êàëüöèåâûé ãîìåîñòàç â òèìîöèòàõ ïðè àïîïòîçå. i. ïîâûøåíèå êîíöåíòðà
реклама
ÓÄÊ 577.342.45:612 ÊÀËÜÖÈÅÂÛÉ ÃÎÌÅÎÑÒÀÇ Â ÒÈÌÎÖÈÒÀÕ ÏÐÈ ÀÏÎÏÒÎÇÅ. I. ÏÎÂÛØÅÍÈÅ ÊÎÍÖÅÍÒÐÀÖÈÈ ÖÈÒÎÇÎËÜÍÎÃÎ Ñà2+ ÍÀ ÐÀÍÍÅÉ ÑÒÀÄÈÈ ÀÏÎÏÒÎÇÀ, ÈÍÄÓÖÈÐÎÂÀÍÍÎÃÎ ÏÅÐÎÊÑÈÄÎÌ ÂÎÄÎÐÎÄÀ Ä. Ì. ÃÐÅÁÈÍÛÊ, Ò. Â. ÊÎÂÀËÜ, Î. Ï. ÌÀÒÛØÅÂÑÊÀß Êèåâñêèé íàöèîíàëüíûé óíèâåðñèòåò èìåíè Òàðàñà Øåâ÷åíêî, Óêðàèíà; e-mail: grebinik@yahoo.com Äîñë³äæóâàëè êîíöåíòðàö³þ â³ëüíîãî öèòîçîëüíîãî Ñà2+ ([Ca2+]i), âõ³ä 45Ñà2+ òà âì³ñò â³äíîâëåíîãî ãëóòàò³îíó (GSH) â ³çîëüîâàíèõ òèìîöèòàõ ï³ñëÿ ðåíòãåí³âñüêîãî îïðîì³íåííÿ â äîç³ 4,5 Ãð àáî çà 䳿 0,1ìÌ Í2Î2 â ïåð³îä, ÿêèé ïåðåäóº âèÿâëåí³é åëåêòðîôîðåòè÷íî ì³æíóêëåîñîìí³é ôðàãìåíòàö³¿ ÄÍÊ. ²ç âèêîðèñòàííÿì çîíäà ôóðà-2 âñòàíîâëåíî, ùî ð³âåíü öèòîçîëüíîãî Ñà2+ â îïðîì³íåíèõ êë³òèíàõ íå çì³íþºòüñÿ ïîð³âíÿíî ç êîíòðîëåì, à âì³ñò GSH íå çíèæóºòüñÿ.  îáðîáëåíèõ ïåðîêñèäîì âîäíþ êë³òèíàõ âèÿâëåíî ïîñòóïîâå ï³äâèùåííÿ [Ca2+]i îäíî÷àñíî ç³ çíèæåííÿì âì³ñòó GSH. Âõ³ä 45Ñà2+ â òèìîöèòè ï³ä 䳺þ àïîïòîãåííèõ ÷èííèê³â íå ïîñèëþºòüñÿ. Äîäàâàííÿ Í2Î2 äî êë³òèí, ïîïåðåäíüî îáðîáëåíèõ òàïñèãàðã³íîì, òàêîæ ïðèçâîäèòü äî ïîäàëüøîãî çðîñòàííÿ [Ca2+]i ÿê ó ñòàíäàðòíîìó, òàê ³ â íîì³íàëüíî áåçêàëüö³ºâîìó ñåðåäîâèù³. Öèêëîñïîðèí À ïðèãí³÷óº Ñà2+-ìîá³ë³çóâàëüíèé åôåêò ïåðîêñèäó âîäíþ, àëå íå ïîïåðåäæຠéîãî ïîâí³ñòþ. Îáãîâîðþºòüñÿ ðîëü âíóòð³øíüîêë³òèííèõ äåïî â ïîðóøåíí³ êàëüö³ºâîãî ãîìåîñòàçó â òèìîöèòàõ çà óìîâ ìîäåëþâàííÿ îêèñíîãî ñòðåñó òà àïîïòîçó. Ê ë þ ÷ î â ³ ñ ë î â à: êàëüö³é, àïîïòîç, ïåðîêñèä âîäíþ, ðåíòãåí³âñüêå îïðîì³íåííÿ, ì³òîõîíäð³¿, öèêëîñïîð³í À, òèìîöèòè. Í åñìîòðÿ íà òî, ÷òî â ïîñëåäíåå âðåìÿ èíòåíñèâíî èññëåäóþòñÿ ìåõàíèçìû àïîïòîçà, ïóòè êîíòðîëèðîâàíèÿ ýòîãî ïðîöåññà îñòàþòñÿ íåäîñòàòî÷íî èçó÷åííûìè. Îò÷àñòè ýòî îáúÿñíÿåòñÿ òåì, ÷òî â êàñêàäàõ ðåàêöèé, çàïóñêàþùèõ ïðîãðàììó êëåòî÷íîé ãèáåëè, ïîñòîÿííî âûÿâëÿþòñÿ íîâûå çâåíüÿ, ïîñëåäîâàòåëüíîñòü âêëþ÷åíèÿ êîòîðûõ çàâèñèò îò ïðèðîäû àïîïòîãåííîãî ñòèìóëà, òèïà è ôóíêöèîíàëüíîé àêòèâíîñòè êëåòîê. Ñîãëàñíî äàííûì ðàáîò ïîñëåäíèõ ëåò, îäíèì èç ôàêòîðîâ êîíòðîëÿ êàê ðàííåãî, òàê è çàâåðøàþùåãîñÿ óïîðÿäî÷åííîé äåãðàäàöèåé ÄÍÊ ïîçäíåãî ýòàïà àïîïòîçà ÿâëÿåòñÿ ïîâûøåíèå êîíöåíòðàöèè ñâîáîäíîãî öèòîçîëüíîãî Ñà2+ â êëåòêå ([Ca2+]i). Çàðåãèñòðèðîâàíî âîçðàñòàíèå [Ca2+]i â ëèìôîèäíûõ êëåòêàõ è òèìîöèòàõ ïðè àïîïòîçå â îòâåò íà îáðàáîòêó ãëþêîêîðòèêîèäàìè, àíòèòåëàìè ê ÑD3 [1–3], à òàêæå â êëåòêàõ ðàçëè÷íûõ òèïîâ ïðè àïîïòîçå, âûçâàííîì òàïñèãàðãèíîì èëè êàëüöèåâûìè èîíîôîðàìè [4,5]. Ïîêàçàíî, ÷òî àïîïòîãåííûé ýôôåêò ìîæåò íàáëþäàòüñÿ â ñëó÷àå îñâîáîæäåíèÿ Ñà2+ èç ýíäîïëàçìàòè÷åñêîãî ðåòèêóëóìà (ÝÏÐ), “eìêîñòíîãî” âõîäà êàòèîíà â êëåòêó ÷åðåç Ñà2+-êàíàëû, àêòèâèðóåìûå îïóñòîøåíèåì ÝÏÐ, à òàêæå âûõîäà Ñà2+ èç ìèòîõîíäðèàëüíîãî ìàòðèêñà [6–8]. Î÷åâèäíî, ÷òî âàæíóþ ðîëü â èíèöèàöèè àïîïòîçà èãðàåò íå ñòîëüêî ïîâûøåíèå îáùåãî óðîâíÿ Ñà2+ â öèòîçîëå, ñêîëü- êî íàðóøåíèå åãî âíóòðèêëåòî÷íîé êîìïàðòìåíòàëèçàöèè âñëåäñòâèå äèñáàëàíñà Ñà2+-ïóëîâ ýíäîïëàçìàòè÷åñêîãî ðåòèêóëóìà è ìèòîõîíäðèé.  