УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК Государственный научный центр Российской Федерации -
реклама
УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК Государственный научный центр Российской Федерации Институт медико-биологических проблем РАН На правах рукописи ЛОБАНОВА МАРГАРИТА ВАДИМОВНА ОСОБЕННОСТИ РЕАЛИЗАЦИИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ ПРИ РАЗЛИЧНОМ СОДЕРЖАНИИ КИСЛОРОДА 03.03.01 - физиология 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор, чл.-корреспондент РАН Буравкова Л.Б. Москва 2015 2 СОДЕРЖАНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ 5 ВВЕДЕНИЕ 8 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13 1.1. Характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток 13 1.1.1. Локализация и тканевые (физиологические) ниши ММСК 13 1.1.2. Особенности ММСК, культивируемых при разном содержании О2 15 1.1.2.1. Жизнеспособность 15 1.1.2.2. Иммунофенотип и морфология 16 1.1.2.3. Пролиферация 17 1.1.2.4. Дифференцировка 18 1.1.2.5. Энергетический метаболизм 19 1.2. Влияние окислительного стресса на свойства ММСК 20 1.2.1. Моделирование окислительного стресса in vitro 21 1.2.2. Механизмы действия АФК 23 1.2.3. Антиоксидантная система защиты клетки 28 1.2.4. Механизмы поддержания устойчивости ММСК к окислительному стрессу 32 1.3. Роль HIF в функционировании ММСК, культивируемых при разном содержании О2 33 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 36 2.1 Используемое оборудование, материалы и реактивы 36 2.2 Приготовление сред для культивирования ММСК 38 2.2.2 Приготовление ростовой среды 38 2.2.3 Приготовление среды для криоконсервации клеток 38 2.3 Получение и культивирование ММСК из жировой ткани человека 38 2.3.1 Получение первичных культур ММСК и их дальнейшее культивирование 38 2.3.2 Культивирование ММСК в условиях пониженного содержания кислорода 39 2.3.3 Криоконсервация культивируемых ММСК 39 2.4 Моделирование окислительного стресса с помощью перекиси водорода 40 2.5 Приготовление лизатов ММСК для оценки ферментативной активности 40 2.6 Характеристика ММСК из жировой ткани человека 40 2.6.1 Оценка жизнеспособности клеток 40 2.6.2 Функционирование прооксидантной системы клеток 41 2.6.2.1 Содержание в клетках активных форм кислорода 41 2.6.2.2 Содержание в ММСК ТБК-активных продуктов 42 2.6.3 Функционирование антиоксидантной системы ММСК 42 3 2.6.3.1 Определение активности каталазы 42 2.6.3.2 Определение активности супероксиддисмутазы 42 2.6.3.3 Определение активности глутатионпероксидазы 43 2.6.4 Оценка функционального состояния митохондрий ММСК 43 2.6.4.1 Выявление митохондрий и характеристика их трансмембранного потенциала 43 2.6.4.2 Оценка интенсивности дыхания ММСК 44 2.6.4.3 Определение уровня АТФ 44 2.7 Определение уровня экспрессии генов в ММСК 45 2.7.1 Выделение тотальной РНК, обратная транскрипция 45 2.7.2 Определение уровня экспрессии генов, ассоциированных с гипоксией и окислительным стрессом 46 2.7.3 Определение уровня экспрессии генов HIF1α и HIF3α 46 2.8 Статистическая обработка результатов 47 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 48 3.1. Характеристика ММСК при культивировании в условиях различного содержания кислорода (20%, 5%, 1%) 48 3.1.1. Жизнеспособность 48 3.1.2. Активность прооксидантной системы 49 3.1.2.1. Содержание АФК 49 3.1.2.2. Содержание ТБК-активных продуктов 53 3.1.3. Функционирование антиоксидантной системы. Активность каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы 54 3.1.4. Функциональное состояние митохондрий ММСК 55 3.1.4.1 Характеристика трансмембранного потенциала 55 3.1.4.2 Интенсивность дыхания 57 3.1.4.3 Уровень АТФ 59 3.1.5. Экспрессия гипоксия-ассоциированных генов 61 3.2. Влияние на ММСК кратковременного изменения содержания кислорода 67 3.2.1. Жизнеспособность 67 3.2.2. Активность прооксидантной системы 68 3.2.2.1. Содержание АФК 68 3.2.2.2. Содержание ТБК-активных продуктов 70 3.2.3. Функционирование антиоксидантной системы. Активность каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы 72 3.2.4. Функциональное состояние митохондрий 76 4 3.2.4.1 Характеристика трансмембранного потенциала 76 3.2.4.2 Интенсивность дыхания 79 3.2.5. Экспрессия генов HIF-1α и HIF-3α 82 3.2.6. Экспрессия гипоксия-ассоциированных генов 85 3.3. Влияние Н2О2 на ММСК 87 3.3.1. Жизнеспособность 87 3.3.2. Активность прооксидантной системы 89 3.3.2.1. Содержание АФК 89 3.3.2.2. Содержание ТБК-активных продуктов 90 3.3.3. Функционирование антиоксидантной системы. Активность каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы 91 3.3.4. Экспрессия генов, связанных с окислительным стрессом 93 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 96 ВЫВОДЫ 98 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 99 5 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ АФК - активные формы кислорода ГП - глутатионпероксидаза ДМСО - диметилсульфоксид МДА - малоновый диальдегид ММСК - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки НСТ - нитросиний тетразолий ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты ПОЛ - перекисное окисление липидов СОД - супероксиддисмутаза ТБК - тиобарбитуровая кислота ТХУ - трихлоруксусная кислота ФМС - феназинметасульфат ЦТК - цикл трикарбоновых кислот ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка ЭТЦ - электрон-транспортная цепь ACAN - аггрекан ACTB - бета-актин Akt - протеинкиназа В AP-1 - активирующий протеин-1 Bad - Bcl-2-ассоциированный агонист гибели клеток Bax - Bcl-2-ассоциированный x белок Bcl-2 - белок B-клеточной лимфомы-2 bFGF - фактор роста фибробластов основной B2M - бета-2-микроглобулин BMP2 - костный морфогенетический белок cAMP - циклический аденозинмонофосфат CAT - каталаза СССР - карбонилцианид-3-хлорфенилгидразон CCND2 - циклин D2 CD - кластер дифференцировки CDKN2C - ингибитор циклин-зависимой киназы 2С CKS2 - регуляторная субъединица протеинкиназы 2 6 COL2A - коллаген 2 типа альфа 1 DAPK3 - гибель-ассоциированная протеинкиназа 3 ENO1 - енолаза 1 (альфа) ERK – киназа, регулируемая внеклеточными сигналами FABP4 - белок, связывающий жирные кислоты 4 FITC - флуоресцеинизотиоцианат FOSB - гомолог онкогена В мышиной вирусной остеосаркомы FOSL1 - FOS-подобный антиген 1 GAPDH - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа G-CSF - гранулоцит-колониестимулирующий фактор GLUT1 - глюкозный транспортер 1 G6PD - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа GPI - глюкозо-6-фосфат-изомераза GPX - глютатионпероксидаза GR - глютатионредуктаза H2DCFDA - 2ʹ7ʹ-дихлорфлуоресцеин диацетат HGF - фактор роста гепатоцитов HIF - гипоксия-индуцируемый фактор HIF-1α, HIF-2α, HIF-3α - -субъединицы транскрипционных факторов семейства HIF HLA - человеческий лейкоцитарный антиген HPRT1 - гипоксантинфосфорибозилтрансфераза hTeRT - теломеразная обратная транскриптаза человека IAP-2 - ингибитор апоптоза 2 IGF-1 - инсулиноподобный фактор роста-1 IGF-BP - белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста LD5, LD15, LD50 - летальные дозы, вызывающие 5%, 15% и 50%-ную гибель клеток LDHA - лактатдегидрогеназа LEP - лептин LPL - липопротеинлипаза MAPK - митоген-активируемая протеинкиназа MT3 - металлотионеин NF-κB - ядерный фактор κB Nox - НАДФ•H-оксидаза Oct-4 - октамер-связывающий транскрипционный фактор 4 p53 - клеточный опухолевый антиген 53 7 p-Akt - фосфорилированная Akt PBS - фосфатно-солевой буфер PCNA - антиген ядер пролиферирующих клеток PDGF - фактор роста тромбоцитов PDK1 - фосфоинозитид-зависимая киназа 1 p-ERK - фосфорилированная ERK PI3K - фосфоинозитид-3-киназа PPAR - пероксисомальный рецептор активации пролиферации PRX - пероксидаза pVHL - подавляющий опухоль белок фон Хиппел-Линдау REX-1 - цинк-пальцевый белок 754 ROS - активные формы кислорода RPLP0 - рибосомный фосфопротеин P0 Runx2 - Runt-связанный транскрипционный фактор 2 SLC2A1 - глюкозный транспортер 1 SLC2A4 - глюкозный транспортер 4 TR - тиоредоксин редуктаза VEGF - фактор роста эндотелия сосудов VEGFR - рецептор VEGF 8 ВВЕДЕНИЕ Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) (Horwitz, Le Blanc, Dominici et al., 2005; Dominici, Le Blanc, Mueller et al., 2006) или мезенхимальные стволовые клетки (Caplan, 1991) вызывают интерес исследователей с момента их открытия А.Я. Фриденштейном как колониеобразующих единиц фибробластов (Фриденштейн, 1970; Fridenstein, Chailakhjan, Lalikina, 1976; Fridenstein, Gorskaja, Kalugina, 1976). Полученное в результате дальнейшего изучения детальное описание характеристик ММСК сделало их привлекательным объектом для клеточной терапии. В ходе многочисленных работ было показано, что ММСК присутствуют в организме в качестве тканевого резерва, участвуя в физиологической и репаративной регенерации путем дифференцировки в различные типы клеток мезенхимального происхождения и выработки паракринных факторов, которые способствуют повышению выживаемости поврежденных клеток и активации резидентных предшественников (Makino, Fukuda, Miyoshi et al., 1999; Pittenger, Mackay, Beck et al., 1999; Colter, Sekiya, Prockop, 2001; Hoffman, Gzichos, Kaps et al., 2002; Jiang, Jahagirdar, Reinhardt, 2002; Pittenger, Martin, 2004; Xu, Zhang, Qian et al., 2004; Dazzi, Ramasamy, Glennie et al., 2006; Буравкова, Андреева, Григорьев, 2012; Wei, Yang, Han, 2013; Buravkova, Andreeva, Gogvadze et. al., 2014). Костный мозг является первой тканью, в которой было показано существование клеток со свойствами ММСК (Fridenstein, Gorskaja, Kalugina, 1976). Однако по последним данным клетки со свойствами ММСК могут быть выделены практически из всех органов и тканей (Kolf, Cho, Tuan, 2007; Mafi, Hindocha, Mafi et al., 2011). По-видимому, данные клетки локализуются в соединительной ткани, образующей строму органов и сопровождающей кровеносные сосуды (da Silva Meirelles, Chagastelles, Nardi, 2006). Наиболее перспективным источником ММСК для медицинских целей является жировая ткань, т.к. ее изъятие является малотравматичным, а последующее культивирование полученных малодифференцированных предшественников in vitro позволяет нарастить достаточное количество клеточного материала, сопоставимого по потенциям с клетками из костного мозга (Zuk, Zhu, Mizuno et al., 2001). Показано, что ММСК являются перспективным инструментом, применимым в регенеративной медицине при лечении заболеваний, связанным с нарушением кровообращения, таких как инфаркт миокарда, инсульт, ишемия нижних конечностей (Al-Khaldi, Al-Sabti, Galipeau et al., 2003; Pittenger and Martin, 2004; Iwase, Nagayaa, Fujii et al., 2005; Nakagami, Maeda, Morishita et al., 2005; Moon, Kim, Kim et al., 2006). Однако, эффективность применения клеточной терапии в данном случае зависит от устойчивости клеток к повреждающим 9 воздействиям, в том числе, окислительному стрессу, развитие которого наблюдается в очагах поражения. Так, установлено, что при инфаркте миокарда чрезмерная продукция активных форм кислорода (АФК) наблюдается как во время реперфузии ишемизированных участков (Ambrosio, Zweier, Duilio et al., 1993; Vanden Hoek, Becker, Shao et al., 2000), так и до нее (Becker, Vanden Hoek, Shao et al., 1999; Lu, Quinn, Sun, 2004). Известно, что устойчивость клеток к окислительному стрессу определяется большим числом факторов, в том числе содержанием кислорода в среде при культивировании in vitro (Theus, Wei, Cui et al., 2008; Peterson, Aly, Lerman et al., 2011). Традиционно ММСК культивируют в CO2-инкубаторах, где уровень углекислого газа приближен к тканевому (5%), а содержание кислорода соответствует таковому в воздухе (20%), что многократно превышает значения in vivo. Несмотря на это такие условия обозначают как «нормоксические», а снижение содержания кислорода, в том числе до физиологических значений, называют «гипоксией». Высокие концентрации кислорода могут вызвать окислительный стресс с помощью продукции АФК, которые могут повреждать липиды, белки и ДНК, влияя на клеточный метаболизм (Wiseman, Halliwell, 1996). Снижение содержания кислорода в среде культивирования может снизить внутриклеточное образование и накопление АФК. Известно, что свойства клеток в условиях разного содержания кислорода будут различаться. Тем не менее, до сих пор нет единого мнения о том, какую концентрацию кислорода необходимо использовать при культивировании ММСК (Mohyeldin, Garzon-Muvdi, Quinones-Hinojosa, 2010; Beegle, Lakatos, Kalomoiris et al., 2015). Показано, что в условиях содержания O2, близких к физиологическим (4-7%) (Fehrer, Brunauer, Laschober et al., 2007; Pattappa, Heywood, de Bruijn et al., 2011), и при его значительном снижении (1%) клетки поддерживаются в менее коммитированном состоянии (Basciano, Nemos, Foliguet et al., 2011). Установлено, что в данном случае может иметь место регуляция экспрессии генов «стволовости» в том числе при действии гипоксия-индуцируемого фактора HIF (Covello, Kehler, Yu et al., 2006). В то же время культивирование при 1% O2 способствует поддержанию более высокой пролиферативной активности (Рылова, Буравкова, 2013). Особого внимания требует изучение влияния содержания кислорода на функционирование ММСК в условиях окислительного стресса. Перспектива применения ММСК при лечении таких заболеваний как инфаркты и инсульты, сопровождающиеся ишемией и гипоксией, обусловливает необходимость проведения исследований, посвященных устойчивости ММСК к окислительному стрессу и оптимизации условий культивирования с целью повышения терапевтического потенциала данных клеток и их адаптивных возможностей. 10 Цель и задачи исследования Цель работы: оценка показателей окислительного стресса и энергетического метаболизма в мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках (ММСК) из жировой ткани человека при культивировании в среде с различным содержанием кислорода. Задачи: 1. Исследование устойчивости ММСК к окислительному стрессу при различном содержании кислорода в среде культивирования. 2. Изучение про- и антиоксидантной активности ММСК при культивировании в условиях 20%, 5% и 1% О2 и его кратковременном изменении. 3. Исследование влияния парциального напряжения кислорода в среде культивирования на функциональное состояние митохондрий ММСК. 4. Анализ уровня экспрессии генов, ассоциированных с гипоксией, в ММСК при культивировании в среде с содержанием кислорода от 20% до 1%. 5. Определение динамики уровня экспрессии генов -субъединиц транскрипционных факторов семейства HIF в ММСК при постоянном культивировании в среде с 20%, 5% и 1% кислорода и его кратковременном изменении. Научная новизна Получены новые данные, свидетельствующие о меньшей активности ферментов антиоксидантной защиты и концентрации ТБК-активных продуктов в культивируемых ММСК при 5% кислорода по сравнению с 20% и 1% О2. Впервые показано, что ММСК, постоянно культивируемые при повышенном (20%) и пониженном (1%) содержании кислорода более устойчивы к моделируемому окислительному стрессу (Н2О2) по сравнению с клетками, культивируемыми в условиях, близких к тканевым (5% О2). Впервые продемонстрировано, что увеличение экспрессии гена HIF-1 в ММСК происходит на ранних этапах снижения содержания О2, а продолжительность его зависит от степени выраженности гипоксии. Дальнейшее уменьшение содержания мРНК HIF-1 сопровождается ростом экспрессии гена HIF-3. Получены новые данные, свидетельствующие о снижении количества потребляемого кислорода, трансмембранного потенциала митохондрий, синтеза АТФ, а также активации гликолиза в ММСК при понижении уровня О2, что сопровождается увеличением экспрессии генов переносчиков глюкозы SLC2A1, SLC2A4 и глюкозо-6-фосфат-изомеразы GPI. 11 Теоретическая и практическая значимость работы Проведенное исследование позволило продемонстрировать влияние содержания кислорода в среде культивирования на редокс-статус ММСК, что имеет большое значение для развития фундаментальных и прикладных исследований в области регенеративной медицины. Полученные в настоящей работе данные показали, что наименее повреждающее действие на культивируемые ММСК оказывает среда с содержанием кислорода 5%, при этом устойчивость к окислительному стрессу возрастает при культивировании в условиях 20% и 1% О2. Экспериментальные результаты вносят существенный вклад в понимание механизмов адаптации прогениторных клеток к гипоксии. ММСК быстро адаптируются к уменьшению содержания кислорода в среде: через 24 ч после снижения О2 наблюдается изменение экспрессии большинства генов, функционирующих в условиях гипоксии и участвующих в процессах пролиферации, гликолиза и апоптоза. Наиболее активно в ответ на снижение содержания кислорода изменяется экспрессия металлотионеина MT3. Положения, выносимые на защиту 1. ММСК, культивируемые при повышенном (20%) и пониженном (1%) содержании кислорода испытывают слабый окислительный стресс, который сопровождается увеличением активности антиоксидантной системы ММСК, следствием чего является повышение устойчивости клеток к моделируемому окислительному стрессу. 2. В ММСК при 5% и 1% кислорода происходит снижение функциональной активности митохондрий, что проявляется в снижении уровня потребления кислорода, величины трансмембранного потенциала и продукции АТФ, клетки поддерживают нормальный метаболизм и жизнеспособность за счет увеличения вклада гликолиза. 3. В ММСК увеличение экспрессии гена HIF-1α происходит только на ранних этапах снижения содержания О2, а его продолжительность зависит от степени выраженности воздействия. Дальнейшее уменьшение содержания мРНК HIF-1 сопровождается ростом экспрессии гена HIF-3. Апробация работы Основные результаты и положения диссертации доложены и обсуждены на XI, XII, XIII и XIV Конференциях молодых ученых, специалистов и студентов, посвященных Дню Космонавтики (Москва, 2012, 2013, 2014, 2015), III Cъезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2012), 7th Fraunhofer Life Science Symposium associated with the 7th Annual Congress of the German Society for Stem Cell Research (GSZ) (Leipzig, Germany, 2012), VI 12 Всероссийском с международным участием Конгрессе молодых ученых-биологов «СимбиозРоссия 2013» (Иркутск, 2013), XIV Конференции по космической биологии и авиакосмической медицине с международным участием, посвященной 50-летию создания ИМБП (Москва, 2013), V Всероссийской научно-практическая конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2013), 9th Fraunhofer Life Science Symposium (Leipzig, Germany, 2014), Tissue Engineering and Regenerative Medicine International Society EU (Genova, Italy, 2014). По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 7 статей в журналах из перечня ВАК РФ. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Текст диссертации изложен на 120 страницах машинописного текста, сопровождается 38 рисунками и 14 таблицами. Список литературы содержит 283 источника, из них 35 на русском и 248 на иностранном языке. 13 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток 1.1.1. Локализация и тканевые (физиологические) ниши ММСК Мультипотентные мезенхимальные стромальные (стволовые) клетки (ММСК) представляют собой гетерогенную популяцию, содержащую в том числе и малодифференцированные прогениторы с высокой пролиферативной активностью, способные к длительному самоподдержанию, дифференцировке в несколько типов клеток и миграции в области повреждения тканей (Zuk, Zhu, Mizuno et al., 2001; Lee, Kim, Choi et al., 2004; Kolf, Cho, Tuan, 2007; Uccelli, Moretta, Pistoia, 2008; Nombela-Arrieta, Ritz, Silberstein, 2011; Kfoury, Scadden, 2015; Nikukar, Reid, Riehle et al., 2015). В настоящее время ММСК выделены из целого ряда органов и тканей, таких как костный мозг, синовиальная жидкость, жировая ткань, скелетные мышцы, легкие, Вартоновское желе пупочного канатика, плацента, периферическая и пуповинная кровь, эндометрий, периодонтальные связки, пульпа зуба (Zuk, Zhu, Mizuno et al., 2001; Inʹt Anker, Scherjon, Kleijburg-van der Keur et al., 2004; Fukuchi, Nakajima, Sugiyama et al., 2004; Романов, Даревская, Мерзликина и др., 2005; da Silva Meirelles, Chagastelles, Nardi, 2006; Serakinci, Keith, 2006; Буравкова, Гринаковская, Андреева и др., 2009; Carvalho, Wu, Yu et al., 2011; Rus Ciuca, Soritau, Susman et al., 2011; Бородкина, Шатрова, Пуговкина и др., 2013). При этом между клетками из разных источников обнаружено удивительно малое количество различий (Kolf, Cho, Tuan, 2007). К наиболее перспективным источникам ММСК с точки зрения последующего клинического применения можно отнести костный мозг, жировую ткань и плаценту. В организме популяции стволовых клеток функционируют в особых условиях микроокружения, для обозначения которого был предложен термин «ниша» (Schofield, 1978). Ниша не просто является физическим местом пребывания прогениторов, она имеет анатомические и функциональные характеристики и при взаимодействии со стволовой клеткой образует динамическую систему, где происходит интеграция сигналов, опосредующих сбалансированный ответ клетки на потребности организма (Watt, Hogan, 2000; Scadden, 2006; Терских, Васильев, Воротеляк, 2007; Kolf, Cho, Tuan, 2007; Калинина, Сысоева, Рубина и др., 2011; Ehninger, Trumpp, 2011). Микроокружение стволовых стромальных клеток включает специфические молекулярные, клеточные и физиологические компоненты (рис. 1). К ним относят взаимодействия с другими клетками, внеклеточным матриксом и влияние растворимых биологически активных 14 медиаторов (Jones, Wagers, 2008; Kim, Han, Hwang et al., 2014). Несмотря на то, что мозаика составляющих ниш ММСК из разных депо может значительно различаться, наиболее характерным физическим фактором во всех случаях будет низкое парциальное давление кислорода (Буравкова, Гринаковская, Андреева и др., 2009; Mohyeldin, Garzon-Muvdi, QuinonesHinojosa, 2010). Адипоциты Wnt-связанные сигналы Стероидные гормоны Самообновление Рецепторы стероидных гормонов ММСК Адипогенез стабилизация Ангиогенез Низкое содержание О2 Эндотелиальные клетки Рис. 1. Микроокружение ММСК из жировой ткани in vivo согласно Kaewsuwan, Song, Kim et al. (2012). В настоящее время появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что содержание кислорода является важным фактором, контролирующим многие процессы в ходе жизнедеятельности ММСК (Rosova, Dao, Capoccia et al., 2008; Nemos, Basciano, Dalloul, 2012; Mathew, Rajendran, Gupta et al., 2013; Drela, Sarnowska, Siedlecka et al., 2014; Kang, Kim, Sung, 2014; Beegle, Lakatos, Kalomoiris, 2015). Данный факт ставит множество вопросов перед исследователями, работающими с ММСК в условиях in vitro. 15 1.1.2. Особенности ММСК, культивируемых при разном содержании О2 1.1.2.1. Жизнеспособность Определяющие функциональные характеристики ММСК, такие как способность длительно поддерживать высокий пролиферативный потенциал, дифференцироваться в определенные типы клеток под действием дифференцировочных стимулов, оказывать иммуносупрессивный эффект и поддерживать гемопоэз, были описаны в ходе многочисленных экспериментов in vitro при культивировании клеток в стандартных «нормоксических» условиях СО2-инкубатора (20% О2, 75% N2, 5% СО2) (Zuk, Zhu, Mizuno et al., 2001; Locke, Windsor, Dunbar, 2009). При этом оказалось, что снижение содержания кислорода до уровня, близкого к физиологическому в тканях, существенным образом модифицирует эти свойства (Csete, 2005; Буравкова, Андреева, Григорьев, 2012; Stubbs, Hsiao, Peshavariya et al., 2012; Kang, Kim, Sung, 2014). Показано, что такой важный параметр как жизнеспособность, остается на высоком уровне при культивировании в разных по содержанию О2 условиях (Fehrer, Brunauer, Laschober et al., 2007; Буравкова, Гринаковская, Андреева и др., 2009; Mathew, Rajendran, Gupta, 2013). Более того, имеются данные, свидетельствующие о высокой устойчивости ММСК к условиям аноксии (Анохина, 2007; Рылова, Буравкова, 2014). Однако в некоторых исследованиях обнаружена активация процессов апоптоза в ММСК при изменении напряжения кислорода. Так, Chen, Zhu, Wang et al. (2014) отмечают, что при моделировании процессов гипоксии (<0,5% О2, 6 ч) и реоксигенации (21% О2, 12 ч) наблюдался выход цитохрома с из митохондрий в цитозоль, снижение трансмембранного потенциала, отрицательная регуляция p-ERK, p-Akt и увеличение экспрессии Bcl-2, p-JUN и VEGF. В ряде исследований по повышению эффективности клеточной терапии заболеваний, связанных с нарушением кровообращения, отмечается положительное влияние на жизнеспособность ММСК кратковременного гипоксического прекондиционирования (Leroux, Descamps, Tojais et al., 2010). В ходе экспериментов, проведенных на ММСК из костного мозга крыс при 10%-ном содержании фетальной телячьей сыворотки показано, что снижение содержания О2 в среде культивирования с 20% до 0,5% на 24-48 ч сопровождается стабилизацией HIF-1α, увеличением продукции VEGF и активацией Akt (Chacko, Ahmed, Selvendiran et al., 2010). Известно, что транскрипционный фактор HIF-1α может напрямую влиять на синтез VEGF (Taylor, 2008), который помимо индукции ангиогенеза активирует PI3Kпуть, что вызывает фосфорилирование Akt, вследствие чего может поддерживаться высокий уровень жизнеспособности клеток (Pons, Huang, Arakawa-Hoyt et al., 2008; Stubbs, Hsiao, Peshavariya et al., 2012; Buravkova, Andreeva, Gogvadze et al., 2014). 16 1.1.2.2. Иммунофенотип и морфология Несмотря на многочисленные попытки, до сих пор не было найдено специфического маркера, который позволил бы однозначно идентифицировать ММСК. Анализ принятого в настоящее время сочетания поверхностных молекул, наличие или отсутствие которых характеризует данный тип клеток (Dominici, Le Blanc, Mueller, 2006), не выявил зависимости от содержания кислорода в среде культивирования. Так, было показано, что при 20% и 5% О2 культуры ММСК из жировой ткани человека не различались по количеству клеток, несущих специфичные маркеры стромальных предшественников (CD9, CD54, CD71, CD90, CD105, HLA-ABC, виментин), экспрессирующие при маркеры, этом в обоих характерные для случаях не эндотелия были и обнаружены клетки, гемапоэтических клеток- предшественников (CD31, CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit) и HLA-DR) (Буравкова, Гринаковская, Андреева, 2009). Не обнаружено различий в экспрессии CD90, CD73, CD54, CD105, CD11b, CD34 и при культивировании аналогичных клеток в условиях 20%, 5% и 1% О2 (Рылова, Андреева, Гогвадзе и др. 2012). В экспериментах Choi, Pingguan-Murphy, Wan Abas et al. (2014) при 21% и 2% О2 не различалось количество ММСК из жировой ткани человека, на поверхности которых присутствовали CD105, CD90, CD73 и не были обнаружены CD45, CD34, CD19, CD14 и HLA-DRDPDQ. В то же время выявлено, что культивирование при разном содержании кислорода приводит к значительным морфологическим изменениям ММСК. Наблюдения за клетками в условиях 20%, 5%, 3% и 1% О2 в течение 4 пассажей показали наличие высокой гетерогенности культуры при атмосферном содержании кислорода на ранних этапах, сменяющееся возрастанием количества крупных распластанных клеток и уменьшением доли фибробластоподобных ММСК. В условиях, наиболее приближенных к физиологическим (3-5% О2), в культуре преобладали клетки классической веретеновидной формы (60-100 мкм), т.е. гетерогенность популяции снижалась и поддерживалась на протяжении всего исследования. При 1% О2 на ранних пассажах обнаруживались клетки небольшого размера (40-60 мкм), однако далее они стали заменяться на крупные и распластанные, характерные для культур при 20% О2. Авторы связывают увеличение гетерогенности культуры, проявляющееся в появлении крупных распластанных клеток, с повреждающим действием завышенного и заниженного (по отношению к физиологическому) содержания О2 (Рылова, Буравкова, 2013). 