Влияние ионов металлов на ферменты мембранного

ISSN 2073-5529. Вестник АГТУ. Сер.: Рыбное хозяйство. 2011. № 2
ÔÈÇÈÎËÎÃÈß È ÁÈÎÕÈÌÈß ÃÈÄÐÎÁÈÎÍÒÎÂ
УДК [597.442:597-113.32]:[597-1.044.546.3/.7T]
Д. А. Бедняков, Л. А. Невалённая, В. Ю. Новинский
ÂËÈßÍÈÅ ÈÎÍΠÌÅÒÀËËÎÂ
ÍÀ ÔÅÐÌÅÍÒÛ ÌÅÌÁÐÀÍÍÎÃÎ ÏÈÙÅÂÀÐÅÍÈß ÁÅËÓÃÈ, ÑÒÅÐËßÄÈ
È ÈÕ ÃÈÁÐÈÄÎÂ – ÁÅÑÒÅÐÀ È ÑÒÅÐÁÅËÀ
D. A. Bednyakov, L. A. Nevalennaya, V. Yu. Novinsky
INFLUENCE OF METAL IONS
ON MEMBRANE DIGESTION ENZYMES
OF BELUGA, STARLET AND THEIR HYBRIDS – BESTER AND STERBEL
Исследовано влияние двухвалентных ионов металлов (Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn) на уровень
активности мальтазы, казеинлитических протеиназ и щелочной фосфатазы слизистой оболочки
кишечника белуги, стерляди и их гибридов – бестера и стербела. Продемонстрировано, что
исследованные ферменты у осетровых являются регулируемыми, т. к. под действием ионов
металлов достоверно изменяется уровень их активности. Установлено, что влияние ионов
металлов на пищеварительные ферменты осетровых проявляется разнонаправленно.
Ключевые слова: осетровые, пищеварительные ферменты, модификаторы, ионы металлов.
The influence of divalent metal ions (Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn) on the activity level of maltase,
caseinlithic proteases, and alkaline phosphatase of the intestine mucous coat of beluga, starlet and their
hybrids – bester and sterbel, is investigated in the paper. It is shown that the studied enzymes in sturgeon are adjustable, as their activity level significantly changes under the influence of metal ions.
It is found out that the impact of metal ions on digestive enzymes of sturgeon is differently developed.
Key words: sturgeon, digestive enzymes, modifiers, metal ions.
Введение
Влияние микроэлементов на различные функции метаболизма у рыб вызывает в последние годы особый интерес у исследователей [1–3]. Однако в настоящее время данных, касающихся воздействия ионов металлов на пищеварительную функцию гидробионтов, недостаточно,
о чем свидетельствуют сообщения последних лет [1, 3–5]. С другой стороны, известно, что кинетические характеристики многих пищеварительных ферментов существенно изменяются под
действием ионов металлов [3, 4, 6, 7], относящихся к группе веществ-модификаторов [8, 9].
Учитывая вышесказанное, целью исследований являлось изучение in vitro влияния ионов
шести металлов четвертого периода периодической системы химических элементов Д. И. Менделеева (Mn, Fe(II), Co, Ni, Cu, Zn) в концентрации 10 мг/л на уровень активности мальтазы, казеинлитических протеиназ и щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника белуги (Huso
huso), стерляди (Acipenser ruthenus) и их гибридов – бестера и стербела.
Материал и методы исследований
Материал был собран и обработан в 2009–2010 гг. Были использованы годовики белуги,
стерляди и их гибридов – бестера и стербела, выращенных в искусственных условиях. Пойманных рыб в течение 1–2 часов доставляли в лабораторию, где у них на холоду изымали желудочно-кишечный тракт и специальным скребком снимали слизистую оболочку кишечника. Готовили суммарные пробы, в состав которых входила слизистая от 3–5 экземпляров. Слизистую тщательно перемешивали и отбирали аликвоту для приготовления исходного гомогената. Гомогенаты готовили при помощи гомогенизатора (лабораторный гомогенизатор Daihan Scientific),
добавляя охлажденный до температуры 2–4 ºС раствор Рингера для холоднокровных животных
(109 mM NaCl, 1,9 mM KCl, 1,1 mM CaCl2, 1,2 mM NaHCO3) в соотношении 1 : 49.
74
Ôèçèîëîãèÿ è áèîõèìèÿ ãèäðîáèîíòîâ
В качестве источников ионов металлов использовали соответствующие сернокислые соли
(MnSO4, FeSO4, CoSO4, NiSO4, CuSO4, ZnSO4). Растворы этих солей добавляли в ферментативно
активный препарат и субстрат в количестве, необходимом для создания в этих средах концентрации соответствующего иона в 10 мг/л.