ñâÿçè ñ ýòèì âàæíîå çíà÷åíèå ïðèîáðåòàåò îöåíêà êîíöåíòðàöèè öèòîçîëüíîãî Ñà2+ â äèíàìèêå àïîïòîçà, èíäóöèðîâàííîãî ðàçëè÷íûìè ôàêòîðàìè è èññëåäîâàíèå âîçìîæíûõ ïðè÷èííî-ñëåäñòâåííûõ ñâÿçåé ìåæäó ïðîÿâëåíèåì ìîðôîëîãè÷åñêèõ ïðèçíàêîâ àïîïòîçà è íàðóøåíèÿìè êàëüöèåâîãî ãîìåîñòàçà â ñèñòåìå åãî ïîääåðæàíèÿ. Äëÿ ýêñïåðèìåíòàëüíîãî ìîäåëèðîâàíèÿ àïîïòîçà íàìè áûëà èñïîëüçîâàíà ñóñïåíçèÿ èçîëèðîâàííûõ òèìîöèòîâ, ïîäâåðæåííàÿ äåéñòâèþ èîíèçèðóþùåé ðàäèàöèè êàê ôàêòîðà, îñíîâíîé ìèøåíüþ êîòîðîãî ÿâëÿåòñÿ ÄÍÊ, ëèáî ïåðîêñèäà âîäîðîäà – óíèâåðñàëüíîãî èíäóêòîðà îêèñëèòåëüíîãî ñòðåññà. Ñîãëàñíî äàííûì, ïîëó÷åííûì íàìè ñ èñïîëüçîâàíèåì ôëóîðåñöåíòíîé ìèêðîñêîïèè, íà ðàííåì ýòàïå èíêóáàöèè òèìîöèòîâ ïîñëå ðåíòãåíîâñêîãî îáëó÷åíèÿ (4,5 Ãð) èëè â ïðèñóòñòâèè Í2Î2 (0,1 ìÌ) â ñóñïåíçèè òèìîöèòîâ îáíàðóæèâàåòñÿ çíà÷èòåëüíîå êîëè÷åñòâî àïîïòè÷åñêèõ êëåòîê ñ êîíäåíñèðîâàííûì è ôðàãìåíòèðîâàííûì õðîìàòèíîì [9]. Öåëüþ äàííîé ðàáîòû áûëî èçó÷èòü äèíàìèêó íàêîïëåíèÿ ïðîäóêòîâ ìåæíóêëåîñîìíîãî ðàñùåïëåíèÿ ÄÍÊ, ïàðàëëåëüíî îöåíèòü óðîâåíü öèòîçîëüíîãî Ñà2+ â êëåòêàõ è ïðîàíàëèçèðîâàòü ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 6 63 ÅÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜͲ ÐÎÁÎÒÈ âîçìîæíûå ïðè÷èíû åãî èçìåíåíèÿ ïîñëå äåéñòâèÿ èññëåäóåìûõ àïîïòîãåííûõ ôàêòîðîâ. Ìàòåðèàëû è ìåòîäû Òèìîöèòû ïîëó÷àëè èç òèìóñà êðûñ ëèíèè Âèñòàð ìàññîé òåëà 120–150 ã. Òèìóñ ïðîòèðàëè ÷åðåç íåéëîíîâîå ñèòî â áóôåð À, ñîäåðæàùèé (ìÌ): Na2HPO4 × 12H2O – 3, KCl – 5, NaCl – 120, ãëþêîçà – 10, HEPES – 5, NaHCO3 – 4, MgCl2 – 1 è CaCl2 – 1. Êîëè÷åñòâî æèçíåñïîñîáíûõ êëåòîê îïðåäåëÿëè â êàìåðå Ãîðÿåâà ñ èñïîëüçîâàíèåì 0,2%-ãî òðèïàíîâîãî ñèíåãî. Óñëîâèÿ ïîñòàíîâêè ýêñïåðèìåíòà: ñóñïåíçèþ êîíòðîëüíûõ òèìîöèòîâ èíêóáèðîâàëè â òå÷åíèå óêàçàííîãî âðåìåíè; â ñðåäó èíêóáàöèè äîáàâëÿëè ïåðîêñèä âîäîðîäà äî êîíå÷íîé êîíöåíòðàöèè 0,1ìÌ; ïåðåä èíêóáàöèåé êëåòî÷íóþ ñóñïåíçèþ ïîäâåðãàëè îäíîðàçîâîìó ðåíòãåíîâñêîìó îáëó÷åíèþ íà óñòàíîâêå ÐÓÌ–17 ïðè ýêñïîçèöèîííîé äîçå – 11,61 × 10-2 Êë/êã (4,5 Ãð, ìîùíîñòü äîçû – 0,24 Ãð/ìèí); ôèëüòðû 0,5 ìì (Cu + Al), íàïðÿæåíèå 200 êÂ, ñèëà òîêà 10 ìÀ, ôîêóñíîå ðàññòîÿíèå – 50 ñì. Èíêóáàöèþ òèìîöèòîâ â êîíöåíòðàöèè (2– 4) × 106 êëåòîê/ìë ïðîâîäèëè â òåðìîñòàòå â ñðåäå RPMI-1640 ñ äîáàâëåíèåì 5%-é ýìáðèîíàëüíîé òåëÿ÷üåé ñûâîðîòêè. Ïîñëå îñàæäåíèÿ (600 g, 10 ìèí) êëåòêè ïîìåùàëè â áóôåð À. Êîíöåíòðàöèþ ñâîáîäíîãî öèòîçîëüíîãî Ñà 2+ â òèìîöèòàõ îïðåäåëÿëè ñ ïîìîùüþ ôóðà-2ÀÌ («Sigma», ÑØÀ). Êëåòî÷íóþ ñóñïåíçèþ (3 × 107 êëåòîê/ìë) íàãðóæàëè çîíäîì â òå÷åíèå 40 ìèí ïðè 25 °Ñ è îòìûâàëè îò èçáûòêà çîíäà òðåõêðàòíûì öåíòðèôóãèðîâàíèåì (600 g, 10 ìèí) ñ ïîñëåäóþùèì ðåñóñïåíäèðîâàíèåì â áóôåðå À äî êîíöåíòðàöèè 1 × 107 êëåòîê/ìë. Ïðè èññëåäîâàíèè ýôôåêòîâ ðàçëè÷íûõ äîáàâîê èíêóáàöèþ íàãðóæåííûõ çîíäîì òèìîöèòîâ ïðîâîäèëè íåïîñðåäñòâåííî â êþâåòå â ñòàíäàðòíîé (áóôåð À) è íîìèíàëüíî áåçêàëüöèåâîé (íå ñîäåðæàùåé CaCl2) ñðåäå. Ñïåêòðû ôëóîðåñöåíöèè ôóðà-2 ðåãèñòðèðîâàëè íà ñïåêòðîôëóîðèìåòðå Shimadzu RF-510, λâîçáóæä. = 330 è 375 íì, λèçëó÷. = = 505 íì. Êîíöåíòðàöèþ Ñà2+ â êëåòêàõ ([Ñà2+]i) ðàññ÷èòûâàëè ñ èñïîëüçîâàíèåì äâóõëó÷åâîãî ôëóîðåñöåíòíîãî ïàðàìåòðà R [10]. Äëÿ îöåíêè âõîäà Ñà2+ òèìîöèòû (5 × 106 êëåòîê) èíêóáèðîâàëè ïðè 37 °Ñ â ñðåäå îáúåìîì 0,5 