17 1.1.2.3. Пролиферация В настоящее время в связи с применением ММСК в клеточной терапии большое количество работ посвящено оптимизации наращивания клеточной массы в условиях in vitro. При этом большое внимание уделяется протоколам с использованием пониженного содержания кислорода, поскольку при их применении многими исследователями была отмечена активация пролиферации по сравнению с клетками при 20% О2. Так, Fehrer, Brunauer, Laschober et al. (2007) зафиксировали значительное увеличение числа удвоений популяции ММСК из костного мозга при длительном культивировании (100 суток) в условиях 3% О2. Choi, Pingguan-Murphy, Wan Abas et al. (2014) показали, что количество клеток при 2% О2 достоверно превышает таковое при атмосферном содержании кислорода, начиная с 7 суток культивирования. При этом авторы отметили снижение времени удвоения популяции при пониженном содержании О2 более, чем в 2 раза. В работе по исследованию пролиферации ММСК из жировой ткани при 5%, 3% и 1% О2 отмечалось, что в течение первого пассажа пролиферативная активность клеток не изменилась по сравнению с таковыми в 20% О2. Дальнейшее культивирование в течение второго пассажа активировало пролиферацию ММСК при 5%, 3%, 1% О2 и снижало в условиях 20% О2. При этом наблюдалось сокращение времени лаг-фазы кривой роста культуры при всех вариантах пониженного содержания кислорода. Далее во всех клетках наблюдалось постепенное снижение пролиферативной активности, максимально низким время удвоения популяции было при содержании О2, наиболее близком к физиологическому (5%), тем не менее скорость деления клеток при 3% и 1% О2 превышала таковую в условиях 20% О2 более чем в 2 раза (Рылова, Буравкова, 2013). В обзоре Csete (2005) также отмечается, что практически все стволовые клетки пролиферируют быстрее в условиях пониженного (близкого к физиологическому), но не критического содержания О2. Стоит отметить, что в среде с 5% О2 не обнаружено увеличения активности теломеразы, вследствии чего авторы предполагают, что активация пролиферации при пониженном содержании кислорода не является результатом трансформации клеток. Было обнаружено увеличение уровня экспрессии генов, отвечающих за вступление клеток в клеточный цикл и позитивно регулирующих пролиферацию (FOSB, FOSL1, PCNA, CCND2, CKS2, CDKN2C) (Рылова, Буравкова, 2013). В исследовании Lee, Xia, Kim et al. (2009) отмечается, что увеличение интенсивности деления ММСК из жировой ткани при снижении содержания кислорода может быть опосредовано интенсификацией синтеза таких ростовых факторов, как VEGF и bFGF, находящихся под контролем HIF. 18 1.1.2.4. Дифференцировка Способность к дифференцировке в различные типы клеток мезенхимального происхождения является одной из главных причин использования ММСК в регенеративной медицине. В ходе многочисленных экспериментов было показано, что содержание кислорода в среде культивирования, помимо воздействия на морфологию клеток и их пролиферацию, оказывает влияние и на этот параметр. D’Ippolito, Diabira, Howard (2006) продемонстрировали эффект ингибирования дифференцировки ММСК в остеогенном направлении при 3% О2 по сравнению с клетками в условиях атмосферного содержания кислорода. При этом в условиях пониженного содержания кислорода была «стволовости» обнаружена как Oct-4, положительная REX-1 и регуляция hTeRT, которая экспрессии таких поддерживалась маркеров даже в дифференцировочной среде. Salim, Nacamuli, Morgan et al. (2004) не обнаружили различий в способности к остеогенной дифференцировке между клетками при 21% и 2% О2, однако, отметили ее снижение при кислородном голодании (0,02% О2). В этих условиях было выявлено уменьшение уровня экспрессии транскрипционного фактора Runx2, необходимого ММСК для дифференцировки в остеобласты (Komori, 2010). По-видимому, это было опосредовано снижением уровня экспрессии BMP2, который действует как активатор Runx2 через Smad сигнальный путь. Xu, Liu, Qu et al. (2013) отмечают возможность действия пониженного содержания кислорода через положительную регуляцию сигнального пути Notch и последующее ингибирование активности Runx2. Другие авторы также отмечают снижение дифференцировки ММСК в остеогенном направлении при низком содержании О2 (Malladi, Xu, Chiou et al., 2006; Fehrer, Brunauer, Laschober et al., 2007; Iida, Takeda-Kawaguchi, Tezuka et al., 2010). Fehrer, Brunauer, Laschober et al. (2007) отмечают, что наряду с подавлением остеогенеза при 3% О2 наблюдается снижение способности ММСК к адипогенной дифференцировке. При этом уменьшается уровень экспрессии таких маркеров адипогенеза как FABP4 и LPL. В другом исследовании аналогичные эффекты наблюдались при 2% О2, а помимо FABP4 и LPL в ММСК снижалась экспрессия PPAR (Choi, Pingguan-Murphy, Wan Abas et al., 2014). Авторы также отмечают возможность подавления дифференцировки как в остео-, так и адипогенном направлении повышенной экспрессией HIF-1α. Boyette, Creasey, Guzik et al. (2014) при обнаруженном подавлении адипогенеза в условиях 5% кислорода в свою очередь указывают на вероятность регуляции данного процесса через увеличение экспрессии HIF-1α-зависимого гена DEC1(STRA13) и, как следствие, снижение уровня PPAR. 19 Что касается влияния пониженного содержания кислорода на дифференцировку в хондрогенном направлении, результаты экспериментов свидетельствуют о ее активации в ММСК по сравнению с клетками в условиях атмосферного содержания О2 (Wang, Fermor, Gimble et al., 2005; Xu, Malladi, Chiou et al., 2007). В недавних исследованиях Choi, PingguanMurphy, Wan Abas et al. (2014) также отметили повышенную скорость индуцированного хондрогенеза и экспрессию COL2A, SOX9 и ACAN в условиях 2% О2. Предполагается, что процесс протекания хондрогенеза находится в прямой зависимости от уровня экспрессии HIF (Malladi, Xu, Chiou et. al., 2007). 1.1.2.5. Энергетический метаболизм Исследования, посвященные оценке энергетической составляющей метаболизма ММСК в условиях различного содержания кислорода, немногочисленны. Тем не менее, установлено увеличение экспрессии генов, ассоциированных с метаболизмом глюкозы (GLUT1, LDHA, PDK1), в ММСК из пуповины при культивировании в течение 72 ч в среде с содержанием кислорода 1,5%, 2,5%, 5% по сравнению с клетками в условиях 21% О2. При этом наиболее значимые изменения происходили в клетках при низком содержании кислорода. Анализ экспрессии гена G6PD в данном случае не выявил изменений по сравнению с клетками при атмосферном О2 (Lavrentieva, Majore, Kasper et al., 2010). Стоит отметить, что экспрессия множества генов, продукты которых участвуют в метаболизме глюкозы, при действии гипоксии регулируется HIF (Carmeliet, Dor, Herbert et al., 1998; Semenza, 2012). При изучении действия пониженного содержания кислорода на ММСК и кардиомиоциты было установлено, что первые имеют значительно более высокую устойчивость к неблагоприятным условиям, поскольку способны к переключению метаболических путей на анаэробные и получению достаточного количества АТФ в процессе гликолиза (Das, Jahr, van Osch et al., 2010), что подтверждают и другие авторы (Papandreou, Cairns, Fontana et al., 2006; Dos Santos, Andrade, Boura et al., 2010; Folmes, Dzeja, Nelson et al., 2012). Как показано Deschepper, Oudina, David et al. (2011), при достаточном количестве глюкозы ММСК способны в течение длительного времени поддерживать жизнеспособность в условиях жесткой гипоксии. Метаболическую пластичность и значительный вклад гликолитических процессов в устойчивость клеток к условиям ишемии отмечают и Mylotte, Duffy, Murphy et al. (2008). В экспериментах этих авторов было показано, что наибольшую чувствительность ММСК демонстрируют к ингибированию гликолиза, при этом резко снижается жизнеспособность клеток. 20 Тем не менее, при изучении метаболизма ММСК в условиях начального этапа роста культуры было отмечено, что как при 2% кислорода, так и при 20% О2 в ММСК наиболее масштабным источником АТФ служит гликолиз, а не окислительное фосфорилирование (Dos Santos, Andrade, Boura et al., 2010). Таким образом, литературные данные свидетельствуют о важной роли кислорода как фактора микроокружения ММСК. Несмотря на отсутствие изменений жизнеспособности и иммунофенотипа, разная концентрация О2 опосредует морфологические и множественные функциональные изменения, проявляющиеся, в том числе, в изменении энергетического обмена, пролиферативной активности клеток и скорости их направленной дифференцировки. Показано, что содержание кислорода в среде культивирования, в частности гипоксическое прекондиционирование, также определяет устойчивость клеток к окислительному стрессу, от которой во многих случаях зависит эффективность применения клеточной терапии (Theus, Wei, Cui et al., 2008; Peterson, Aly, Lerman et al., 2011). 1.2. Влияние окислительного стресса на свойства ММСК Как известно, активные формы кислорода (АФК) постоянно образуются в клетках в ходе нормального метаболизма в аэробных условиях. В последнее время АФК рассматривают в качестве вторичных посредников в процессах жизнедеятельности клеток, которые включаются в сигнальную трансдукцию, влияя на ключевые звенья обменных процессов: фосфорилирование, метаболизм кальция, модуляцию факторов транскрипции, гидролиз фосфолипидов (Дубинина, 2001). При этом повреждения клетки отсутствуют благодаря деятельности антиоксидантной системы, нейтрализующей большинство негативных эффектов АФК. Тем не менее, нарушение баланса между количеством образующихся свободных радикалов и способностью антиоксидантной системы нейтрализовать их могут приводить к возникновению окислительного стресса (Sies, 1985) или прооксидантного состояния (Cerutti, 1985) в клетке, которое сопровождается повреждением макромолекул, в том числе ДНК, и запуском апоптотических процессов (Dayem, Choi, Kim et al., 2010; Pollina, Brunet, 2011). Согласно Harman (1956), результатом накопления повреждений в клетках, нанесѐнных избытком свободных радикалов с течением времени, является старение. Кроме того, показано, что окислительный стресс сопровождает множество патологий, в числе которых инфаркты, инсульты, в связи с чем к данному процессу обращено пристальное внимание со стороны ученых (Chang, Song, Moon et al., 2013; Saparov, Chen, Beckman et al., 2013; Chen, Teng, Chen et al., 2014; Pan, Qin, Ma et al., 2014). 21 1.2.1. Моделирование окислительного стресса in vitro Для индукции прооксидантного состояния в клетках используют два подхода, один из которых основан на увеличении количества свободных радикалов, а другой направлен на ингибирование компонентов антиоксидантной системы. Увеличение количества свободных радикалов в клетке может быть вызвано действием -радиации, повышенным напряжением кислорода в среде (гипероксия), добавлением супероксида (в виде диоксида калия) и перекиси водорода, а также использованием препаратов, способствующих генерации супероксида (паракват, менадион) (Morrison, 1984; Krall, Bagley, Mullenbach et al., 1988). Из компонентов антиоксидантной системы при моделировании окислительного стресса ингибируют каталазу и супероксиддисмутазу с помощью 3-аминотриазола (Bhuyan, Bhuyan, 1977) и диэтилдитиокарбамата (Misra, 1979) соответственно, а также истощают количество глутатиона в клетке действием бутионин-сульфоксимина (Meister, 1983). Перекись водорода, добавляемая непосредственно в среду культивирования, сама по себе не является особенно активной химически, однако, посредством образования гидроксил-радикалов в реакции Габера-Вейса ее присутствие вызывает индукцию перекисного окисления липидов и повреждение ДНК. Показано, что при добавлении Н2О2 в высоких концентрациях к культуре клеток китайского хомячка уже через 5 минут наблюдалось большое количество разрывов нитей ДНК. Для определения концентрации Н2О2 в среде культивирования клеток используют методики Taylor, Camalier, Taylor (1979) и Pick E., Keisari (1980). Супероксид может быть добавлен непосредственно в среду культивирования клеток в виде диоксида калия (КО2). В этом случае может быть получена высокая, но быстро снижающаяся концентрация супероксида. Супероксид способен спонтанно дисмутировать с водой в кислород и пероксид водорода, последний из которых окисляет ионы переходных металлов, в результате образуя гидроксил-радикал. Эффекты супероксида на клетку практически идентичны действию Н2О2. Супероксид, в отличие от Н2О2, лишен способности легко проникать через клеточную мембрану. Теоретически попадать без затруднений в клетку может гидропероксидный радикал НО2˙, образующийся из супероксида, однако, вследствие своей активности данный радикал быстрее прореагирует с компонентами плазматической мембраны. При исследовании эффектов супероксида per se в среду культивирования клеток добавляют каталазу с целью элиминации пероксида водорода и предотвращения образования гидроксил-радикалов ˙ОН. В экспериментах, требующих присутствия супероксида в течение длительного отрезка времени, возможна его генерация в энзиматической системе ксантин-ксантиноксидаза, компоненты которой добавляют в среду культивирования. При этом отследить ход реакции позволяют ураты - ее первичные продукты. Показано, что уровень образования уратов 22 снижается по прошествии 30-40 мин вследствие инактивации ксантиноксидазы (Zimmerman, Cerutti, 1984). В моделях длительного действия супероксида необходимо избегать накопления уратов, поскольку эти соединения являются активными антиоксидантами, а их накопление оказывает на реакцию ингибирующее действие. Накопление уратов регулируют путем добавления в среду культивирования уриказы (урат оксидазы), катализирующей окисление уратов до аллантоина при одновременной генерации АФК (Jones, 1985). Таким образом, при использовании данной системы продуцируются супероксид и Н2О2, соотношение которых зависит от активности СОД и каталазы клеток. Уровень генерации данных видов АФК комплексом может быть определен спектрофотометрически по NBT-реакции (супероксид) и анализу количества Н2О2. При моделировании окислительного стресса путем добавления супероксида и Н2О2 в полную среду культивирования клеток необходимо учитывать, что компоненты среды могут модулировать конечный эффект АФК. Так, пируват снижает эффективную дозу Н 2О2 (Andrae, Singh, Ziegler-Skylakakis, 1985), гистидин увеличивает его токсическое действие, в то время как аскорбат действует как антиоксидант, так и прооксидант. Факторы роста, присутствующие в сыворотке, также могут компенсировать повреждающее действие окислительного стресса на культивируемые клетки. Плотность посадки клеток также является важным фактором, который необходимо учитывать при изучении эффектов АФК, добавляемых в среду культивирования. Высокая плотность посадки клеток способствует снижению их чувствительности к действию Н2О2, что объясняется более быстрой нейтрализацией АФК (Gille, Joenje, 1991). Гипероксия характеризуется присутствием кислорода в среде культивирования в концентрациях, которые превышают физиологические значения. Так, некоторые линии раковых клеток адаптированы к атмосферному содержанию кислорода в инкубаторе, т.е. 20% для них является «нормоксией». В то же время практически для всех первичных культур оптимум содержания кислорода при культивировании in vitro составляет 2-5% (Balin, Fisher, Carter, 1984; Gille, Joenje, 1991; Fehrer, Brunauer, Laschober et al., 2007). В условиях гипероксии супероксид и перекись водорода образуются внутри клетки в тех же компартментах, что и в норме, но в большем количестве. Происходит образование данных АФК в ходе ферментативных реакций (Jones, 1985). Митохондрия является основным источником эндогенных АФК. Показано, что изолированные митохондрии генерируют супероксид, восстанавливая кислород на уровне НАДН-дегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы и убихинон цитохром с редуктазы. В условиях гипероксии образование супероксида катализируется теми же ферментами, но в избыточном количестве. Моделирование окислительного стресса с помощью гипероксии осуществляют инкубацией клеток в среде, содержащей 98% О2 и 2% CО2 при давлении 1 атм. (нормобарическая 23 гипероксия). Токсический эффект гипероксии определяется плотностью клеточной популяции, от которой зависит время начала массовой гибели клеток (Spitz et. al., 1990). Подвергая нормобарической гипероксии разные типы клеток, исследователи описали наблюдающиеся при этом морфологические изменения: повышение количества лизосом, пикнозис, повреждения митохондрий, включающие набухание и дезорганизацию крист (Spitz et. al., 1990). Полученные данные позволяют предположить, что митохондрии являются прямой мишенью гипероксии, которая приводит к перестройкам их метаболизма. Выявлено, что при этом происходит инактивация НАДН-дегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы и -кетоглутаратдегидрогеназы, которая приводит к повышению генерации супероксида. Уровень АТФ в процессе культивирования клеток в условиях гипероксии снижается, что, возможно, является ключевой причиной гибели клетки. Установлено, что в условиях гипероксии (75% - 100% O2) ингибируется пролиферативная активность эндотелиальных клеток человека. В культуре ММСК данный показатель остается неизменным, однако, при этом на поверхности клеток снижается экспрессия молекул клеточной адгезии (CD9, CD54) (Гринаковская, 2007). Как показывает обзор литературных данных, чаще всего клетки подвергают действию супероксида и Н2О2 не более чем на 60 мин. В то же время длительную нормобарическую гипероксию используют в экспериментах по изучению возможности адаптации клеток к стрессовым условиям (Jones, 1985). В последнее время многие исследователи обращают пристальное внимание на условия культивирования клеток in vitro. Halliwell (2003) отмечает, что в исследованиях, проводимых на культурах клеток, проблема влияния окислительного стресса недооценивается. В условиях in vitro не происходит ограничения образования АФК за счет низкого содержания О2 (Halliwell, Gutteridge, 1999; Halliwell, 2007), поскольку парциальное давление кислорода в CО2- инкубаторе обычно превышает таковое in vivo в 3 раза и более. 1.2.2. Механизмы действия АФК В процессе метаболических реакций с участием кислорода при его неполном восстановлении до воды в клетках организма образуются гораздо более агрессивные окислители, чем сам О2, - так называемые активные формы кислорода (АФК). В это понятие включаются все активированные метаболиты О2 радикальной и нерадикальной природы. Наиболее важные из них представлены в табл. 1. 24 Табл. 1. Активные формы кислорода, образующиеся в клетках. Вид соединений Название Химическая формула Гидроксильный ОН.- радикал Радикалы Гидропероксидный радикал НО2· Липоперекисный LОО. и другие перекисные ROO. радикалы Оксид азота NO. Пероксинитрит ONOO- Супероксид О2.- Гипохлорная кислота HOCL Нерадикальные Перекиси липидов LOOH соединения Пероксид водорода Н2О2 Синглетный * О2 кислород АФК генерируются в клетке многочисленными источниками, к которым относятся НАДФНоксидаза, электрон-транспортная цепь митохондрий, ксантиноксидаза, цитохром р450, синтаза оксида азота (Андреев, Кушнарева, Старков, 2005; Гривенникова, Виноградов, 2013; Turrens, 1997; Griendling, Sorescu, Ushio-Fukai, 2000; Li, Shah, 2004; Holmstrom, Finkel, 2014). 95-98% поступающего в клетку О2 расходуется на выработку энергии и окислительный метаболизм субстратов, а 2-5% О2 переходит в АФК (Cheeseman, Slater, 1993). При образовании АФК донорами электронов являются металлы с переменной валентностью (Fe, Cu и другие), которые входят в состав ряда ферментов (Кулинский, 1999). При восстановлении кислорода одним электроном образуется супероксидный анион-радикал .- О2 , который не обладает сильными окислительными свойствами, имеет короткое время полужизни, но представляет большую опасность, поскольку является источником образования более активных АФК (Murphy, 2009). О2·- генерируется, в основном, комплексами I и III дыхательной цепи митохондрий. (Turrens, 1997). Применение ингибиторов данных комплексов, антимицина и ротенона, способствует генерации АФК, которые влияют на пролиферацию и ангиогенный потенциал ММСК из жировой ткани (Carriere, Fernandez, Rigoulet et al., 2003; Carriere, Ebrahimian, Dehez et al., 2009; 25 Murphy, 2009). Супероксид-анион также образуется в результате деятельности НАДФН-оксидаз путем переноса электрона с внутриклеточного НАДФН на внеклеточный кислород. Электрон при этом пересекает мембрану, поэтому О2.- накапливается вне клетки (Ткачук, ТюринКузьмин, Белоусов и др., 2012). В отличие от О2, заряженный супероксидный анион-радикал окружен молекулами воды, что не позволяет ему преодолеть гидрофобный мембранный барьер. Отмечается, что система НАДФН-оксидаз является главным источником АФК прогениторных клеток при действии ростовых факторов и гипоксии (Hu, Ramachandrarao, Siva et al., 2005; Garrido, Griendling, 2009; Kim, Park, Park et al., 2011). Гидропероксидный радикал (НО2·) – более сильный окислитель, чем О2.-. Он возникает при протонировании супероксидного анион-радикала в условиях закисления среды, при взаимодействии Н2О2 с органическими радикалами или О2.- (Владимиров, Арчаков, 1972). Вследствие отсутствия заряда НО2· свободно проникает через биологические мембраны, диффундирует между компартментами клетки, реагирует с ненасыщенными жирными кислотами (линолевой, линоленовой, арахидоновой), окисляя их до гидроперекисей, и некоторыми аминокислотами (гистидин, метионин и триптофан) (Reeder, Wilson, 2001). Пероксид водорода (Н2О2), наиболее стабильная молекула из всех АФК, может возникать в результате спонтанной дисмутации О2-·, но чаще всего эта реакция происходит с участием супероксиддисмутазы (Zelko, Mariani, Folz, 2002). Н2О2 хорошо растворим в воде и благодаря отсутствию заряда, как и НО2·, легко проходит сквозь биомембраны. Н2О2 может инактивировать некоторые ферменты, окисляя их тиоловые группы. Так, Cu/Zn- супероксиддисмутаза и Fe-супероксиддисмутаза инактивируются Н2О2. В присутствии ионов переходных металлов перекись водорода служит основой для образования высокоактивного гидроксильного радикала ОН·, обладающего наибольшей цитотоксичностью среди АФК (Владимиров, 2000). При взаимодействии с белками ОН· образует гидропероксиды, что приводит к нарушению ферментативной и регуляторной активности многих процессов в связи с возможным изменением третичной структуры белков, их агрегации и денатурации. Вследствие отсутствия заряда гидроксильный радикал способен проникать в толщу гидрофобного липидного слоя и вступать в химическое взаимодействие с полиненасыщенными жирными кислотами с образованием липидных радикалов, которые вступают в реакцию с растворенным в среде О2, образуя радикал липоперекиси (Донцов, Крутько, Мрикаев и др., 2006). Гидроксильный радикал также разрушает углеводные мостики между нуклетотидами, что приводит к однонитевым разрывам ДНК. Вследствие этого происходит активация поли(АДФрибоза)полимеразы, которая способствует быстрому поглощению НАД, прямым результатом чего является снижение уровня АТФ в клетке (Schraufstatter, Hinshaw, Hyslop et al., 1986). Однако, другие исследователи объясняют снижение количества АТФ ингибированием 26 гликолиза, поскольку показана Н2О2-индуцируемая инактивация глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы (Hinshaw, Burger, Delius et al., 1990). С гибелью клеток при обработке Н2О2 также хорошо коррелирует количество двунитевых разрывов ДНК (Prise, Davies, Michael, 1989), которые, по-видимому, являются критическим звеном в устойчивости клеток. Помимо этого показано, что Н2О2 может активировать такие транскрипционные факторы как NF-κB, AP-1 и p53, что может приводить к индукции апоптоза (Dayem, Choi, Kim et al., 2010). Синглетный кислород (*О2), как и пероксид водорода, генерируется при дисмутации супероксидных радикалов, а также в реакциях фотоокисления в присутствии фотосенсибилизаторов (флавины, гематопорфирин и т.д.). Это одна из наиболее реакционноспособных форм активированного кислорода. *О2 окисляет различные органические молекулы, включая липиды, белки, аминокислоты, нуклеотиды, углеводы, тиолы, фенолы и др., реагируя по двойной связи с образованием различных гидроперекисей. В присутствии металлов с переменной валентностью эти продукты запускают цепные реакции окислительной деградации биологических молекул с образованием липидных радикалов, пероксилов и гидропероксидов (Донцов и др., 2006). В последнее время возрастает интерес к производному кислорода – оксиду азота (NO) и особенно его радикалу (NO·). Оксид азота реагирует с супероксидным анион-радикалом О2.- и ионами металлов переменной валентности. Реакция взаимодействия NO· с О2.-приводит к генерации крайне токсичного пероксинитрита ONOO- и ОН·. Взаимодействие NO· с Fе, входящим в состав белков, вызывает изменение их структурно-функциональных свойств (Dobashi, Pahan, Chahal et al., 1997; Ulker, McMaster, McKeown et al., 2003; Донцов, 2006). При действии пероксинитрита ONOO- в клетке происходит увеличение интенсивности протекания процессов ПОЛ, окислительного повреждения ДНК и белков, активация матриксных металлопротеиназ и инактивация ряда ферментов (рис. 2). ONOO- также вызывает увеличение проницаемости мембран митохондрий и инактивацию митохондриальных ферментов, что приводит к снижению трансмембранного потенциала, продукции АТФ и выходу проапоптотических молекул (цитохрома с и апоптоз-индуцирующего фактора AIF). Непосредственной причиной гибели клеток путем некроза, вероятно, служит истощение пула АТФ, являющееся следствием чрезмерной активации поли(АДФ-рибозо)полимеразы PARP-1 в ответ на повреждение ДНК (Pacher, Schulz, Liaudet et al., 2005). 27 Митохондрии, НАДФН-оксидаза, Ксантиноксидаза ПОЛ, окисление, нитрование белков, инактивация ферментов, активация ММП L-аргинин Митохондрия Цитруллин Легкое Чрезмерное повреждение повреждение Цитоплазма Повреждение PARP-1 Разрывы инакт. ДНК Цитохром с Фрагментация ДНК Активация каспазы PARP-1 акт. Репарация Ядро Некроз Экспрессия генов Рис. 2. Молекулярные механизмы повреждения клетки, опосредованного действием пероксинитрита (ONOO-) согласно Pacher, Beckman, Liaudet (2007). При взаимодействии с биологическими молекулами в процессе пероксидации АФК образуют гидропероксиды ДНК, белков и липидов. В остатках полиненасыщенных жирных кислот АФК вызывают перекисное окисление липидов (ПОЛ) - цепные реакции с образованием липидных радикалов (L*), пероксилов (LOO*), гидропероксилов (LOOH) и алкоксилов (LO*). Окисление носит свободнорадикальный, цепной самоускоряющийся характер. Выделяют 4 стадии процесса: инициация, продолжение цепи, разветвление, обрыв цепи (Владимиров, 1987). При инициации цепи в слое биологических мембран образуются липидные радикалы (L*), которые вступает в реакцию с растворенным в среде молекулярным кислородом, образуя новый свободный радикал – радикал липоперекиси (LOO* ). Радикал LOO* атакует одну из соседних молекул фосфолипида с образованием гидроперекиси липида LOOH и нового радикала L*. Цепная реакция перекисного окисления липидов представляет собой чередование этих двух реакций. Существенное ускорение пероксидации липидов наблюдается в присутствии Fe2+. В этом случае происходит взаимодействия Fe2+ c гидроперекисями разветвление липидов. Цепь цепей обрывается в результате в результате 28 взаимодействия свободных радикалов с антиоксидантами, ионами металлов переменной валентности (Fe2+) или друг с другом. Ускорение процессов ПОЛ является одной из причин дестабилизации мембран. Образование диеновых коньюгатов, гидроксильных радикалов, гидроперекисей липидов вызывают конформационные изменения в комплексе фосфолипидов, что приводит к нарушению функций органоидов клеток (Хавинсон, Баринов, Арутюнян и др., 2003). Показано, что помимо повреждающего воздействия на клетку АФК выполняют сигнальную функцию (Thannickal, Fanburg, 2000; Зоров, Банникова, Белоусов и др., 2005; Hamanaka, Chandel, 2010; Bigarella, Liang, Ghaffari, 2014; Atashi, Modarressi, Pepper, 2015). Так, в 1976 г. White, Crawford, Patt et al. впервые обнаружили активацию гуанилатциклазы перекисью водорода. К настоящему времени получено множество данных, которые свидетельствуют об участии эндогенных АФК в клеточной пролиферации и дифференцировке (Finkel, 2003; Sarsour, Kumar, Chaudhuri et al., 2009; Sena, Chandel, 2012), регуляции клеточного цикла нормальных и опухолевых клеток (Гамалей, Полозов, Аксенов и др., 2001; Havens, Ho, Yoshioka et al., 2006). Также выявлено участие АФК в активации процессов пролиферации, миграции и паракринной активности ММСК из жировой ткани (Kim, Park, Park et al., 2011; Park, Kim, Xia et al., 2011; Kaewsuwan, Song, Kim et al., 2012; Kim, Park, Song et al., 2013) путем запуска PI3K/Akt и MAPK сигнальных путей. При этом Chang, Lee, Park (2013) обнаружили, что данные эффекты АФК также опосредуются через увеличение экспрессии miR-210. Во всех случаях авторы отмечают, что АФК выступают в роли сигнальных молекул только в низких концентрациях, не приводящих к повреждениям клеток, что диктует необходимость более детального изучения условий культивирования клеток с точки зрения адаптации к содержанию кислорода и развития окислительного стресса. 