Уровень активности мальтазы (КФ 3.2.1.20) определяли модифицированным глюкозооксидазным методом, щелочной фосфатазы (КФ 3.1.3.1) – по степени гидролиза n-нитрофенилфосфата.
Казеинлитическую активность протеиназ (КФ 3.4.21) в нейтральной (рН = 7,4) среде определяли
модифицированным методом Лоури [10].
В качестве субстратов были использованы: 0,6 mM раствор n-нитрофенилфосфата для
щелочной фосфатазы, 2 % раствор мальтозы для мальтазы, приготовленные на растворе Рингера, и 1 % раствор казеина для казеинлитических протеиназ, приготовленный на фосфатном буферном растворе (0,05 N Na2HPO4 + H2O в соотношении 1 : 3 соответственно). Активность фермента выражали в мкмоль продуктов гидролиза, образующихся за 1 минуту инкубации в расчете на 1 г влажной массы ткани.
Статистическая обработка данных проводилась по общепринятым методикам [11]. Данные
обрабатывали с использованием приложения EXCEL программы MS Office для WINDOWS XP.
Результаты исследований и их обсуждение
Данные, полученные при исследовании влияния ионов металлов в концентрации 10 мг/л
на уровень активности мальтазы, казеинлитических протеиназ и щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника белуги и стерляди, а также их гибридов – бестера и стербела –
представлены в таблице.
Влияние ионов металлов на уровень активности пищеварительных ферментов
слизистой оболочки кишечника исследуемых осетровых
Ион металла
Контроль
Mn
Fe(II)
Co
Ni
Cu
Zn
Фермент
Мальтаза
Казеинлитические протеиназы
Щелочная фосфатаза
Мальтаза
Казеинлитические протеиназы
Щелочная фосфатаза
Мальтаза
Казеинлитические протеиназы
Щелочная фосфатаза
Мальтаза
Казеинлитические протеиназы
Щелочная фосфатаза
Мальтаза
Казеинлитические протеиназы
Щелочная фосфатаза
Мальтаза
Казеинлитические протеиназы
Щелочная фосфатаза
Мальтаза
Казеинлитические протеиназы
Щелочная фосфатаза
Уровень активности ферментов, мкмоль/(г · мин)
Белуга
Стерлядь
Бестер
Стербел
11,06 ± 0,08
13,29 ± 0,08
16,79 ± 0,08
5,72 ± 0,04
1,32 ± 0,04
6,17 ± 0,06
6,67 ± 0,04
7,80 ± 0,07
0,80 ± 0,01
0,53 ± 0,01
0,78 ± 0,01
0,51 ± 0,01
11,74 ± 0,23
14,60 ± 0,11
17,69 ± 0,04
6,81 ± 0,08
1,45 ± 0,02
6,38 ± 0,04
6,86 ± 0,06
7,71 ± 0,04
0,92 ± 0,01
0,83 ± 0,01
1,08 ± 0,01
0,79 ± 0,01
11,05 ± 0,08
12,61 ± 0,08
17,73 ± 0,04
6,10 ± 0,08
1,17 ± 0,02
6,37 ± 0,04
6,58 ± 0,09
7,57 ± 0,09
1,02 ± 0,01
0,85 ± 0,01
0,96 ± 0,01
0,79 ± 0,01
11,48 ± 0,08
12,42 ± 0,08
18,29 ± 0,08
6,32 ± 0,04
1,24 ± 0,04
6,30 ± 0,07
6,58 ± 0,07
7,67 ± 0,04
0,94 ± 0,01
0,59 ± 0,01
0,89 ± 0,01
0,62 ± 0,01
12,57 ± 0,08
13,62 ± 0,11
19,00 ± 0,08
6,47 ± 0,04
1,39 ± 0,04
6,33 ± 0,07
6,80 ± 0,06
7,46 ± 0,06
0,71 ± 0,01
0,48 ± 0,01
0,65 ± 0,01
0,45 ± 0,01
12,80 ± 0,11
12,16 ± 0,08
18,29 ± 0,08
6,50 ± 0,11
1,17 ± 0,04
6,42 ± 0,07
6,88 ± 0,04
7,54 ± 0,09
0,64 ± 0,01
0,42 ± 0,01
0,63 ± 0,01
0,42 ± 0,01
12,31 ± 0,08
11,97 ± 0,08
18,25 ± 0,08
6,14 ± 0,04
1,22 ± 0,04
6,54 ± 0,07
6,95 ± 0,11
7,84 ± 0,04
0,76 ± 0,01
0,48 ± 0,01
0,69 ± 0,01
0,44 ± 0,01
Как видно из таблицы, ионы металлов могут оказывать разнонаправленное влияние
на уровень активности исследуемых ферментов слизистой оболочки исследованных осетровых.