ìë, ñîäåðæàùåé áóôåð À è 1 ìêÊè 45ÑàÑl2 («Amersham», Âåëèêàÿ Áðèòàíèÿ). Ðåàêöèþ îñòàíàâëèâàëè áûñòðîé ôèëüòðàöèåé ïðîá ÷åðåç ôèëüòðû “Millipore” (0,45 ìêì), êîòîðûå òðèæäû ïðîìûâàëè 3 ìë îõëàæäåííîãî ðàñòâîðà, ñîäåðæàùåãî 150 ìM KÑl, 5 ìÌ ÑîÑl2 × 6Í2Î, 10 ìÌ ÍÅÐÅS, ðÍ 7,4. Äëÿ îïðåäåëåíèÿ àäñîðáöèè êàëüöèÿ ñóñïåíçèþ êëåòîê íàíîñèëè íà 64 ôèëüòðû ñðàçó æå ïîñëå äîáàâëåíèÿ ìåòêè. Ðàäèîàêòèâíîñòü ïðîá èçìåðÿëè íà æèäêîñöèíòèëëÿöèîííîì ñ÷åò÷èêå Delta (ÑØÀ). Ñòðóêòóðíîå ñîñòîÿíèå ÄÍÊ îöåíèâàëè ñ ïîìîùüþ ýëåêòðîôîðåçà â 1,5%-ì àãàðîçíîì ãåëå, ñîäåðæàùåì áðîìèä ýòèäèÿ (0,5 ìêã/ìë), â òðèñàöåòàòíîì áóôåðå (pH = 8,3), íà ïðîòÿæåíèè 5 ÷ ïðè íàïðÿæåíèè 5 Â/ñì. Äëÿ ýêñòðàêöèè ÄÍÊ ê òèìîöèòàì äîáàâëÿëè ëèçèðóþùèé áóôåð, ñîäåðæàùèé 10 ìÌ òðèñ – HCl (pH = 7,4), 10 ìÌ ÝÄÒÀ, òðèòîí X-100 (0,5%), ñìåñü èíêóáèðîâàëè 10 ìèí ïðè +4 °Ñ. Ýêñòðàêöèþ ÄÍÊ èç äåïðîòåèíèçîâàííûõ ïðîòåèíêèíàçîé Ê («Sigma», ÑØÀ) ïðîá ïðîâîäèëè ïðè –20 °Ñ ñìåñüþ 3 Ì àöåòàòà íàòðèÿ (ðÍ 5,2) : ýòàíîë (1 : 20) è öåíòðèôóãèðîâàíèåì (13 000 g, 10 ìèí). Êîëè÷åñòâî âîññòàíîâëåííîãî ãëóòàòèîíà (GSH) îöåíèâàëè ôëóîðåñöåíòíûì ìåòîäîì ñ ïðèìåíåíèåì îðòîôòàëåâîãî àëüäåãèäà [11]. Äëÿ îïðåäåëåíèÿ èñïîëüçîâàëè ñóïåðíàòàíò êëåòî÷íîãî ýêñòðàêòà, ïîëó÷åííûé ïîñëå ðàçðóøåíèÿ òèìîöèòîâ (2 × 107 êëåòîê/ìë) â ñðåäå, ñîäåðæàùåé 1,5 ìë 0,1 Ì ÍÑÎ2Í, è öåíòðèôóãèðîâàíèÿ (10 000 g, 15 ìèí). Ôëóîðåñöåíöèþ ïðîá èçìåðÿëè ïðè λâîçáóæä. = 350 íì, λèçëó÷. = 420 íì íà ñïåêòðîôëóîðèìåòðå Shimadzu RF-510 (ßïîíèÿ). Ñòàòèñòè÷åñêóþ îáðàáîòêó ïîëó÷åííûõ ðåçóëüòàòîâ ïðîâîäèëè îáùåïðèíÿòûìè ìåòîäàìè ñ èñïîëüçîâàíèåì t-êðèòåðèÿ Ñòüþäåíòà. Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå Ðåçóëüòàòû ýëåêòðîôîðåòè÷åñêîãî àíàëèçà ñòðóêòóðíîãî ñîñòîÿíèÿ ÄÍÊ, âûäåëåííîé èç òèìîöèòîâ ÷åðåç 1 è 3 ÷ ïîñëå ðåíòãåíîâñêîãî îáëó÷åíèÿ â äîçå 4,5 Ãð èëè äåéñòâèÿ 0,1 ìÌ Í2Î2, ïðåäñòàâëåíû íà ðèñ. 1. Íà ïðîòÿæåíèè èíêóáàöèè êîíòðîëüíûõ òèìîöèòîâ âûñîêîïîëèìåðíîå ñîñòîÿíèå ÄÍÊ ñîõðàíÿåòñÿ, òîãäà êàê â îáëó÷åííûõ è ïîäâåðæåííûõ äåéñòâèþ ïåðîêñèäà êëåòêàõ ïðîèñõîäèò ðàñùåïëåíèå ÄÍÊ. Òàê, óæå ÷åðåç 1 ÷ âîçëå ëèíèè ñòàðòà îòìå÷àåòñÿ íàêîïëåíèå ïðîäóêòîâ êðóïíîìàñøòàáíîé ôðàãìåíòàöèè ÄÍÊ, âûçâàííîé íåóïîðÿäî÷åííûìè ðàçðûâàìè ìîëåêóëû. ×åðåç 3 ÷ íà ýëåêòðîôîðåãðàììàõ îáíàðóæèâàþòñÿ ïðîäóêòû ìåæíóêëåîñîìíîé äåãðàäàöèè ÄÍÊ – îëèãîíóêëåîñîìíûå ôðàãìåíòû ÄÍÊ, êðàòíûå 200 ï.î. Õîòÿ äèíàìèêà ïîâðåæäåíèÿ ñòðóêòóðû ÄÍÊ â êëåòêàõ ïîñëå äåéñòâèÿ èññëåäóåìûõ ôàêòîðîâ ïîäîáíà, êîëè÷åñòâåííàÿ îöåíêà ïîêàçàëà, ÷òî îáùåå ñîäåðæàíèå íàêîïëåííûõ â òå÷åíèå 3 ÷ âûñîêîïîëèìåðíûõ ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ âûøå â òèìîöèòàõ, ïîäâåðãøèõñÿ äåéñòâèþ ïåðîêñèäà âîäîðîäà, à îëèãîíóêëåîñîìíûõ ôðàãìåíòîâ – â îáëó÷åííûõ êëåòêàõ [12]. ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 6 Ä. Ì. ÃÐÅÁÈÍÛÊ, Ò. Â. ÊÎÂÀËÜ, Î. Ï. ÌÀÒÛØÅÂÑÊÀß 2 3 4 5 Ðèñ. 1. Ýëåêòðîôîðåãðàììà ÄÍÊ, âûäåëåííîé èç êîíòðîëüíûõ òèìîöèòîâ (1) è èíêóáèðîâàííûõ â òå÷åíèå 1 ÷ (2,3) è 3 ÷ (4,5) ïîñëå äîáàâëåíèÿ 0,1 ìÌ ïåðîêñèäà âîäîðîäà (2,4) èëè îáëó÷åíèÿ â äîçå 4,5 Ãð (3,5). Ýòè ðåçóëüòàòû ñîãëàñóþòñÿ ñ ëèòåðàòóðíûìè äàííûìè, ñîãëàñíî êîòîðûì ïðîöåññ ôðàãìåíòàöèè ÄÍÊ ïðè îáëó÷åíèè òèìîöèòîâ in vitro õàðàêòåðèçóåòñÿ íàëè÷èåì íåçàâèñÿùåãî îò äîçû è ìîùíîñòè ðàäèàöèîííîãî âîçäåéñòâèÿ ëàã-ïåðèîäà è ëèíåéíûì íàðàñòàíèåì êîëè÷åñòâà ïðîäóêòîâ ìåæíóêëåîñîìíîé äåãðàäàöèè ÄÍÊ â äèàïàçîíå äîç 0,5–6 Ãð [13].  