1.2.3. Антиоксидантная система защиты клетки Для предотвращения повреждений высокими концентрациями АФК в клетке функционирует антиоксидантная система, представляющая собой комплекс тонко организованных компонентов, состоящий из ряда ферментов и низкомолекулярных веществ (Кожевников, 1985; Demple, 1999). Согласованное действие ферментативного и неферментативного звеньев обеспечивает неспецифическую резистентность организма и адаптивные возможности к воздействию разнообразных по своей природе стрессовых факторов. Функция антиоксидантных ферментов заключается в поддержании стационарной концентрации перекисей и кислородных радикалов (рис. 3). Ферментативное звено разделяется на две группы: ферменты, инактивирующие супероксид анион-радикал, - супероксиддисмутаза (СОД), 29 ферроксидаза (церулоплазмин) и ферменты, разрушающие неорганические и органические перекиси, – каталаза, глутатионзависимые пероксидазы и трансферазы. К антиоксидантным ферментам относится также глутатионредуктаза, обеспечивающая восстановление компонента неферментативного звена антиоксидантной системы - глутатиона. ЭТЦ Окисление липидов Повреждение ДНК ЦТК Окисление белков Митохондрия Пентозофосфатный путь Лактат Гликолиз Глюкоза Рис. 3. Схематичная иллюстрация процессов генерации АФК в клетке и путей их элиминации согласно Kobayashi, Suda (2012). Мембранные липиды от перекисного окисления защищают -токоферол глутатионпероксидаза гидроперекисей фосфолипидов. Липидорастворимый и -токоферол обладает способностью восстанавливать радикалы липидов и в свою очередь регенерируется убихинолом в мембранах или водорастворимой аскорбиновой кислотой на границе цитозольмембрана. Селеносодержащий фермент глутатионпероксидаза гидроперекисей фосфолипидов (ГП4), использующий глутатион как источник восстановительных эквивалентов, относительно неселективен и способен восстанавливать гидроперекиси фосфолипидов и жирных кислот, пероксид водорода, пероксид холестерина и перекись тимина, защищая клетку от острого 30 окислительного стресса (Imai, Narashima, Arai et al., 1998; Takebe, Yarimizu, Saito et al., 2002; Андреев, Кушнарева, Старков, 2005). Особо важным компонентом эффективности ферментативного звена антиоксидантной системы является сбалансированность активности СОД, каталазы и пероксидазы. Супероксиддисмутаза (СОД, КФ 1.15.1.1) представлена семейством металлоферментов, которые являются важным компонентом антиоксидантной защиты, переводящим супероксидные радикалы О2.- в перекись водорода (Pervaiz, Taneja, Ghaffari, 2009). В некоторых работах СОД рассматривается даже как стресс-белок, синтезируемый в ответ на окислительный стресс (McCord, 1990). СОД характеризуется высокой структурной стабильностью и является одним из наиболее термостабильных глобулярных белков. Стабильность СОД связывают с тем, что в ее состав входит небольшое количество сульфгидрильных групп. Считают, что основным регулятором активности СОД в клетке является уровень О2.-, который выступает по отношению к ферменту в качестве индуцирующего фактора. Причем индукция СОД при повышении генерации О2.- связана с усилением синтеза фермента в клетке de novo. Супероксиддисмутаза кодируется генами SOD1 (цитоплазматическая, Cu, Zn-зависимая СОД1), SOD2 (митохондриальная, Mn-зависимая СОД2), SOD3 (внеклеточная СОД3) (Majima, Oberley, Furukawa et al., 1998; Fukai, Ushio-Fukai, 2011). Cu, Zn-СОД является гомодимером (32 kDa), в состав каждой субъединицы которого входит атом меди и цинка, связанные с белковой частью молекулы через гистидиновые остатки. Проведенные Seo, Kang, Cho et al. (1997) исследования показали, что данная изоформа фермента играет важную роль в замедлении процессов старения и появления мутаций, обусловленных действием окислительного стресса и других негативных факторов окружающей среды. Mn-СОД представляет собой гомотетрамер (96 kDa), содержащий на каждую субъединицу атом Mn, который изменяет свою валентность с III на II и обратно в процессе двуступенчатой дисмутации супероксида (Guan, Hickey, Borgstahl et al., 1998). Экстраклеточная изоформа СОД является крупным гомотетрамерным гликопротеином (135 кДа) с высокой аффинностью к таким гликозаминогликанам как гепарин и гепаран сульфат. Это единственный известный внеклеточный фермент, способный нейтрализовать О2.-. Индукция СОД3 регулируется с помощью цитокинов, а не в ответ на изменение концентрации ее субстрата и других оксидантов (Mates, 2000). Образованный в реакции дисмутации пероксид водорода элиминируется при действии глутатионпероксидазы (Cohen, Hochstein, 1963), пероксиредоксина (Hofmann, Hecht, Flohe, 2002) или каталазы (Michiels, Raes, Toussaint et al., 1994). Эти ферменты, используя в качестве 31 донора электронов H2O2 в случае каталазы или различные органические соединения в случае пероксидазы, катализируют двухэлектронное восстановление до H2O. Каталаза (КФ 1.11.1.6) представляет собой двухкомпонентный фермент - хромопротеид с молекулярной массой около 240 кДа, состоящий из 4-х субъединиц, каждая из которых содержит в качестве кофактора железопорфириновый комплекс. Каталазная активность в клетках животных и растений сосредоточена в основном в пероксисомах, которые содержат также ферменты, образующие перекись водорода (глюкозооксидаза, уратоксидаза и флавопротеиндегидрогеназа). Частично каталаза локализуется в микросомах и в меньшей мере в цитозоле. Полагают, что каталаза не имеет высокого сродства к Н2О2 и не может эффективно обезвреживать это соединение при низких концентрациях, имеющихся в цитозоле. В пероксисомах, где концентрация Н2О2 высока, каталаза, напротив, активно разрушает ее. Данный фермент играет важную роль в развитии адаптивных реакций клетки в ответ на окислительный стресс (Hunt, Sim, Sullivan et al., 1998). Каталаза относится к ферментам, которые наиболее длительно сохраняют высокую активность, а скорость реакции разложения пероксида водорода лимитируется лишь скоростью диффузии субстрата к активному центру каталазы (Liedias F., Rangel P., Hansberg, 1998). Каталаза также проявляет умеренную пероксидазную активность, то есть катализирует реакции окисления перекисью водорода различных доноров электронов, среди которых этанол, метанол и др. (Havir, McHall, 1989). Cеленсодержащие пероксидазы, к которым относится глутатионпероксидаза (ГП, КФ 1.11.1.9), способны катализировать восстановление различных гидропероксидов, тем самым защищая клетки от окислительного повреждения. У млекопитающих обнаружено несколько изоформ данного фермента. ГП1, обнаруженная в цитозоли и митохондриях, катализирует реакцию восстановления гидроперекисей жирных кислот и пероксида водорода с использованием глутатиона. ГП1 является Se-содержащим ферментом с молекулярной массой 80 кДа, состоящим из 4-х идентичных субъединиц, каждая из которых содержит остаток селеноцистеина (Ding, Liu, Zhu et al., 1998). Данная изоформа и глутатионпероксидаза гидроперекисей фосфолипидов (ГП4) обнаружены в большинстве тканей. Цитозольная изформа ГП2, внеклеточная ГП3 и селенонезависимая ГП5 детектируются слабо. В большинстве клеток млекопитающих около 70 % ГП локализовано в цитоплазме и около 30 % – в митохондриях (Cheng, Ho, Valentine et al., 1998). Таким образом, пероксид водорода, образующийся при действии пероксисомальных ферментов, удаляется содержащейся в пероксисомах каталазой, а в митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме Н 2О2 разрушается преимущественно под действием ГП. Глутатионпероксидаза обладает в 1000 раз 32 большим сродством к пероксиду водорода по сравнению с каталазой. В этой связи ГП рассматривают в качестве антиоксидантного фермента, имеющего первостепенное значение в защите клетки от постоянно образуемой перекиси водорода. Наряду с этим, ГП способна восстанавливать гидроперекиси жирных кислот, перекиси белкового и нуклеиновокислотного происхождения. В целом антиоксидантный эффект ГП проявляется в том, что они предотвращают продолжение цепей ПОЛ, с одной стороны, обезвреживая уже образовавшиеся гидроперекиси жирных кислот и предупреждая их образование путем расщепления Н 2О2 – с другой. Показано, что ГП главным образом защищает клетку от слабого окислительного стресса, в то время как каталаза действует при более интенсивной прооксидантной нагрузке (Yan, Harding, 1997). Тем не менее, в экспериментах на эмбриональных стволовых клетках мыши была установлена роль GPX1 как ключевого регулятора их самоподдержания (Wang, Liu, Wang et al., 2014). Функционирование ГП тесно сопряжено с работой глутатионредуктазы (ГР), регенерирующей GSH из GSSG. Они образуют единую глутатионовую антипероксидную систему, осуществляющую глутатионовый редокс-цикл (Ченас, Ракаускене, Кулис, 1989). Для функционирования ГР/ГП системы необходим постоянный приток кофермента НАДФН. Кроме того, НАДФН необходим также для поддержания активной конформации каталазы в условиях интенсификации окислительного стресса при развитии многих патологических состояний. Основными поставщиками данного кофермента являются глюкозо6-фосфатдегидрогеназная (Г6ФДГ-) и НАДФ-изоцитратдегидрогеназная (НАДФ-ИДГ)-реакции. Помимо каталазы и ГП в элиминации пероксида водорода участвуют пероксиредоксины. Представители данного семейства антиоксидантных ферментов обнаружены в цитоплазме и митохондриях, в зависимости от изоформы молекула пероксиредоксина содержит в активном центре один или два цистеиновых остатка (Ogasawara, Zhang, 2009). Регуляторные контуры про- и антиоксидантной систем в настоящее время могут быть выявлены с помощью разрабатываемых карт интерактома окислительного статуса (Золотухин, 2014). 1.2.4. Механизмы поддержания устойчивости ММСК к окислительному стрессу Показано, что стволовые клетки обладают довольно высокой устойчивостью к окислительному стрессу вследствие увеличенной экспрессии ряда антиоксидантных ферментов по сравнению с дифференцированными клетками (Dernbach, Urbich, Brandes et al., 2004). VallePrieto, Conget (2010) в экспериментах на ММСК помимо активности СОД, 33 глутатионпероксидазы и каталазы продемонстрировали высокий уровень глутатиона. Также показано, что в данном типе клеток на высоком уровне конститутивно экспрессируется метионин сульфоксид редуктаза А - фермент, катализирующий реакцию восстановления метионин-сульфоксидных модификаций белков (Salmon, Perez, Bokov et al., 2009). Более того, работы коллектива под руководством Kim W.S. свидетельствуют о том, что ММСК способствуют повышению устойчивости к окислительному стрессу клеток окружающих тканей (Kim, Park, Park et al., 2009; Kim, Park, Sung, 2009). В кондиционированной среде от ММСК из жировой ткани авторы обнаружили ряд белков, выполняющих антиоксидантные и антиапоптотические функции, среди которых супероксиддисмутаза, белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста IGF-BP, гранулоцит-колониестимулирующий фактор G-CSF, фактор роста тромбоцитов PDGF (Kim, Park, Kim et al., 2008). В ответ на окислительный стресс в стволовых клетках включаются сигнальные пути, в которые вовлечены такие транскрипционные факторы как HIF (Zhang, Ju, 2010). Кроме того, эмбриональные и взрослые стволовые клетки для генерации АТФ используют премущественно гликолиз, а отказ от окислительного фосфорилирования приводит к сокращению образования АФК (Simsek, Kocabas, Zheng et al., 2010; Folmes, Nelson, Martinez-Fernandez et al., 2011). 1.3. Роль HIF в функционировании ММСК, культивируемых при разном содержании О2 В настоящее время достигнут значительный прогресс в понимании механизмов клеточной чувствительности к содержанию кислорода в окружающей среде. Показано, что важную роль в ответе клетки на изменение содержания кислорода играет протеиновый комплекс, обладающий транскрипционной активностью – фактор, индуцируемый гипоксией (hypoxia-inducible factor – HIF) (Semenza, 1992; Patel, Simon, 2008; Lendahl, Lee, Yang et al., 2009). HIF представляет собой гетеродимер, в состав которого входит одна из трех существующих изоформ α-субъединицы (HIF-1α, HIF-2α или HIF-3α) и β-субъединица (HIF-1β) (см. обзоры Анохина, Буравкова, 2010; Keith, Johnson, Simon, 2012). В присутствии кислорода αсубъединица при участии подавляющего опухоль белка фон Хиппел-Линдау (von Hippel-Lindau tumor suppressor protein, pVHL) быстро убиквитинируется и расщепляется протеасомой. Протекание данного процесса обуславливается кислород-зависимым гидроксилированием высококонсервативных пролиновых остатков Pro-402 и Pro-564 ODDD-домена (oxygendependent degradation domain) α-субъединицы HIF. В условиях низкого содержания кислорода данная реакция практически не протекает, поэтому HIF-α накапливается и димеризуется с конститутивно экспрессируемой HIF-1β (Semenza, 2001; Schofield, Ratcliffe, 2004). Помимо 34 стабилизации и деградации α-субъединицы, регуляция функционирования HIF обеспечивается и на уровнях транскрипции, трансляции HIF-1α, ее транслокации в ядро, димеризации субъединиц, взаимодействия HIF с другими транскрипционными факторами, сборки полноценного транскрипционного комплекса и его взаимодействия с ДНК (Wenger, 2002; Koh, Spivak-Kroizman, Powis, 2008). Гены-мишени HIF кодируют белки, обеспечивающие функционирование клетки в анаэробных условиях, влияющие на жизнеспособность, миграцию и пролиферацию клеток, стимулирующие повышение содержания кислорода в ткани за счет стимуляции эритропоэза, ангиогенеза и регуляции тонуса сосудов (Анохина, Буравкова, 2010; Semenza, 2001; Koh, Spivak-Kroizman, Powis, 2008). Стабилизация HIF-1 способствует увеличению экспрессии и дальнейшей секреции VEGF (Rehman, Traktuev, Li et al., 2004; Kim, Park, Park et al., 2011). HIF-1 является регулятором генов, вовлеченных в процессы дифференцировки и ангиогенеза (Song, Chung, Sung, 2010). Более подробно внутриклеточные процессы, связанные с HIF, рассмотрены в ряде российских и зарубежный обзоров (Анохина, Буравкова, 2010; Wenger, Gassmann, 1997; Semenza, 2001; Pugh, Ratcliffe, 2003; Safran, Kaelin, 2003; Hellwig-Burgel, Stiehl, Wagner et al., 2005; Schofielda, Ratcliffeb, 2005; Ratcliffe, 2007; Weidemann, Johnson, 2008; Adams, Difazio, Rolandelli et al., 2009; Koh, Powis, 2012; Loboda, Jozkowicz, Dulak, 2012; Greer, Metcalf, Wang et al., 2012; Hu, Fu, Li et al., 2014). Имеющиеся данные свидетельствуют о роли HIF-1α и HIF-2α в поддержании плюрипотентности эмбриональных клеток, в частности, путем активации экспрессии OCT4 (Covello, Kehler, Yu et al., 2006; Hu, Iyer, Sataur et al., 2006; Forristal, Wright, Hanley et al., 2010). Показано участие HIF в регуляции гомеостаза стволовых клеток (Mohyeldin, Garzon-Muvdi, Quinones-Hinojosa, 2010; Suda, Takubo, Semenza, 2011), в частности сохранении гликолитических процессов в клетках на высоком уровне (Zhou, Choi, Margineantu et al., 2012; Takubo, Nagamatsu, Kobayashi et al., 2013). Более того, отмечена положительная регуляция экспрессии HIF-1α и HIF-2α при действии пируваткиназы (PKM2) (Luo, Hu, Chang et al., 2011). В недавних работах Kiani, Abdi, Halabian et al. (2014) было продемонстрировано, что повышенный уровень экспрессии HIF-1α в ММСК способствовал продукции c-kit лиганда, что при сокультивировании с гемопоэтическими стволовыми клетками выражалось в снижении количества колоний и уменьшении способности к дифференцировке последних. Тем не менее данные, касающиеся активации HIF в ММСК, малочисленны и противоречивы. Высокая экспрессия HIF-1α в ММСК выявлена при 20% кислорода (Palomaki S., Pietila M., Laitinen S. et al., 2013), в то время как другие авторы отмечают его высокий уровень только в условиях пониженного содержания кислорода (Wang, Wood, Trayhurn, 2008). В нашей лаборатории методами проточной цитофлуориметрии показано снижение уровня HIF1α в ММСК из костного мозга человека при культивировании в условиях 5% и 1% О 2 35 (Жамбалова, Гершович, Буравкова и др., 2009). В то же время не было обнаружено значимых изменений транскрипции HIF в ММСК из жировой ткани человека при длительном культивировании в условиях пониженного содержания кислорода (Buravkova, Andreeva, Rylova, 2011). 36 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Используемое оборудование, материалы и реактивы В работе использовали ламинарный шкаф (ВЛ22, Сампо, Россия), CO2-инкубатор (Sanyo, Япония), мультигазовый инкубатор (Sanyo, Япония), герметичную камеру (Stem Cell Technologies, Канада) с инвертированный микроскоп кислородным датчиком, световой фазово-контрастный Leica DM (Германия), флуоресцентный фазово-контрастный микроскоп Nikon Eclipse TiU (Nikon, Япония), оснащенный лампой Nikon Intensilight C-HGFI, наборами фильтров для анализа флуоресценции UV-2A (Ex 330-380, DM 400, BA420), DAPI (Ex 340-380, DM 400, BA 435-485), B-2A (ВР 450-490, DM 505, BA 520), FITC (ВР 465-495, DM 505, BA 515-555), Tex Red (ВР 540-580, DM 595, BA 600-660), камерой и системой анализа изображения NIS-elements (Nikon, Япония), конфокальный лазерный сканирующий микроскоп LSM 780 (Zeiss, Германия), оснащенный инкубационной камерой (5% СО2, 37°С), ксеноновой лампой Х-Сite 120, диодным (405 нм, 30 мВт) и аргоновым (488, 561 и 633 нм, 13 мВт) лазерами, наборами фильтров 488/561/633, 488 – 556 нм, 568 – 685 нм и объективом PlanApochromat 63x/1.40 Oil DIC M27, проточный цитофлуориметр Coulter Epics XL (Beckman Coulter, США), анализатор клеточного метаболизма XFe (Seahorse Bioscience, США), систему для измерения потребления кислорода во времени OxygraphPlus (Hansatech Instruments, Великобритания), люминометр TD-20/20 (Turner Design, США), спектрофотометр DU-530 (Beckman Coulter, США), планшетный ридер (Bio-Rad, США), BioPhotometer (Eppendorf, Германия), амплификаторы 2720 Thermal cycler (Applied Biosystems, США), Mx300P (Stratagene, США), ПЦР-бокс (BioSan, Латвия), центрифугу Eppendorf 5810 R (Германия), центрифугу Eppendorf 5417 R (Германия), вортекс-центрифугу (Elmi, Латвия), вортекс (Elmi, Латвия), водяную баню (BioSan, Латвия), термостат (Смоленское СКТБ СПУ, Россия), термостат «Термит» (НПО ДНК Технология, Россия), аналитические и прецизионные весы Adventure (Ohaus, Китай), установку импульсную ультрафиолетовую «АЛЬФА - 05» (Мелитта, Россия), миллипоровые фильтры (Millipore, США), автоматические пипетки (Eppendorf, Германия), гемоцитометр (Bright Line, США), сосуды Дьюара для жидкого азота (НПО Гелиймаш, Россия), холодильник (Indesit, Россия) и низкотемпературный холодильник (Sanyo, Япония). ММСК выращивали в чашках Петри диаметром 35 мм, 60 мм, 100 мм (Corning, США). Для пассирования клеток, смены и сбора среды культивирования использовали серологические пипетки и центрифужные пробирки различного объема (Nunc, Дания или Corning, США), а также микропробирки (Eppendorf, Германия) и наконечники для автоматических пипеток (Eppendorf, Германия). Криоконсервацию клеток проводили в криопробирках (Corning, США). 37 Для микроскопии были использованы покровные и предметные стѐкла MENZEL-GLÄSER (Gerhard Menzel GmbH, Германия). При анализе клеточных параметров с применением проточного цитофлуориметра использовали пробирки, рекомендуемые производителем прибора (Beckman Coulter, США). Для спектрофотометрических измерений пользовались оригинальными кюветами Beckman Coulter (США) и UVette® (Eppendorf, Германия). При выделении общей РНК, синтезе кДНК и проведении ОТ-ПЦР в реальном времени использовали наконечники с двойным фильтром (Eppendorf, Германия) и микропробирки (Axygen, США), рекомендованные для ПЦР и ПЦР в реальном времени. В работе использовали среду культивирования α-МЕМ (Gibco, США), фетальную бычью сыворотку (HyClone, США), раствор антибиотиков, содержащий 5000 Ед./мл пенициллина и 5000 мкг/мл стрептомицина (ПанЭко, Россия), 0,05% раствор трипсин-ЭДТА (Gibco, США), коллагеназу типа IA (Sigmа, США), PBS (ПанЭко, Россия), ДМСО (ПанЭко, Россия), 30% раствор Н2О2 (Sigmа, США), набор для приготовления клеточных лизатов M-PER Plus Halt Protease Inhibitor Cocktail Kit (Thermo Scientific, США), набор для определения жизнеспособности клеток Annexin V-FITC/PI (Immunotech, Франция), Na2HPO4, NaH2PO4 (Реахим, Россия), трихлоруксусную кислоту (Panreac, Испания), тиобарбитуровую кислоту (Merck, Германия), аммоний молибденовокислый (Реахим, Россия), нитросиний тетразолий, феназин метасульфат, НАДН восстановленный, реактив Эллмана (Sigma, США), ЭДТА (Santa Cruz, США), 2,7-дихлорфлуоресцеин диацетат (H2DCFDA) (Sigma, США), JC-1, MitoTracker Red FM, (все - Invitrogen, США), метанол (Merck, Германия), набор для определения уровня АТФ ATP bioluminescent somatic cell assay kit (Sigmа, США), этанол, хлороформ, изопропанол (ТОО Компонент, Россия), QIAzol Lysis Reagent (Qiagen, США), набор реагентов для синтеза кДНК на основе мРНК QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, США), набор для проведения ОТ-ПЦР в реальном времени RT2 - Real Time SYBR Green/ROX PCR master mix (Qiagen, США), «Набор реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green 1» (Синтол, Россия), набор для определения уровня экспрессии 84 генов, ассоциированных с гипоксией RT² Profiler™ PCR Array Human Hypoxia Signaling Pathway (Qiagen, США), набор для определения уровня экспрессии 84 генов, связанных с окислительным стрессом RT² Profiler™ PCR Array Oxidative stress (Qiagen, США), оптимизированные для метода ОТ-ПЦР в реальном времени пары праймеров QuantiTect Primer Assay HIF1α – кат. № QT00083664, HIF3A - кат. № QT00059157 и HPRT – кат. № QT00059066 (Qiagen, США). 38 2.2 Приготовление сред для культивирования ММСК 2.2.2 Приготовление ростовой среды ММСК культивировали в среде α-МЕМ, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и раствор антибиотика пенициллин/стрептомицин (конечная концентрация в среде составляла 50 ед/мл и 50 мг/мл соответственно). 2.2.3 Приготовление среды для криоконсервации клеток Среда для замораживания ММСК представляла собой эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС), содержащую 8% ДМСО. 2.3 Получение и культивирование ММСК из жировой ткани человека 2.3.1 Получение первичных культур ММСК и их дальнейшее культивирование Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки выделяли из образцов подкожножировой клетчатки, которые были предоставлены многопрофильной медицинской клиникой «Союз» согласно договору №25. Для получения первичной культуры ММСК использовали метод Zuk, Zhu, Mizuno et al. (2001) с модификациями (Буравкова, Гринаковская, Андреева и др., 2009). Выделение проводили в ламинарном боксе, в стерильных условиях. Образцы дважды промывали раствором фосфатно-солевого буфера (PBS). Для этого в 50 мл центрифужную пробирку помещали биоптаты жировой ткани и доводили объем пробирки PBS так, чтобы соотношение объема ткани и буфера было 1:2. Полученную смесь центрифугировали 10 мин при 1500 об/мин. Затем проводили ферментативную дезагрегацию ткани. Для этого жировую ткань взвешивали, добавляли раствор коллагеназы IA до конечной концентрации 0,075% и инкубировали 30 мин на водяной бане при 37°С, встряхивая каждые 5 минут. Затем фермент инактивировали равным объемом ростовой среды α-MEM, содержащей 10% ЭТС, и центрифугировали 10 минут при 1500 об/мин. Осадок ресуспендировали в ростовой среде и пропускали через 100-мкм клеточные фильтры. Полученную клеточную суспензию с плотностью 3х103 клеток на см2 высевали на чашки Петри, которые помещали в стандартные (5% СО2, 95% воздуха, 37°С, 100% влажность) или гипоксические (5% СО2, 5% или 1% О2, 90% 39 или 94% N2, 37°С, 100% влажность) условия. Через 24 часа неприкрепившиеся клетки удаляли, первичную культуру промывали PBS и добавляли свежую полную ростовую среду. ММСК пассировали при достижении монослоем 70-80% конфлуентности. Для этого из чашек Петри удаляли среду культивирования и дважды промывали клетки PBS. Для снятия клеток с поверхности пластика использовали раствор трипсин-ЭДТА, с которым инкубировали клетки при 37°С около 3 минут, периодически встряхивая чашку Петри в горизонтальной плоскости для перемешивания раствора трипсина и контролируя отлипание клеток от поверхности пластика под микроскопом. После открепления клеток действие трипсина ингибировали добавлением к клеточной суспензии избыточного количества среды культивирования, содержащей 10% ЭТС. Клетки тщательно ресуспендировали и переносили содержимое культуральной чашки в центрифужную пробирку. Суспензию клеток центрифугировали 5 минут при 1500 об/мин, осадок ресуспендировали в полной среде α-MEM и высевали на чашки Петри с плотностью 3х103 клеток/см2. Клетки подсчитывали с помощью гемоцитометра, используя формулу: количество клеток в 1 мл суспензии = среднее число клеток в центральном квадрате (1 мм2) x объем смеси x 10 000. По мере роста клеток процедуру повторяли. В работе использовали ММСК 2-6 пассажа со стабильной экспрессией HLA-ABC, CD105, CD73, CD90, CD54, CD106, CD9, не несущие CD45, СD31, СD34, CD62L, СD62Е, СD62P, CD117(c-kit) и HLA-DR. 2.3.2 Культивирование ММСК в условиях пониженного содержания кислорода Гипоксические условия создавали с помощью мультигазового инкубатора (Sanyo, Япония), поддерживающего содержание кислорода на уровне 5%, и герметичной камеры (Stem Cell Technologies, Канада), которую, после установки в нее чашек Петри с культивируемыми ММСК, продували газовой смесью (95% N2, 5% СО2) до установления концентрации кислорода в среде 1% и помещали в термостат (37°С). 2.3.3 Криоконсервация культивируемых ММСК Для замораживания ММСК отмывали от среды PBS, открепляли от поверхности пластика раствором трипсин-ЭДТА, инактивировали трипсин полной средой α-MEM и ресуспендировали клетки. Суспензию клеток переносили в пробирку, центрифугировали (5 минут, 1500 об/мин), супернатант сливали. К осадку, содержащему клетки (не менее 700 тыс.), добавляли 1 мл среды для замораживания, осторожно ресуспендировали и переносили в пробирки для 40 криоконсервации. Пробирки с суспензией клеток помещали на -20°С на 1 час, затем на -70°С на 24 часа. Длительное хранение клеток осуществляли в сосудах Дюара с жидким азотом. Клетки размораживали при комнатной температуре и отмывали от криопротектора, помещая в большой объем полной среды культивирования, затем центрифугировали (5 минут, 1500 об/мин) и отбирали супернатант. Добавляли к клеточному осадку необходимый объем полной среды, осторожно ресуспендировали и высевали на чашки Петри с плотностью 3х103 клеток/см2. 2.4 Моделирование окислительного стресса с помощью перекиси водорода Окислительный стресс моделировали добавлением в ростовую среду раствора перекиси водорода в PBS (диапазон конечных концентраций от 0,5 до 30 пМ/кл.). Через 24 ч от начала воздействия изучали жизнеспособность ММСК и вычисляли концентрацию Н 2О2, соответствующую LD5, LD15 и LD50. Далее основные параметры ММСК определяли через 24 ч от начала воздействия перекиси водорода в концентрациях LD5 и LD15. 2.5 Приготовление лизатов ММСК для оценки ферментативной активности Для определения активности ферментов и содержания ТБК-активных продуктов из ММСК готовили лизаты с помощью M-PER Plus Halt Protease Inhibitor Cocktail Kit. Клетки на чашках Петри дважды промывали PBS, и лизировали реагентом M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent с добавлением ингибиторов протеиназ Protease Inhibitor Coctail при 4°С. В полученных лизатах методом Бредфорд определяли содержание белка. Для приготовления реактива Бредфорд 5 мг кумасси G250 растворяли в 2,5 мл спирта, добавляли 5 мл ортофосфорной кислоты, доводили объем до 50 мл и фильтровали. Для проведения реакции брали клеточный лизат и реактив в соотношении 1:50, перемешивали пипетированием и измеряли оптическую плотность при 540 нм. 2.6 Характеристика ММСК из жировой ткани человека 2.6.1 Оценка жизнеспособности ММСК Жизнеспособность ММСК оценивали по количеству апоптотических и некротических клеток методом проточной цитофлуориметрии с использованием набора Annexin V-FITC/PI согласно инструкции производителя. 41 Аннексин V, меченый FITC, в присутствии ионов Са2+ и Mg2+ взаимодействует с фосфатидилсерином, который в норме находится во внутреннем слое фосфолипидного бислоя мембран клеток, а при апоптозе, когда клетка теряет способность поддерживать ассиметричность локализации мембранных фосфолипидов, перемещается во внешний монослой. Некротические клетки определяли за счет связывания с пропидия йодидом, который при необратимом повреждении клетки проходит через клеточную мембрану и взаимодействует с малой бороздкой ДНК. Для проведения анализа жизнеспособности исследуемую культуру клеток (не менее 100 тысяч на пробу) дважды отмывали от среды культивирования PBS, открепляли от пластика раствором трипсин-ЭДТА, инактивировали трипсин двойным объемом полной среды, ресуспендировали клетки и переносили в пробирку для проточного цитофлуориметра. Далее клетки центрифугировали 5 минут при 1500 об/мин, удаляли супернатант и добавляли 100 мкл предварительно разведенного холодного связывающего буфера, 5 мкл пропидия йодида, 1 мкл аннексина. Пробы инкубировали 10 минут при 4°С, затем в каждую добавляли 400 мкл однократного связывающего буфера, ресуспендировали и анализировали на проточном цитофлуориметре. 2.6.2 Функционирование прооксидантной системы клеток 2.6.2.1 Содержание в клетках активных форм кислорода Для детекции активных форм кислорода в ММСК использовали 2ʹ7ʹ-дихлорфлуоресцеин диацетат, который пассивно диффундирует через мембрану, внутри клетки при действии эстераз гидролизуется и окисляется внутриклеточными активными формами кислорода с образованием флуоресцирующего продукта, который может быть визуализирован. Для окрашивания клеток H2DCFDA, растворенный в ДМСО, вносили в среду культивирования ММСК в конечной концентрации 20 µM. Инкубацию проводили в течение 30 мин при 37°С и в соответствующей газовой среде. Клетки дважды промывали PBS, снимали с чашек Петри раствором трипсин-ЭДТА, ингибировали трипсин избыточным количеством среды культивирования, клеточную суспензию переносили в пробирки, центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Среду сливали, к осадку добавляли 400 мкл PBS, ресуспендировали и анализировали клетки на проточном цитофлуориметре. Количество АФК на клетку определяли по средней интенсивности флуоресценции. 