeri (•); P. phosphoreum (•) ночь при температуре 24 °С без перемешивания. Инактивацию проводили при 33 °С с добавлением Cm (167мкг/мл). Hit-shock проводили 5 минут при температуре 42 °С. Рефолдинг проводили при температуре 24 °С. График на рис. 8 показывает, что уровень рефолдинга термоинактивированной люциферазы психрофильной бактерии A. logei составляет 10%, что на порядок ниже уровня рефолдинга термоинактивированных люцифераз мезофильной бактерии A. fischeri и психрофильной бактерии P. phosphoreum (практически 100%) 4.3. Фолдинг люцифераз Alliivibrio fischeri и Alliivibrio logei. Клетки E. coli K12 PK202 с плазмидами с генами luxAB (pF2, pSVAB) растили в LB-бульоне при постоянном перемешивании (100-200 об/с) и при разных температурах (17 °С, 24 °С, 30 °С, 37 °С). Была измерена биолюминесценция бактерий при разных OD600. 18 Рисунок 9. Фолдинг люциферазы. Клетки E. coli PK202 с плазмидами, содержащими гены люцифераз A. logei (•); Люминесценция снята A. fischeri (•) при растили OD600=0.4, при нормирована постоянном на перемешивании. максимальную полученную люминесценцию. На рисунке 9 представлены данные эксперимента по сравнению способности люцифераз A. logei и A. fischeri к фолдингу в клетках E. coli, мутантных по генам dnaKJ (отсутствует рефолдинг) при разных температурах. Способность к фолдингу определялась по люминесценции клеток нормированной на максимальную люминесценцию при OD600=0.4. Как видим, уровень фолдинга люцифераз спадает при повышении температуры роста бактерий. Падение способности к фолдингу примерно одинаково для люцифераз A. logei и A. fischeri. На рисунке Рисунок 10. Зависимость люминесценции клеток E. coli PK202 с плазмидами, содержащими гены люцифераз A. logei (•); A. fischeri (•), от оптической плотности культуры клеток.10 представлены данные зависимости интенсивности биолюминесценции E. coli , содержащих плазмиды с генами люцифераз A. logei и A. fischeri, в зависимости от OD600 при температуре 30 °С. Как видно, биолюминесценция люциферазы A. fischeri на два порядка больше интенсивности биолюминесценции люциферазы A. logei. 19 Разница в интенсивности биолюминесценции E. coli, содержащих плазмиды с генами люцифераз A. logei и 1e+05 1000 10 luminiscence level A. fischeri сохраняется и для других температур (данные не представлены). 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 OD,ratio Рисунок 10. Зависимость люминесценции клеток E. coli PK202 с плазмидами, содержащими гены люцифераз A. logei (•); A. fischeri (•), от оптической плотности культуры клеток. 4.4.Анализ количества синтезированных люцифераз Aliivibrio fischeri и Aliivibrio logei. Для проверки гипотезы о том, зависит ли различие интенсивности биолюминесценции клеток E. coli, содержащих плазмиды с генами люцифераз A. logei и A. fischeri от количества синтезированного белка люциферазы, или от активности соответствующего белка люциферазы, был проведен анализ количества синтезированного белка люцифераз Alliivibrio fischeri и Alliivibrio logei в клетках E.coli. Белки клеток E. coli, содержащих плазмиды с генами люцифераз A. logei и A. fischeri были разделены в ДСН-ПААГ. Фотография белкового фореза была обработана в программе TotalLab. Программа распознаёт на изображении фореза все линии белков для данной полосы и, используя информацию об их яркости, оценивает массовую долю белков данной линии 20 по отношению ко всем белкам, синтезированным в данной клетке. Т.