При этом уровень активности ферментов зависит как от положения металла в периодической
системе химических элементов Д. И. Менделеева, так и от вида рыб, обнаруживая индивидуальные адаптации к такому влиянию. Так, например, Mn2+ повышает уровень активности щелочной фосфатазы на 15 % у белуги, 57 % у стерляди и 38 и 55 % у бестера и стербела соответственно. Присутствие Fe2+ и Co2+ приводит к увеличению ферментативной активности щелочной фосфатазы у исследованных видов от 11 до 60 %, в то время как присутствие Ni2+, Cu2+
и Zn2+, напротив, вызывает ингибирование уровня активности от 5 до 21 %. При исследовании
влияния ионов металлов на уровень активности мальтазы и казеинлитических протеиназ слизистой оболочки белуги, стерляди, бестера и стербела отмечено, что модификационное влияние
также проявляется разнонаправленно.
75
ISSN 2073-5529. Вестник АГТУ. Сер.: Рыбное хозяйство. 2011. № 2
Ранее А. М. Уголевым [12] было высказано предположение о существовании не одного,
а нескольких регуляторных центров в молекулах пищеварительных ферментов, специализированных для различающихся групп эффектов. По мнению ряда исследователей [13], быстрые
конформационные переходы одной формулы молекулы в другую могут происходить в результате действия модификаторов как органической, так и неорганической природы, приводя
к изменениям в уровне активности ферментов.
Еще один возможный механизм взаимодействия металла с молекулой фермента, вероятно,
заключается в связывании иона металла со специальной контактной площадкой (регуляторный
или аллостерический центр), пространственно отделенной от активного центра [14, 15], с замещением металлокомпонента некоторых энзимов (пептидазы, щелочная фосфатаза) на металл,
близкий по атомному строению. Так, ионы ряда металлов, например марганца, кобальта, цинка,
способны активно подменять ионы других металлов, в частности магния, в ряде энзиматических
систем [16].
Скорее всего, первый способ взаимодействия ионов металлов с ферментом лежит в основе
изменения гидролитической активности такой исследуемой группы ферментов, как казеинлитические протеиназы и мальтаза, а взаимодействия второго типа характерны для щелочной фосфатазы. Однако не исключено, что в ряде случаев мы имеем дело с эффектом положительной
кооперативности, оказываемым ионами металлов, когда в результате взаимодействия олигомерной глобулы фермента с ионом металла увеличивается сродство фермента к субстрату. Следствием этого становится возросшая эффективность образования продукта реакции [8, 9].
Из полученных в результате наших экспериментов данных видно, что существуют межвидовые отличия у исследованных нами осетровых в уровне ответной реакции пищеварительных
ферментов на присутствие ионов металлов в инкубационной среде. Это позволяет предположить,
что каталитические и регуляторные центры могут различаться у представителей одного отряда.
Зависимость ответной реакции ферментов на действие ионов металлов в соответствии
с их положением в периодической системе химических элементов Д. И. Менделеева была отмечена в свое время А. В. Войнаром [7]. В частности им было установлено, что в ряду металлов
IV периода вспомогательных групп максимально активирующее влияние оказывают металлы,
находящиеся в начале периода, а максимально ингибирующее – в конце. В наших экспериментах подобная закономерность была явно зафиксирована в случае с влиянием металлов на уровень активности щелочной фосфатазы, для мальтазы и казеинлитических протеиназ она также
прослеживалась, но в меньшей степени.
Заключение
Таким образом, приведенные результаты демонстрируют регуляторную функцию ионов
металлов, выступающих в качестве модификаторов гидролитических систем осетровых видов
рыб. Из приведенных данных следует, что варьируя концентрацию микроэлементов, входящих
в составе премиксов в искусственные корма, можно стимулировать процесс усвоения белковых
или углеводных компонентов пищи у выращиваемых осетровых видов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Кузьмина В. В., Ушакова Н. В. Влияние температуры, рН и тяжелых металлов (медь, цинк) на активность протеиназ слизистой оболочки пищеварительного тракта типичных и факультативных ихтиофагов // Вопр. ихтиологии. – 2007. – Т. 47, № 4. – С. 566–573.
2. Леус Ю. В., Грубишко В. В. Активность антиоксидазной системы карпа при действии ионов тяжелых металлов // Гидробиологический журнал. – 1998. – Т. 34, № 2. – С. 59–63.