42 2.6.2.2 Содержание в ММСК ТБК-активных продуктов Для определения уровня ТБК-активных продуктов (Ko, Godin, 1990) в микропробирку с крышкой к 500 мкл клеточного лизата добавляли 300 мкл 20% раствора ТХУ и 500 мкл 0,5% раствора ТБК. В контрольной пробе клеточный лизат заменяли аналогичным объемом лизисбуфера. Смесь нагревали при 95 °С в течение 30 минут с помощью термостата «Термит» (НПО ДНК-Технология, Россия), охлаждали при комнатной температуре и центрифугировали в течение 5 минут при 12 000 g. Оптическую плотность опытных образцов измеряли при длинах волн 532 и 585 нм относительно контрольной пробы. Концентрацию ТБК-активных продуктов выражали в мкмоль МДА/мг белка, используя коэффициент молярной экстинкции комплекса малоновый диальдегид - ТБК (1,56*105 М-1см-1). 2.6.3 Функционирование антиоксидантной системы ММСК 2.6.3.1 Определение активности каталазы Активность каталазы (КФ 1.11.1.6) определяли с помощью методики Королюка, Ивановой, Майоровой (1988). Реакцию запускали добавлением 0,1 мл лизата ММСК к 1 мл 0,03% раствора перекиси водорода. В холостой пробе лизат заменяли 0,1 мл дистиллированной воды. Реакцию останавливали через 10 минут добавлением 1 мл 4% раствора молибдата аммония. Интенсивность развивающейся окраски измеряли на спектрофотометре при длине волны 410 нм против контрольной пробы, в которую вместо перекиси водорода вносили 1 мл воды. Активность фермента выражали в мкМ Н2О2/мин. на 1 мкг клеточного белка, используя коэффициент миллимолярной экстинкции Н2О2 (22,2*103 мМ-1см-1). 2.6.3.2 Определение активности супероксиддисмутазы Активность супероксиддисмутазы (КФ 1.15.1.1) определяли по ингибированию скорости восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) в неэнзиматической системе феназинметасульфата (ФМС) и НАДН (Матюшин, Логинов, Ткачев, 1991). Лизат ММСК вносили в количестве 10 мкл на 300 мл среды инкубации, состоящей из 0,1 М фосфатный буфера (рН 7,8), 0,33 мМ ЭДТА, 0,41 мМ НСТ, 0,01 мМ ФМС и 0,8 мМ НАДН. Реакцию запускали добавлением НАДН и регистрировали прирост оптической плотности за 5 мин. при длине волны 540 нм. За единицу активности СОД принимали количество фермента, необходимого для 50%-го ингибирования восстановления НСТ. Расчет вели по формуле: 43 E = (100 - E0 * 100 / Ek) / 50 * мкг белка, где E0 и Ek – среднее значение прироста экстинции за 1 мин. в опытной и контрольной пробах соответственно. Активность СОД выражали в усл. ед. на 1 мкг белка. 2.6.3.3 Определение активности глутатионпероксидазы Для определения активности глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9) в две микропробирки вносили 25 мкл лизата и 25 мкл 31,88 мМ раствора восстановленного глутатиона. Полученную смесь инкубировали 5 мин при 37 °С. Затем в опытную пробирку добавляли 5 мкл 13,8 мМ раствора Н2О2, встряхивали на вортексе и оставляли в термостате. Через 1 мин в контрольную и опытную пробы добавляли по 0,1 мл холодного 10% раствора ТХУ, после чего в контрольную пробирку добавляли 5 мкл 13,8 мМ раствора Н2О2. Обе пробирки встряхивали и помещали в холодильник на 10 мин, затем центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин и 4°С. К 50 мкл надосадочной жидкости добавляли по 1 мл фосфатного буфера (pH 8,0), 5 мкл реактива Эллмана, тщательно перемешивали и измеряли оптическую плотность опытной пробы по сравнению с контрольной при 412 нм. Для определения скорости неферментативного окисления восстановленного глутатиона исследовали пробы, в которые вместо лизата добавляли аналогичный объем дистиллированной воды. 2.6.4 Оценка функционального состояния митохондрий ММСК 2.6.4.1 Выявление митохондрий и характеристика их трансмембранного потенциала Выявление митохондрий и определение в них трансмембранного потенциала осуществляли с помощью митотрекеров JC-1 и Mitotracker Red FM, растворенных в ДМСО. Флуоресцентные красители вносили в среду культивирования ММСК в конечной концентрации 5 мкM (JC-1) и 500 нМ (Mitotracker Red FM), инкубировали в течение 30 мин при 37°С в соответствующей газовой среде и дважды промывали PBS. JC-1 использовали в экспериментах с анализом живых ММСК на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе в среде для культивирования. Для изучения трансмембранного потенциала митохондрий ММСК методом проточной цитофлуориметрии применяли Mitotracker Red FM. Клетки снимали с чашек Петри раствором трипсин-ЭДТА, ингибировали трипсин избыточным количеством среды культивирования, клеточную суспензию переносили в пробирки, центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Среду сливали, к осадку добавляли 400 мкл PBS, ресуспендировали и анализировали. 44 Величину трансмембранного потенциала ММСК определяли по средней интенсивности флуоресценции. Данные конфокальной микроскопии получены совместно с д.м.н. С.В. Буравковым (ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова). 2.6.4.2 Оценка интенсивности дыхания ММСК Интенсивность клеточного дыхания ММСК анализировали с помощью системы для измерения потребления кислорода OxygraphPlus. Клетки, снятые с чашек Петри в количестве 4 млн центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин, ресуспендировали в 300 мкл среды культивирования и помещали в ячейку прибора. В течение 3-4 мин измеряли уровень базального дыхания, затем добавляли 5 мкМ разобщителя окислительного фосфорилирования СССР и оценивали максимальную скорость дыхания ММСК. Анализатор клеточного метаболизма XFe Seahorse Bioscience был использован для более детального изучения процессов дыхания в ММСК. Исследовали скорость потребления кислорода клетками, посаженными на специализированные 96-луночные планшеты XF96 V3 PS Cell Cultire Microplates. На начальном этапе записывали уровень базального дыхания, добавляли олигомицин и оценивали вклад митохондриального дыхания в синтез АТФ (разница между базовым дыханием и дыханием в присутствии олигомицина). Затем оценивали скорость максимального дыхания после добавления СССР и немитохондриальное потребление кислорода после воздействия антимицина. Добавление антимицина, который блокирует дыхательную цепь, дает возможность изучить дыхание, необходимое на поддержание мембранного потенциала, не расходуемого на синтез АТФ. Для этого вычитали из скорости дыхания в присутствии олигомицина скорость дыхания в присутствии антимицина. 2.6.4.3 Определение уровня АТФ Уровень АТФ в клетках оценивали с использованием набора ATP bioluminescent somatic cell assay kit. ММСК снимали с чашек Петри раствором трипсин-ЭДТА, ингибировали трипсин избыточным количеством среды культивирования, клеточную суспензию переносили в пробирки, центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Среду удаляли, к осадку добавляли 2 мл PBS, осторожно ресуспендировали, подсчитывали в гемоцитометре количество клеток, повторно центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. После удаления супернатанта осадок лизировали с помощью Somatic Cell ATP Releasing Reagent и смешивали с эквивалентным объемом ATP Assay Mix, содержащим люциферазу и люциферин. Пробы 45 быстро вортексировали и анализировали с помощью люминометра. Результаты количественного содержания АТФ оценивали с использованием калибровочной кривой. Результаты экспериментов по определению уровня АТФ и параметров клеточного дыхания получены совместно с д.б.н. В.Г. Гогвадзе (ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова). 2.7 Определение уровня экспрессии генов в ММСК 2.7.1 Выделение тотальной РНК, обратная транскрипция Выделение тотальной РНК проводили с использованием лизирующего реагента QIAzol. Клетки дважды промывали PBS, лизировали на чашке Петри добавлением 500 или 300 мкл реактива в зависимости от диаметра чашки (100 или 60 мм соответственно) и выдерживали 5 минут при комнатной температуре для улучшения диссоциации нуклеопротеиновых комплексов. Лизаты переносили в микропробирки и добавляли 100 мкл хлороформа на 500 мкл реагента QIAzol, взятого для лизиса (далее количество добавляемых реагентов также рассчитывается исходя из этого объема), интенсивно встряхивали в течение 15 с и оставляли при комнатной температуре на 2-3 минуты. Далее органическую и водную фазы разделяли центрифугированием (12000 об/мин, 15 мин, 4°С), во время которого денатурированный белок собирался в интерфазе. Верхнюю (водную) фазу переносили в новую микропробирку и добавляли 250 мкл изопропанола, вортексировали, оставляли при комнатной температуре на 10 мин и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин при 4°С. Осторожно удаляли супернатант, к гелеобразному осадку РНК добавляли 0,5 мл 75% этанола и центрифугировали (7500 об/мин, 5 мин, 4°С). Полностью удаляли супернатант, РНК сушили в открытой пробирке, а затем растворяли воде, свободной от РНКаз. Выход и чистоту препарата РНК оценивали по поглощению разбавленной пробы при 260 и 280 нм. Получение кДНК на основе выделенной РНК в реакции обратной транскрипции осуществляли с помощью набора QuantiTect Reverse Transcription Kit. Для элиминации геномной ДНК к 1 мкг РНК, растворенной в 12 мкл деионизированной воды, добавляли 2 мкл gDNA Wipeout buffer и инкубировали 5 мин при 42°С. Далее в смесь добавляли 1 мкл QuantyScript Reverse Transcriptase, 4 мкл QuantyScript RT Buffer и 1 мкл смеси праймеров RT Primer mix. Реакция обратной транскрипции производилась в течение 30 мин при 42°С, после чего обратную транскриптазу QuantyScript Reverse Transcriptase инактивировали 4 минуты при 95°С. 46 2.7.2 Определение уровня экспрессии генов ММСК, ассоциированных с гипоксией и окислительным стрессом Для определения уровня экспрессии генов, ассоциированных с гипоксией и окислительным стрессом, в ММСК использовали наборы RT² Profiler™ PCR Array Human Hypoxia Signaling Pathway и RT² Profiler™ PCR Array Oxidative stress. Для проведения ОТ-ПЦР в реальном времени использовали RT2 - Real Time SYBR Green/ROX PCR master mix. Конечный объем реакционной смеси составлял 25 мкл, количество кДНК в пересчете на одну реакцию – 500 нг. Реакционная смесь переносилась в планшеты RT² Profiler™ PCR Array с иммобилизованными лиофилизированными праймерами. Стадии реакции приведены в таблице 2. Для нормализации результатов исследования использовались хаускиппинг-гены (ACTB, B2M, HPRT1, RPLP0), входящие в состав наборов. Табл. 2. Стадии ОТ-ПЦР при использовании RT² Profiler™ PCR Array. Количество циклов Стадия Продолжительность Температура 1 Денатурация 5 мин 95°С 40 Денатурация 20 сек 95°С Отжиг праймеров и 60 сек 60°С элонгация 2.7.3 Определение уровня экспрессии генов HIF-1α и HIF-3α Для определения уровня экспрессии генов HIF-1α и HIF-3α использовали набор реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green 1. Конечный объем смеси для одной реакции составлял 25 мкл, из которой 10 мкл – 2,5x реакционная смесь, содержащая KCl, ТрисHCl (pH 8,8), 6,25 мМ MgCl2, Taq ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, глицерол, Tween 20, 1 мкл – 25 мМ MgCl2, 2,5 мкл – пары праймеров QuantiTect Primer Assay HIF1α, HIF3A или HPRT (10x раствор), остальное – 500 нг кДНК, растворенной в деионизированной воде. Параметры реакции приведены в таблице 3. 47 Табл. 3. Стадии ОТ-ПЦР при определения уровня экспрессии генов HIF1A и HIF3A. Количество циклов Стадия Продолжительность Температура 1 Денатурация 7 мин 95°С 40 Денатурация 20 сек 94°С Отжиг праймеров 30 сек 57°С Элонгация 30 сек 72°С Ген гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (HPRT) был использован в качестве хаускиппинг-гена для определения относительного значения изменения уровня экспрессии HIF-1α и HIF-3α, т. к. в условиях длительной гипоксии экспрессия традиционно используемых генов «домашнего хозяйства», к примеру GAPDH, может измениться. Специфичность проводимой реакции определялась с помощью анализа кривой плавления продуктов амплификации в диапазоне от 55°С до 95°С с шагом в 1 градус. 2.9 Статистическая обработка результатов Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica 7.0. В качестве характеристик полученных выборок использовали среднее, стандартное отклонение и стандартную ошибку среднего. Для оценки относительного уровня экспрессии HIF-1α использовали метод 2-∆∆Ct. Достоверность различий между группами оценивали на основе критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при p ≤ 0,05. Обработка данных, полученных в экспериментах с использованием наборов RT² Profiler™ PCR Array, осуществлялась с помощью программного обеспечения, доступного на сайте производителя (http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php). 48 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Характеристика ММСК при культивировании в условиях различного содержания кислорода (20%, 5%, 1%) 3.1.1. Жизнеспособность На первом этапе исследований была проведена оценка повреждающего действия различного уровня содержания кислорода на ММСК. Жизнеспособность оценивали с помощью пропидия йодида (PI), проникающего в поврежденные некротические клетки и взаимодействующего с ДНК, и аннексина V (Annexin V-FITC), аффинного к фосфатидилсерину, который в процессе апоптоза локализуется на клеточной поверхности и формирует один из специфичных сигналов для распознавания данного пути гибели клеток. Двойное окрашивание клеток свидетельствует о возможности переключения с апоптоза на постапоптотический некроз. Проведенный анализ жизнеспособности ММСК не выявил достоверных отличий между клетками, постоянно культивируемыми при 20%, 5% и 1% кислорода (табл. 4). Таблица 4. Жизнеспособность ММСК при постоянном культивировании в среде с различным содержанием кислорода. Представлено количество живых (AnnV-PI-), апоптотических (AnnV+PI-), некротических (AnnV-PI+) и клеток в состоянии постапоптотического некроза (AnnV+PI+), M±m, n=7. AnnV-PI-, % AnnV+PI-, % AnnV-PI+, % AnnV+PI+, % 20% 92,17±1,55 2,56±0,81 3,40±1,39 1,88±0,47 5% 93,30±1,55 2,87±1,54 2,82±0,41 1,00±0,25 1% 93,68±1,06 3,58±0,90 1,04±0,39 1,71±0,53 Содержание О2 в среде культивирования Полученные данные согласуются с результатами других авторов. В частности, Fehrer, Brunauer, Laschober et al. (2007) показали, что ММСК из костного мозга сохраняют одинаковую жизнеспособность (порядка 86-90%) при постоянном культивировании в условиях 20% и 3% О2. Mathew, Rajendran, Gupta et al. (2013) также не обнаружили значительных изменений доли живых клеток-предшественников при 20% и 2-2,5% кислорода. В этом случае данный параметр достигал 95-98,3% предшественников. для ММСК из плаценты и 96,4-98,9% для костномозговых 49 Тем не менее, известны данные, свидетельствующие о том, что низкое содержание кислорода при культивировании in vitro может оказывать как проапоптотический, так и антиапоптотический эффект на мультипотентные стромальные клетки. Показано, что антиапоптотический эффект наблюдается в ММСК при низком содержании кислорода благодаря активации гипоксия-индуцируемого транскрипционного фактора NF-B, что приводит к увеличению экспрессии IAP-2, который способствует подавлению транслокации Bax (Dong, Wang, Yu et al., 2003; Greijer, Wall, 2004). Также устойчивость к апоптозу может поддерживаться за счет PI3K/Akt сигнального пути посредством индукции NF-B и предотвращения образования гетеродимеров Bad-Bcl-xL (Greijer, Wall, 2004). С другой стороны, проапоптотическое действие может быть обусловлено активацией JNK киназы (Teraishi, Wu, 2005; Harada, Nakamura, 2006), повышением проницаемости внутренней мембраны митохондрий, что приводит к выходу цитохрома С, ингибированием дыхательной цепи, переноса протонов и снижением трансмембранного потенциала. Стоит отметить, что данных о снижении жизнеспособности ММСК при длительном воздействии гипоксии очень мало. В наших экспериментах доля неповрежденных клеток в культурах во всех случаях превышала 90%, что отражает высокую устойчивость ММСК к широкому диапазону содержания кислорода в среде культивирования и подтверждает ранее полученные в нашей лаборатории результаты (Буравкова Л.Б., Гринаковская О.С., Андреева Е.Р. и др., 2009). 3.1.2. Активность прооксидантной системы 3.1.2.1. Содержание АФК При культивировании клеток в диапазоне содержания кислорода от 20% до 1%, была проведена оценка уровня внутриклеточных АФК, поскольку известно, что они постоянно образуются в клетках как продукты нормального метаболизма О2 и могут выполнять регуляторную функцию, если их содержание не превышает пороговых значений (Suzuki, Forman, Sevanian, 1997). С другой стороны, избыточное образование АФК может приводить к активации ПОЛ и повреждению внутриклеточных органелл. Определение содержания цитофлуориметрии Липофильный с АФК помощью DCFH2-DA в ММСК было проведено 2,7-дихлорфенилфлуоресцеин диффундирует через клеточную методом диацетата мембрану, проточной DCFH2-DA. при действии внутриклеточных эстераз деацетилируется с образованием DCFH2. DCFH2, для которого в отличие от предшествующего соединения мембрана является непроницаемой, реагирует с 50 внутриклеточными АФК, результатом чего является образование флуоресцентного продукта DCF (Rosenkranz, Schmaldienst, Stuhlmeier et al., 1992; Rota, Fann, Mason, 1999; Chen, Zhong, Xu et al., 2010). DCFH2-DA позволяет детектировать такие виды АФК как Н2О2, ОН·, пероксинитрит (ONOO-), *О2 (Zhu, Bannenberg, Mold et al., 1994; Myhrea, Andersena, Aarnesc et al., 2003; Chen, Zhong, Xu et al., 2010). Определение содержания АФК в ММСК не показало достоверных различий между клетками, постоянно культивируемыми в условиях 20%, 5% и 1% О2, однако при этом наблюдалась тенденция к увеличению их содержания при повышенном и пониженном О2 по 5% O2 1% O2 76 Число клеток сравнению с условиями, близкими к физиологическим (5% О2) (Рис. 4). 20% O2 0 1000 Интенсивность флуоресценции Рис. 4 Содержание АФК в ММСК при постоянном культивировании в среде с различным содержанием кислорода (H2DCFDA, проточная цитофлуориметрия). Данные репрезентативного эксперимента, n=6. Guzy и Schumacker (2006) отмечают, что увеличение количества активных форм кислорода в клетках в гипоксических условиях культивирования имеет важное значение. В этом случае они выступают в роли сигнальных агентов, выполняя различные функции, в том числе активацию генной экспрессии путем стабилизации HIF- (Schofield, Ratcliffe, 2005). Кроме того, анализ 51 литературных данных показал, что в условиях низкого содержания кислорода (от 5% и менее) in vitro в ММСК также может происходить увеличение уровня активных форм кислорода по сравнению с клетками при атмосферном О2 (Lee, Lee, Song et al., 2010; Kim, Park, Park et al., 2011). Стоит отметить, что в данных экспериментах было использовано кратковременное снижение содержания кислорода, а также среда культивирования без добавления или с низким содержанием эмбриональной телячьей сыворотки. Поскольку отсутствие в среде факторов роста является для клеток стрессором и может стимулировать рост продукции АФК, нами была проведена дополнительная серия экспериментов с кратковременным культивированием ММСК в среде без сыворотки. Оценка проводилась относительно уровня АФК в контрольных ММСК, культивируемых в аналогичных по содержанию О2 условиях и среде культивирования с 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Показано, что сывороточная депривация, а не пониженное содержание кислорода является основным фактором, способствующим активной продукции АФК (рис. 5), что может быть обусловлено отсутствием цитопротекторного действия альбумина или регуляцией аутофагии (Liu, Chen, Yang et al., 2012). Во всех случаях при удалении из среды ЭТС наблюдалось более чем двукратное увеличение содержания АФК в клетках. При этом в условиях повышенного содержания кислорода (20%) в клетках через 6 ч наблюдались наиболее значительные изменения, которые усилились с течением времени. При 5% О2 выявлено наименьшее возрастание уровня АФК в клетках, незначительно изменившееся через 24 ч. В условиях пониженного содержания кислорода (1%) на начальном этапе обнаружено наиболее заметное по сравнению с 5% и 1% кислорода увеличение данного параметра. Интересно, что через 24 ч уровень АФК снижался. При снижениии содержания кислорода было установлено, что при 5% и 1% О2 в условиях 24-часовой сывороточной депривации наблюдается тенденция к уменьшению интенсивности образования активных форм кислорода по сравнению с клетками при атмосферном О2 (рис. 6). При аналогичных условиях в полной среде не наблюдалось изменения содержания АФК за исключением клеток при культивирования в условиях 5% кислорода в течение 24 ч. 16 14 12 10 * *# 8 6 4 2 0 * ч 6 от к и и сы во р бе з 1% бе з сы во р от к и от к 1% 24 ч ч 24 6 и 5% 20 сы во р сы во р от к и % 5% бе з от к сы во р бе з бе з % 20 ч ч 24 6 и от к сы во р ыв о ро тк ой ч с сс % 20 * * * бе з Уровень АФК в ММСК по сравнению с контролем, кратность отличий 52 Условия культивирования Рис. 5. Уровень АФК в ММСК в условиях различного содержания кислорода при сывороточной депривации. Данные представлены в виде M±m, n=3. * - p≤0,01 относительно содержания АФК в контрольных ММСК # - p≤0,05 относительно изменения содержания АФК в ММСК при аналогичном воздействии в 16 14 12 10 8 6 4 2 0 * * * * % -5 % бе 24 зс 20 ч % ыв -5 ор % о тк бе и зс 6 ыв ч ор от ки 24 ч 20 % -1 % 6 20 ч 20 % % -1 -1 % % бе 24 зс 20 ч % ыв -1 ор % о тк бе и зс 6 ыв ч ор от ки 24 ч ч % -5 % 20 % -5 % 6 24 20 от ки сы во р 20 20 % бе з сы во р от ки 6 ч ч * бе з % 20 * * 20 % Содержание АФК в ММСК, кратность отличий условиях 5% О2 Условия культивирования Рис. 6. Содержание АФК в ММСК при кратковременном изменении содержания кислорода с 20% до 5%, 1% и сывороточной депривации. Данные представлены в виде M±m, n=3. * - p≤0,01 относительно содержания АФК в ММСК при 20% О2 53 Схожие данные были получены в экспериментах на ММСК, выделенных из Вартоновского желе пупочного канатика. Majumdar, Bhonde, Datta (2013) показали, что данные клетки являются более чувствительными к сыворочной депривации, чем к парциальному напряжению кислорода в среде. В данной работе также не было выявлено изменения содержания АФК при культивировании в условиях 21% и 2% О2. Увеличение значений данного показателя наблюдалось только в условиях сывороточной депривации и имело временную зависимость. 3.1.2.2. Содержание ТБК-активных продуктов Принято считать, что важную роль в функционировании клеток млекопитающих играет свободнорадикальное (перекисное) окисление липидов. По-видимому, это связано с тем, что АФК имеют наиболее высокую константу взаимодействия с полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК), являющимися основным структурным компонентом фосфолипидов мембран (Владимиров, Арчаков, 1972). Об интенсивности процессов ПОЛ косвенно можно судить по количеству ТБК-активных продуктов. Первичные продукты ПОЛ (гидроперекиси липидов) нестойкие и довольно быстро разрушаются с образованием вторичных продуктов ПОЛ: альдегидов, кетонов, спиртов, эпоксидов. Среди них наиболее известен малоновый диальдегид, составляющий основной компонент группы так называемых ТБК-активных веществ (взаимодействующих с тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного продукта). В литературе встречаются данные, свидетельствующие о том, что ММСК способствуют снижению уровня ПОЛ в клетках окружающих тканей при различных патологиях (Bozhkov, Klimova, Nikitchenko et al., 2014), однако отсутствует информация о протекании перекисного окисления липидов в самих прогениторных клетках. В нашей работе в ММСК при 20%, 5% и 1% О2 определяли содержание ТБК-активных продуктов. Наименьшая их концентрация была обнаружена при культивировании клеток в условиях 5% содержания кислорода (рис. 7). В клетках при 20% О2 данный показатель составлял 0,57±0,14 мкМ МДА/мг белка. Полученные данные не противоречат результатам по изучению уровня АФК в ММСК, представленным выше, и указывают на некоторое снижение уровня окислительного стресса при культивировании клеток в условиях 5% кислорода. Содержание ТБК-активных продуктов в ММСК, кратность отличий 54 2 1,5 1 * 0,5 0 20% 5% 1% Содержание кислорода в среде культивирования Рис. 7. Содержание ТБК-активных продуктов в ММСК при постоянном культивировании в среде с различным содержанием кислорода. Данные представлены относительно 20% О2 в виде M±m, n=3. * - p≤0,01 относительно величины содержания ТБК-активных продуктов в ММСК при 20% О2 3.1.3. Функционирование антиоксидантной системы. Активность каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы В литературе встречаются работы, посвященные влиянию стромальных прогениторов на устойчивость дифференцированных клеток к окислительному стрессу. Как показано Liu, Huang, Lee et al. (2010), под действием кондиционированной среды от ММСК плаценты через активацию STAT3 происходит увеличение экспрессии гена SOD2 в эндотелиальных клетках. При этом отсутствует информация о защитных механизмах при окислительном стрессе в самих ММСК. В нашей работе изучение ферментов системы антиоксидантной защиты, как и в экспериментах по анализу ТБК-активных продуктов, выявило некоторые отличия их активности в ММСК при культивировании в условиях 5% О2 по сравнению с клетками в 20% О2 и 1% О2 (табл. 5). Было обнаружено снижение уровня активности СОД, катализирующей реакцию дисмутации супероксид-анион-радикала с образованием молекулярного кислорода и Н2О2 (Zelko, Mariani, Folz, 2002). Активность каталазы, ускоряющей реакцию двухэлектронного восстановления Н2О2 до Н2О, достоверно не изменялась, однако, в целом сохранялась тенденция к ее уменьшению. Уровень ГП, катализирующей реакцию восстановления 55 гидроперекиси с помощью глутатиона, был понижен. Отметим, что наряду с указанной функцией ГП способна восстанавливать гидроперекиси жирных кислот и перекиси белкового происхождения. Таблица 5. Активность ферментов антиоксидантной системы в ММСК при культивировании в условиях различного содержания О2. Данные представлены в виде M±m, n=3. Фермент 20% О2 5% О2 1% О2 Каталаза (КФ 1.11.1.6), 5,86±0,92 4,65±0,79 5,97±0,99 0,077±0,004 0,057±0,001* 0,065±0,002 0,0038±0,0001 0,0026±0,0003* 0,0037±0,0001 мкМ Н2О2/минмкг белка СОД (КФ 1.15.1.1), у.е./мкг белка ГП (КФ 1.11.1.9), мкМ восстановленного глутатиона/ минмкг белка * - p≤0,01 относительно активности ферментов в ММСК при 20% и 1% О2 3.1.4. Функциональное состояние митохондрий ММСК 3.1.4.1 Характеристика трансмембранного потенциала Изучение функционального состояния митохондрий ММСК проводили с использованием специфических потенциал-зависимых флуоресцентных красителей JC-1 и Mitotracker Red FM (Invitrogen, США). Окрашенные клетки анализировали методами проточной цитофлуориметрии и конфокальной микроскопии. При изучении трансмембранного потенциала ММСК методами проточной цитофлуориметрии с помощью Mitotracker Red FM было показано, что пониженное содержание кислорода в среде культивирования приводит к уменьшению величины данного показателя при снижении содержания кислорода в среде культивирования (рис. 8). Интенсивность флуоресценции Mitotracker Red FM, кратность отличий 56 1,5 * 1 * 0,5 0 20% 5% 1% Содержание кислорода в среде культивирования Рис. 8. Трансмембранный потенциал митохондрий ММСК при постоянном культивировании в среде с различным содержанием кислорода. Данные представлены относительно 20% О2 в виде M±m, n=6. * - p≤0,01 относительно величины трансмембранного потенциала ММСК при 20% О2 Удобный для визуализации флуоресцентный краситель JC-1, позволяющий, как и Mitotracker Red FM, регистрировать трансмембранный потенциал в живых клетках, был использован в экспериментах с последующим анализом методами микроскопии. Как известно, JC-1 может существовать в двух формах: мономерной и в виде J-агрегатов, образование которых происходит в митохондриях при наличии трансмембранного потенциала в линейной зависимости от его величины (Smiley, Reers, Mottola-Hartshorn et al., 1991) и является обратимым. При переходе из мономерной формы в агрегатную происходит сдвиг флуоресценции с зеленой области в красную с эмиссией в 590 нм (Poot, Pierce, 1999), поэтому в данном случае для изучения потенциала митохондрий требуется двухволновая регистрация данного показателя. Как видно на рис. 9, ММСК в условиях атмосферного содержания кислорода содержат большее количество активных митохондрий по сравнению с клетками, постоянно культивирующимися при 5% О2, что соответствует результатам, полученным с помощью проточной цитофлуориметрии (рис. 8). 57 А Б Рис. 9. Трансмембранный потенциал митохондрий ММСК при постоянном культивировании в среде с содержанием кислорода 20% (А) и 5% (Б). Клетки окрашены JC-1. Длина масштабного отрезка 20 мкм. Данные проведенных экспериментов совпадают с результатами, полученными в нашей лаборатории ранее при длительном (26-суток) воздействии пониженного содержания кислорода (5%, 3% и 1%) на клетки, культивируемые на 0 пассаже в условиях 20% О2. Также полученные результаты по снижению трансмембранного потенциала митохондрий в ММСК при 5% и 1% подтверждают выявленное уменьшение потребления глюкозы и увеличение соотношения между количеством продукции лактата и потребленной глюкозы (Буравкова, Рылова, Гальчук и др., 2011). 