ñëó÷àå îáðàáîòêè êëåòîê ðàçíîãî òèïà ïåðîêñèäîì âîäîðîäà â êîíöåíòðàöèÿõ íèæå 1 ìÌ ìåæíóêëåîñîìíàÿ ôðàãìåíòàöèÿ ÄÍÊ ïîäòâåðæäåíà ýëåêòðîôîðåòè÷åñêè è ìåòîäîì ìå÷åíèÿ in situ ðàñùåïëåííûõ êîíöîâ ìîëåêóëû [1, 14]. Ïîëó÷åííûå íàìè äàííûå ïîçâîëèëè îöåíèòü äëèòåëüíîñòü ïåðèîäà, êîòîðûé ïðåäøåñòâóåò ìåæíóêëåîñîìíîìó ðàñùåïëåíèþ ÄÍÊ – íåîáðàòèìîé ñòàäèè àïîïòîçà òèìîöèòîâ, èíäóöèðîâàííîãî èîíèçèðóþùåé ðàäèàöèåé èëè ïåðîêñèäîì âîäîðîäà. Ïðåäïîëàãàåòñÿ, ÷òî èìåííî â ýòîò “ïðåàïîïòè÷åñêèé” ïåðèîä ïðîèñõîäèò àêòèâàöèÿ êîíòðîëèðóþùèõ àïîïòîç êàñêàäîâ, â òîì ÷èñëå è ôîðìèðîâàíèå êàëüöèåâîãî ñèãíàëà [1,3]. Ðåçóëüòàòû îïðåäåëåíèÿ êîíöåíòðàöèè ñâîáîäíîãî öèòîçîëüíîãî Ñà2+ â òèìîöèòàõ, êîòîðîå ïðîâîäèëè ñ èñïîëüçîâàíèåì ôëóîðåñöåíòíòíîãî çîíäà ôóðà-2, ïðèâåäåíû íà ðèñ. 2. Âåëè÷èíà [Ca2+]i â êîíòðîëüíûõ òèìîöèòàõ ñîñòàâëÿåò 104 ± 9 íÌ è íå èçìåíÿåòñÿ íà ïðîòÿæåíèè èíISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 6 êóáàöèè êëåòîê â êîíòðîëå. Íàìè íå áûëî âûÿâëåíî èçìåíåíèé â êîíöåíòðàöèè öèòîçîëüíîãî Ñà2+ â òèìîöèòàõ ïîñëå äåéñòâèÿ ðåíòãåíîâñêîãî èçëó÷åíèÿ (ðèñ. 2, 1).  òèìîöèòàõ, èíêóáèðîâàííûõ â ïðèñóòñòâèè Í2Î2, íàáëþäàåòñÿ áûñòðîå ïîâûøåíèå óðîâíÿ Ñà2+ â öèòîçîëå – óæå ÷åðåç 30 ìèí îí âîçðàñòàåò â 2,7 ðàçà, à â ïåðèîä 2–3 ÷ äîñòèãàåò ìàêñèìàëüíîé âåëè÷èíû, ïðåâûøàþùåé êîíòðîëüíóþ â 5 ðàç (ðèñ. 2, 2). ×åðåç 5 ÷ íàáëþäàåòñÿ åå ñíèæåíèå. Ñëåäóåò ó÷èòûâàòü, ÷òî ìîíèòîðèíã [Ca2+]i íà óðîâíå ñóñïåíçèè êëåòîê ïîçâîëÿåò îöåíèòü ïîâûøåíèå åãî ñîäåðæàíèÿ â ñðåäíåì, êîòîðîå ÿâëÿåòñÿ áîëåå íèçêèì ïî ñðàâíåíèþ ñ òàêîâûì â öèòîçîëå îòäåëüíîé êëåòêè. Ïîýòîìó îáíàðóæåííîå âîçðàñòàíèå [Ca2+]i óêàçûâàåò íà çíà÷èòåëüíîå ðàííåå íàðóøåíèå êàëüöèåâîãî ãîìåîñòàçà â òèìîöèòàõ, îáðàáîòàííûõ H2O2. Ïðè÷èíîé óâåëè÷åíèÿ [Ca2+]i ìîæåò áûòü ëèáî óñèëåííûé âõîä êàòèîíà ÷åðåç ïëàçìàòè÷åñêóþ ìåìáðàíó êëåòîê (ïîâûøåíèå ñïåöèôè÷åñêîé è íåñïåöèôè÷åñêîé ïðîíèöàåìîñòè), ëèáî åãî âûáðîñ èç âíóòðèêëåòî÷íûõ äåïî. Êàê ïîêàçàíî íàìè ðàíåå, äîáàâëåíèå â ñðåäó èíêóáàöèè áëîêàòîðà êàëüöèåâûõ êàíàëîâ âåðàïàìèëà íå âëèÿåò íà âåëè÷èíó ïîâûøåíèÿ [Ca2+]i, íàáëþäàåìîãî ÷åðåç 0,5 è 1 ÷ ïîñëå äåéñòâèÿ H2O2 [15]. Ýòî ïîçâîëÿåò ïðåäïîëîæèòü, ÷òî ñïåöèôè÷åñêàÿ ïðîíèöàåìîñòü êàëüöèåâûõ êàíàëîâ ïëàçìàòè÷åñêîé ìåìáðàíû òèìîöèòîâ â ýòîò ïåðèîä âðåìåíè íå èçìåíÿåòñÿ. Êàê èíòåãðàëüíûé ïîêàçàòåëü òðàíñìåìáðàííîãî ïåðåìåùåíèÿ èîíîâ Ñà ÷åðåç ïëàçìàòè÷åñêóþ ìåìáðàíó îöåíèâàëè ïàññèâíûé âõîä 45Ñà2+ â òèìîöèòû. Ñîãëàñíî ïîëó÷åííûì äàííûì (ðèñ. 3), ÷åðåç 15 ìèí ïîñëå äåéñòâèÿ êàê îáëó- 700 600 500 [Ca2+]i, нМ 1 400 22 300 200 1 1 100 0 0 1 2 3 4 5 Время, ч Ðèñ. 2. Äèíàìèêà èçìåíåíèÿ êîíöåíòðàöèè ñâîáîäíîãî Ñà2+ â öèòîçîëå òèìîöèòîâ ïîñëå ðåíòãåíîâñêîãî îáëó÷åíèÿ (1) èëè äîáàâëåíèÿ H2O2 (2). 