СПИРТОВОЕ БРОЖЕНИЕ. ДРОЖЖИ
реклама
ЗАНЯТИЕ 12. 45 СПИРТОВОЕ БРОЖЕНИЕ. ДРОЖЖИ 12.1 ИНФОРМАЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ Дрожжи очень широко распространены в окружающей среде. Они активно размножаются в тех субстратах, где имеются доступные растворимые источники углерода, т.е. в соках, сиропах, на плодах, в нектарах цветов, в сокотечениях деревьев, на поверхности листьев, в воде, в почве. Хотя дрожжи и не вызывают образования токсических веществ при развитии на пищевых продуктах, они могут изменять их вкус, запах и внешний вид. Необычными потребностями для роста характеризуются дрожжи, обитающие в специфических природных очагах. Например, обитатели кишечника теплокровных животных нуждаются в витаминах и аминокислотах. Осмофильные дрожжи лучше растут при высоких концентрациях сахара в среде (50% и выше) - Zygosaccharomyces (рис. 44). Они встречаются в пчелиных ульях, являются причиной порчи меда, варенья, джема, вызывают скисание вин. Некоторые виды дрожжей - Pichia, Hansenula ассоциированы с насекомыми-ксилофагами (короедами) и встречаются в местах их обитания. Они используют в качестве питательных веществ целлобиозу и ксилозу. Некоторые дрожжи, такие как Candida, могут быть возбудителями тяжелых заболеваний, например, кандидоза. Систематическое положение. Термин “дрожжи” таксономического значения не имеет. Филогенетические связи обнаруживаются как с сумчатыми, так и с базидиальными грибами. Дрожжи, у которых половой процесс не обнаружен, относят к несовершенным грибам. Границы группы очерчены нечётко: многие грибы, способные вегетативно размножаться в одноклеточной форме и идентифицируемые поэтому как дрожжи, на других стадиях жизненного цикла образуют развитый мицелий, а в ряде случаев и макроскопические плодовые тела. До появления методов молекулярного анализа такие грибы выделяли в особую группу дрожжеподобных, но сейчас их все обычно рассматривают вместе с дрожжами. Исследования 18S рРНК показали близкое родство с типичными дрожжами видов, способных к росту только в виде мицелия. К настоящему времени полностью расшифрован геном дрожжей Saccharomyces cerevisiae (они стали первыми эукариотами, чей геном был полностью секвенирован) и Schizosaccharomyces pombe. Типичные размеры дрожжевых клеток составляют 3—7 мкм в диаметре, а некоторые виды способны вырастать до 40 мкм. Культурные дрожжи выведены путем длительной селекции из диких дрожжей. К ним относятся: Saccharomyces cerevisiae и S. vini, S. ellipsoides. Эти дрожжи отличаются от диких тем, что способны выдерживать большие концентрации спирта в среде, образуют меньше побочных продуктов брожения, вследствие чего интенсивнее идут процессы брожения. Спиртовое брожение идет в анаэробных условиях, тогда как размножение дрожжей происходит при широком доступе кислорода при оптимальных температурах 30-35 °С. Образующийся спирт вреден для дрожжей, и при накоплении его брожение прекращается. Однако при высокой концентрации сахара в растворе дрожжи могут оставаться живыми в среде, содержащей до 15 % спирта. Дрожжевая клетка состоит из клеточной мембраны, цитоплазмы, внутри которой расположены органоиды (ядро, митохондрии, рибосомы, вакуоль, аппарат Гольджи) и включения (запасные вещества) в виде капелек жира, зерен гликогена и волютина. Некоторые дрожжи содержат пигменты. По мере роста дрожжевых клеток в них появляются вакуоли (водный раствор органических и минеральных веществ). Оболочка клетки дрожжей состоит из нескольких слоев. В состав ее входят полисахариды, липиды, азотсодержащие вещества. Оболочка клетки у некоторых дрожжей может в той или иной степени ослизняться, вследствие чего клетки склеиваются друг с другом и при развитии в жидких средах образуют оседающие на дно сосуда хлопья. Такие дрожжи называют хлопьевидными в отличие от пылевидных, оболочки клеток которых не ослизняются; пылевидные дрожжи в жидкости находятся во взвешенном состоянии Форма и размеры дрожжей могут заметно изменяться в зависимости от от вида, возраста, питательной среды, способа культивирования, а также от возраста клеток. Так, например, клетка может принимать форы: круглую, эллиптическую, овальную, реже лимонообразную и цилиндрическую, иногда сильно вытянутую в виде гиф. Форма и структура клеток непостоянна, она может изменяться в связи с изменением условий культивирования. В зависимости от вида дрожжи вегетативно могут размножаться почкованием (так размножаются ЗАНЯТИЕ 12. 46 дрожжи овальной формы), бинарным делением (характерно для дрожжей цилиндрической или палочковидной формы) или почкующимся делением. Кроме вегетативного размножения, дрожжи – аскомицеты могут размножаться половым путем с образованием аскоспор. а д б е г в ж з Рис. Формы дрожжевых клеток: а - овальная яйцевидная; б - цилиндрическая; в – апикулятная; лимоновидная; г – стреловидная; д – треугольная; е – серповидная; ж – колбовидная; з, и - мицелевидная Техническое значение дрожжей основано на их способности превращать сахар в этиловый спирт и углекислый газ. В связи с этим издавна они получили общее название сахарных грибов, или сахаромицетов. Дрожжи отличаются высоким содержанием белков и витаминов (B1, Вз, В6, никотиновой кислоты). Дрожжи-сахаромицеты имеют овальную форму, вегетативно