3.1.4.2 Интенсивность дыхания Для определения функционального состояния митохондрий была проведена оценка величины клеточного дыхания ММСК с помощью системы для измерения потребления кислорода во времени OxygraphPlus (Hansatech Instruments Ltd, UK). Типичная кривая поглощения кислорода представлена на рисунке 10. Базальную интенсивность потребления кислорода ММСК оценивали в течение 3 мин после помещения клеток в ячейку прибора, затем для оценки максимальной активности дыхательной цепи добавляли СССР, разобщающий окислительное фосфорилирование. Оценка потребления кислорода митохондриями показала заметное подавление дыхания при низких концентрациях кислорода. Наиболее активное 58 снижение поглощения кислорода ММСК наблюдалось в условиях 1% кислорода. Базальное дыхание снизилось на 70%, а потребление кислорода при стимуляции СССР снизилось почти в 5 раз (рис. 11). Очевидно, что в результате этого в ММСК при 5% и 1% О2 наблюдалось снижение трансмембранного потенциала митохондрий, показанное нами ранее. Клетки 10 нмоль СССР 2 мин Рис. 10. Типичная кривая поглощения кислорода, получаемая с помощью OxygraphPlus. 6 нмоль О 2 /мин/5х10 клеток Поглощение кислорода, Стрелками показано помещение в прибор клеток и добавление CCCP. 30 25 20 15 10 5 0 Базальное дыхание +СССР 20% 5% 1% Содержание кислорода в среде культивирования Рис. 11. Базовая и максимальная интенсивность потребления кислорода ММСК в условиях различного содержания кислорода. Lavrentieva, Majore, Kasper et al. (2010) также обнаружили изменение данного параметра в экспериментах с ММСК, полученными из пуповины, при 1,5%, 2,5%, 5% и 21% кислорода. При этом снижение интенсивности митохондриального потребления кислорода обсуждается в связи с увеличением экспрессии PDK1, регулирующего поступление пирувата в цикл Кребса. 59 3.1.4.3 Уровень АТФ Для оценки энергетической составляющей метаболизма ММСК исследовали уровень АТФ в клетках при разном содержании кислорода. Показано, что как следствие подавления активности митохондрий в условиях пониженного содержания кислорода снижался и уровень этого Уровень АТФ, у.е. энергетического продукта (рис. 12). 12 10 8 * 6 4 2 0 20% 5% 1% Содержание кислорода в среде культивирования Рис. 12. Уровень АТФ в ММСК при культивировании в условиях различного содержания кислорода. Данные представлены в виде M±m, n=3. * - p≤0,01 относительно уровня АТФ в ММСК при 20% О2 Для оценки вклада гликолиза в процесс образования АТФ в среду культивирования ММСК добавляли ингибитор гликолиза - 5 mM 2-дезоксиглюкозы и инкубировали в течение 16 часов. Используя формулу АТФ гликол. = (АТФ - АТФ 2-дезоксиглюкоз.) / АТФ, где АТФ гликол. - количество АТФ, образующейся в процессе гликолиза, АТФ - общее количество АТФ, АТФ 2-дезоксиглюкоз. - количество АТФ, продуцируемой в присутствии неметаболизируемого аналога глюкозы - 2-дезоксиглюкозы, было обнаружено, что по сравнению с 20% в условиях 5% О2 несколько увеличивается продукция АТФ в процессе гликолиза, в то время как при 1% кислорода данный показатель вырастает почти в два раза (рис. 13). Доля АТФ, образующейся в процессе гликолиза, % 60 80 70 60 50 40 30 20 10 0 20% 5% 1% Содержание кислорода в среде культивирования Рис. 13. Доля АТФ, образующейся в результате гликолиза в ММСК при разном содержании кислорода. Данные представлены в виде M±m, n=3. Определение доли АТФ, образующейся в результате окислительного фосфорилирования, проводили при использовании 1 мкг/мл олигомицина - ингибитора митохондриальной АТФсинтазы. Количество АТФ, образованное ММСК в присутствии олигомицина, сравнивали с аналогичным показателем в интактных клетках. Разница между этими двумя показателями и составляла вклад окислительного фосфорилирования в продукцию АТФ. Данные наших экспериментов показали, что условия содержания кислорода, близкие к физиологическим (5%), способствуют некоторому снижению доли АТФ, образующейся в результате окислительного фосфорилирования, в то время как при пониженном содержании О2 действие олигомицина практически не влияет на общий уровень АТФ в клетках (рис. 14), что свидетельствует об уменьшении вклада окислительного фосфорилирования в синтез АТФ при низком содержании Уровень АТФ, у.е. О2. 3 2,5 2 1,5 1 0,5 * 0 20% 5% 1% Содержание кислорода в среде культивирования Рис. 14. Уровень АТФ, образующейся в результате окислительного фосфорилирования в ММСК при разном содержании кислорода. Данные представлены в виде M±m, n=3. * - p≤0,01 относительно уровня АТФ в ММСК при 20% О2 61 Результаты экспериментов, свидетельствующие о важной роли гликолитических процессов в метаболизме АТФ, были получены Mylotte, Duffy, Murphy et al. (2008) в экспериментах на ММСК из костного мозга крыс. В условиях атмосферного содержания кислорода через 24 ч после добавления 2-дезоксиглюкозы зафиксированы значительное снижение жизнеспособности клеток и активация каспазы-3. Кроме того, авторами было зарегистрировано увеличение чувствительности ММСК к ишемии в условиях ингибирования гликолиза. При этом также в зависимости от продолжительности воздействия увеличивалось количество апоптотических клеток. При изучении действия кратковременного снижения содержания кислорода до 0,5% через 12 ч авторы зафиксировали снижение продукции АТФ в ММСК практически на 40%, а через 48 ч - на 60%. 3.1.5. Экспрессия гипоксия-ассоциированных генов Проведенный в нашей лаборатории ранее с помощью микрочипов Human-Ref8 (Illumina, США) полногеномный анализ ММСК, культивируемых при 5% и 20% О 2, показал изменение экспрессии 558 генов из 22184 проанализированных. Пониженное содержание О 2 повышало экспрессию генов, вовлеченных в пролиферацию, ангиогенез, сигналинг и клеточный метаболизм (Buravkova, Andreeva, Rylova, 2011). С целью выявления сигнальных путей регуляции метаболизма ММСК при постоянном культивировании в условиях различного содержания кислорода (20%, 5%, 1%) в нашей работе проводилось определение уровня экспрессии 84 генов, функционирование которых связано с гипоксией, методом ОТ-ПЦР в реальном времени с помощью системы RT² Profiler™ PCR Array Human Hypoxia Signaling Pathway (Qiagen, США). Исследуемые гены были разделены на группы (табл. 6). Таблица 6. Гены, входящие в состав RT² Profiler™ PCR Array Human Hypoxia Signaling Pathway и их условная классификация (переведено с английского по данным производителя) Ответ на стресс Ответ на гипоксию Ответ на ANGPTL4, ARNT2, CREBBP, EP300, HIF1A, MT3, PRKAA1 окислительный CAT, CYGB, GPX1, IPCEEF1 стресс Иммунный ответ GPI, IL1A, IL6, IL6ST, NOS2, NOTCH1, PTX3, RARA Другие ADM, EPO, HYOU1, VEGFA Оксидоредуктазы 62 Пероксидазы CAT, CYGB, GPX1, IPCEF1 Другие HIF1AN, HMOX1, MT3, NOS2, PLOD3, TH Гемоглобин- CYGB, EPO, HBB, HMOX, NOS2, IPCEF1 ассоциированные гены Транскрипционные факторы и регуляторы Транскрипционные CREBBP, DR1, ENO1, EP300, EPAS1, KAT5, RARA кофакторы Транскрипционные факторы ARNT2, BHLHE40, CREBBP, ENO1, EP300, EPAS1, HIF1A, HIF3A, KHSRP, MYBL2, PPARA, RARA Другие HIF1AN, NOTCH1 Апоптоз Антиапоптотические BAX, ANGPTL4, BIRC5, IL1A, MYBL2, PEA15, PRKAA1, VEGFA Каспазная активность BIRC5, CASP1 Индукция апоптоза BAX, DAPK3, NUDT2 Другие EP300 Трансдукция сигнала ADM, ARNT2, CASP1, CDC42, CREBBP, EP300, EPAS1, EPO, GNA11, HIF1A, HIF3A, HMOX1, IGFBP1, IL1A, IL6, IL6ST, IQGAP1, KIT, LEP, PLAU, RARA, VEGFA Метаболизм белков Биосинтез белков EEF1A1, PDIA2 (PDIP), PRKAA1, RPL28, RPL32, RPS2, RPS7 Гетеродимеризация белков ARNT2, HIF1A, RARA, SAE1 Гомодимеризация белков ARNT2, RARA, VEGFA Фосфорилирование DAPK3, KIT, PRKAA1 Связывание белков CASP1, CREBBP, ENO1, EP300, IQGAP1, NOS2, PEA15, PPP2CB, RARA Другие NAA10, CDC42, GNA11, HYOU1, MAN2B1, PLOD3, PSMB3, SUMO2, TUBA4A (TUBA1) Гены, связанные с функционированием внеклеточного матрикса Ингибиторы протеаз BIRC5, CSTB Протеазы AGTPBP1, CASP1, ECE1, PLAU, PSMB3 Другие ADM, ANGPTL4, CHGA, COL1A1, EPO 63 Цитоскелет DCTN2, SPTBN1 Рост и пролиферация Клеточный цикл BAX, BIRC5, EP300, HK2, IGF2, IL1A, MYBL2, SSSCA1, VEGFA Клеточная пролиферация DCTN2, IGF2, IL1A, IL6, MT3, NPY, RARA, VEGFA Ростовые факторы GPI, IGF2, IGFBP1, IL1A, IL6, KIT, VEGFA Другие ENO1 Метаболизм Метаболизм углеводов GPI, HK2, LCT, MAN2B1, PEA15, PRKAA1, SLC2A1, SLC2A4 Метаболизм липидов AGPAT2, ANGPTL4, PPARA, PRKAA1 Метаболизм одноуглеродных CA1 соединений Метаболизм супероксида MT3, NOS2 Метаболизм РНК PRPFF40A (FNBP3), KHSRP, RARA, RPL28, RPS2, SNRNP70 Другие ADM, AGPAT2, MOCS3, NUDT2, TH, TST, UCP2 Сердечная деятельность ARNT, CHGA, DAPK3, GNA11, IQGAP1, KIT, NOS2, NOTCH1, NPY, PRKAA1, SPTBN1 В результате наших исследований было обнаружено достоверное изменение экспрессии 10,7% рассматриваемых генов в ММСК при постоянном культивировании в среде с содержанием кислорода 5% по сравнению с ММСК при 20% О2 (табл. 7). При этом более чем в 2 раза увеличивалась экспрессия только 3 генов (MT3, SLC2A1 и SLC2A4), относящихся к группам пролиферации, метаболизма супероксида и глюкозы. 64 Таблица 7. Изменение экспрессии генов в ММСК при постоянном культивировании в среде с 5% О2*. RefSeq Символ Название продукта гена Экспрессия гена относительно клеток в 20% О2, кратность различий NM_001042 SLC2A4 Глюкозный транспортер 4 2,90 NM_005954 MT3 Металлотионеин 3 2,39 NM_006516 SLC2A1 Глюкозный транспортер 1 2,15 NM_000575 IL1A Интерлейкин 1, альфа 1,72 NM_003670 BHLHE40 Белок e40 семейства 1,61 транскрипционных факторов с основным доменом типа спиральпетля-спираль NM_441047 ADM Адреномедуллин -1,80 *Представлены гены, экспрессия которых достоверно (p< 0,05) изменилась более чем в 1,5 раза. Постоянное культивирование ММСК при 1% О2 привело к изменению экспрессии 39,3% исследуемых генов, из них более чем в 2 раза изменялась экспрессия 12 генов (табл. 8). 65 Таблица 8. Изменение экспрессии генов в ММСК при постоянном культивировании в среде с 1% О2*. Refseq Символ Продукт гена гена Экспрессия гена относительно клеток в 20% О2, кратность различий NM_005954 MT3 Металлотионеин 3 9,95 NM_000612 IGF2 Инсулиноподобный фактор роста 2 7,81 NM_152794 HIF3A Гипоксия-индуцируемый фактор 3, 4,07 α-субъединица NM_000230 LEP Лептин 3,16 NM_006516 SLC2A1 Глюкозный транспортер 1 2,22 NM_003376 VEGFA Сосудистый эндотелиальный 2,07 фактор роста А NM_003670 BHLHE40 Белок e40 семейства 2,01 транскрипционных факторов с основным доменом типа спиральпетля-спираль NM_000575 IL1A Интерлейкин 1, α 1,93 NM_000088 GPI Глюкоза-6-фосфат изомераза 1,59 NM_033292 CASP1 Каспаза 1 -2,79 NM_001430 EPAS1 Эндотелиальный белок-1, -2,41 содержащий PAS-домен (HIF2A) NM_001168 BIRC5 Сурвивин -2,11 NM_002133 HMOX1 Гемоксигеназа 1 -1,97 NM_000581 GPX1 Глютатионпероксидаза 1 -1,89 NM_017617 NOTCH1 Notch 1 -1,88 NM_001348 DAPK3 Гибель-ассоциированная -1,76 протеинкиназа 3 NM_441047 ADM Адреномедуллин -1,52 *Представлены некоторые гены, экспрессия которых достоверно (p<0,05) изменилась более чем в 1,5 раза. Показано, что одним из наиболее быстро реагирующих компонентов механизма клеточного ответа на гипоксию, обеспечивающим приспособление ММСК уже к небольшому снижению 66 содержания кислорода в среде, является транскрипционный фактор HIF (hypoxia-inducible factor), представляющий собой гетеродимер, в состав которого входит одна из трех существующих изоформ α-субъединицы (HIF-1α, HIF-2α или HIF-3α) и β-субъединица (HIF-1β). Мы не обнаружили отличий между экспрессией генов HIF-1α и HIF-2α при стандартном (20% О2) культивировании ММСК и снижении О2 в среде до 5%. Однако, постоянное культивирование при 1% О2 привело к повышенной в 4 раза экспрессии другой изоформы αсубъединицы этого транскрипционного фактора - HIF-3α, при этом экспрессия HIF-1α и HIF-2α несколько снижалась (в 1,47 и 2,41 раза соответственно). Следует отметить, что транскрипционный фактор HIF не только выступает в роли сенсора тканевой гипоксии, но и координирует процесс адаптации клетки к пониженному содержанию кислорода, регулируя многие метаболические процессы. При этом его активация может не зависеть от напряжения кислорода (Dery, Michaud, Richard, 2005), а быть обусловленной плейотропным действием факторов роста и посттрансляционными модификациями (Lee, Bae, Jeong et al., 2004). Отсутствие повышенной экспрессии HIF-1α в условиях длительного культивирования клеток при 5% О2 и понижение при 1% О2, возможно, отражает адаптивные, необходимые для поддержания функционального статуса ММСК, уровни активности транскрипционного фактора, сформировавшиеся в результате баланса синтеза и деградации HIF-1α на уровне белкового продукта, однако, этот вопрос требует дальнейших исследований. Анализ экспрессии блока апоптоз-ассоциированных генов не выявил отличий от контроля в ММСК при культивировании в среде с содержанием кислорода 5%, а при 1% О2 было обнаружено снижение экспрессии индукторов апоптоза (BAX, DAPK3), что согласуется с данными о высоком уровне жизнеспособности клеток при достаточно низком содержании О 2. В среде культивирования с пониженным содержанием кислорода в ММСК наблюдается увеличение экспрессии гена глюкозного транспортера 1 (SLC2A1), с чем, вероятно, связана стимуляция поглощения глюкозы клетками (Dos Santos, Andrade, Boura et al., 2010). Помимо этого при 5% О2 увеличивается экспрессия другой изоформы данного транспортера - SLC2A4, а в условиях 1% О2 возрастает экспрессия гена глюкозо-6-фосфат изомеразы, что хорошо согласуется выявленным переключением энергетического матаболизма с окислительного на гликолитический. Нами было показано, что при пониженном содержании кислорода для ММСК, как и для некоторых других типов клеток (Yamasaki, Nomura, Sato et al., 2007), характерно увеличение экспрессии гена MT3, продукт которого вовлечен в процессы хелатирования металлов, клеточной пролиферации и апоптоза. Наиболее значительно (в 9,95 раза) количество мРНК MT3 возрастало при культивировании клеток в условиях жесткой гипоксии (1% О2). 67 Особое внимание следует обратить на то, что при 1% О2 в ММСК в 2 раза повышается экспрессия гена VEGFA, продукт которого способствует пролиферации и оказывает антиапоптотическое действие, что делает ММСК применимыми в клеточной терапии (Pons, Huang, Arakawa-Hoyt et al., 2008). Помимо этого в данных условиях для ММСК показано увеличение экспрессии лептина. Как известно, лептин стимулирует пролиферацию, в том числе и стволовых клеток, и участвует в регуляции процессов дифференцировки и секреции цитокинов (Gainsford, Willson, Metcalf et al., 1996). Таким образом, в условиях умеренной гипоксии (5% О2) по уровню экспрессии исследуемых генов клетки незначительно отличаются от нормоксии (20% О2), несмотря на выраженные изменения морфологии и пролиферативной активности (Рылова Ю.В., Буравкова Л.Б., 2013). При культивировании в среде с низким содержанием О2 (1%) помимо изменения экспрессии генов, кодирующих проапоптотические белки, регуляторы метаболизма и пролиферации, повышается уровень экспрессии генов ряда паракринных факторов, благодаря чему ММСК могут более эффективно поддерживать жизнеспособность в условиях гипоксии и участвовать в регенеративных процессах. 3.2. Влияние на ММСК кратковременного изменения содержания кислорода 3.2.1. Жизнеспособность При изучении краткосрочных эффектов изменения содержания кислорода в среде культивирования использовали как понижение процентного содержания кислорода в газовой фазе с 20% и 5% до 1% (моделирование гипоксии), так и повышение - с 1% до 5% и 20% О2 (моделирование реоксигенации). В ходе наших экспериментов ни один из вариантов 24-часового изменения содержания кислорода в среде культивирования не оказывал влияния на жизнеспособность ММСК из жировой ткани человека (табл. 9). Тем не менее, рядом авторов выявлен положительный эффект гипоксического прекондиционирования – кратковременного снижения содержания кислорода в среде культивирования перед трансплантацией клеток в ишемизированные области (Hu). Такое воздействие способствует сохранению жизнеспособности ММСК, которые при обычных условиях погибают практически через 4 суток (Toma, Pittenger, Cahill et al., 2002). Гипоксическое прекондиционирование повышает экспрессию таких ростовых факторов как HGF, VEGF, IGF-1 (Wang, Crisostomo, Herring et al., 2006; Crisostomo, Wang, Markel et al., 2008). Как было показано, гипоксия активирует PI3/Akt сигнальный путь, что способствует повышению жизнеспособности клеток в результате прямого воздействия на проапоптотические 68 белки или модуляции клеточного метаболизма (Datta, Brunet, Greenberg, 1999). Отмечается, что к механизмам, способствующим выживанию ММСК в данных условиях, относятся использование гликолитического пути и продукция глюкозо-6-фосфатазы для использования глюкозы (Mylotte L.A., Duffy A.M., Murphy M. et al., 2008; Lord-Dufour, Copland, Levros et al., 2009). Таблица 9. Жизнеспособность ММСК при изменении содержания кислорода в среде культивирования на 24 ч. Представлено количество живых (AnnV-PI-), апоптотических (AnnV+PI-), некротических (AnnV-PI+) и клеток в состоянии постапоптотического некроза (AnnV+PI+) в виде M±m, n=4. AnnV-PI-, % AnnV+PI-, % AnnV-PI+, % AnnV+PI+, % 20% 91,90±1,37 3,06±0,86 3,09±1,25 1,97±0,41 20%-5% 96,87±1,49 0,78±0,47 1,02±0,31 1,29±0,73 20%-1% 92,34±1,15 4,79±1,00 1,35±0,18 1,53±0,25 5% 93,41±1,29 2,90±1,27 2,60±0,34 1,09±0,23 5%-20% 96,46±0,88 1,26±0,55 1,06±0,22 1,24±0,43 5%-1% 91,80±1,78 2,27±0,40 2,35±1,02 3,59±1,17 1% 91,75±2,12 5,30±1,88 1,10±0,34 1,84±0,47 1%-20% 90,07±4,35 6,44±3,89 2,02±0,98 1,47±0,53 1%-5% 86,17±1,32 2,82±2,60 9,50±3,85 1,47±0,13 Диапазон содержания О2 в среде культивирования 3.2.2. Активность прооксидантной системы 3.2.2.1. Содержание АФК В данной серии экспериментов с целью изучения ответа ММСК на кратковременное изменение содержания кислорода в среде культивирования проводили снижение уровня О2 в газовой фазе с 20% и 5% до 1% и повышение с 1% до 5% и 20% на 6 ч и 24 ч. В отличие от клеток, постоянно культивируемых при разном О2, кратковременное изменение его содержания повлияло на содержание АФК в ММСК. В наших экспериментах наиболее восприимчивыми с точки зрения содержания АФК оказались клетки, постоянно культивируемые при 5% О2. Как повышение уровня О2 до 20%, так и снижение до 1% в данном случае сопровождались возрастанием количества АФК (рис. 16). 69 Достоверное изменение данного показателя наблюдалось уже через 6 ч после начала действия гипоксии. При повышении уровня О2 до атмосферного через 24 ч наблюдалось наиболее значительное увеличение уровня внутриклеточных АФК. Кратковременное снижение кислорода с 20% до 5% приводило к снижению АФК в клетках (рис. 15). Через 6 ч в этих условиях наблюдалась тенденция к уменьшению данного показателя, а через 24 ч отличия стали достоверными. Действие среды с 1% О2 на начальном этапе сопровождалось тенденцией к уменьшению количества АФК в клетках, однако, через 24 ч данный показатель выравнивался или даже несколько превышал начальное значение. В ММСК, постоянно культивируемых в условиях низкого содержания О2 (1%), при увеличении его содержания до 20% и 5% на короткий промежуток времени достоверных Содержание АФК в ММСК, кратность отличий изменений в содержании АФК не наблюдалось (данные не представлены). 1,6 1,4 1,2 1 * 0,8 0,6 0,4 0,2 0 20% 20%-5%, 6 ч 20%-5%, 24 ч 20%-1%, 6 ч 20%-1%, 24 ч Содержание кислорода, условия культивирования Рис. 15. Содержание АФК в ММСК при кратковременном изменении содержания кислорода с 20% до 5% и 1%. Оценка проводилась относительно клеток, постоянно культивируемых при 20% О2. Данные представлены в виде M±m, n=3. * - p≤0,01 относительно содержания АФК в ММСК при 20% О2 Содержание АФК в ММСК, кратность отличий 70 1,8 * 1,6 1,4 * * 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 5% 5%-20%, 6 ч 5%-20%, 24 ч 5%-1%, 6 ч 5%-1%, 24 ч Содержание кислорода, условия культивирования Рис. 16. Содержание АФК в ММСК при кратковременном изменении содержания кислорода с 5% до 20% и 1%. Оценка проводилась относительно клеток, постоянно культивируемых при 5% О2. Данные представлены в виде M±m, n=3. * - p≤0,01 относительно содержания АФК в ММСК при 5% О2 Таким образом, при кратковременном изменении содержания кислорода уровень АФК в ММСК может изменяться. Результаты наших экспериментов показывают, что среда с 5% О2 даже при кратковременном воздействии в большинстве случаев способствует снижению АФК в клетках. 3.2.2.2. Содержание ТБК-активных продуктов Как и в экспериментах по изучению постоянного культивирования ММСК в условиях разного содержании кислорода, так при кратковременном изменении данного показателя было показано, что наиболее низкие значения показателей ПОЛ наблюдаются в среде с 5% О2. При перемещении клеток из указанных условий в 20% и 1% О2 через 24 ч в обоих случаях достоверно увеличивался уровень ТБК-активных продуктов (рис. 18). В клетках, постоянно культивируемых при атмосферном содержании кислорода, значение данного показателя возрастало при снижении О2 до 1% (рис. 17). Содержание ТБК-активных продуктов в ММСК при кратковременном изменении содержания кислорода с 1% до 20% и 5%, как и показатели АФК (см. гл. 3.2.2.1), не изменялось (данные не представлены). Содержание ТБК-активных продуктов в ММСК, кратность отличий 71 2,5 * 2 1,5 1 0,5 0 20% 20%-5% 24ч 20%-1% 24ч Содержание кислорода в среде культивирования Рис. 17. Содержание ТБК-активных продуктов в ММСК при кратковременном изменении содержания кислорода с 20% до 5% и 1%. Оценка проводилась относительно клеток, постоянно культивируемых при 20% О2. Данные представлены в виде M±m, n=3. * - p≤0,01 относительно величины содержания ТБК-активных продуктов в ММСК при 20% О2 Содержание ТБК-активных продуктов в ММСК, кратность отличий 4,5 * 4 3,5 3 2,5 * 2 1,5 1 0,5 0 5% 5%-20% 24ч 5%-1% 24ч Содержание кислорода в среде культивирования Рис. 18. Содержание ТБК-активных продуктов в ММСК при кратковременном изменении содержания кислорода с 5% до 20% и 1%. Оценка проводилась относительно клеток, постоянно культивируемых при 5% О2. Данные представлены в виде M±m, n=3. * - p≤0,01 относительно величины содержания ТБК-активных продуктов в ММСК при 5% О2 72 3.2.3. Функционирование антиоксидантной системы. Активность каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы Кратковременное изменение содержания кислорода в среде культивирования ни в одном из случаев не приводило к достоверным изменениям активности каталазы (табл. 10). Таблица 10. Изменение активности каталазы в ММСК при культивировании в среде с различным содержанием кислорода. Оценка проводилась относительно клеток, культивируемых при 20% О2. Данные представлены в виде M±m, n=3. 20%-5% 20%-5% 20%-5% 20%-1% 20%-1% 20%-1% 20% 3ч 6ч 24ч 3ч 6ч 24ч 1±0 1,09±0,1 1,06±0,23 1,06±0,15 1,03±0,15 1,10±0,20 1,27±0,18 5%-20% 5%-20% 5%-20% 5%-1% 5%-1% 5%-1% 5% 3ч 6ч 24ч 3ч 6ч 24ч 1±0 1,01±0,10 1,19±0,28 1,27±0,19 1,11±0,11 1,06±0,40 1,34±0,25 1%-20% 1%-20% 1%-20% 1%-5% 1%-5% 1%-5% 1% 3ч 6ч 24ч 3ч 6ч 24ч 1±0 1,02±0,16 0,88±0,19 1,13±0,15 0,95±0,13 0,98±0,15 1,11±0,21 Снижение содержания кислорода c 20% до 5% в течение 24 ч и до 1% на 3 ч и 6 ч сопровождалось уменьшением активности СОД (рис. 19). Наиболее выраженным было изменение уровня этого фермента при уменьшении содержания кислорода до 5% в течение 24 ч. Напротив, выраженная гипоксия (1%) через 24 ч вызывала восстановление активности СОД до контрольных значений. Изменение активности СОД в ММСК, кратность отличий 73 1,2 1 * 0,8 0,6 0,4 * * * * 0,2 0 20% 20%-5% 20%-5% 20%-5% 20%-1% 20%-1% 20%-1% 3ч 6ч 24ч 3ч 6ч 24ч Содержание кислорода в среде культивирования Рис. 19. Изменение активности СОД в ММСК при культивировании в среде с различным содержанием кислорода. Оценка проводилась относительно клеток, культивируемых при 20% О2. Данные представлены в виде M±m, n=3. * - p≤0,01 относительно величины активности СОД в ММСК при 20% О2 Клетки, постоянно культивируемые в условиях, близких к физиологическим (5% О2), при увеличении и уменьшении значений данного показателя в большинстве случаев характеризовались повышенной активностью СОД (рис. 20). Наиболее выраженная реакция Изменение активности СОД в ММСК, кратность отличий наблюдалась после 6-часовой экспозиции. 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 * * 5% * * 5%-20% 5%-20% 5%-20% 3ч 6ч 24ч 5%-1% 3ч * 5%-1% 6ч 5%-1% 24ч Содержание кислорода в среде культивирования Рис. 20. Изменение активности СОД в ММСК при культивировании в среде с различным содержанием кислорода. Оценка проводилась относительно клеток, культивируемых при 5% О2. Данные представлены в виде M±m, n=3. * - p≤0,01 относительно величины активности СОД в ММСК при 5% О2 74 Перемещение ММСК из условий низкого содержания кислорода в близкие к физиологическим (5%) и в 20% О2 практически не сопровождалось изменением активности данного фермента (рис. 21). Повышение уровня СОД наблюдалось только в одном случае - Изменение активности СОД в ММСК, кратность отличий через 6 ч после увеличения содержания кислорода до стандартного (атмосферного). 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 * 1% 1%-20% 1%-20% 1%-20% 1%-5% 3ч 6ч 24ч 3ч 1%-5% 6ч 1%-5% 24ч Содержание кислорода в среде культивирования Рис. 21. Изменение активности СОД в ММСК при культивировании в среде с различным содержанием кислорода. Оценка проводилась относительно клеток, культивируемых при 1% О2. Данные представлены в виде M±m, n=3. * - p≤0,01 относительно величины активности СОД в ММСК при 1% О2 Кратковременное изменение содержания кислорода в среде культивирования также способствовало значительному изменению активности глутатионпероксидазы. Снижение данного показателя наблюдалось во всех случаях кратковременного уменьшения Активность ГП в ММСК, кратность отличий содержания кислорода в среде (рис. 22). 1,2 1 * 0,8 * * * * * 0,6 0,4 0,2 0 20% 20%-5% 3ч 20%-5% 6ч 20%-5% 24ч 20%-1% 3ч 20%-1% 6ч 20%-1% 24ч Содержание кислорода в среде культивирования Рис. 22. Изменение активности глутатионпероксидазы в ММСК при культивировании в среде с различным содержанием кислорода. Оценка проводилась относительно клеток, культивируемых при 20% О2. Данные представлены в виде M±m, n=3. * - p≤0,01 относительно величины активности ГП в ММСК при 20% О2 75 Кратковременное увеличение или уменьшение содержания кислорода с 5%, напротив, практически на всех рассматриваемых временных промежутках сопровождалось увеличением активности ГП (рис. 23). При этом можно отметить тенденцию к максимальному возрастанию Активность ГП в ММСК, кратность отличий данного показателя при атмосферном содержании кислорода. 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 * 5% * * 5%-20% 5%-20% 5%-20% 3ч 6ч 24ч 5%-1% 3ч * * 5%-1% 6ч 5%-1% 24ч Содержание кислорода в среде культивирования Рис. 23. Изменение активности глутатионпероксидазы в ММСК при культивировании в среде с различным содержанием кислорода. Оценка проводилась относительно клеток, культивируемых при 5% О2. Данные представлены в виде M±m, n=3. * - p≤0,01 относительно величины активности ГП в ММСК при 5% О2 Увеличение содержания кислорода также способствует активации ГП в клетках, культивируемых при 1% кислорода (рис. 24). В данном случае, в отличие от супероксиддисмутазы, достоверное изменение этого показателя наблюдалось, начиная с 6 ч воздействия. Активность ГП в ММСК, кратность отличий 76 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 * 1% * * 1%-5% 6ч 1%-5% 24ч * 1%-20% 1%-20% 1%-20% 3ч 6ч 24ч 1%-5% 3ч Содержание кислорода в среде культивирования Рис. 24. Изменение активности глутатионпероксидазы в ММСК при культивировании в среде с различным содержанием кислорода. Оценка проводилась относительно клеток, культивируемых при 1% О2. Данные представлены в виде M±m, n=3. * - p≤0,01 относительно величины активности ГП в ММСК при 1% О2 К сожалению, в литературе встречается мало экспериментальных данных, характеризующих прооксидантную и антиоксидантную системы ММСК в условиях начального этапа изменения содержания кислорода. Тем не менее, результаты наших экспериментов частично соотносятся с материалом работ Peterson, Aly, Lerman et al. (2011). В подобных экспериментах на ММСК крыс через 24 ч после снижения содержания кислорода в среде культивирования с 20% до 1% авторы с помощью иммуноблоттинга так же не обнаружили изменений уровня СОД (митохондриальной), но зафиксировали снижение количества каталазы. Однако уровень АФК при этом повышался. При анализе активности антиоксидантной системы было выявлено, что наиболее чувствительными к изменению содержания кислорода в среде ее компонентами являются СОД и ГП. 3.2.4. Функциональное состояние митохондрий 3.2.4.1 Характеристика трансмембранного потенциала Изучение трансмембранного потенциала митохондрий в условиях кратковременного снижения содержания кислорода показало, что изменение данного показателя наблюдается уже через 6 часов после воздействия на ММСК, культивируемые при атмосферном О2 (рис. 25). 