65 ÅÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜͲ ÐÎÁÎÒÈ ÷åíèÿ, òàê è ïåðîêñèäà âîäîðîäà, óðîâåíü 45Ñà2+, ïîñòóïèâøåãî â êëåòêè çà 1 ìèí, äîñòîâåðíî íå èçìåíÿåòñÿ. ×åðåç 30 ìèí èíêóáàöèè êëåòîê â ïðèñóòñòâèè Í2Î2 ïîêàçàòåëü ñíèæàåòñÿ íà 47%. Òàêîå åãî óìåíüøåíèå, ñêîðåå âñåãî, ñâÿçàíî ñ àêòèâàöèåé Ñà2+-ÀÒÐ-àçû ïëàçìàòè÷åñêîé ìåìáðàíû òèìîöèòîâ â óñëîâèÿõ ïîâûøåíèÿ óðîâíÿ Ñà2+ â öèòîçîëå, ò.ê. ïîêàçàíî, ÷òî â Ò-ëèìôîöèòàõ àêòèâíîñòü Na+/Ñà2+ îáìåííèêà íå ôèêñèðóåòñÿ, à ñêîðîñòü îòêà÷èâàíèÿ êàòèîíà Ñà2+-ÀÒÐàçîé çíà÷èòåëüíî óâåëè÷èâàåòñÿ ïðè âîçðàñòàíèè [Ca2+]i [16].  ñîâîêóïíîñòè ýòè ðåçóëüòàòû ïîçâîëÿþò çàêëþ÷èòü, ÷òî íà ðàííåì ýòàïå ïîñëå ðåíòãåíîâñêîãî îáëó÷åíèÿ ñèñòåìà ïîääåðæàíèÿ êàëüöèåâîãî ãîìåîñòàçà â òèìîöèòàõ íå íàðóøàåòñÿ, òîãäà êàê ïîñëå äåéñòâèÿ ïåðîêñèäà âîäîðîäà ïðîèñõîäèò ïîâûøåíèå [Ca2+]i âñëåäñòâèå íåêîíòðîëèðóåìîãî ïîñòóïëåíèÿ êàòèîíà â öèòîçîëü èç âíóòðèêëåòî÷íûõ äåïî. Ïðè÷èíîé ýòîãî ìîæåò áûòü äèñêîîðäèíàöèÿ ôóíêöèîíèðîâàíèÿ ÝÏÐ è ìèòîõîíäðèé â óñëîâèÿõ îêèñëèòåëüíîãî ñòðåññà è ñíèæåíèÿ àíòèîêñèäàíòíîé çàùèòû âíóòðèêëåòî÷íûõ ìåìáðàííûõ ñòðóêòóð. Ïîñêîëüêó îêèñëèòåëüíûé ñòðåññ ñ÷èòàåòñÿ âàæíûì êîìïîíåíòîì ïðîãðàììû àïîïòîçà, èíäóöèðîâàííîãî êàê ïåðîêñèäîì âîäîðîäà, òàê è èîíèçèðóþùåé ðàäèàöèåé, ìû îöåíèëè ñîñòîÿíèå àíòèîêñèäàíòíîé ñèñòåìû â òèìîöèòàõ ïî òàêîìó ïîêàçàòåëþ, êàê ñîäåðæàíèå âîññòàíîâëåííîãî ãëóòàòèîíà. Ñîäåðæàíèå GSH â êîíòðîëüíûõ êëåòêàõ ñîñòàâèëî 0, 8 ± 0,05 ìêã/107 êëåòîê è äîñòîâåðíî íå ñíèæàåòñÿ â ïåðèîä äî 3-õ ÷àñîâ èíêóáàöèè. Ïîñëå îáðàáîòêè òèìîöèòîâ íàáëþäàþòñÿ ñóùåñòâåííûå îòëè÷èÿ â èçìåíåíèè óðîâíÿ GSH, çàâèñÿùèå îò ïðèðîäû àïîïòîãåííîãî ôàêòîðà (ðèñ. 4). Òàê, ÷åðåç 15 ìèí ïîñëå îáëó÷åíèÿ óðîâåíü GSH â êëåòêàõ áûë ñóùåñòâåííî ïîâûøåí, ÷åðåç 1 ÷ ïîêàçàòåëü âîçâðàùàåòñÿ ê êîíòðîëüíîìó çíà÷åíèþ è ñíèæàåòñÿ íà 24% ÷åðåç 3 ÷. Òàêèì îáðàçîì, åñëè â îáëó÷åííûõ òèìîöèòàõ è ïðîèñõîäèò ñìåùåíèå â öèêëå ãëóòàòèîíà â íàïðàâëåíèè óâåëè÷åíèÿ ñîäåðæàíèÿ îêèñëåííîãî ãëóòàòèîíà, òî â ïåðèîä, îòäàëåííûé îò ìîìåíòà ðàäèàöèîííîãî âîçäåéñòâèÿ.  êëåòêàõ, îáðàáîòàííûõ ïåðîêñèäîì âîäîðîäà, ñîäåðæàíèå GSH áûñòðî ñíèæàåòñÿ – íà 28% îò êîíòðîëÿ ÷åðåç 30 ìèí è íà 48% ÷åðåç 1 ÷, óäåðæèâàÿñü íà ýòîì óðîâíå äî 3 ÷. Ïîëó÷åííûå íàìè äàííûå ñîãëàñóþòñÿ ñ òåì, ÷òî ïåðîêñèä âîäîðîäà, êîòîðûé ñàì ïî ñåáå íå ÿâëÿåòñÿ ñèëüíûì îêèñëèòåëåì, áûñòðî ïðîíèêàåò ÷åðåç ïëàçìàòè÷åñêóþ ìåìáðàíó âíóòðü êëåòêè, ãäå ìîãóò íàêàïëèâàòüñÿ ïðîäóêòû åãî ïðåâðàùåíèÿ, â ÷àñòíîñòè, íàèáîëåå ðåàêöèîííî-àêòèâíûé ãèäðîêñèëüíûé ðàäèêàë.  çíà÷èòåëüíîé ìåðå ïîâðåæäàþùåìó äåéñòâèþ ïåðîêñèäà ïîäâåðæåíû ìèòîõîíäðèè, â êîòîðûõ îòñóòñòâóåò êàòàëàçà è âîññòàíîâëåíèå Í2Î2 îñóùåñòâëÿåòñÿ ãëóòàòèîíïåðîêñèäàçîé [7,17]. Îáðàçîâàâøèéñÿ â êëåòêàõ îêèñëåííûé ãëóòàòèîí ìîæåò áûòü âîññòàíîâëåí äî GSH ãëóòàòèîíðåäóêòàçîé, íî ïðè ýòîì ïîòðåáëÿåòñÿ âîññòàíîâëåííûé NADPH, ïîýòîìó ïðè äëèòåëüíîì âîçäåéñòâèè ïåðîêñèäà ìîæåò ïðîèñõîäèòü îêèñëåíèå SH-ãðóïï ñòðóêòóðíûõ è ðåãóëÿòîðíûõ áåëêîâ, èñòîùåíèå ïóëîâ NADPH è NADÍ, íàðóøåíèå Ñà-àêêóìóëèðóþùåé ñïîñîáíîñòè ÝÏÐ è ìèòîõîíäðèé. 1 2 3 800 * 600 400 45 СаСl2, имп/мин 1000 200 0 15 мин min 30 мин min Время инкубации Ðèñ. 3. Âõîä Ñà2+ â òèìîöèòû â êîíòðîëå (1), ïîñëå ðåíòãåíîâñêîãî îáëó÷åíèÿ (2) èëè äîáàâëåíèÿ Í2Î2 (3). *p ≤ 0,05 îòíîñèòåëüíî êîíòðîëÿ. 