размножаются почкованием, в неблагоприятных условиях размножаются половым путем аскоспорами. Роль дрожжей в хлебопекарном производстве заключается в разрыхлении теста. Дрожжи сбраживают сахара муки и мальтозу, образующуюся из крахмала с выделением спирта и углекислого газа. При этом образуются побочные продукты (уксусный альдегид, бутиловый, изобутиловый, изоамиловый спирты, органические кислоты, ароматические вещества – диацетил и ацетоин, эфиры и др.), которые создают вкус и аромат хлеба. При производстве пшеничного хлеба применяют дрожжи Saccharomyces cerevisiae, а при производстве ржаного хлеба - дрожжи двух видов Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces minor, причем преобладают дрожжи второго вида. Дрожжи Saccharomyces minor отличаются более высокой кислотоустойчивостью, чем дрожжи первого вида, менее требовательны к источникам витаминного и азотного питания, более спиртоустойчивы. В пивоварении используются Saccharomyces. Пивные дрожжи относятся к двум cerevisiae и S. carlsbergensis. видам: S. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются дрожжами верхового брожения и в пивоварении ис- ЗАНЯТИЕ 12. 47 пользуются редко, в основном для темных и специальных сортов пива. Эти дрожжи в производственных условиях сбраживают сусло при 12…15 0С. Дрожжи Saccharomyces carlsbergensis относятся к дрожжам низового брожения и в производстве осуществляют главное брожение при 5…10 0С. Они нашли широкое применение в пивоваренном производстве и используются для приготовления стандартного и сортового пива. Спиртовые дрожжи. В спиртовом производстве применяют дрожжи вида Saccharomyces cerevisiae. Дрожжи - дейтеромицеты могут размножаться только вегетативным способом. Некоторые из этих дрожжей (например, дрожжи рода Candida) используются в промышленности для получения кормового белка, органических кислот, витаминов и других продуктов микробного синтеза. Дрожжи вида Torulopsis kefir входят в состав симбиотической закваски – кефирного грибка. Другие представители несовершенных (аспорогенных) дрожжей являются дикими дрожжами и вызывают порчу многих пищевых продуктов. К дрожжам - вредителям производства относятся дрожжи родов Pichia, Hansenula, Candida, Rhodotorula, Torula, Torulopsis, Mycoderma, Trichosporon и др. Среди аспорогенных дрожжей встречаются ложные дрожжи, которые образуют псевдомицелий и растут на жидких субстратах в виде пленок. 12.2 ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ. Типы питания. Источники энергии, углерода, азота, доноры электронов у фотолитотрофов, фотоорганотрофов, нитрифицирующих, хемоорганотрофов. Сапрофиты и паразиты. Ауксотрофы. Миксотрофы. Питательные среды и культивирование микроорганизмов. Использование микроорганизмами высокомолекулярных соединений и веществ, нерастворимых в воде. Особенности энергетического обмена микроорганизмов : источники энергии и формы энергии, используемые в бактериальной клетке, способы аккумуляции энергии клеткой. Определение понятия "брожение". Субстраты сбраживания. а) Можно ли брожение назвать «бескислородным дыханием»? ..................................................... ............................................................................................................................................................ ............................................................................................................................................................ б) Указать биологическое значение фаз брожения и записать суммарные уравнения реакций: окислительная фаза: ..................................................................................................................... ......................................................................................................................................................... восстановительная фаза: .............................................................................................................. ......................................................................................................................................................... в) Микрофотография и схематическое изображение поперечного разреза дрожжевой клетки. Указать под какими номерами обозначены следующие органоиды на схеме: ЗАНЯТИЕ 12. 48 … вакуоль; … гранулы полифосфата метахроматина (волютина); … диктиосома; … жировые капельки; … клеточная стенка; … митохондрия; … рибосомы; … рубец на месте отпочковавшейся дочерней клетки; … цитоплазма; … цитоплазматическая мембрана; … эндоплазматическая сеть; … ядро; … ядрышко. г) Какое влияние оказывает О2 на жизнедеятельность дрожжей? ................................................. ............................................................................................................................................................ д) Для спиртового брожения дрожжей указать: 1. способ брожения: ........................................................................................................................ 