77 Достоверных различий в степени снижения трансмембранного потенциала митохондрий при действии на клетки 5% и 1% О2 не наблюдалось. Стоит отметить, что при постоянном культивировании в аналогичных условиях значения этого параметра также практически не различаются (см. гл. 3.1.4.1). Интенсивность флуоресценции Mitotracker Red FM, кратность отличий 1,2 1 * 0,8 * * * 0,6 0,4 0,2 0 20%-5%, 6 ч 20%-5%, 24 ч 20%-1%, 6 ч 20%-1%, 24 ч 20% Содержание кислорода, условия культивирования Рис. 25. Изменение величины трансмембранного потенциала в ММСК при снижении содержания кислорода. Оценка проводилась относительно клеток, культивируемых при 20% О2. Данные представлены в виде M±m, n=3. * - p≤0,01 относительно величины трансмембранного потенциала в ММСК при 20% О2 Судя по трансмембранному потенциалу, функциональное состояние митохондрий существенно не изменяется при увеличении и уменьшении содержания кислорода в клетках, постоянно культивируемых в условиях 5% и 1% (табл. 11). 78 Таблица 11. Трансмембранный потенциал митохондрий ММСК при кратковременном изменении содержания кислорода с 5% до 20%, 1% О2 и с 1% до 20%, 5% О2. Оценка проводилась относительно клеток, постоянно культивируемых при 5% и 1% О2 соответственно. Данные представлены в виде M±m, n=3. Содержание Изменение Содержание Изменение кислорода, условия трансмембранного кислорода, условия трансмембранного культивирования потенциала культивирования потенциала 5%, постоянное митохондрий митохондрий ММСК ММСК 10 культивирование 1%, постоянное 10 культивирование 5%-20%, 6 ч 0,990,19 1%-20%, 6 ч 0,970,07 5%-20%, 24 ч 0,880,09 1%-20%, 24 ч 0,910,10 5%-1%, 6 ч 0,860,16 1%-5%, 6 ч 0,940,08 5%-1%, 24 ч 0,950,08 1%-5%, 24 ч 0,910,13 Данные, полученные в ходе экспериментов по изучению кратковременного изменения содержания кислорода, описание которых встречается в литературе, также свидетельствуют о снижении уровня трансмембранного потенциала при уменьшении содержания О2 в среде. Однако, как и случае с определением АФК (см. гл. 3.1.2.1), авторы используют модель гипоксии в сочетании с сывороточной депривацией (Zhang, Su, Gao et al., 2009). Результаты наших дополнительных экспериментов показали, что сывороточная депривация существенным образом влияет на трансмембранный потенциал митохондрий ММСК и способствует снижению его величины (рис. 26). При этом менее выражено данный процесс происходит в клетках при низких значениях О2 (5%, 1%). 1,2 1 * * 0,8 0,6 * * * * * * * * 0,4 0,2 6 20 % -5 % % бе 24 зс ч ыв % -5 ор % от бе ки зс 6 ыв ч ор от ки 24 ч 20 % -1 % 6 20 ч 20 % % -1 -1 % % бе 24 зс 20 ч ыв % -1 ор % от бе ки зс 6 ыв ч ор от ки 24 ч ч ч % -5 20 % % -5 20 20 от к и и сы во р от к 20 % бе з сы во р % 20 24 6 20 % ч 0 бе з Интенсивность флуоресценции Mitotracker Red FM, кратность отличий 79 Содержание кислорода, условия культивирования Рис. 26. Трансмембранный потенциал ММСК при кратковременном изменении содержания кислорода с 20% до 5%, 1% и сывороточной депривации. Оценка проводилась относительно клеток, постоянно культивируемых при 20% О2. Данные представлены в виде M±m, n=3. * - p≤0,01 относительно величины трансмембранного потенциала ММСК при 20% О2 3.2.4.2 Интенсивность дыхания Детальное изучение процессов дыхания в ММСК при кратковременном изменении содержания кислорода в среде культивирования проводили с помощью анализатора клеточного метаболизма XFe Seahorse Bioscience. Данный прибор позволяет оценивать разные параметры процесса дыхания клеток: определять уровень базового дыхания, вклад митохондриального дыхания в производство АТФ (разница между базовым дыханием и дыханием в присутствии олигомицина), скорость максимального дыхания после добавления СССР и немитохондриальное потребление кислорода после воздействия смеси антимицина и ротенона. Добавление антимицина и ротенона, которые блокируют дыхательную цепь, дает возможность изучить дыхание, необходимое на поддержание мембранного потенциала, не расходуемого на синтез АТФ (рис. 27). Скорость потребления кислорода, пкМ/мин 80 Время, мин А - олигомицин В - СССР С - ротенон+антимицин Рис. 27. Пример кривой потребления кислорода ММСК, полученной с помощью анализатора клеточного метаболизма XFe Seahorse Bioscience. В данной части нашей работы изучались параметры дыхания клеток, которые постоянно культивировали в условиях 20%, 5% и 1% О2, а затем на 48 ч переносили в среду с 5% или атмосферным содержанием кислорода. Результаты показали, что даже через довольно длительный промежуток времени пребывания в условиях атмосферного содержания кислорода дыхание в ММСК, ранее культивируемых при 5% и 1% О2 отличается от такового в клетках при 20% О2 (рис. 28). Несмотря на отсутствие различий во вкладе митохондриального дыхания в синтез АТФ и немитохондриальном потреблении кислорода, скорость максимального дыхания отличается от таковой при 20% О2. Для клеток, культивируемых при 5% О2, данный показатель увеличился по сравнению с исходным (см. гл. 3.1.4.2) и даже несколько превышает потребление кислорода после воздействия СССР клетками при атмосферном О2. Однако, в случае клеток, культивируемых ранее в условиях 1% О2, скорость максимального потребления кислорода остается пониженной. Скорость потребления кислорода, пкМ/мин 81 30 * 25 20 * Базальное дыхание 15 Олигомицин 10 CCCP 5 Ротенон+антимицин 0 20% 5% - 20% 1% - 20% Содержание кислорода Рис. 28. Параметры потребления кислорода ММСК, культивируемых в условиях кратковременного повышения содержания кислорода. Данные представлены в виде M±m, n=3. *-p< 0,01 - относительно скорости потребления кислорода при с клетками при 20% и 1% О2 Оценка параметров дыхания ММСК, перенесенных на 48 ч из условий атмосферного содержания в 5% О2, показала некоторое снижение как базального, так и максимального уровня потребления кислорода, а также скорости немитохондриального дыхания даже по сравнению с клетками в 5% О2 (рис. 29). Скорость потребления кислорода, пкМ/мин 25 20 15 Базальное дыхание Олигомицин 10 CCCP Антимицин+ротенон 5 0 5% 20% - 5% Содержание кислорода Рис. 29. Параметры потребления кислорода ММСК, культивируемых в условиях кратковременного понижения содержания кислорода. Данные репрезентативного эксперимента. 82 Papandreou, Cairns, Fontana et al. (2006) также показали, что даже 24-часовая экспозиция клеток первичной культуры фибробластов человека и иммортализованных мышиных фибробластов при 0,5% кислорода снижает уровень потребления кислорода на 50% по сравнению с клетками при атмосферном О2. Результаты наших экспериментов показывают, что ММСК, культивируемые при 20% и 5% О2, способны быстрее перестраивать скорость метаболических процессов при изменении содержания кислорода в окружающей среде по сравнению с клетками, культивируемыми при гипоксии (1%). 3.2.5. Экспрессия генов HIF-1α и HIF-3α В настоящее время большое внимание уделяется выяснению функций транскрипционных комплексов HIF, в состав которых входят разные α-субъединицы. Во многих типах клеток активно изучается роль HIF-1α и HIF-2α, имеющих как общие для обоих, так и специфические гены-мишени (Koh, Powis, 2012). На клетках нейробластомы показано, что HIF-1α активируется в течение короткого временного промежутка (2-24 ч) при действии жестких условий гипоксии (<0,1% О2), в то время как HIF-2α пролонгированно (48-72 ч) действует в условиях 5% О2 (Holmquist-Mengelbier L., Fredlund E., Lofstedt T. et al., 2006). При этом довольно мало известно о HIF-3α, хотя отмечается, что один из продуктов его альтернативного сплайсинга является ингибитором HIF-1α (Makino Y., Kanopka A., Wilson W.J. et al., 2002). Как было показано нами при длительном культивировании ММСК в условиях пониженного содержания кислорода, увеличения экспрессии HIF-1α не происходит, в то время как экспрессия HIF-3α повышается (табл. 8). Для анализа ранних (до 24 ч) эффектов пониженного содержания кислорода в ММСК была определена временная динамика уровня mRNA HIF-1α и HIF-3α в ММСК. Снижение кислорода с 20% до 5% вызывало достоверное увеличение экспрессии HIF-1α (рис. 30). * * ч * * 24 8 ч * 4 ч ми н * 30 ки сл ор од а 15 ми н * ч * * * * 1 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Условия культивирования 20 % Экспрессия гена HIF-1α в ММСК, кратность отличий 83 снижение содержания кислорода с 20% до 5% снижение содержания кислорода с 20% до 1% Рис. 30. Динамика изменения экспрессии HIF-1α в ММСК при кратковременном снижении содержания кислорода с 20% до 5% (1) и 1% (2). *-p≤ 0,01 относительно экспрессии HIF-1α в ММСК при 20% О2 Эффект нарастал с 15 до 30 минуты, затем стабилизировался до 8 часов, после чего снижался, достигая минимума (0,6±0,02 по отношению к уровню экспрессии HIF-1α в ММСК при 20% О2, принятому за единицу). Снижение кислорода с 20% до 1% приводило к аналогичному по величине (1,5±0,04), но более быстрому увеличению экспрессии HIF-1α в ММСК. Однако, уже через 30 мин началось снижение экспрессии, в результате чего через час исследуемый показатель не отличался от контроля (20% О2), а к 4 часам уровень мРНК HIF-1α достоверно снизился. Таким образом, мы показали, что максимальное увеличение транскрипции HIF-1α в ММСК наблюдалось на разных временных отрезках в зависимости от степени выраженности гипоксического воздействия. Наиболее быстрая, но непродолжительная (до 1 ч) реакция была выявлена в клетках при снижении содержания кислорода с 20% до 1%. При воздействии менее жесткой гипоксии (5% О2) обнаружено более продолжительное возрастание транскрипции HIF-1α, достигающее максимума к 8 ч от воздействия. При этом выраженность увеличения мРНК не зависела от степени гипоксии, по крайне мере в пределах 15% О2. Необходимо отметить, что во всех экспериментах после 24-часовой экспозиции ММСК в гипоксической среде экспрессия HIF-1α характеризовалась пониженным уровнем по сравнению с исходным. Эти данные совпадают с результатами Bohan Wang и соавт., также обнаружившими четырехкратное снижение уровня мРНК субъединицы 1α данного транскрипционного фактора в адипоцитах после аналогичного воздействия. Стоит отметить, 84 что такое же снижение было зарегистрировано и при постоянном культивировании ММСК в 1% О2. Тот факт, что экспрессия HIF-1α после 24 ч экспозиции при 5% О2 и при постоянном культивировании в условиях «физиологической гипоксии» различалась (см. гл. 3.1.5), может указывать на более медленный процесс нормализации экспрессии данной субъединицы транскрипционного фактора при увеличении длительности воздействия гипоксии. Изучение временной динамики экспрессии mRNA HIF-3α выявило стабильный рост при кратковременном снижении содержания кислорода как до 5%, так и до 1% (рис. 31). При этом в первом случае наблюдался более ранний, но менее выраженный ответ. В ММСК, кратковременно помещенных в условиях с низким содержанием кислорода (1%), экспрессия гена HIF-3α интенсивно нарастала со временем, начиная с 4 часа. Необходимо отметить, что в данном случае через 24 ч после воздействия изменение количества mRNA HIF-3α практически Экспрессия гена HIF-3α в ММСК, кратность отличий в 2 раза превышало таковое при постоянном культивировании. 25 20 * 15 * 10 20 % * * ч 24 ч * 8 4 ч 1 ми н 30 ки сл ор од а 15 ми н 0 * * 1 ч 5 Условия культивирования снижение содержания кислорода с 20% до 5% снижение содержания кислорода с 20% до 1% Рис. 31. Динамика изменения экспрессии HIF-3α в ММСК при кратковременном снижении содержания кислорода с 20% до 5% и 1%. *-p≤ 0,01 относительно экспрессии HIF-3α в ММСК при 20% О2 Таким образом, HIF-1α, являясь одним из наиболее чувствительных компонентов механизма клеточного ответа, обеспечивает приспособление ММСК к гипоксии, быстрота которого зависит от степени снижения содержания кислорода в среде. Вероятно, после активации геновмишеней экспрессия HIF-1α подвергается негативной регуляции HIF-3α, что способствует поддержанию транскрипции данного гена на уровне ниже конституциональной экспрессии при нормоксии. 85 3.2.6. Экспрессия гипоксия-ассоциированных генов Для сравнения эффектов длительного и кратковременного воздействия пониженного содержания О2 были проанализированы транскриптомные изменения 84 генов, классифицированных по группам (табл. 6, см. гл. 3.1.5.) Кратковременное снижение содержания кислорода в среде культивирования с 20% до 1% на 24 часа вызывало изменение экспрессии 29,7% исследуемых генов, большая часть их перекрывается с генами, функционирование которых в ММСК изменилось при постоянном культивировании в условиях содержания О2 1% (см. гл. 3.1.5.), что свидетельствует о быстрой адаптации исследуемых клеток к гипоксии. При этом значительно изменялась экспрессия 7 генов, что составляет 8,3% от общего количества (табл. 12). В отличие от клеток, постоянно культивируемых в условиях 1% О 2, в данном случае происходит изменение экспрессии меньшего числа генов, продукты которых участвуют в апоптозе. После 24-часового воздействия пониженного содержания кислорода наблюдалось снижение количества мРНК гена индуктора апоптоза DAPK3, что соотносится с высоким уровнем жизнеспособности ММСК. Также через 24 часа после снижения содержания кислорода с 20% до 1% в клетках наблюдается активация генов, продукты которых участвуют в процессе гликолиза. Так, практически в 2 раза увеличивается экспрессия альфа-енолазы ENO1 и глюкоза-6-фосфат изомеразы GPI. Также необходимо отметить обнаруженное увеличение экспрессии глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы GAPDH - гена, экспрессия которого зачастую используется для нормализации результатов ПЦР. В отличие от клеток, постоянно культивируемых при 1% кислорода, краткосрочное снижение значения данного параметра до аналогичного уровня привело к более значительным изменениям экспрессии генов LEP и MT3. Показано, что лептин, помимо участия в энергетическом обмене, проявляет ангиогенные свойства, а важную роль в повышении его транскрипционной активности играет HIF-1 (Ambrosini, Nath, Sierra-Honigmann et al., 2002; Wang, Wood, Trayhurn, 2008). Металлотионеин 3, как показывают результаты нашей работы, является особо чувствительным компонентом системы ответа на снижение содержания кислорода ММСК и, как отмечается, также регулируется HIF-1 (Ivan, Kondo, Yang et al., 2001; Jaakkola, Mole, Tian et al., 2001). В данных экспериментах через 24 ч снижения содержания кислорода мы обнаружили отрицательную регуляцию гена субъединицы гипоксия-индуцируемого фактора HIF-2α. Вероятно, как и в случае с уровнем HIF-1α, экспрессия HIF-2α подвергается негативной 86 регуляции HIF-3α, что способствует поддержанию необходимого уровня транскрипции данного гена. Таблица 12. Изменение экспрессии генов в ММСК при снижении содержания кислорода в среде с 20% до 1% на 24 ч – положительная и отрицательная регуляция*. Refseq Символ Продукт гена гена Экспрессия гена относительно нормоксии (20% О2), кратность различий NM_005954 MT3 Металлотионеин 3 38,73 NM_000230 LEP Лептин 7,09 NM_152794 HIF3A Гипоксия-индуцируемый фактор 3, α- 4,30 субъединица NM_001428 ENO1 Енолаза 1 (альфа) 2,06 NM_000088 GPI Глюкоза-6-фосфат изомераза 1,90 NM_002046 GAPDH Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа 1,86 NM_002067 GNA11 Гуанин нуклеотид-связывающий белок -2,35 (G-белок), альфа 11 (Gq класс) NM_033292 CASP1 Каспаза 1 -2,29 NM_003685 KHSRP Регуляторный белок сплайсинга KH типа -2,23 NM_001430 EPAS1 Эндотелиальный белок-1, содержащий -1,80 PAS-домен (HIF2A) NM_017617 NOTCH1 Notch 1 -1,76 NM_003128 SPTBN1 Неэритроидный бета-спектрин 1 -1,70 NM_001348 DAPK3 Гибель-ассоциированная протеинкиназа 3 -1,63 NM_001530 HIF1A Гипоксия-индуцируемый фактор 1, α- -1,55 субъединица *Представлены некоторые гены, экспрессия которых достоверно (p < 0,05) изменилась более чем в 1,5 раза. Таким образом, изучение экспрессии гипоксия-ассоциированных генов в ММСК при кратковременном снижении содержания кислорода с 20% до 1% свидетельствует о быстрой адаптации клеток к гипоксии. Увеличение экспрессии генов, продукты которых принимают 87 участие в процессах гликолиза, а также активация металлотионеина и лептина могут обуславливать повышенные адаптивные возможности и терапевтический потенциал ММСК при гипоксическом прекондиционировании. 3.3. Влияние Н2О2 на ММСК 3.3.1. Жизнеспособность Перекись водорода часто используется в качестве классической модели окислительного стресса из-за своих уникальных биохимических свойств, таких как относительно длительный период полураспада и растворимость в липидах и водной среде (Droge, 2002). H2O2 легко проникает через мембрану, быстро устанавливается равновесие ее концентраций внутри и вне клетки. При исследовании чувствительности ММСК из жировой ткани человека к окислительному стрессу, вызванному широким диапазоном концентраций Н2О2, использовали величины LD5, LD15 и LD50 – концентрации Н2О2 в среде культивирования, при которых через 24 ч погибает 5%, 15% и 50% клеток соответственно. Для определения LD использовали удельную концентрацию (пмоль/кл), поскольку ранее показано, что на жизнеспособность клеток влияет не конечная концентрация Н2О2 в среде, а то ее количество, которое приходится на клетку (Бурова, Люблинская, Шатрова и др., 2012). В результате проведенных экспериментов на клетках трех разных доноров было выявлено, что для ММСК, культивируемых при 20% О2, LD15 и LD50 составляют 10,7±1,45 и 13,3±0,83 пмоль/кл., для ММСК при 1% О2 – 11,2±0,73 и 13,7±0,33 пмоль/кл. соответственно. При 5% О2 чувствительность к действию Н2О2 возрастала, показатель LD15 зарегистрирован на уровне 8±1 пмоль/кл., что достоверно ниже, чем в ММСК при 1% О2, а удельная концентрация Н2О2, соответствующая LD50, имела достоверно более низкое значение (11,3±0,33 пмоль/кл.) по сравнению с клетками при 20% и 1% О 2. Значения LD5 во всех трех группах регистрировались на уровне 6-8 пмоль/кл (рис. 32). Таким образом, по устойчивости к перекиси водорода ММСК из жировой ткани человека сравнимы с дермальными фибробластами (Бурова, Люблинская, Шатрова и др., 2012). Живые клетки, % 88 120 100 А 80 В 60 Б 40 20 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Н2О2, пмоль/кл. Рис. 32. Жизнеспособность ММСК, культивируемых при 20% О2 (А), 5% О2 (Б) и 1% О2 (В), после 24-часового окислительного стресса в зависимости от удельного количества Н2О2 в среде. Данные репрезентативного эксперимента, n=3. При исследовании путей клеточной гибели было показано, что перекись водорода индуцирует гибель клеток преимущественно путем апоптоза (табл. 13). Таблица 13. Пути клеточной гибели ММСК, культивируемых в условиях различного содержания О2, после обработки Н2О2 в дозах LD5 и LD15. AnnV-PI-, % AnnV+PI-, % AnnV-PI+, % AnnV+PI+, % 20% 94,60,28 2,00,20 2,30,57 1,1±0,09 5% 95,22,02 3,6±1,86 0,60,33 0,5±0,26 1% 95,10,38 4,0±0,20 0,20,02 0,6±0,21 20% 85,8±1,09 7,2±2,67 0,90,39 6,0±3,07 5% 84,9±1,46 10,2±1,58 0,50,09 4,45±2,70 1% 85,9±1,34 10,1±0,72 0,80,28 3,16±0,52 Доза Содержание О2 Н2О2 в среде LD5 LD15 Представлено количество живых (AnnV-PI-), апоптотических (AnnV+PI-), некротических (AnnV-PI+) и клеток в состоянии постапоптотического некроза (AnnV+PI+) в виде Мm, n=3. 89 3.3.2. Активность прооксидантной системы 3.3.2.1. Содержание АФК С помощью H2DCFDA методами проточной цитофлуориметрии было обнаружено, что обработка ММСК Н2О2 в дозе LD5, в отличие от LD15, через 24 ч вызывает продукцию Изменение содержания АФК в ММСК, кратность отличий внутриклеточных АФК независимо от содержания О2 в среде культивирования (рис. 33). * 2,5 * 2 1,5 * LD5 LD15 1 0,5 0 20% 5% 1% Содержание кислорода в среде культивирования Рис. 33. Изменение содержания АФК в ММСК, культивируемых при разном содержании О2, через 24 ч после воздействия Н2О2 в дозах LD5 и LD15. Данные представлены в виде M±m, n=3. * - p≤0,01 относительно средней интенсивности флуоресценции H2DCFDA в интактных ММСК при соответствующих условиях культивирования Как известно, обработка перекисью водорода помимо непосредственного влияния приводит к образованию различных форм АФК, например, супероксида, перекиси водорода и гидроксильного радикала, которые способны повреждать ДНК, белки и липиды мембран клетки (Cadenas, 1989). В нашей работе более сильное изменение содержания внутриклеточных АФК вызывала низкая концентрация H2O2. Наблюдаемое уменьшение величины данного показателя при увеличении дозы воздействия обусловлено, по-видимому, пермеабилизацией мембран в результате окислительного стресса и вытеканием красителя в среду. Оценка содержания внутриклеточных АФК в ММСК проводилась через 24 после начала воздействия H 2O2, при этом отмечено относительно небольшое увеличение количества внутриклеточных АФК. Аналогичную картину наблюдали исследователи в экспериментах с клетками HeLa (Непряхина, 90 2009). Проведенный ими детальный анализ зависимости накопления АФК в клетках от времени воздействия H2O2 выявил наиболее интенсивное увеличение продукции АФК на начальных этапах воздействия (2 ч). Можно предположить, что накопление АФК компенсируется благодаря увеличению активности антиоксидантных систем клетки. 3.3.2.2. Содержание ТБК-активных продуктов Перекись водорода внутриклеточных в АФК концентрации при всех LD5 способствовала повышению количества вариантах культивирования, однако, не вызывала окислительного стресса, о чем свидетельствует отсутствие изменений в содержании ТБКактивных продуктов – маркеров перекисного окисления липидов (рис. 34). Увеличение содержания ТБК-активных продуктов в клетках происходило при действии перекиси водорода в концентрации LD15. Наибольшего среднего значения данная величина Содержание ТБК-активных продуктов в ММСК, кратность отличий достигала в ММСК при 5% О2. 7 * 6 5 LD5 LD15 4 3 * * 2 1 0 20% 5% 1% Условия культивирования Рис. 34. Изменение содержания ТБК-активных продуктов в ММСК, культивируемых при разном содержании О2, через 24 ч после воздействия Н2О2 в дозах LD5 и LD15. Данные представлены в виде M±m, n=3. * - p≤0,01 относительно содержания ТБК-активных продуктов в интактных ММСК при соответствующих условиях культивирования 91 3.3.3. Функционирование антиоксидантной системы. Активность каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы Достоверных различий в уровне активности каталазы при действии пероксида водорода в течении 24 ч также не было обнаружено, однако, при 5% О2 после обработки Н2О2 в дозе LD15 наблюдалась тенденция к увеличению уровня активности данного фермента. Достоверных изменений на уровне каталазы на исследуемом временном отрезке не наблюдалось, что, Изменение активности каталазы в ММСК, кратность отличий возможно, может объясняться более ранней ее активацией (рис. 35). 3,5 3 2,5 2 LD5 LD15 1,5 1 0,5 0 20% 5% 1% Содержание кислорода в среде культивирования Рис. 35. Изменение активности каталазы в ММСК, культивируемых при разном содержании О2, через 24 ч после воздействия Н2О2 в дозах LD5 и LD15. Данные представлены в виде M±m, n=3. Повышение активности СОД в 1,15-1,25 раз при всех вариантах условий культивирования наблюдалось после воздействия Н2О2 в дозе LD15, а также при 1% О2 и наиболее интенсивно (в 1,7 раз) при 5% О2 после LD5 (рис. 36). Активность СОД в ММСК, кратность отличий 92 # * 2 1,5 * * * * LD5 1 LD15 0,5 0 20% 5% 1% Условия культивирования Рис. 36. Изменение активности СОД в ММСК, культивируемых при разном содержании О2, через 24 ч после воздействия Н2О2 в дозах LD5 и LD15. Данные представлены в виде M±m, n=3. * - p≤0,01 относительно активности СОД в интактных ММСК при соответствующих условиях культивирования # - p≤0,01 относительно изменений СОД в ММСК при 20% и 1% О2 Перекись водорода в дозе LD15 способствовала увеличению в 1,7 раза активности глутатионпероксидазы при обработке клеток при 5% кислорода (рис. 37). В других условиях достоверных изменений не отмечалось. Активность ГП в ММСК, кратность отличий 93 * 2 1,5 LD5 1 LD15 0,5 0 20% 5% 1% Условия культивирования Рис. 37. Изменение активности ГП в ММСК, культивируемых при разном содержании О2, через 24 ч после воздействия Н2О2 в дозах LD5 и LD15. Данные представлены в виде M±m, n=3. * - p≤0,01 относительно активности ГП в интактных ММСК при соответствующих условиях культивирования и изменений ГП в ММСК при 20% и 1% О2 Таким образом, на временном отрезке 24 ч от начала действия пероксида водорода на клетки самыми чувствительными компонентами антиоксидантной системы ММСК являются СОД и ГП. Активность ферментов при действии Н2О2 наиболее интенсивно увеличивается в клетках при 5% кислорода. 3.3.4. Экспрессия генов, связанных с окислительным стрессом При рассмотрении уровня экспрессии генов, связанных с окислительным стрессом, изучали гены 7 изоформ глутатионпероксидазы, 3 изоформ супероксиддисмутазы и каталазы после обработки клеток при 20% кислорода перекисью водорода в дозе LD15. Было обнаружено увеличение количества мРНК GPX1, GPX7, SOD1 и SOD2 (табл. 14), что согласуется с полученными нами данными об активности указанных ферментов. 94 Таблица 14. Изменение экспрессии генов некоторых ферментов в ММСК, культивируемых в среде с 20% О2, через 24 ч после воздействия Н2О2 в дозе LD15. RefSeq Символ Название продукта гена Экспрессия гена p относительно нормоксии (20% О2), кратность различий NM_000581 GPX1 Глутатионпероксидаза 1 1,36 0,044638** NM_002083 GPX2 Глутатионпероксидаза 2 -1,42 0,721638 NM_002084 GPX3 Глутатионпероксидаза 3 2,72 0,100193 NM_002085 GPX4 Глутатионпероксидаза 4 1,12 0,087788 NM_001509 GPX5 Глутатионпероксидаза 5 -1,25 0,58497 NM_182701 GPX6 Глутатионпероксидаза 6 -1,28 0,475627 NM_015696 GPX7 Глутатионпероксидаза 7 2,28 0,000171** NM_000454 SOD1 Супероксиддисмутаза 1, 2,69 0,000514** 2,98 0,000196** -1,07 0,409125 1,05 0,847114 цитоплазматическая NM_000636 SOD2 Супероксиддисмутаза 2, митохондриальная NM_003102 SOD3 Супероксиддисмутаза 3, внеклеточная NM_001752 CAT Каталаза ** - p<0,05 относительно экспрессии гена в ММСК при 20% О2 В условиях окислительного стресса в зависимости от типа клеток аналогичное воздействие способствует увеличению экспрессии генов CAT и GPX1 (Braun, 2012). Как показано в экспериментах по моделированию окислительного стресса в эндотелиальных и гладкомышечных клетках, обработка H2O2 может активировать различные сигнальные пути, в том числе NADPH оксидазу и сопровождаться повышением количества О2.- (Li, 2001). Данный факт не противоречит результатам проведенных измерений активности СОД. Также в нашей работе показано, что ГП принимает более активное участие в элиминации пероксида водорода по сравнению с каталазой. Wijeratne, Cuppett, Schlegel (2005) установили подобную закономерность на клеточной линии Caco-2. В экспериментах этих авторов активность каталазы не изменялась в зависимости от количества добавляемой H2O2, в то время как активность ГП при высоких концентрациях пероксида увеличивалась в несколько раз. 95 Кроме того выявлено, что даже в эритроцитах, где содержание каталазы велико, нейтрализация H2O2 происходит с помощью ГП (Nicholls, 1972). 