66 ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 6 Ä. Ì. ÃÐÅÁÈÍÛÊ, Ò. Â. ÊÎÂÀËÜ, Î. Ï. ÌÀÒÛØÅÂÑÊÀß 160 GSH, % от контроля 140 120 100 KK 80 11 60 22 40 20 0 0 1 2 3 Время, Время, чч Ðèñ. 4. Äèíàìèêà èçìåíåíèÿ ñîäåðæàíèÿ âîññòàíîâëåííîãî ãëóòàòèîíà â òèìîöèòàõ ïîñëå ðåíòãåíîâñêîãî îáëó÷åíèÿ (1) èëè äîáàâëåíèÿ H2O2 (2). ×òîáû îöåíèòü âîçìîæíóþ ðîëü îñíîâíûõ âíóòðèêëåòî÷íûõ äåïî â ïîâûøåíèè [Ca2+]i ïîñëå äåéñòâèÿ Í2Î2, ìû èññëåäîâàëè, âëèÿåò ëè ïåðîêñèä âîäîðîäà íà óðîâåíü êàòèîíà â öèòîçîëå òèìîöèòîâ â óñëîâèÿõ ïðåäâàðèòåëüíîãî îïóñòîøåíèÿ êàëüöèåâûõ çàïàñîâ ÝÏÐ. Äëÿ ýòîãî èñïîëüçîâàëè èíãèáèòîð Ñà2+-ÀÒÐ-àçû ÝÏÐ òàïñèãàðãèí, êîòîðûé â êîíöåíòðàöèÿõ 100–500 íÌ âûçûâàåò áûñòðîå ïîâûøåíèå [Ca2+]i, â òèìîöèòàõ âñëåäñòâèå îïóñòîøåíèÿ êàëüöèåâûõ çàïàñîâ ÝÏÐ è âõîäà Ñà2+ ÷åðåç ïëàçìàòè÷åñêóþ ìåìáðàíó áåç ãåíåðàöèè èíîçèòîëôîñôàòîâ [4,8]. Ýêñïåðèìåíòû ïðîâîäèëè, èñïîëüçóÿ ïðåäâàðèòåëüíî íàãðóæåííûå çîíäîì òèìîöèòû, äîáàâëÿÿ òàïñèãàðãèí è ïåðîêñèä íåïîñðåäñòâåííî â èññëåäóåìóþ ïðîáó. Íà ðèñ. 5, À ïðåäñòàâëåíû äàííûå, ïîëó÷åííûå ïðè èíêóáàöèè êëåòîê â ñðåäå, ñîäåðæàùåé 1 ìÌ ÑàÑl2.  ýòîì ñëó÷àå äîáàâëåíèå â ïðîáó 300 íÌ òàïñèãàðãèíà ïðèâîäèò ê áûñòðîìó ïîâûøåíèþ (â ïÿòü ðàç) óðîâíÿ öèòîçîëüíîãî Ñà2+, êîòîðîå óäåðæèâàåòñÿ â òå÷åíèå 30 ìèí âñëåäñòâèå âõîäà êàòèîíà ÷åðåç ïëàçìàòè÷åñêóþ ìåìáðàíó. Ïîñëå äîáàâëåíèÿ íà 15-é ìèíóòå Í2Î2 íàáëþäàåòñÿ äàëüíåéøåå, áîëåå çàìåäëåííîå ïîâûøåíèå [Ca2+]i, äîñòèãàþùåå óðîâíÿ áîëåå 1 ìêÌ. Ðåçóëüòàòû ýêñïåðèìåíòîâ, ïðîâåäåííûõ â íîìèíàëüíî áåçêàëüöèåâîé ñðåäå ïðåäñòàâëåíû íà ðèñ. 5, Á.  õîäå ïðåäâàðèòåëüíîé 10-ìèíóòíîé èíêóáàöèè êëåòîê â íîìèíàëüíî áåçêàëüöèåâîé ñðåäå â öèòîçîëå òèìîöèòîâ óñòàíàâëèâàëàñü ðàâíîâåñíàÿ êîíöåíòðàöèÿ 62 ± 7 íÌ. Äîáàâëåíèå òàïñèãàðãèíà ïðèâîäèò ê îïóñòîøåíèþ ÝÏÐ è ïîâûøåíèþ [Ca2+]i äî 96 ± 8 íÌ, êîòîðîå óäåðæèâàåòñÿ â òå÷åíèå 5 ìèí, ïîñëå ÷åãî óðîâåíü êàòèîíà ïîñòåïåííî ñíèæàåòñÿ.  ñëó÷àå äîáàâëåíèÿ Í2Î2 òàêæå íàáëþäàåòñÿ äàëüíåéøåå âîçðàñòàíèå óðîâíÿ öèòîçîëüíîãî Ñà2+ ñ âûõîäîì íà ïëàòî ÷åðåç 20 ìèí. Ïîëó÷åííûå ðåçóëüòàòû ñâèäåòåëüñòâóþò, ÷òî èñòî÷íèêîì âûÿâëåííîãî íà ðàííèõ ýòàïàõ àïîïòîçà ïîñòóïëåíèÿ Ca2+ â öèòîçîëü ìîæåò áûòü íå òîëüêî ÝÏÐ, íî è äðóãèå âíóòðèêëåòî÷íûå äåïî. Åñëè ðîëü òàêîâûõ âûïîëíÿþò ìèòîõîíäðèè, òî îñâîáîæäåíèå Ñà2+ ïîä äåéñòâèåì òàêîãî îêèñëèòåëÿ, êàê Í2Î2, ìîæåò ïðîèñõîäèòü è áåç êàëüöèåâîé ïåðåãðóçêè. Äëÿ ïðîâåðêè ïðåäïîëîæåíèÿ îá ó÷àñòèè ìèòîõîíäðèé â íàðóøåíèè êàëüöèåâîãî ãîìåîñòàçà íàìè áûëè èñïîëüçîâàíû ðóòåíèåâûé êðàñíûé (RuR, èíãèáèòîð ìèòîõîíäðèàëüíîãî Ñà2+óíèïîðòåðà) è öèêëîñïîðèí À (CsA, áëîêàòîð íåñåëåêòèâíîé ìèòîõîíäðèàëüíîé ïîðû, ÍÌÏ), êîòîðûå âíîñèëè â èíêóáèðóåìóþ ïðîáó ñ íàãðóæåííûìè çîíäîì ôóðà-2 òèìîöèòàìè îäíîâðåìåííî ñ Í2Î2. Äîáàâëåíèå RuR â ñðåäó èíêóáàöèè ïðèâîäèò ê ñíèæåíèþ óðîâíÿ êàòèîíà (ðèñ. 6).  