3. Туктаров А. В. Влияние ионов металлов на пищеварительно-транспортную функцию кишечника
осетровых рыб: автореф. дис…. канд. биол. наук. – Астрахань, 2002. – 24 с.
4. Неваленный А. Н., Туктаров А. В., Бедняков Д. А. Функциональная организация и адаптивная
регуляция процессов пищеварения у рыб. – Астрахань: Изд-во АГТУ, 2003. – 152 с.
5. Бедняков Д. А. Совместное влияние температуры и ионов металлов на уровень активности щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника белуги, стерляди и их гибрида // Юг России. Экология,
развитие. – 2010. – № 4. – С. 53–56.
6. Бедняков Д. А. Модификационное регулирование уровня активности некоторых пищеварительных ферментов у рыб: автореф. дис. …канд. биол. наук. – Астрахань, 2004. – 24 с.
76
Ôèçèîëîãèÿ è áèîõèìèÿ ãèäðîáèîíòîâ
7. Войнар А. И. Биологическая роль микроэлементов в организме животных и человека. – М.: Высш.
шк., 1960. – 544 с.
8. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. – М.: Мир, 1982. – Т. 1. – 392 с.
9. Плакунов В. К. Основы энзимологии. – М.: Логос, 2001. – 128 с.
10. Невалённый А. Н., Бедняков Д. А., Дзержинская И. С. Энзимология: учеб. пособие. – Астрахань:
Изд-во АГТУ, 2005. – С. 74–79.
11. Глинский В. В., Ионин В. Г. Статистический анализ. Руководство по обучению. – М.: ИНФРА-М;
Новосибирск: Сибирское соглашение, 2002. – 241 с.
12. Уголев А. М., Иезуитова Н. Н., Цветкова В. А. Эволюционная физиология пищеварения // Руководство по физиологии. Эволюционная физиология / под ред. Е. М. Крепса. – Л.: Наука, 1983. – С. 301–370.
13. Уголев А. М., Кузьмина В. В. Пищеварительные процессы и адаптации у рыб. – СПб.: Гидрометеоиздат, 1993. – 283 с.
14. Monod J., Wyman J., Changeux J. P. On the nature of allosteric transition // J. Mol. Biol. – 1965. –
Vol. 12. – P. 85–118.
15. Уголев А. М. Мембранное пищеварение. Полисубстратные процессы, организация и регуляция. –
Л.: Наука, 1972. – 358 с.
16. Калоус В., Павличек З. Биофизическая химия. – М.: Мир, 1985. – 446 с.
Статья поступила в редакцию 14.09.2011
ÈÍÔÎÐÌÀÖÈß ÎÁ ÀÂÒÎÐÀÕ
Áåäíÿêîâ Äìèòðèé Àíäðååâè÷ – Àñòðàõàíñêèé ãîñóäàðñòâåííûé òåõíè÷åñêèé óíèâåðñèòåò; êàíä. áèîë.
íàóê, äîöåíò; äîöåíò êàôåäðû «Ñîöèàëüíî-êóëüòóðíûé ñåðâèñ è òóðèçì»; bednyakovd@rambler.ru.
Bednyakov Dmitry Andreevich – Astrakhan State Technical University; Candidate of Biological Science,
Assistant Professor; Assistant Professor of the Department "Social-Cultural Service and Tourism";
bednyakovd@rambler.ru.
Íåâàë¸ííàÿ Ëåéëà Àçàäîâíà – Àñòðàõàíñêàÿ ãîñóäàðñòâåííàÿ ìåäèöèíñêàÿ àêàäåìèÿ; êàíä. ìåä.
íàóê, äîöåíò; äîöåíò êàôåäðû «Îôòàëüìîëîãèÿ»; nevalennyy@rambler.ru.
Nevalennaya Leila Azadovna – Astrakhan State Medical Academy; Candidate of Medical Science, Assistant Professor; Assistant Professor of the Department "Ophthalmology"; nevalennyy@rambler.ru.
Íîâèíñêèé Âåíèàìèí Þðüåâè÷ – Àñòðàõàíñêèé ãîñóäàðñòâåííûé òåõíè÷åñêèé óíèâåðñèòåò;
ìëàäøèé íàó÷íûé ñîòðóäíèê ëàáîðàòîðèè «Ôèçèîëîãèÿ ïèòàíèÿ ðûá»; novinskii@bk.ru.
Novinsky Veniamin Yurievich – Astrakhan State Technical University; Junior Research Worker
of the Laboratory "Physiology of Fish Feeding"; novinskii@bk.ru.
77