96 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Стромальный компартмент тканей внутренней среды состоит из клеток разной степени дифференцировки, среди которых важное место занимает популяция малодифференцированных предшественников, которые в настоящее время принято называть мультипотентными мезенхимальными стромальными (стволовыми) клетками (ММСК). Это гетерогенная популяция клеток разной степени коммитированности и различной локализации в организме, которые привлекают значительный интерес в связи с их фундаментальной ролью в обеспечении физиологии и регенерации тканей. Благодаря тому, что МСК могут быть легко выделены из организма и использованы в клеточной терапии и регенеративной медицине как для аутологичного, так и аллогенного введения, интерес к биологии этих клеток все время растет. Уже накоплен значительный экспериментальный и клинический демонстрирующий эффективность применения ММСК (Сaplan, 2006; материал, Dong, Caplan, 2012; Dimarino, Caplan, Bonfield, 2013; Sohni, Verfaillie, 2013; Almeida, Donizetti-Oliveira, BarbosaCosta, 2013). Тем не менее, успешное применение данных клеток зачастую зависит от устойчивости к неблагоприятным факторам микроокружения, среди которых одним из главных является окислительный стресс. В данной работе проанализированы особенности окислительно-восстановительного и энергетического метаболизма ММСК в зависимости от содержания кислорода в среде культивирования, а также проведена оценка влияния уровня О2 in vitro на устойчивость клеток к моделируемому окислительному стрессу. Результаты показали, что наименее повреждающее действие на клетки оказывает среда с 5% кислорода (рис. 38). Условия повышенного (20%) и пониженного (1%) содержания кислорода вызывают в клетках слабый окислительный стресс, адаптация к которому, вероятно, приводит к повышению устойчивости клеток к моделируемому окислительному стрессу, поскольку данные условия способствуют повышению активности ферментов антиоксидантой системы. Кроме того, при физиологической (5%) и пониженной (1%) концентрации кислорода в среде культивирования по сравнению с клетками в 20% О2 происходит уменьшение поглощения кислорода ММСК, снижение величины трансмембранного потенциала и продукции АТФ, а также активация гликолиза, что сопровождается увеличением экспрессии генов глюкозных транспортеров и ферментов гликолитического пути. Данные изменения могут быть обусловлены обратимым повышением экспрессии гена HIF-1α, наблюдаемым при уменьшении концентрации кислорода в среде культивирования. Таким образом, проведенное исследование демонстрирует роль кислорода не только как фактора, модулирующего свойства ММСК, но и как важного компонента микроокружения 97 клеток, позволяющего понять принципы их функционирования. Результаты дальнейших исследований в этой области внесут существенный вклад в прояснение механизмов участия ММСК в поддержании тканевого гомеостаза и регенерации тканей. Жизнеспособность ≈ Прооксидантная система ↑ Антиоксидантная система ↑ ∆ψ ≈ Дыхание ↑ Жизнеспособность ≈ Прооксидантная система ↑ Антиоксидантная система ↑ ∆ψ ↑ ММСК Дыхание ↑ 20% О2 АТФ ↑ Экспрессия гипоксия-ассоциированных генов ↓ Экспрессия HIF1A ≈ Экспрессия HIF3A ≈ Устойчивость к Н2О2 ↑ ММСК 20% О2 Жизнеспособность ≈ Прооксидантная система ↓ Антиоксидантная система ↓ ∆ψ ↓ Дыхание ↓ 3-48 ч Постоянное Жизнеспособность ≈ Прооксидантная система ↑ Антиоксидантная система ↑ ∆ψ ≈ ММСК 5% О2 3-48 ч ММСК 1% О2 культивирование Жизнеспособность ≈ Прооксидантная система ↑ Антиоксидантная система ↑ ∆ψ≈ ММСК Дыхание ↓ 1% О2 АТФ ↓ Экспрессия гипоксия-ассоциированных генов ↑ Экспрессия HIF1A ↓ Экспрессия HIF3A ↑ Устойчивость к Н2О2 ↑ Жизнеспособность ≈ Прооксидантная система ≈ Антиоксидантная система ≈ ↑ ∆ψ ≈ Рис. 38. Функционирование ММСК в условиях различного содержания кислорода. 98 ВЫВОДЫ 1. Уровень содержания кислорода в диапазоне от 20% до 1% не оказывает существенного влияния на жизнеспособность ММСК как при постоянном культивировании, так и при коротких экспозициях (24 ч). 2. Постоянное культивирование ММСК в условиях содержания О2, близких к физиологическим (5%), вызывает в них достоверное уменьшение количества ТБК-активных продуктов, активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы по сравнению с клетками в 20% и 1% О2, при этом устойчивость к окислительному стрессу, вызванному H2О2, снижается. 3. Содержание внутриклеточных АФК уменьшается при кратковременном снижении содержания О2 до 5% и увеличивается при изменении его уровня с 5% до 20% и 1%, при этом количество ТБК-активных продуктов возрастает в 1,75-2,5 раза в условиях снижения О2 до 1%, активность СОД и ГП в ММСК уменьшается на 5-35% при кратковременном снижении содержания кислорода до 5% и 1% и увеличивается при экспозиции из 5% в 20% и 1% О2. 4. Постоянное культивирование и кратковременные экспозиции в условиях пониженного О2 приводят к достоверному уменьшению трансмембранного потенциала митохондрий ММСК на 20-30%, количества потребляемого кислорода в 1,5-5,5 раз и синтеза АТФ, который происходит преимущественно за счет гликолиза, на 10-50%. 5. При постоянном культивировании в условиях 1% О2 наблюдается пониженная экспрессия гена -субъединицы гипоксия-индуцируемого транскрипционного фактора HIF-1α и повышенная экспрессия гена HIF-3α по сравнению с клетками, культивируемыми при 20% и 5% О2. При кратковременном снижении содержания О2 наблюдается кислород-зависимое транзиторное увеличение уровня HIF-1α в 1,5 раза, последующее снижение которого сопровождается возрастанием экспрессии HIF-3α в 17 раз. 6. Пониженное содержание О2 (5%, 1%) способствует увеличению в 1,5-10 раз экспрессии гипоксия-ассоциированных генов, принимающих участие в пролиферации (IL1A, LEP, MT3, VEGFA), метаболизме глюкозы (GPI, SLC2A1, SLC2A4) и ангиогенезе (VEGFA). 99 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Андреев А.Ю., Кушнарева Ю.Е., Старков A.A. Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях.// Биохимия. - 2005. - Т. 70. - Вып. 2. - С. 246-264. 2. Анохина Е.Б. Влияние пониженного содержания кислорода на культивируемые мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс : дис. … канд. биол. наук : 03.00.13; 03.00.25 / Анохина Екатерина Борисовна. - М., 2007. - 161 с. 3. Анохина Е.Б., Буравкова Л.Б. Механизмы регуляции транскрипционного фактора HIF при гипоксии.// Биохимия. - 2010. - Т. 75. - Вып. 2. - С. 185-195. 4. Бородкина А.В., Шатрова А.Н., Пуговкина Н.А. Различные защитные механизмы эмбриональных и тканеспецифичных стволовых клеток человека в условиях окислительного стресса.// Цитология. - 2013. - № 8. - С. 517-526. 5. Буравкова Л.Б., Андреева Е.Р., Григорьев А.И. Роль кислорода как физиологического фактора в проявлении функциональных свойств мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека.// Физиология человека. - 2012. - Т. 38. - № 4. - С. 121-130. 6. Буравкова Л.Б., Гринаковская О. С., Андреева Е. Р. и др. Характеристика мезенхимных стромальных клеток из липоаспирата человека, культивируемых при пониженном содержании кислорода.// Цитология. - 2009. - Т. 51. - № 1. - С. 5-11. 7. Буравкова Л.Б., Гринаковская О.С., Андреева Е.Р. и др. Модификация свойств мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани с помощью снижения содержания кислорода в среде культивирования./ Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные исследования и перспективы клинического применения. Под редакцией В.А. Ткачука. - М.: Литтерра. - 2009. - С. 125-146. 8. Буравкова Л.Б., Рылова Ю.В., Гальчук С.В. и др. Особенности метаболизма и экспрессии генов ММСК из жировой ткани человека, культивируемых при различном содержании кислорода./ Стволовые клетки и регенеративная медицина. Под ред. В.А. Ткачука. - М.: МАКС Пресс. - 2011. - С. 113-130. 9. Бурова Е.Б., Люблинская О.Г., Шатрова А.Н., Бородкина А.В., Никольский Н.Н. Сравнительный анализ устойчивости к окислительному стрессу стволовых клеток эндометрия и фибробластов человека.// Цитология. - 2012. - Т. 54. - № 6. - С. 478-483. 10. Владимиров Ю.А. Свободнорадикальное окисление липидов и физические свойства липидного слоя биологических мембран.// Биофизика. - 1987. - Т. 32. - № 5. - С. 830-844. 11. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах.// Соросовский образовательный журнал. - 2000. - №12. - C. 13-19. 100 12. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биомембранах./ Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. - М.: Наука, 1972 - 252 c. 13. Гамалей И.А, Полозов Ю.С, Аксенов Н.Д и др. Клеточный цикл и образование активных форм кислорода в фибробластах грызунов.// Цитология. - 2001. - Т. 43. - N. 6. - С. 595601. 14. Гривенникова В. Г., Виноградов А. Д. Генерация активных форм кислорода митохондриями.// Успехи биологической химии. - 2013. - Т. 53. - С. 245-296 15. Гринаковская О.С. Влияние газовых смесей с различным содержанием кислорода на культивируемые эндотелиальные и мезенхимальные стромальные клетки человека : дис. … канд. мед. наук : 14.00.32 / Гринаковская Ольга Сергеевна - М., 2007. - 154 с. 16. Донцов В.И., Крутько В.Н., Мрикаев Б.М. и др. Активные формы кислорода как система: значение в физиологии, патологии и естественном старении.// Информатика здоровья и долголетия. Труды ИСА РАН. - 2006. - Т. 19. - С. 50-69. 17. Дубинина Е.Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состояниях окислительного стресса.// Вопросы медицинской химии. - 2001. - Т. 47. - Вып. 6. - С. 561-581. 18. Жамбалова А.П., Гершович Ю.Г., Буравкова Л.Б. и др. Влияние пониженного содержания кислорода на дифференцировку мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека in vitro.// Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2009. - Т. 4. - № 3. - С. 47-51. 19. Золотухин П.В. Особенности окислительного статуса и регуляции транскриптома в процессе беременности : дис. … канд. биол. наук : 03.03.01 / Золотухин Петр Владимирович. - Ростов-на-Дону, 2014. - 177 с. 20. Зоров Д.Б., Банникова С.Ю., Белоусов В.В. и др. Друзья или враги. Активные формы кислорода и азота// Биохимия. - 2005. - Т. 70. - № 2. - С. 265-272. 21. Калинина Н. И., Сысоева В. Ю., Рубина К. А. и др. Мезенхимальные стволовые клетки в процессах роста и репарации тканей.// Acta Naturae. - 2011. - Вып. 4. - Т. 3. - С. 32-39. 22. Кожевников Ю.Н. О перекисном окислении липидов в норме и патологии.// Вопросы мед. химии. - 1985. - №5. - С. 2-7. 23. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г. Метод определения активности каталазы// Лаб. дело. – 1988. – № 1. – С. 16–19. 24. Кулинский В.И. Активированные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита.// Соросовский образовательный журнал. - 1999. № 1. - С. 2-7. 101 25. Матюшин Б. Н., Логинов А. С., Ткачев В. Д. Определение супероксиддисмутазной активности в материале пункционной биопсии печени при ее хроническом поражении// Лаб. дело. - 1991. - № 7. - С. 16-19. 26. Непряхина О.К. Изучение динамики митохондриального ретикулума при окислительном стрессе : автореф. дис. … канд. биол. наук : 03.00.25-03 / Непряхина Ольга Константиновна. - М., 2009. - 23 с. 27. Романов Ю.А., Даревская А.Н., Мерзликина Н.В. и др. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга и жировой ткани человека: получение, характеристика, возможности дифференцировки.// Клет. Технол. Биол. Мед. - 2005. - № 3. - С. 158-164. 28. Рылова Ю.В., Андреева Е.Р., Гогвадзе В.Г. и др. Этопозид и гипоксия не активируют апоптоз мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток in vitro.// Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2012. - № 3. - С.148-151. 29. Рылова Ю.В., Буравкова Л.Б. Постоянное культивирование мультипотентых мезенхимных стромальных клеток при пониженном содержании кислорода.// Цитология. - 2013. - № 12. - С. 852-859. 30. Рылова Ю. В., Буравкова Л.Б. Устойчивость мультипотентных мезенхимных стромальных клеток жировой ткани к аноксии in vitro.// Цитология. - 2014. - Т. 56. - № 12. - С. 881-889. 31. Терских В.В., Васильев А.В.1 Воротеляк Е.А. Ниши стволовых клеток.// Известия российской академии наук. Серия биологическая. - 2007. - № 3. - С. 261-272. 32. Ткачук В.А., Тюрин Кузьмин П.А., Белоусов В.В. и др. Пероксид водорода как новый вторичный посредник.// Биологические мембраны. - 2012. - Т. 29. - № 1-2. С. 21–37. 33. Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р.К., Лалыкина К.С. О фибробластоподобных клетках в культурах кроветворной ткани морских свинок // Цитология. – 1970. – Т. 12. - № 9. – С. 1147-1155. 34. Хавинсон В.Х., Баринов В.А., Арутюнян А.В. и др. Свободнорадикальное окисление и старение./ В.Х. Хавинсон, В.А. Баринов, А.В. Арутюнян, В.В. Малинин. - СПб.: Наука, 2003. - 327 с. 35. Ченас Н.К., Ракаускене Г.А., Кулис Ю.Ю. Соотношения между глутатионредуктазной и диафоразной активностью глутатионредуктазы из Sacharomyces Cerevisiae.// Биохимия. 1989. - Vol. 34. - № 7. - P. 1090-1097. 36. Adams J.M., Difazio L.T., Rolandelli R.H. HIF-1: a key mediator in hypoxia.// Acta Physiol Hung. - 2009. - Vol. 96. - N. 1. - P. 19-28. 102 37. Al-Khaldi A., Al-Sabti H., Galipeau J. Therapeutic Angiogenesis Using Autologous Bone Marrow Stromal Cells: Improved Blood Flow in a Chronic Limb Ischemia Model.// Ann Thorac Surg. - 2003. - Vol. 75. - P. 204-209. 38. Almeida D.C., Donizetti-Oliveira C., Barbosa-Costa P. In Search of Mechanisms Associated with Mesenchymal Stem Cell-Based Therapies for Acute Kidney Injury.// Clin Biochem Rev. 2013. - Vol. 34. - N. 3. - P. 131-144. 39. Ambrosini G., Nath A.K., Sierra-Honigmann M. et al. Transcriptional Activation of the Human Leptin Gene in Response to Hypoxia. Involvement of hypoxia-inducible factor.// The Journal of Biological Chemistry. - 2002. - Vol. 277. - N. 37. - P. 34601–34609. 40. Ambrosio G., Zweier J.L., Duilio C. et al. Evidence that mitochondrial respiration is a source of potentially toxic oxygen free radicals in intact rabbit hearts subjected to ischemia and reflow.// J Biol Chem. - 1993. - Vol. 268. - N. 25. - P. 18532-18541. 41. Andrae U., Singh J., Ziegler-Skylakakis K. Pyrnvate and related alpha-ketoacids protect mammalian cells in culture against hydrogen-peroxide induced cytotoxicity.// Toxicol. Lett. 1985. - Vol. 28. P.93-98. 42. Atashi F., Modarressi A., Pepper M.S. The Role of Reactive Oxygen Species in Mesenchymal Stem Cell Adipogenic and Osteogenic Differentiation: A Review.// Stem Cells Dev. - 2015. 43. Balin A.K., Fisher A.J., Carter D.M. Oxygen modulates growth of human cells at physiologic partial pressures.// J. Exp. Med. - 1984. - Vol. 160. - P. 152-166. Basciano L., Nemos C., Foliguet B. Long term culture of mesenchymal stem cells in hypoxia promotes a genetic program maintaining their undifferentiated and multipotent status.// BMC Cell Biology. - 2011. - Vol. 12. - Art. 12. 44. Becker L.B., Vanden Hoek T.L., Shao Z.H. et al. Generation of superoxide in cardiomyocytes during ischemia before reperfusion.// Am J Physiol Heart Circ Physiol. - 1999. - Vol. 277. - P. 2240 - 2246. 45. Beegle J., Lakatos K., Kalomoiris S. et al. Hypoxic Preconditioning of Mesenchymal Stromal Cells Induces Metabolic Changes, Enhances Survival and Promotes Cell Retention in Vivo.// Stem Cells. - 2015. 46. Bhuyan K.C., Bhuyan D.K. Regulation of hydrogen peroxide in eye tumors. Effects of 3amino-l-H-1,2,4-triazole on catalase and glutathione peroxidase of rabbit eye.// Biochim. Biophys. Acta. - 1977. - Vol. 497. - P. 641-651. 47. Bigarella C.L., Liang R., Ghaffari S. Stem cells and the impact of ROS signaling.// Development. - 2014. - Vol. 141. - N. 22. - P. 4206-4218. 48. Bozhkov A.I., Klimova E.M., Nikitchenko Y.V. et al. Stem Cells Take Part in Regulation of Prooxidant Activity and Immunity at Liver Fibrosis.// American Journal of Biomedical and 103 Life Sciences. Special Issue: Mechanisms of Protection Against Oxidative Stress. - 2014. - Vol. 2. - P. 5-12. 49. Boyette L.B., Creasey O.A., Guzik L. et al. Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Display Enhanced Clonogenicity but Impaired Differentiation With Hypoxic Preconditioning.// Stem Cells Transl Med. - 2014. - Vol. 3. - N. 2. - P. 241-254. 50. Buravkova L., Andreeva E., Gogvadze V. et al. Mesenchymal stem cells and hypoxia: where are we? // Mitochondrion. - 2014. - Vol. 19. - P. 105–112. 51. Buravkova L.B., Andreeva E.R., Rylova J.V. O2-influence on MMSC's metabolic and differentiation status./ Recent researches in modern medicine. - Cambrige: WSEAS Press. 2011. - P. 43-48. 52. Buschfort C.M., Muller R., Seeber S. et al. DNA excision repair profiles of normal and leukemic human lymphocytes: functional analysis at the single-cell level.// Cancer Res. - 1997. - Vol. 57. - P. 651-658. 53. Cadenas E. Biochemistry of oxygen toxicity.// Annu Rev Biochem. - 1989. - Vol. 58. - P. 79110. 54. Caplan A.I. Mesenchymal stem cells.// J Orthop Res. - 1991. - Vol. 9. - N. 5. - P. 641-650. 55. Caplan A.I., Dennis J.E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators.// 56. Carmeliet P., Dor Y., Herbert J.M. et al. Role of HIF-1alpha in hypoxia-mediated apoptosis, cell proliferation and tumour angiogenesis.// Nature. - 1998. - Vol. 394. - P. 485-490. 57. Carriere A., Ebrahimian T.G., Dehez S. et al. Preconditioning by mitochondrial reactive oxygen species improves the proangiogenic potential of adipose-derived cells-based therapy.// Arterioscler Thromb Vasc Biol. - 2009. - Vol. 29. - N. 7. - P. 1093-1099. 58. Carriere A., Fernandez Y., Rigoulet M. et al. Inhibition of preadipocyte proliferation by mitochondrial reactive oxygen species.// FEBS Lett. - 2003. - Vol. 550. - P. 163-167. 59. Carvalho P.P., Wu X., Yu G. et al. The effect of storage time on adipose-derived stem cell recovery from human lipoaspirates.// Cells Tissues Organs. - 2011. - Vol. 194. - N. 6. - P. 494500. 60. Cerutti P.A. Prooxidant states and tumor promotion.// Science. - 1985. - Vol. 227. P. 375-381. 61. Chacko S.M., Ahmed S., Selvendiran K. et al. Hypoxic preconditioning induces the expression of prosurvival and proangiogenic markers in mesenchymal stem cells.// Am J Physiol Cell Physiol. - 2010. - Vol. 299. - N. 6. - P. 1562-1570. 62. Chang W., Lee C.Y., Park J.H. et al. Survival of hypoxic human mesenchymal stem cells is enhanced by a positive feedback loop involving miR-210 and hypoxia-inducible factor 1.// J Vet Sci. - 2013. - Vol. 14. - N. 1. -P. 69-76. 104 63. Chang W., Song B., Moon J. et al. Anti-death strategies against oxidative stress in grafted mesenchymal stem cells.// Histol Histopathol. - 2013. - Vol. 28. - P. 1529-1536. 64. Cheeseman K. H., Slater T. F. // Brit. Med. Bull. - 1993. - Vol. 49. - P. 481-493. 65. Chen T.L., Zhu G.L., Wang J.A. et al. Apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells caused by hypoxia/reoxygenation via multiple pathways.// Int J Clin Exp Med. - 2014. - Vol. 7. - N. 12. - P. 4686-4697. 66. Chen Y.H., Teng X.M., Chen W.Q. et al. Timing of transplantation of autologous bone marrow derived mesenchymal stem cells for treating myocardial infarction.// Science China Life Sciences. - 2014. - Vol. 57. - N. 2. - P. 195-200. 67. Chen X., Zhong Z., Xu Z. et al. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.// Free Radic Res. - 2010. - Vol. 44. - № 6. - P. 587-604. 68. Cheng W.H., Ho Y.S., Valentine B.A. et al. Cellular glutathione peroxidase is the mediator of body selenium to protect against paraquat lethality in transgenic mice.// J Nutr. - 1998. - Vol. 128. - № 7. - P. 1070-1076. 69. Choi J.R., Pingguan-Murphy B., Wan Abas W.A. et al. Impact of low oxygen tension on stemness, proliferation and differentiation potential of human adipose-derived stem cells.// Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2014. - Vol. 448. - P. 218-224. 70. Cohen G., Hochstein P. Glutathione peroxidase: the primary agent for the elimination of hydrogen peroxide in erythrocytes.// Biochemistry. - 1963. - Vol. 2. - P. 1420-1428. 71. Covello K.L., Kehler J., Yu H. et al. HIF-2alpha regulates Oct-4: effects of hypoxia on stem cell function, embryonic development, and tumor growth.// Genes Dev. - 2006. - Vol. 20. - N. 5. - P. 557-570. 72. Crisostomo P.R., Wang Y., Markel T.A. et al. Human mesenchymal stem cells stimulated by TNF-alpha, LPS, or hypoxia produce growth factors by an NF kappa B- but not JNKdependent mechanism.// Am J Physiol Cell Physiol. - 2008. - Vol. 294. - P. 675-682. 73. Csete M. Oxygen in the Cultivation of Stem Cells.// Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2005. - Vol. 1049. P. 1-8. 74. Colter C.D., Sekiya I., Prockop D.J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells.// Proc Natl Acad Sci USA. - 2001. - Vol. 98. - N. 14. - P. 7841–7845. 75. Covello K.L., Kehler J., Yu H. et al. HIF-2alpha regulates Oct-4: effects of hypoxia on stem cell function, embryonic development, and tumor growth.// Genes Dev. - 2006. - Vol. 20. - P. 557-570. 105 76. Da Silva Meirelles L., Chagastelles P.C., Nardi, N.B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues.// Journal of Cell Science. - Vol. 119. - P. 2204-2213. 77. Datta S.R., Brunet A., Greenberg M.E. Cellular survival: a play in three Akts.// Genes Dev. 1999. - Vol. 13. - N. 22. - P. 2905-2927. 78. Dayem A.A., Choi H.Y., Kim J.H. et al. Role of Oxidative Stress in Stem, Cancer, and Cancer Stem Cells.// Cancers. - 2010. - Vol. 2. - P. 859-884. 79. Dazzi F., Ramasamy R., Glennie S. et al. The role of mesenchymal stem cells in haemopoiesis.// Blood reviews. - 2006. - Vol. 20. - P. 161-171. 80. Demple B. Radical ideas: genetic responses to oxidative stress.// Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. - 1999. - Vol. 26. - P. 64-68. 81. Dernbach E., Urbich C., Brandes R.P. et al. Antioxidative stress-associated genes in circulating progenitor cells: evidence for enhanced resistance against oxidative stress.// Blood. - 2004. Vol. 104. - N. 12. - P. 3591-3597. 82. Dery M.A., Michaud M.D., Richard D.E. Hypoxia-inducible factor 1, regulation by hypoxic and non-hypoxic activators.// Int. J. Biochem. Cell Biol. - 2005. - Vol. 37. - P. 535-540. 83. Deschepper M., Oudina K., David B. et al. Survival and function of mesenchymal stem cells (MSCs) depend on glucose to overcome exposure to long-term, severe and continuous hypoxia.// Journal of cellular and molecular medicine. - 2011. - Vol. 15. - P. 1505-1514. 84. Dimarino A.M., Caplan A.I., Bonfield T.L. Mesenchymal stem cells in tissue repair.// Front Immunol. - 2013. - Vol. 4. - P. 201. 85. Ding L., Liu Z., Zhu Z. et al. Biochemical characterization of selenium-containing catalytic antibody as a cytosolic glutathione peroxidase mimic.// Biochem J. - 1998. - Vol. 15. - N. 332. - P. 251-255. 86. D’Ippolito G.D., Diabira S., Howard G.A. Low oxygen tension inhibits osteogenic differentiation and enhances stemness of human MIAMI cells.// Bone. - 2006. - Vol. 39. - P. 513-522. 87. Dobashi K., Pahan K., Chahal A. et al. Modulation of endogenous antioxidant enzymes by nitric oxide in rat C6 glial cells.// J Neurochem. - 1997. - Vol. 68. - P. 1896-1903. 88. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.// Cytotherapy. - 2006. - Vol. 8. - N. 4. - P. 315-317. 89. Dong F., Caplan, A.I. Cell transplantation as an initiator of endogenous stem cell-based tissue repair.// Curr. Opin. Organ Transplant. - 2012. - Vol. 17, P. 670-674. 90. Dong Z., Wang J.Z., Yu F. et al. Apoptosis-resistance of hypoxic cells: multiple factors involved and a role for IAP-2.// Am J Pathol. - 2003. - Vol. 163. - P. 663-671. 106 91. Dos Santos F., Andrade P.Z., Boura J.S., et al. Ex vivo expansion of human mesenchymal stem cells: a more effective cell proliferation kinetics and metabolism under hypoxia.// J Cell Physiol. - 2010. - Vol. 223. - P. 27-35. 92. Drela K., Sarnowska A., Siedlecka P. et al. Low oxygen atmosphere facilitates proliferation and maintains undifferentiated state of umbilical cord mesenchymal stem cells in an hypoxia inducible factor-dependent manner.// Cytotherapy. - 2014. - Vol. 16. - N. 7. - P. 881-892. 93. Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function.// Physiol Rev. - 2002. Vol. 82. - P. 47-95. 94. Ehninger A., Trumpp A. The bone marrow stem cell niche grows up: mesenchymal stem cells and macrophages move in.// J. Exp. Med. - Vol. 208. - N. 3. - P. 421-428. 95. Fehrer C., Brunauer R., Laschober G. et al. Reduced oxygen tension attenuates differentiation capacity of human mesenchymal stem cells and prolongs their lifespan.// Aging Cell. - 2007. Vol. 6. - N. 6. - P. 745-757. 96. Finkel T. Oxidant signals and oxidative stress.// Curr Opin Cell Biol. - 2003. - Vol. 15. - N. 2. P. 247-254. 97. Folmes C.D., Dzeja P.P., Nelson T.J. et al. Metabolic plasticity in stem cell homeostasis and differentiation.// Cell stem cell. - Vol. 11. - P. 596-606. 98. Folmes C.D., Nelson T.J., Martinez-Fernandez A. et al. Somatic oxidative bioenergetics transitions into pluripotency-dependent glycolysis to facilitate nuclear reprogramming.// Cell Metab. - 2011. - Vol. 14. - P. 264-271. 99. Forristal C.E., Wright K.L., Hanley N.A. et al. Hypoxia inducible factors regulate pluripotency and proliferation in human embryonic stem cells cultured at reduced oxygen tensions.// Reproduction. - 2010. - Vol. 139. - N. 1. - P. 85-97. 100. Friedenstein A.J., Chailakhjan R.K., Lalikina K.S. (1976). The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells.// Cell Tissue Kinet. - 1976. - Vol. 3. - N. 4. - P. 393-403.Friedenstein A.J., Gorskaja J.F., Kulagina N.N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs.// Exp Hematol. - 1976. - Vol. 4. - N. 5. - P. 267-274. 101. Fukai T; Ushio-Fukai M. Superoxide dismutases: role in redox signaling, vascular function, and diseases.// Antioxid. Redox Signaling. - 2011. - Vol. 15. - P. 1583-1606. 102. Fukuchi Y., Nakajima H., Sugiyama D. et al. Human placentaderived cells have mesenchymal stem/progenitor cell potential.// Stem Cells. - 2004. - Vol. 22. P. 649-658. 103. Gainsford T., Willson T.A., Metcalf D. et al. Leptin can induce proliferation, differentiation, and functional activation of hemopoietic cells.// Proc Natl Acad Sci USA. 1996. - Vol. 93. - N. 25. - P. 14564-14568. 107 104. Garrido A.M., Griendling K.K. NADPH oxidases and angiotensin II receptor signaling.// Mol Cell Endocrinol. - 2009. - Vol. - 302. N. 2. - P. 148-158. 105. Giile J.J.P., Joenje H. Biological consequences of oxygen toxicity.// Membrane Lipid Oxidation. Ed. C. Vigo-Pelfrey. - An introduction, in: C. Vigo-Pelfrey (Ed.). - Boca Raton, FL, CRC Press. - 1991. - Vol. III. - P. 1-32. 106. Greer S.N., Metcalf J.L., Wang Y. et al. The updated biology of hypoxia-inducible factor.// The EMBO Journal. - 2012. - Vol. 31. - N. 11. - P. 2448-2460. 107. Greijer A.E., Wal E. The role of hypoxia inducible factor 1 (HIF-1) in hypoxia induced apoptosis.// J Clin Pathol. - 2004. - Vol. 57. - N. 10. - P. 1009-1014. 108. Griendling K.K., Sorescu D., Ushio-Fukai M. NAD(P)H oxidase: role in cardiovascular biology and disease.// Circ Res. - 2000. - Vol. 86. - N. 5. - P. 494-501. 109. Guan Y., Hickey M.J., Borgstahl G.E. et al. Crystal structure of Y34F mutant human mitochondrial manganese superoxide dismutase and the functional role of tyrosine 34.// Biochemistry. - 1998. - Vol. 37. - P. 4722-4730. 110. Guzy R.D., Schumacker P.T. Oxygen sensing by mitochondria at complex III: the paradox of increased reactive oxygen species during hypoxia.// Exp. Physiol. - 2006. - Vol. 91. - № 5. - P. 807-819. 111. Iida K., Takeda-Kawaguchi T., Tezuka Y. et al. Hypoxia enhances colony formation and proliferation but inhibits differentiation of human dental pulp cells.// Arch. Oral Biology. 2010. - Vol. 55. - N. 9. - P. 648-654. 112. Ivan M., Kondo K., Yang H. et al. HIFα targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: implications for O2 sensing.// Science. - 2001. - Vol. 292. - P. 464-468. 113. Iwasea T., Nagayaa N., Fujii T. et al. Comparison of angiogenic potency between mesenchymal stem cells and mononuclear cells in a rat model of hindlimb ischemia.// Cardiovascular Research. - 2005. - Vol. 66. - P. 543 – 551. 114. Halliwell B. Oxidative stress in cell culture: an under-appreciated problem?// FEBS Letters. 2003. - Vol. 540. - P. 3-6. 115. Halliwell B. Biochemistry of oxidative stress.// Biochemical Society Transactions. - 2007. - Vol. 35. - P. 1147-1150. 116. Halliwell B., Gutteridge J. Free Radicals in Biology and Medicine./ B. Halliwell, J. Gutteridge. - Oxford: Oxford University Press. - 1999. 117. Hamanaka R.B., Chandel N.S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes.// Trends Biochem Sci. - 2010. - Vol. 35. - N. 9. - P. 505-513. 108 118. Harman D. Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry.// J. Gerontol. - 1956. - Vol. 11. - P. 298-300. 119. Havens C.G., Ho A., Yoshioka N. et al. Regulation of Late G1/S Phase Transition and APCCdh1 by Reactive Oxygen Species.// Mol Cell Biol. - 2006. - Vol. 26. - N. 12. - P. 47014711. 120. Havir E.A., McHale N.A. Enhanced-peroxidatic activity in specific catalase isozymes of tobacco, barley, and maize.// Plant Physiol. - 1989. - Vol. 91. - N. 3. - P. 812-815. 121. Hellwig-Burgel T., Stiehl D.P., Wagner A.E.et al. Review: Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): A novel transcription factor in immune reactions.// J Interferon Cytokine Res. - 2005. -Vol. 25. - P. 297-310. 122. Hinshaw D.B., Burger J.M., Delius R.E. et al. Mechanism of protection of oxidant- injured endothelial cells by glutamine.// Surgery. - 1990. - Vol. 108. - N. 2. - P. 298-304. 123. Hofmann B., Hecht H.J., Flohe L. Peroxiredoxins.// Biol Chem. - 2002. - Vol. 383. - P. 347-364. 124. Holmquist-Mengelbier L., Fredlund E., Lofstedt T. et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF2alpha promotes an aggressive phenotype.// Cancer Cell. - 2006. - Vol. 10. - P. 413-423. 125. Holmstrom K.M., Finkel T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signaling.// Nature reviews. - 2014. - Vol. 15. - P. 411-421. 126. Horwitz E.M., Le Blanc K., Dominici M. et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement.// Cytotherapy. - 2005. - Vol. 7. - N. 5. - P. 393-395. 127. Hoffmann A., Czichos S., Kaps C. et al. The T-box transcription factor Brachyury mediates cartilage development in mesenchymal stem cell line C3H10T1/2.// J Cell Sci. - 2002. - Vol. 115. - P. 769–781. 128. Hu Y., Fu L., Li S. Hif-1α and Hif-2α differentially regulate Notch signaling through competitive interaction with the intracellular domain of Notch receptors in glioma stem cells.// Cancer Lett. - 2014. - Vol. 349. - N. 1. - P. 67-76. 