к известна примерная масса α- и β-субъединиц бактериальных люцифераз, возможно оценить количество белка люциферазы синтезирующегося в клетках с плазмидами с генами luxAB и в клетках без них. Полученные данные показали, что количество синтезированной люциферазы A. fischeri несколько больше, чем количество синтезированной люциферазы A. logei (см. таблицу 5). Рисунок 11. Белковый форез клеток E. coli MG1655 с плазмидами, содержащими гены Рисунок 12. Данные с белкового фореза, люцифераз A. logei (2); A. fischeri (3); обработанные в программе TotalLab без плазмид (5). (4) – стандартный маркер Fermentas Таблица 5. Соотношение содержания белка в полосах соответствующих α- и βсубъединицам бактериальных люцифераз A. logei и A. fischeri № полосы no lux A. logei A. fischeri 7 16% 14% 20% 8 10% 12% 12% 4.5. Конструирование люциферазы Alliivibrio logei с заменой L48K. Последовательность люциферазы A. logei в местах межсубъединичных контактов содержит одну аминокислотную замену по сравнению с V. harvei различается знаком заряда в области межсубъединичных контактов β-субъединиц люцифераз (см. табл. 6). Данная замена должна приводить к потере водородной связи между субъединицами. Было высказано 21 предположение, что восстановление неполярного лейцина в 48 положении на положительно заряженный лизин, может привести к усилению межсубъединичного контакта и как следствие к увеличению скорости и уровня рефолдинга люциферазы A. logei. Таблица 6. Аминокислотная последовательность областей межсубъединичного контакта βсубъединиц люцифераз A. logei и A. fischeri Для замены 3х нуклеотидов на 48й позиции методом ПЦР (L48K: CTT -> AAA) были использованы праймеры ERIluxAF, L48KR, L48KF, ClIluxBR (см. описание сайтнаправленного мутагенеза в методах). Успешность клонирования была подтверждена секвенированием. 4.6.DnaK-зависимый рефолдинг люциферазы Aliivibrio logei с заменой L48Kв клетках Escherichia coli. Клетки E. coli K12 PK202 с плазмидами pF2, pSVAB, p2015 и pL48K, содержащими гены бактериальных люцифераз luxAB из A. logei, P. phosphoreum и мутантной люциферазы A. logei L48K соответственно. 22 A. fischeri, Рисунок 13. Рефолдинг термоинактивированной клонированной люциферазы при 24 °С. Клетки E. coli MG1655 с плазмидами, содержащими гены люцифераз A. logei (•); A. fischeri (•); P. phosphoreum (•); A. logei с заменой L48K (•) выращивали ночь при температуре 24 °С без перемешивания. Инактивацию проводили при 33 °С с добавлением Cm (167мкг/мл). Hit-shock проводили 5 минут при температуре 42 °С. Рефолдинг проводили при температуре 24 °С На рисунке 13 видно, что уровень рефолдинга термоинактивированной мутантной люциферазы равен уровню рефолдинга термоинактивированной люциферазы A. logei (примерно 10%). 4.7.Инактивация люциферазы Aliivibrio logei с заменой L48K в клетках Escherichia coli. Клетки E. coli K12 MG1655 с плазмидами с генами luxAB (pF2, pSVAB, p2015, pL48K) и PK202 pSVAB выращивали при температуре 25 °С, выдерживали 30 мин при 42 °С для индукции теплового шока, добавляли Cm (167мкг/мл) для ингибирования синтеза белка, инактивировали люциферазу 5 мин при 46 °С. 23 Рисунок 14. Инактивация клонированной люциферазы при 33 °С. Клетки E. coli MG1655 с плазмидами, содержащими гены люцифераз A. logei (•); A. fischeri (•); P. phosphoreum (•); A. logei с заменой L48K (•) выращивали ночь при температуре 24 °С без перемешивания. Инактивацию проводили с предшествующим ингибированием синтеза белка. Из графика на рис. 14 видно, что мутантная люцифераза, инактивировавшаяся