ïðèñóòñòâèè CsA Ñà2+-ìîáèëèçèðóþùèé ýôôåêò H2O2 íå ïðîÿâëÿåòñÿ â íà÷àëüíûé ïåðèîä èíêóáàöèè è çíà÷èòåëüíî ñíèæàåòñÿ ïðè åå ïðîäîëæåíèè, îäíàêî íå ïðåäîòâðàùàåòñÿ ïîëíîñòüþ. Äëÿ îáúÿñíåíèÿ ýòèõ ðåçóëüòàòîâ ñëåäóåò ó÷èòûâàòü ðàçíîîáðàçèå âîçìîæíûõ ïóòåé ìîáèëèçàöèè Ñà2+ ïðè äåéñòâèè Í2Î2, ìîäåëèðóþùåì îêèñëèòåëüíûé ñòðåññ. Òàê, óñèëåíèå ïðîöåññîâ ëèïîïåðîêñèäàöèè â òàêèõ óñëîâèÿõ ìîæåò îêàçûâàòü ðàçîáùàþùèé ýôôåêò è ïðèâîäèòü ê ñíèæåíèþ ìåìáðàííîãî ïîòåíöèàëà ìèòîõîíäðèé, îáðàùåíèþ Ñà2+- óíèïîðòåðà è ÷àñòè÷íîìó âûõîäó êàòèîíà èç ìèòîõîíäðèàëüíîãî ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 6 67 ÅÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜͲ ÐÎÁÎÒÈ А 1200 + Н2 О 2 Н2 О 2 100 800 TG - Н 2О 2 80 i 600 - Н2 О 2 400 200 0 + Н2О2 Н2 О2 TG 120 2+2+ [Ca [Ca ]i], ,нМ нМ 2+ [Ca ]i,] нМ [ i, 1000 Б 140 60 40 20 0 5 10 15 20 25 Время, мин 30 0 35 0 5 10 15 20 25 Время, мин 30 35 Ðèñ. 5. Äèíàìèêà ïîâûøåíèÿ [Ca2+]i â òèìîöèòàõ ïðè èíêóáàöèè â ñòàíäàðòíîé (À) è íîìèíàëüíî áåçêàëüöèåâîé (Á) ñðåäå ïîñëå äîáàâëåíèÿ 320 íÌ òàïñèãàðãèíà (TG) è Í2Î2. ìàòðèêñà [18]. Áëîêèðîâàíèå Ñà2+- óíèïîðòåðà ïðåäîòâðàùàåò òàêîé âûõîä, ÷òî è íàáëþäàåòñÿ â ïðèñóòñòâèè RuR â ïðîáå. Òîò ôàêò, ÷òî ýôôåêò CsA ïðîÿâëÿåòñÿ äîñòàòî÷íî áûñòðî, íî ïîâûøåíèå [Ca2+]i ïðåäîòâðàùàåòñÿ íå ïîëíîñòüþ, óêàçûâàåò íå òîëüêî íà ðàííåå îáðàçîâàíèå ïîðû â ìèòîõîíäðèÿõ, îáðàáîòàííûõ Í2Î2 òèìîöèòîâ, íî è íà ó÷àñòèå äðóãèõ âíóòðèêëåòî÷íûõ îðãàíåëë â ïîääåðæàíèè âûñîêîãî óðîâíÿ êàòèîíà â öèòîçîëå. Îòêðûòèå ÍÌÏ â ÷àñòè ìèòîõîíäðèé ïðåäñòàâëÿåòñÿ âïîëíå âåðîÿòíûì â óñëîâèÿõ ëîêàëüíîãî ïîâûøåíèÿ óðîâíÿ Ñà2+, çíà÷èòåëüíîãî îêèñëåíèÿ êëåòî÷íîãî ãëóòàòèîíà è ìåìáðàííûõ äèòèîëîâ â ìèòîõîíäðèÿõ, à òàêæå ñíèæåíèÿ ñîäåðæàíèÿ ýíäîãåííûõ ïèðèäèíîâûõ íóêëåîòèäîâ. Ïðåäïîëàãàåòñÿ, ÷òî îêèñëåíèå êàðäèîëèïè- íà, óäåðæèâàþùåãî öèòîõðîì Ñ íà âíåøíåé ñòîðîíå âíóòðåííåé ìåìáðàíû ìèòîõîíäðèé, ñîïðîâîæäàåòñÿ âûõîäîì öèòîõðîìà Ñ â öèòîçîëü è åãî ñâÿçûâàíèåì ñ ðåöåïòîðàìè ê èíîçèòîëòðèôîñôàòó ÝÏÐ, ÷òî äåëàåò èõ íå÷óâñòâèòåëüíûìè ê àóòîèíãèáèðîâàíèþ ïîâûøåííûìè êîíöåíòðàöèÿìè Ñà2+, â ðåçóëüòàòå ÷åãî èç ÝÏÐ òàêæå îñâîáîæäàåòñÿ êàëüöèé [7]. Ïîëó÷åííûå ðåçóëüòàòû ïîçâîëÿþò ñäåëàòü íåñêîëüêî îáùèõ âûâîäîâ. Õàðàêòåðíàÿ äëÿ àïîïòîçà ôðàãìåíòàöèÿ ÄÍÊ íàáëþäàåòñÿ â òèìîöèòàõ â îòâåò íà äåéñòâèå êàê èîíèçèðóþùåé ðàäèàöèè, òàê è îáðàáîòêè êëåòîê ïåðîêñèäîì âîäîðîäà, îäíàêî ðàííåå ïîâûøåíèå óðîâíÿ [Ca2+]i âñëåäñòâèå íàðóøåíèÿ âíóòðèêëåòî÷íîé êîìïàðòìåíòàëèçàöèè Ñà2+ íàáëþäàåòñÿ ëèøü ïîñëå äåé- [Ca2+]i, (в % от контроля) 700 600 1 500 2 400 3 300 200 100 0 0 10 20 30 40 50 60 Время, мин Ðèñ. 6. Äèíàìèêà ïîâûøåíèÿ [Ca2+]i â òèìîöèòàõ ïðè èíêóáàöèè â ïðèñóòñòâèè Í2Î2 áåç èíãèáèòîðîâ (1), ïðè äîáàâëåíèè 5 ìêÌ ðóòåíèåâîãî êðàñíîãî (2) èëè 5 ìêÌ öèêëîñïîðèíà À (3). 68 ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 6 Ä. Ì. ÃÐÅÁÈÍÛÊ, Ò. Â. ÊÎÂÀËÜ, Î. Ï. ÌÀÒÛØÅÂÑÊÀß ñòâèÿ H2O2. Õîòÿ îáà èññëåäóåìûõ àïîïòîãåííûõ ôàêòîðà äåéñòâóþò ïî âíóòðèêëåòî÷íîìó ñèãíàëüíîìó ìåõàíèçìó, åãî èíèöèàöèÿ è óñèëåíèå ìîæåò ïðîèñõîäèòü ñ âîâëå÷åíèåì ðàçëè÷íûõ âíóòðèêëåòî÷íûõ êîìïàðòìåíòîâ è ðàçëè÷íûìè ïóòÿìè – êàê ñ ó÷àñòèåì ôàêòîðîâ, îñâîáîæäàþùèõñÿ èç ìèòîõîíäðèé è êàñêàäà èñïîëíèòåëüíûõ êàñïàç, òàê è ÷åðåç ôîðìèðîâàíèå ïðîòåîñîìíûõ êîìïëåêñîâ, àêòèâàöèè ãðàíçèìîâ, êàòåïñèíîâ è äð. , ÷òî òðåáóåò áîëåå ãëóáîêîãî èçó÷åíèÿ. CALCIUM HOMEOSTASIS DURING THYMOCYTE APOPTOSIS. I. INCREASE IN CYTOSOLIC Ñà2+ CONCENTRATION AT THE EARLY STAGE OF APOPTOSIS INDUCED BY HYDROGEN