129. Hu C.J., Iyer S., Sataur A. et al. Differential regulation of the transcriptional activities of hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1alpha) and HIF-2alpha in stem cells.// Mol Cell Biol. 2006. - Vol. 26. - P. 3514-3526. 130. Hu T., Ramachandrarao S.P., Siva S. et al. Reactive oxygen species production via NADPH oxidase mediates TGF beta-induced cytoskeletal alterations in endothelial cells.// Am J Physiol Renal Physiol. - 2005. - Vol. 289. - N. 4. - P. 816-825. 109 131. Hunt C., Sim J.E., Sullivan S.J. et al. Genomic instability and catalase gene amplification induced by chronic exposure to oxidative stress.// Cancer Res. - 1998. - Vol. 58. P. 3986-3992. 132. Imai H., Narashima K., Arai M. et al. Suppression of leukotriene formation in RBL-2H3 cells that overexpressed phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase.// J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273. - P. 1990-1997. 133. Inʹt Anker P.S., Scherjon S.A., Kleijburg-van der Keur C. et al. Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta.// Stem Cells. - 2004. - Vol. 22. - N. 7. - P. 1338-1345. 134. Jaakkola P., Mole D.R., Tian Y.M. et al. Targeting of HIF-α to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation.// Science. - 2001. - Vol. 292. - P. 468-472. 135. Jiang Y., Jahagirdar B.N., Reinhardt R.L. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.// Nature. - 2002. - Vol. 418. - N. 6893. - P. 41-49. 136. Jones D.A. The role of oxygen concentration in oxidative stress: hypoxic and hyperoxic models.// Oxidative Stress. Ed. H. Sies. - New York, Academic Press. - 1985. - P. 152-195. 137. Jones D.L., Wagers A.J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche.// Nat Rev Mol Cell Biol. - 2008. - Vol. 9. - P. 11–21. 138. Kaewsuwan S., Song S.Y., Kim J.H. et al. Mimicking the functional niche of adipose- derived stem cells for regenerative medicine.// Expert Opin Biol Ther. - 2012. - Vol. 12. - N. 12. - P. 1575-1588. 139. Kang S., Kim S.M., Sung J.H. Cellular and molecular stimulation of adipose-derived stem cells under hypoxia.// Cell Biol Int. - 2014. - Vol. 38. P. 553-562. 140. Keith B., Johnson R.S., Simon M.C. HIF1α and HIF2α: sibling rivalry in hypoxic tumour growth and progression.// Nature Reviews Cancer. - 2012. - Vol. 12. - N. 1. - P. 9-22. 141. Kfoury Y., Scadden D.T. Mesenchymal Cell Contributions to the Stem Cell Niche.// Cell Stem Cell. - 2015. - Vol. 16. - N. 3. - P. 239-253. 142. Kiani A.A., Abdi J., Halabian R. Over expression of HIF-1α in human mesenchymal stem cells increases their supportive functions for hematopoietic stem cells in an experimental co-culture model.// Hematology. - 2014. - Vol. 19. - N. 2. - P. 85-98. 143. Kim J.H., Park S.G., Song S.Y. et al. Reactive oxygen species-responsive miR-210 regulates proliferation and migration of adipose-derived stem cells via PTPN2.// Cell Death. 2013. - Vol. 4. - P. 588. 110 144. Kim J.H., Park S.H., Park S.G. et al. The pivotal role of reactive oxygen species generation in the hypoxia-induced stimulation of adipose-derived stem cells.// Stem Cells Dev. - 2011. - Vol. 20. - P. 1753-1761. 145. Kim W.S., Han J., Hwang S. et al. An update on niche composition, signaling and functional regulation of the adipose-derived stem cells.// Expert Opin. Biol. Ther. - 2014. - Vol. 14. - N. 8. -P. 1-12. 146. Kim W.S., Park B.S., Kim H.K. et al. Evidence supporting antioxidant action of adipose-derived stem cells: protection of human dermal fibroblasts from oxidative stress.// J Dermatol Sci. - 2008. - Vol. 49. - P. 133-42. 147. Kim W.S., Park B.S., Park S.H. et al. Antiwrinkle effect of adipose-derived stem cell: activation of dermal fibroblast by secretory factors.// J Dermatol Sci. - 2009. - Vol. 53. - P. 96102. 148. Kim W.S., Park B.S., Sung J.H. The wound-healing and antioxidant effects of adipose- derived stem cells.// Expert Opin Biol Ther. - 2009. - Vol. 9. - P. 879-87. 149. Ko K.M., Godin D.V. Ferric ion-induced lipid peroxidation in erythrocyte membranes: effects of phytic acid and butylated hydroxytoluene// Mol. Cell. Biochem. - 1990. - Vol. 95. № 2. - Р. 125-131. 150. Kobayashi C.I., Suda T. Regulation of reactive oxygen species in stem cells and cancer stem cells.// J. Cell. Physiol. - 2012. - Vol. 227. - P. 421-430. 151. Koh M.Y., Powis G. Passing the baton: the HIF switch.// Trends Biochem Sci. - 2012. - Vol. 37. - N. 9. - P. 364-372. 152. Koh M.Y., Spivak-Kroizman T.R., Powis G. HIF-1 regulation: Not so easy come, easy go.// Trends Biochem. Sci. - 2008. - Vol. 33. - № 11. - P. 526-534. 153. Kolf C.M., Cho E., Tuan R.S. Mesenchymal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of niche, self-renewal and differentiation.// Arthritis Res Ther. - 2007. - Vol. 9. - N. 1. - P. 204-219. 154. Komori T. Regulation of bone development and extracellular matrix protein genes by RUNX2.// Cell Tissue Res. - 2010. - Vol. 339. - P. 189-195. 155. Krall J., Bagley A.C., Mullenbach G.T. et al. Superoxide mediates the toxicity of paraquat for cultured mammalian cells.// J. Biol. Chem. - 1988. - Vol. 263. - P. 1910-1914. 156. Lavrentieva A., Majore I., Kasper C. et al. Effects of hypoxic culture conditions on umbilical cord-derived human mesenchymal stem cells.// Cell Communication and Signaling. 2010. - Vol. 8. - P. 18-26. 157. Lee J.W., Bae S.H., Jeong J.W. et al. Hypoxia-inducible factor (HIF-1) alpha: its protein stability and biological functions.// Exp Mol Med. - 2004. - Vol. 36. - P. 1-12. 111 158. Lee S.H., Lee Y.J., Song C.H. et al. Role of FAK phosphorylation in hypoxia induced hMSCS migration: involvement of VEGF as well as MAPKS and eNOS pathways.// Am. J. Physiol. Cell Physiol. - 2010. - V. 298. - № 4. - P. 847-856. 159. Lee R.H., Kim B.C., Choi I.S. et al. Characterization and Expression Analysis of Mesenchymal Stem Cells from Human Bone Marrow and Adipose Tissue.// Cell Physiol Biochem. - 2004. - Vol. 14. - P.311-324. 160. Lee E.Y., Xia Y., Kim W. Hypoxia-enhanced wound-healing function of adipose- derived stem cells: Increase in stem cell proliferation and up-regulation of VEGF and bFGF.// Wound Rep Reg. - 2009. - Vol. 17. - P. 540–547. 161. Lendahl U., Lee K.L., Yang H. et al. Generating specificity and diversity in the transcriptional response to hypoxia.// Nat Rev Genet. - 2009. - Vol. 10. - P. 821-832. 162. Leroux L., Descamps B., Tojais N.F. et al. Hypoxia Preconditioned Mesenchymal Stem Cells Improve Vascular and Skeletal Muscle Fiber Regeneration After Ischemia Through a Wnt4-dependent Pathway.// Molecular Therapy. - 2010. - Vol. 18. - N. 8. - P. 1545–1552. 163. Li J.M., Shah A.M. Endothelial cell superoxide generation: regulation and relevance for cardiovascular pathophysiology.// Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. - 2004. - Vol. 287. - N. 5. - P. 1014-1030. 164. Liedias F., Rangel P., Hansberg W. Oxidation of catalase by singlet oxygen.// J. Biol. Chem. - 1998. - Vol. 273. - P. 10630-10637. 165. Liu S., Chen C., Yang T. et al. Albumin prevents reactive oxygen species-induced mitochondrial damage, autophagy, and apoptosis during serum starvation.// Apoptosis. – 2012. - Vol. 17. - P. 1156-1169. 166. Liu S., Huang J., Lee R.K. et al. Paracrine Factors from Human Placental Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Protect Endothelium from Oxidative Injury via STAT3 and Manganese Superoxide Dismutase Activation.// Biology of reproduction. - 2010. - Vol. 82. - P. 905-913. 167. Loboda A., Jozkowicz A., Dulak J. HIF-1 versus HIF-2--is one more important than the other?// Vascul Pharmacol. - 2012. - Vol. 56. - N. 5-6. - P. 245-251. 168. Locke M., Windsor J., Dunbar P.R. Human adipose-derived stem cells: isolation, characterization and applications in surgery.// ANZ J Surg. - 2009. - Vol. 79. - P. 235-244. 169. Lord-Dufour S., Copland I.B., Levros L.C. et al. Evidence for transcriptional regulation of the glucose-6-phosphate transporter by HIF-1alpha: Targeting G6PT with mumbaistatin analogs in hypoxic mesenchymal stromal cells.// Stem Cells. - 2009. - Vol. 27. - P. 489-497. 112 170. Lu L., Quinn M.T., Sun Y. Oxidative stress in the infarcted heart: role of de novo angiotensin II production.// Biochem Biophys Res Commun. - 2004. - Vol. 325. - N. 3. - P. 943-51. 171. Luo W., Hu H., Chang R. Pyruvate kinase M2 is a PHD3-stimulated coactivator for hypoxia-inducible factor 1.// Cell. - 2011. - Vol. 145. - N. 5. - P. 732-744. 172. Mafi P., Hindocha S., Mafi R. et al. Adult mesenchymal stem cells and cell surface characterization - a systematic review of the literature// The Open Orthopaedics Journal. 2011. - Vol. 5. - Suppl. 2. - P. 253–260. 173. Majima H., Oberley T.D., Furukawa K. et al. Prevention of mitochondrial injury by Mn- SOD reveals a primary mechanism for alkaline-induced cell death.// J. Biol. Chem. - 1998. Vol. 273. - P. 8217–8224. 174. Majumdar D., Bhonde R., Datta I. Influence of ischemic microenvironment on human Wharton's Jelly mesenchymal stromal cells.// Placenta. - 2013. - Vol. 34. - N. 8. - P. 642-649. 175. Makino S., Fukuda K., Miyoshi S. et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro.// J Clin Invest. - 1999. - Vol. 103. - N 5. - P. 697-705. 176. Makino Y., Kanopka A., Wilson W.J. et al. Inhibitory PAS domain protein (IPAS) is a hypoxia-inducible splicing variant of the hypoxia-inducible factor-3alpha locus.// J Biol Chem. - 2002. - Vol. 277. - N. 36. - P. 32405-32408. 177. Malladi P., Xu Y., Chiou M. et al. Effect of reduced oxygen tension on chondrogenesis and osteogenesis in adiposederived mesenchymal cells.// Am J Physiol Cell Physiol. - 2006. Vol. 290. - P. 1139-1146. 178. Malladi P., Xu Y., Chiou M. et al. Hypoxia inducible factor-1alpha deficiency affects chondrogenesis of adipose-derived adult stromal cells.// Tissue Eng. - 2007. - Vol. 13. - P. 1159-1171. 179. Mates J.M. Effects of antioxidant enzymes in the molecular control of reactive oxygen species toxicology.// Toxicology. - 2000. - Vol. 153. P. 83-104. 180. Mathew S.A., Rajendran S., Gupta P.K. et al. Modulation of physical environment makes placental mesenchymal stromal cells suitable for therapy.// Cell Biol Int. - 2013. - Vol. 37. - N. 11. P. 1197-1204. 181. McCord J.M. (1990). Is superoxide dismutase a stress protein?/ Stress protiens in inflammation. Edited by R. Burbon, C. Rice-Evans, D. Blake, C. Window. - London: Richalien. - 1990. - P. 125. 182. Meister A. Selective modification of glutathione metabolism.// Science. - 1983. - Vol. 220. - P. 472-477. 113 183. Michiels C., Raes M., Toussaint O. et al. Importance of Se-glutathione peroxidase, catalase, and Cu/Zn-SOD for cell survival against oxidative stress.// Free Radic Biol Med. 1994. - Vol. 17. - P. 235-248. 184. Misra H.P. Reaction of copper-zinc superoxide dismutase with diethyldithiocarbamate.// J. Biol, Chem. - 1979. - Vol. 254. - P. 11623-11628. 185. Mohyeldin A., Garzon-Muvdi T., Quinones-Hinojosa A. Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche.// Cell stem cell. - 2010. - Vol. 7. - P. 150-161. 186. Moon M. H., Kim S. Y., Kim Y. J. et al. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells improve postnatal neovascularization in a mouse model of hindlimb ischemia.// Cell Physiol. Biochem. - 2006. - Vol. 17. - P. 279-290. 187. Morrison H., Jenstom B., Nordenskjold M. et al. Induction of DNA damage by menadione (2-methyl-l,4-naphthoquinone) in primary cultures of rat hepatocytes.// Biochem. Pharmacol. - 1984. - Vol. 33. - P. 1763-1769. 188. Murphy M.P. How mitochondria produce reactive oxygen species.// Biochem J. - 2009. - Vol. 417. - N. 1. - P. 1-13. 189. Myhrea O., Andersena J.M., Aarnesc H. et al. Evaluation of the probes 20,70- dichlorofluorescin diacetate, luminol, and lucigenin as indicators of reactive species formation.// Biochemical Pharmacology. - 2003. - Vol. 65. - P. 1575-1582. 190. Mylotte L.A., Duffy A.M., Murphy M. et al. Metabolic flexibility permits mesenchymal stem cell survival in an ischemic environment.// Stem Cells. - 2008. - Vol. 26. - P. 1325-1336. 191. Nakagami H., Maeda K., Morishita R. et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells.// Arteriosclerosis Thrombosis Vasc Biol. - 2005. - Vol. 25. - P. 2542-2547. 192. Nemos C., Basciano L., Dalloul A. Biological effects and potential applications of mesenchymal stem cell culture under low oxygen pressure.// Pathol Biol. - 2012. - Vol. 60. - N. 3. P. 193-198. 193. Nicholls P. Contribution of catalase and glutathione peroxidase to red cell peroxide removal.// Biochim. Biophys. Acta. - 1972. - Vol. 279. - P. 306-309. 194. Nikukar H., Reid S., Riehle M.O. et al. Control of Mesenchymal Stem-Cell Fate by Engineering the Nanoenvironment.// Stem-Cell Nanoengineering. - 2015. 195. Nombela-Arrieta C., Ritz J., Silberstein L.E. The elusive nature and function of mesenchymal stem cells.// Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2011. - Vol. 12. - P. 126-131. 196. Ogasawara M.A., Zhang H. Redox Regulation and Its Emerging Roles in Stem Cells and Stem-Like Cancer Cells.// Antioxidants & Redox Signaling. - 2009. - Vol. 11. - N. 5. - P. 1107-1122. 114 197. Pacher P., Beckman J.S., Liaudet L. Nitric Oxide and Peroxynitrite in Health and Disease.// Physiol Rev. - 2007. - Vol. 87. - N. 1. - P. 315-424. 198. Pacher P., Schulz R., Liaudet L. et al. Nitrosative stress and pharmacological modulation of heart failure.// Trends Pharmacol Sci. - 2005. - Vol. 26. - N. 6. - P. 302-310. 199. Palomaki S., Pietila M., Laitinen S. et al. HIF-1α is upregulated in human mesenchymal stem cells.// Stem Cells. - 2013. - Vol. 31. - P. 1902-1909. 200. Pan Q., Qin X., Ma S. et al. Myocardial Protective Effect of Extracellular Superoxide Dismutase Gene Modified Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells on Infarcted Mice Hearts.// Theranostics. - 2014. - Vol. 4. - N. 5. - P. 475-486. 201. Papandreou I., Cairns R.A., Fontana L. et al. HIF-1 mediates adaptation to hypoxia by actively downregulating mitochondrial oxygen consumption.// Cell metabolism. - 2006. - Vol. 3. - P. 187-197. 202. Park S.G., Kim J., Xia Y. et al. Generation of reactive oxygen species in adipose- derived stem cells: Friend or Foe?// Expert Opin Ther Targets. - 2011. - Vol. 15. - N. 11. - P. 1297-1306. 203. Patel S.A., Simon M.C. Biology of hypoxia-inducible factor-2alpha in development and disease.// Cell Death Differ. - 2008. - Vol. 15. - P. 628-634. 204. Pattappa G., Heywood H.K., de Bruijn J.D. et al. The metabolism of human mesenchymal stem cells during proliferation and differentiation.// J Cell Physiol. - 2011. - Vol. 226. - N. 10. - P. 2562-2570. 205. Pervaiz S., Taneja R., Ghaffari S. Oxidative stress regulation of stem and progenitor cells.// Antioxid Redox Signal. - 2009. - Vol. 11. - P. 2777–2789. 206. Peterson K.M., Aly A., Lerman A. et al. Improved survival of mesenchymal stromal cell after hypoxia preconditioning: role of oxidative stress.// Life Sci. - 2011. - V. 88. - P. 65-73. 207. Pick E., Keisari Y. A simple colorimetric method for the measurement of hydrogen peroxide produced by cells in culture.// J. Immunol. Methods. - 1980. - Vol. 38. - P. 161-170. 208. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.// Science. - 1999. - Vol. 284. - N. 5411. - P.143-147. 209. Pittenger M.F., Martin B.J. Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics.// Circ Res. - 2004. - Vol. 95. - N. 1. - P. 9-20. 210. Pollina E.A., Brunet A. Epigenetic regulation of aging stem cells.// Oncogene. - 2011. - Vol. 30. - P. 3105-3126. 211. Pons J., Huang Y., Arakawa-Hoyt J. et al. VEGF improves survival of mesenchymal stem cells in infarcted hearts.// Biochem Biophys Res Commun. - 2008. - Vol. 376. P. 419-422. 115 212. Pugh C.W., Ratcliffe P.J. Regulation of angiogenesis by hypoxia: role of the HIF system.// Nat Med. - 2003. - Vol. 9. - N. 6. - P. 677-684. 213. Ratcliffe P.J. HIF-1 and HIF-2: working alone or together in hypoxia?// J Clin Invest. - 2007. - Vol. 117. - N. 4. - P. 862-865. 214. Reeder B., Wilson M. The effects of pH on the mechanism of hydrogen peroxide and lipid hydroperoxide consumption by myoglobin: a role for the protonated ferryl species.// Free Radic Biol Med. - 2001. - Vol. 30. - N. 11. - P.1311-1318. 215. Rehman J., Traktuev D., Li J. et al. Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells.// Circulation. - 2004. - Vol. 109. - N. 10. - P. 1292-1298. 216. Poot M., Pierce R.C. Detection of apoptosis and changes in mitochondrial membrane potential with chloromethyl-X-rosamine.// Cytometry. - 1999. - Vol. 36. - N. 4. - P. 359-360. 217. Rosenkranz A.R., Schmaldienst S., Stuhlmeier K.M. et al. A microplate assay for the detection of oxidative products using 2′,7′-dichlorofluorescin-diacetate.// J Immunol Methods. 1992. - Vol. 156. - P. 39 - 45. 218. Rosova I., Dao A.M., Capoccia A.B. et al. Hypoxic Preconditioning Results in Increased Motility and Improved Therapeutic Potential of Human Mesenchymal Stem Cells.// Stem Cells. - 2008. - Vol. 26. - P. 2173-2182. 219. Rota C., Fann Y.C., Mason R.P. Phenoxyl free radical formation during the oxidation of the fluorescent dye 2′,7′- dichlorofluorescein by horseradish peroxidase. Possible consequences for oxidative stress measurements.// J Biol Chem. - 1999. - Vol. 274. - P. 28161 - 28168. 220. Prise K.M., Davies S., Michael B.D. Cell killing and DNA damage in Chinese hamster V79 cells treated with hydrogen peroxide.// Int J Radiat Biol. - 1989. - Vol. 55. - N. 4. - P. 583592. 221. Rus Ciuca D., Soritau O., Susman S. et al. Isolation and characterization of chorionic mesenchymal stem cells from the placenta.// Rom J Morphol Embryol. - 2011. - Vol. 52. - N. 3. - P. 803-808. 222. Safran M., Kaelin W.G. HIF hydroxylation and the mammalian oxygen-sensing pathway.// J Clin Invest. - 2003. - Vol. 111. - N. 6. - P. 779-783. 223. Salim A., Nacamuli R.P., Morgan E.F. et al. Transient changes in oxygen tension inhibit osteogenic differentiation and Runx2 expression in osteoblasts.// J Biol Chem. - 2004. - Vol. 279. - P. 40007-40016. 224. Salmon A.B., Perez V.I., Bokov A. et al. Lack of methionine sulfoxide reductase A in mice increases sensitivity to oxidative stress but does not diminish life span.// FASEB J. 2009. - Vol. 23. - P. 3601-3608. 116 225. Saparov A., Chen C.W., Beckman S.A. et al. The role of antioxidation and immunomodulation in postnatal multipotent stem cell-mediated cardiac repair.// Int J Mol Sci. 2013. - Vol. 14. - N. 8. - P. 16258-16279. 226. Sarsour E.H., Kumar M.G., Chaudhuri L. Redox Control of the Cell Cycle in Health and Disease.// Antioxid Redox Signal. - 2009. - Vol. 11. - N. 12. - P. 2985-3011. 227. Scadden D. T. The stem-cell niche as an entity of action.// Nature. - 2006. - Vol. 441. - P. 1075-1079. 228. Schofield R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cell.// Blood Cells. - 1978. - Vol. 4. - P. 7-25. 229. Schofield C.J., Ratcliffe P.J. Oxygen sensing by HIF hydroxylases.// Nat Rev Mol Cell Biol. -2004. - Vol. 5. - N. 5. - P. 343-354. 230. Schofield C.J., Ratcliffe P.J. Signalling hypoxia by HIF hydroxylases.// Biochem Biophys Res Commun. - 2005. - Vol. 338. - N. 1. - P. 617-626. 231. Schraufstatter I.U., Hinshaw D.B., Hyslop P.A. et al. Oxidant injury of cells. DNA strand-breaks activate polyadenosine diphosphate-ribose polymerase and lead to depletion of nicotinamide adenine dinucleotide.// J Clin Invest. - 1986. - Vol. 77. - N. 4. - P. 1312-1320. 232. Semenza G.L. HIF-1, O(2), and the 3 PHDs: how animal cells signal hypoxia to the nucleus.// Cell. - 2001. - Vol. 107. - P. 1-3. 233. Semenza G.L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine.// Cell. - 2012. - Vol. 148. - P. 399-408. 234. Semenza G.L., Wang G.L. A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation.// Mol Cell Biol. - 1992. - Vol. 12. - N. 12. - P. 5447-5454. 235. Sena L.A., Chandel N.S. Physiological Roles of Mitochondrial Reactive Oxygen.// Molecular Cell. - 2012. - Vol. 48. - P. 158-167. 236. Seo S.J., Kang S.S., Cho G. et al. C/EBP alpha and C/EBP beta play similar roles in the transcription of the human Cu/Zn SOD gene.// Gene. -1997. - Vol. 203. - P. 11-15. 237. Serakinci N., Keith N.W. Therapeutic potential of adult stem cells.// Eur. J. Cancer. - 2006. - Vol. 42. - P. 1243-1246. 238. Sies H. Oxidative stress. Introductory remarks.// Oxidative Stress. Ed. H. Sies. - London, Academic Press. - 1985. - P. 1-8. 239. Simsek T., Kocabas F., Zheng J. et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.// Cell Stem Cell. - 2010. - Vol. 7. - P. 380390. 117 240. Smiley S.T., Reers M., Mottola-Hartshorn C. et al. Intracellular heterogeneity in mitochondrial membrane potentials revealed by a J-aggregate-forming lipophilic cation JC-1.// Proc Natl Acad Sci USA. - 1991. - Vol. 88. - N. 9. - P. 3671-3675. 241. Sohni A., Verfaillie C.M. Mesenchymal stem cells migration homing and tracking.// Stem Cells Int. - 2013. 242. Song S.Y., Chung H.M., Sung J.H. The pivotal role of VEGF in adipose-derived-stem- cell-mediated regeneration.// Expert Opin Biol Ther. - 2010. - Vol. 10. - N. 11. - P. 1529-1537. 243. Spitz D.R., Elwell J.H., Sun Y. et al. Oxygen toxicity in control and H202-resistant Chinese hamster fibroblast cell lines.// Arch. Biochem. Biophys. - 1990. - Vol. 279. - P. 249260. 244. Stubbs S.L., Hsiao S.T., Peshavariya H.M. et al. Hypoxic preconditioning enhances survival of human adipose-derived stem cells and conditions endothelial cells in vitro.// Stem Cells Dev. - 2012. - Vol. 21. - N. 11. - P. 1887-1896. 245. Suda T., Takubo K., Semenza G.L. Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.// Cell Stem Cell. - 2011. - Vol. 9. - P. 298-310. 246. Suzuki Y.J., Forman H.J., Sevanian A. Oxidants as stimulators of signal transduction.// Free Radic Biol Med. - 1997. - Vol. 22. - P. 269-285. 247. Takubo K., Nagamatsu G., Kobayashi C.I. et al. Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells.// Cell Stem Cell. - 2013. - Vol. 12. - P. 49-61. 248. Takebe G., Yarimizu J., Saito Y. et al. A comparative study on the hydroperoxide and thiol specificity of the glutathione peroxidase family and selenoprotein.// Journal of Biological Chemistry. - 2002. - Vol. 277. - P. 21254-21258. 249. Taylor C.T. Mitochondria and cellular oxygen sensing in the HIF pathway.// Biochem J. - 2008. - Vol. 409. - P. 19-26. 250. Taylor W.G., Camalier R.F., Taylor M.J. A spectrophotometric assay for hydrogen peroxide in tissue culture medium.// TCA Manual. - 1979. - Vol. 5. - P. 1081-1086. 251. Teraishi F., Wu S. Identification of a Novel Synthetic Thiazolidin Compound Capable of Inducing c-Jun NH2-Terminal Kinase-Dependent Apoptosis in Human Colon Cancer Cells.// Cancer Res. - 2005. - Vol. 65. - N. 14. - P. 6380-6387. 252. Thannickal V.J., Fanburg B.L. Reactive oxygen species in cell signaling.// Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. - 2000. - Vol. 279. - N. 6. - P. 1005-1028. 253. Theus M.H., Wei L., Cui L. et al. In vitro hypoxic preconditioning of embryonic stem cells as a strategy of promoting cell survival and functional benefits after transplantation into the ischemic rat brain.// Exp Neurol. - 2008. - V. 210. - N. 2. - P. 656-670. 118 254. Toma C., Pittenger M.F., Cahill K.S. et al. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart.// Circulation. - 2002. - Vol. 105. - P. 93-98. 255. Turrens J.F. Superoxide production by the mitochondrial respiratory chain.// Biosci Rep. - 1997. - Vol. 17. - N. 1. - P. 3-8. 256. Uccelli A., Moretta L., Pistoia V. Mesenchymal stem cells in health and disease.// Nat. Rev. Immunol. - 2008. - Vol. 8. - P. 726-736. 257. Ulker S., McMaster D., McKeown P.P. et al. Impaired activities of antioxidant enzymes elicit endothelial dysfunction in spontaneous hypertensive rats despite enhanced vascular nitric oxide generation.// Cardiovasc Res. - 2003. - Vol. 59. - P. 488-500. 258. Valle-Prieto A., Conget P.A. Human mesenchymal stem cells efficiently manage oxidative stress.// Stem Cells Dev. - 2010. - Vol. 19. - N. 12. - P. 1885-1893. 259. Vanden Hoek T., Becker L.B., Shao Z.H. et al. Preconditioning in cardiomyocytes protects by attenuating oxidant stress at reperfusion.// Circ Res. - 2000. - Vol. 86. - P. 541-548. 260. Wang B., Wood I.S., Trayhurn P. Hypoxia induces leptin gene expression and secretion in human preadipocytes: differential effects of hypoxia on adipokine expression by preadipocytes.// J Endocrinol. - 2008. - Vol. 198. - N. 1. - P. 127-134. 261. Wang D.W., Fermor B., Gimble J.M. et al. Influence of oxygen on the proliferation and metabolism of adipose derived adult stem cells.// J. Cell Physiol. - 2005. - Vol. 204. - N. 1. - P. 184-191. 262. Wang M.J., Crisostomo P.R., Herring C. et al. Human progenitor cells from bone marrow or adipose tissue produce VEGF, HGF, and IGF-I in response to TNF by a p38 MAPK-dependent mechanism.// Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. - 2006. - Vol. 291. P. 880-884. 263. Wang Q.Y., Liu Z.S., Wang J. Glutathione peroxidase-1 is required for self-renewal of murine embryonic stem cells.// Biochem Biophys Res Commun. - 2014. - Vol. 448. - N. - 4. P. 454-460. 264. Watt F.M., Hogan B.L. Out of Eden: stem cells and their niches.// Science. - 2000. - Vol. 287. - N. 5457. - P. 1427-1430. 265. Wei X., Yang X., Han Z. Mesenchymal stem cells: a new trend for cell therapy.// Acta Pharmacologica Sinica. - 2013. - Vol. 34. - P. 747-754. 266. Weidemann A., Johnson R.S. Biology of HIF-1alpha.// Cell Death Differ. - 2008. - Vol. 15. - N. 4. - P. 621-627. 119 267. Wenger R.H. Cellular adaptation to hypoxia: O2-sensing protein hydroxylases, hypoxia- inducible transcription factors, and O2-regulated gene expression.// The FASEB Journal. 2002. - Vol. 16. - P. 1151-1162. 268. Wenger R.H., Gassmann M. Oxygen(es) and the hypoxia-inducible factor-1.// Biol Chem. -1997. - Vol. 378. - N. 7. - P. 609-616. 269. White A.A., Crawford K.M., Patt C.S. et al. Activation of soluble guanylate cyclase from rat lung by incubation or by hydrogen peroxide.// J Biol Chem. - 1976. - Vol. 251. - N. 23. - P. 7304-7312. 270. Wijeratne S.K., Cuppett S.L., Schlegel V. Hydrogen Peroxide Induced Oxidative Stress Damage and Antioxidant Enzyme Response in Caco-2 Human Colon Cells.// J. Agric. Food Chem. - 2005. - Vol. 53. - P. 8768-8774. 271. Wiseman H, Halliwell B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: Role in inflammatory disease and progression to cancer.// Biochemical Journal. - 1996. - Vol. 313. - P. 17-29. 272. Xu N., Liu H., Qu F. et al. Hypoxia inhibits the differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts by activation of Notch signaling.// Experimental and Molecular Pathology. - 2013. - Vol. 94. - P. 33-39. 273. Xu Y., Malladi P., Chiou M. et al. In vitro expansion of adipose-derived adult stromal cells in hypoxia enhances early chondrogenesis.// Tissue Eng. - 2007. - Vol. 13. P. 2981-2993. 274. Xu W., Zhang X., Qian H. Mesenchymal stem cells from adult human bone marrow differentiate into a cardiomyocyte phenotype in vitro.// Exp Biol Med. - 2004. - Vol. 229. - N. 7. P. 623-631. 275. Yamasaki M., Nomura T., Sato F. et al. Metallothionein is up-regulated under hypoxia and promotes the survival of human prostate cancer cells.// Oncol Rep. - 2007. - Vol. 18. - P. 1145-1153. 276. Yan H., Harding J.J. Glycation-induced inactivation and loss of antigenicity of catalase and superoxide dismutase.// Biochem J. - 1997. - Vol. 328. - P. 599-605. 277. Zelko I.N., Mariani T.J., Folz R.J. Superoxide dismutase multigene family: a comparison of the CuZn-SOD (SOD1), Mn-SOD (SOD2), and EC-SOD (SOD3) gene structures, evolution, and expression.// Free Radic. Biol. Med. - 2002. - Vol. 33. - P. 337-349. 278. Zhang J., Ju Z. Telomere, DNA damage, and oxidative stress in stem cell aging.// Birth Defects Res C Embryo Today. - 2010. - Vol. 90. - P. 297-307. 279. Zhang W., Su X., Gao Y. et al. Berberine Protects Mesenchymal Stem Cells against Hypoxia-Induced Apoptosis in Vitro.// Biol. Pharm. Bull. - 2009. - Vol. 32. - N. 8. - P. 13351342. 120 280. Zhou W., Choi M., Margineantu D. et al. HIF1α induced switch from bivalent to exclusively glycolytic metabolism during ESC-to-EpiSC/hESC transition.// EMBO Journal. Vol. 31. - N. 9. - P. 2103-2116. 281. Zhu H., Bannenberg G.L., Mold P. et al. Oxidation pathways for the intracellular probe 2',7'-dichlorofluorescin.// Arch Toxicol. - 1994. - Vol. 68. - P. 582-587. 282. Zimmerman R., Cerutti P.A. Active oxygen acts as a promoter of transformation in mouse embryo C3H/10T½/C18 fibroblasts.// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1984. - Vol. 81. P. 2085-2087. 283. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H. et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.// Tissue Eng. - 2001. - Vol. 7. - N. 2. - P. 211-228.