за час до уровня 30% более термостабильна, чем у люциферазы бактерий A. logei и A. fischeri, инактивировавшиеся до уровня 20% за час. 24 5. Выводы. Уровень рефолдинга термоинактивированной люциферазы A. logei ниже, чем уровень рефолдинга термоинактивированной люциферазы A. fischeri. Уровень и скорость инактивации люцифераз A. logei и A. fischeri совпадают. Получена плазмида с люциферазой A. logei с заменой лейцина на лизин в 48 положении β-субъединицы люциферазы. Замена лейцина в 48 положении βсубъединицы люциферазы A. logei. на лизин приводит к увеличению термостабильности фермента. Кинетика рефолдинга термоинактивированной люциферазы A. logei и мутантной люциферазы совпадают. 25 6. Список литературы. 1. Baldwin, T.O. и др. Structure of bacterial luciferase./ T.O. Baldwin и др. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1995. Т. 5. № 6. С. 798–809. 2. Baldwin, T., Nicoli, Z., Becvar, J.E. Bacterial luciferase. Binding of oxidized flavin mononucleotide./ T. Baldwin и др. // J. Biol. Chem. 1975. Т. 250. № April 25. С. 2763–2768. 3. Baldwin, T.O., Ziegler, M.M. The biochemistry and molecular biology of bacterial bioluminescence/ T.O. Baldwin, M.M. Ziegler. // Chem. Biochem. flavoenzymes. 1992. Т. 3. С. 467–530. 4. Fisher, A.J. и др. Three-dimensional structure of bacterial luciferase from Vibrio harveyi at 2.4 .ANG. resolution/ A.J. Fisher и др. // Biochemistry. 1995. Т. 34. С. 6581–6586. 5. Tomoyasu, T. и др. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in Escherichia coli cytosol./ T. Tomoyasu и др. // Mol. Microbiol. 2001. Т. 40. С. 397–413. 6. Hartl, F.U. Molecular chaperones in cellular protein folding./ F.U. Hartl. // Nature. 1996. Т. 381. С. 561–570. 7. Ben-Zvi, A.P., Goloubinoff, P. Review: mechanism of disaggregation and refolding of stable protein aggregates by molecular chaperones./ A.P. Ben-Zvi, P. Goloubinoff. // J. Struct. Biol. 2001. Т. 135. С. 84–93. 8. Sharma, S.K., Chrimten, P., Goloubinoff, P. Disaggregating chaperones: an Unfolding story./ S.K. Sharma и др. // Curr. Protein Pept. Sci. 2009. Т. 10. С. 342–446. 9. Priya, S., Sharma, S.K., Goloubinofff, P. Molecular chaperones as enzymes that catalytically unfold misfolded polypeptides/ S. Priya и др. // FEBS Lett. 2013. Т. 587. С. 19981–1987. 10. Rosenzweig, R., Moradi, S., Zarrine-Afsar A., Glover J, R., K.L.E. Unraveling the mechanism of protein disaggregation through a ClpB-DnaK interaction./ R. Rosenzweig и др. // Science (80-. ). 2013. Т. 339. С. 1080–1083. 11. Tyedmers, J., Mogk, A., Bukau, B. Cellular strategies for controlling protein aggregation./ J. Tyedmers и др. // Nat. Rev. Mol. cell Biol. 2010. Т. 11. С. 777–788. 12. Liberek, K., Lewandowska, A., Zietkiewicz, S. Chaperones in control of protein disaggregation/ K. Liberek и др. // EMBO J. 2008. Т. 27. С. 328–335. 13. Nicoll, W.S. и др. Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones./ W.S. Nicoll и др. // Protein Expr. Purif. 2006. Т. 46. С. 1–15. 14. Hartl, F.U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperonesin protein folding and proteostasis./ F.U. Hartl и др. // Nature. 2011. Т. 475. № 7356. С. 324–332. 15. Lill, R. и др. No Title/ R. Lill и др. // Cell. 1988. Т. 54. С. 1013–1018. 26 16. Hoffman, A., Bukau, B., Kramer, G. No Title/ A. Hoffman и др. // Biochim. Biophys. Acta. 2010. Т. 1803. С. 650–661. 17. Fuqua, W.C., Winans, S.C., Greenberg, E.P. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators/ W.C. Fuqua и др. // J. Bacteriol. 