PEROXIDE D. M. Grebinyk, T. V. Koval, O. P. Matyshevska Kyiv Taras Shevchenko National University, Ukraine; å-mail: grebinik@yahoo.com Summary The concentration of free cytosolic Ca 2+ ([Ca ]i), 45Ca2+ entry and the level of reduced glutathione (GSH) after x-irradiation in a dose of 4.5 Gy or 0.1 mM H2O2-treatment were investigated in isolated rat thymocytes during the period preceding electrophoretically detected DNA intranucleosomal fragmentation. Using fura-2 it was shown that the level of [Ca2+]i in X-irradiated thymocytes was not changed as compared with the control, while the GSH content was increased. The gradual increase in [Ca2+]i along with GSH level falling was detected in the H2O2-treated cells. 45Ca2+ entry in the cells exposed to apoptogenic stimuli was not enhanced. After addition of H2O2 to the cells previously treated with thapsigargin further [Ca2+]i increase in both normal and nominally calcium-free medium was detected. Cyclosporine A inhibited Ca2+-mobilizing effect of H2O2, but did not prevent it completely. The role of intracellular calcium depots in calcium homeostasis disturbance during oxidative stress and apoptosis is discussed. 2+ 1. Orrenius S., Zhivotovsky B., Nicotera P. // Nature Reviews. 2003. 4. P. 552–565. 2. Berridge M. J., Bootman M. D., Roderick H. L. // Nature Reviews. 2003. 4. P. 517–529. 3. McConkey D. J., Orrenius S. // Stem Cells. – 1996. –14. – P. 619-631. 4. Bustamante J., Di Libero E., Fernandez-Cobo M. // Free Rad. Biol. and Med. 2004. 37, N 9. P. 1490–1498. 5. Rodriguez-Tarduchy G., Collins M., Lopez-Rivas A. // EMBO J. 1990. 9. P. 2997–3002. 6. Pinton P., Ferrari D., Rapizzi E., et al. // EMBO J. 2001. 20. P. 2690–2701. 7. Brookes P. S., Yoon Y., Robotham J. I. et al. // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2004. 287. P. 817– 833. 8. Zhu L. P., Yu X. D., Ling S. et al. // Cell Calcium. 2000. 28, N 2. P. 107–117. 9. Ãðèíþê ². ²., Êîðí³é÷óê Ã. Ì., Êàïðàëîâ Î. Î., Ìàòèøåâñüêà Î. Ï. // Óêð. á³îõ³ì. æóðí. 2004. 76, ¹ 5. Ñ. 69–74. 10. Grynkiewicz G., Poenie M., Tsien R. Y. // J. Biol. Chem. – 1985. 260,N 6. P. 3440-3450. 11. Hissin P. J., Hilf R. // Anal. Biochem. 1976. 74. P. 214–227. 12. Êîâàëü Ò. Â., Êàïðàëîâ Î. Î., Ìàòèøåâñüêà Î. Ï., Êó÷åðåíêî Ì. ª. // Äîï. ÍÀÍ Óêðà¿íè. 2004. ¹ 7. Ñ. 166–171. 13. Umansky S. R., Korol’ B. A., Nelipovich P. A. // Biochem. Biophys. Acta. 1981. 27, N 665 (1). P. 9–17. 14. Lelli J. L., Becks L. L., Dabrowska M. I., Hinhaw D. B. // Free Rad. Biol. and Med. 1998. 25, N 6. P. 694–702. 15. Ãðåá³íèê Ä. Ì., Àðòåìåíêî O. Þ., Ñåìåíîâ Þ. Â., Çèìà Â. Ë., Ìàòèøåâñüêà Î. Ï. // ³ñí. Êè¿â. íàö. óí-òó. Á³îëîã³ÿ. 2003. 38. Ñ. 16–18. 16. Donnadieu E., Bismuth G., Trautmann A. // JBC. 1992. 267, N 36. P. 25864–25872. 17. Crompton M. // Biochem. J. – 1999. – 341. – P. 233-249. 18. Montero M., Alonso M. T., Albillos A. et al. // Mol. Biol. Cell. 2001. 12. P. 63–71. Ïîëó÷åíî 19.11.2004 K e y w o r d s: calcium, apoptosis, hydrogen peroxide, X-irradiation, mitochondria, cyclosporine A, thymocytes. ISSN 0201 — 8470. Óêð. á³îõ³ì. æóðí., 2004, ò. 76, ¹ 6 69
