СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК

СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК
I. ПРОЦЕДУРА МАКСАМА-ГИЛБЕРТА (MAXAM-GILBERT, late 1970’s)
Процедура начинается с получения участка ДНК при расщеплении ее двумя
различными рестриктазами. При этом образуются нетождественные “липкие” концы.
Полученныйдвунитевой фрагмент ДНК после очистки на ПААГ делится на две порции,
каждая
из
которых
маркируется
селективно
радиоактивными
нуклеотидами, комплементарнымикрайнему основанию на 5’-конце.
Реакция
катализируется
(Klenow Fragment).
фрагментом
ДНК-Полимеразы
Фрагмент Кленова получается
1
бактерии E.Coli,
частичным протеолизом ДНК-
Полимеразы 1 E. Coli и обладает лишь активностью катализировать продолжение
полинуклеотидной цепи в направлении 5’-3’. Немеченная радиоактивностью цепь далее в
регистрации не будет видна. Проба делится на 4 части и обрабатывается химически с
целью разрушения одного или двух азотистых оснований. На сегодняшний день есть
возможность селективно разрушать либо только пуриновые основания (А+G), либо
только пиримидиновые (С+T), либо только Гуанин (G), либо только Цитозин (С). Пока не
найдено способа разрушения только А или только Т.
Более или менее селективное разрушение достигается вследствие разной
способности пуриновых оснований к метилированию и последующему гидролизу с
разрывомN-гликозидной связи
(отщепление
азотистого
основания).
Так,
гуанин
легче метилируется диметилсульфатом (в положение 7):
аденин метилируется труднее
и
в
положение
3.
Но
3-
метилпроизводные аденина легче гидролизуются. Изменением условий метилирования и
гидролиза можно добиваться некоторой селективности разрушения азотистых оснований.
Разрушение пиримидиновых азотистых оснований происходит при действии
гидразина.
При этом тимин разрушается гидразином, а цитозин- гидразином в присутствии хлорида
натрия:
Разрушение азотистых оснований происходит случайным образом. Однако
гидролиз ДНК (разрыв фосфоэфирных связей) протекает тотально, по местам всех
разрушенных оснований. Процедура вкратце:
•
Аденин/Гуанин – CH3-OSO2-OCH3 (метилирование по N3 Аденина, N7
гуанина),
затем тотальный гидролиз у (случайно) разрушенных оснований.
•
Аденин/Гуанин – CH3-OSO2-OCH3 (метилирование), затем мягкий кислотный
гидролиз (при 0 С) разбавленной HCl (0,5 М).
Гидролиз протекает по местам разрушенных оснований (показаны синим). В смеси
можно добиться всех вариантов разрушений. Разделение полученных отрезков разной
длины проводят гель-электрофорезом, при этом регистрируются только помеченные
радиоактивностью отрезки (на рисунке показанное серым шрифтом не регистрируется):
Ниже показаны реальные результаты секвенирования:
При этом получаются детектируемые по радиоактивности отрезки, которые
разделяются электрофорезом на ПААГ . Более короткие цепи продвигаются быстрее по
гелю,
более
тяжелые
осуществляется авторадиографом.
-
медленнее.
Идентификация
полос
II. ПРОЦЕДУРА СЭЙНДЖЕРА
1. Выделяется фрагмент однонитевой
ДНК, последовательность в которой следует
определить и к ней пришивается так
называемый “универсальный праймер”,
помеченный радиоактивностью 32Р или 35S.
Образец делится на 4 части и помещается
в пробирки, в каждой из которых имеются все
4 трифосфонуклеотида(dTNP) и по
одному дидеоксинуклеотиду (ddTNP), у
которого отсутствует гидроксил при 3’ атоме
углерода рибозы, следовательно, за ней
продолжение цепи невозможно.
Дидеоксинуклеотиды
конкурируют
в
реакции продолжения цепи с обычными
нуклеотидами, в результате они встраиваются
в растущую цепь в различных местах и в
итоге получается смесь из комплементарных
цепей различной длины, которая разделяется
электрофорезом на ПААГ и регистрируется
авторадиографом.
Метод
позволяет
определять
последовательность нуклеотидов в цепях до
400 мономеров, в то время как по МаксамуГилберту только 250.