1994. Т. 176. С. 269–275. 18. Dunlap, P.V., Urbanchczyk, H. Luminos bacteria/ P.V. Dunlap, H. Urbanchczyk. // Procariotic Physiol. Biochem. 2013. С. 495–528. 19. Meigen, E.A. Molecular biology of bacterial bioluminescence/ E.A. Meigen. // Microbiol. Rev. 1991. Т. 55. С. 123–142. 20. Завигельский, Г.Б., Манухов, И.. Quorum sensing, или как бактерии «разговаривают» друг с другом. Молекуляр. биология./ Г.Б. Завигельский, И.. Манухов. // Молекулярная биология. 2001. Т. 35. С. 268–277. 21. Хмель, И.., Метлицкая, А.З. Quorum sensing регуляция экспрессии генов – перспективная модель для создания лекарств против патогенных бактерий/ И.. Хмель, А.З. Метлицкая. // Молекулярная биология. 2006. Т. 40. С. 195–211. 22. Engebrecht, J., Silverman, M. Identification of genes and gene products necessary for bacterial bioluminescence/ J. Engebrecht, M. Silverman. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1984. Т. 81. С. 4154–4158. 23. Eberhard, A. и др. Structural identification of autoinducer of Photobacterium fischeri luciferases/ A. Eberhard и др. // Biochemistry. 1981. Т. 20. С. 2444–2449. 24. Kaplan, H.B., Greenberg, E.P. Diffusion of autoinducer is involved in regulation of the Vibrio fischeri luminescence system/ H.B. Kaplan, E.P. Greenberg. // J. Bacteriol. 1985. Т. 163. С. 1210–1214. 25. Завигельский, Г.Б., Манухов, И.. Роль La протеазы в негативном контроле экспрессии генов luxICDABEG Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli/ Г.Б. Завигельский, И.. Манухов. // Молекулярная биология. 1997. Т. 31. С. 945–949. 26. Завигельский, Г.Б., Манухов, И.., Котова, В.. Внутриклеточные факторы регуляции экспрессии lux-оперона Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli/ Г.Б. Завигельский и др. // Микробиология. 2006. Т. 75. С. 525–531. 27. Manukhov, I.V. и др. Comparative Analysis of the lux-Operon Structure in Aliivibrio logei KCh1 (Kamchatka Isolate) and Aliivibrio salmonicida/ I.V. Manukhov и др. // J. Bacteriol. 2011. Т. 193. № 15. С. 3998–4001. 28. Manukhov, I. V. и др. Folding and refolding of thermolabile and thermostable bacterial luciferases: The role of DnaKJ heat-shock proteins/ I. V. Manukhov и др. // FEBS Lett. 1999. Т. 448. № 2-3. С. 265–268. 29. Завильгельский, Г.Б. и др. Влияние белков семейства Clp на DnaKзависимый рефолдинг бактериальных люцифераз./ Г.Б. Завильгельский и др. // Молекулярная биология. 2004. Т. 38. № 3. С. 507–514. 27 30. Raviol, H. и др. Chaperone network in the yeast cytosol: Hsp110 is revealed as an Hsp70 nucleotide exchange factor./ H. Raviol и др. // EMBO J. 2006. Т. 25. № 11. С. 2510– 2518. 31. Adar, Y., Simaan, M., Ulitzur, S. Formation of the LuxR protein in the Vibrio fischeri lux system is controlled by HtpR through the GroESL proteins/ Y. Adar и др. // J. Bacteriol. 1992. Т. 174. С. 7138–7143. 32. Завигельский, Г.Б., Манухов, И.В. Lon-протеаза участвует в регуляции транскрипции lux-оперона Vibrio fischeri./ Г.Б. Завигельский, И.В. Манухов. // Генетика. 1994. Т. 30. С. 337–341. 33. Завильгельский, Г.Б., Манухов, И.В. Роль Lon протеазы в негативном контроле экспрессии luxCDABE генов Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli./ Г.Б. Завильгельский, И.В. Манухов. // Молекулярная биология. 1997. Т. 31. С. 945–949. 34. Ясный, И. Рисунок: мутагенез с помощью ПЦР. (с) Creative Commons Attribution-Share Alike 3.0 [Электронный ресурс]. URL: http://ru.wikipedia.org/wiki/Файл:Mutagenesis.png. 28