2. доноры и акцепторы электронов: ............................................................................................... ....................................................................................................................................................... ; 3. переносчики электронов и электронтранспортные системы: .................................................. ....................................................................................................................................................... ; 4. отношение дрожжей к кислороду: ............................................................................................ ; 5. тип питания: ................................................................................................................................. ; 6. источники энергии: ...................................................................................................................... 7. источники углерода: .................................................................................................................... 8. источники азота: .......................................................................................................................... ; 9. субстраты процесса:.................................................................................................................... 10. продукты процесса: ..................................................................................................................... 11. возбудители процесса: ............................................................................................................... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... 12. практическое использование метаболитов в промышленности и сельском хозяйстве: .... ....................................................................................................................................................... ....................................................................................................................................................... . ЗАНЯТИЕ 12. 49 12.3 ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА Вид дрожжевых клеток под объективом микроскопа в зависимости от их возраста Внешний вид Возраст дрожжевых клеток и содержи- Покоящиеся (чи- Молодые (неЗрелые ПерезреГолодающие Мертвые мое клеток стая культура) зрелые) лые(старые) Форма Овальная Овальная Овальная Клетки съежи- Клетки съеживаются ваются Размер Крупные Крупные Крупные Уменьшаются Уменьшаются в размерах в размерах Почкующиеся Нет или едиПочкуется 10 Почкуется 10 Нет или едиНет Нет клетки ничные % % ничные Оболочка Очень тонкая Очень тонкая Четко очерчен- Толстая или Толстая или Расплывается и ная двуконтурная двуконтурная распадается Цитоплазма Нежная и одно- Нежная и од- НеоднородСильно зер- Сильно зерКомковатая родная нородная ная или зернистая нистая нистая Вакуоли Нет Нет Содержат не- Иногда заниНет многие клетки мает всю клетку Гликоген В единичных Занимает Занимает от В небольших Отсутствует Отсутствует клетках меньше 1/4 1/3 до 2/3 количествах клетки или отклетки сутствует 12.3.1 Определение морфологического состояния дрожжей Приготовить препарат из жидкой культуры хлебных дрожжей методом раздавленной капли: на предметное стекло наносят каплю разбавленной дрожжевой суспензии и накрывают ее покровным стеклом. Излишки воды удаляют фильтровальной бумагой. Микроскопировать с объективом 40х в затемненном поле зрения микроскопа. При микроскопировании обращают внимание на форму, размеры клеток, толщину оболочек, структуру цитоплазмы, наличие почкующихся клеток. Дрожжи должны иметь форму и размеры, соответствующие применяемой расе. Клетки должны быть равномерной величины, с тонкой оболочкой, однородной или мелкозернистой цитоплазмой, небольшими вакуолями. Количество почкующихся клеток в засевных дрожжах, используемых в пивоварении должно составлять 40…70%. Наличие большого количества морфологически измененных клеток свидетельствует о дегенерации культуры, поэтому такие дрожжи использовать в производстве не рекомендуется. Зернистая цитоплазма, крупные вакуоли и отсутствие почкующихся клеток характеризует старую культуру. Морфологическое состояние дрожжей: .................................................................................................. .................................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................................... Записать основные стадии химических превращений веществ при спиртовом брожении от глюкозы до этанола, отметив количество молекул АТФ, образовавшихся из одной молекулы глюкозы. .................................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................................... ЗАНЯТИЕ 12. 50 12.3.2 Определение процентного содержания мертвых клеток На предметное стекло наносят каплю разбавленной дрожжевой суспензии и каплю раствора синьки Финка (раствор метиленового синего концентрацией 1:5000). Через 2 мин препарат накрывают покровным стеклом, излишки воды убирают с помощью фильтровальной бумаги. Микроскопирование ведут в 5 полях зрения. При этом подсчитывают количество всех дрожжевых клеток, а также отдельно считают количества мертвых (окрашенных в синий цвет) клеток. Далее рассчитывают процентное содержание мертвых клеток. Определение мертвых клеток в дрожжевой суспензии можно проводить и с помощью водного раствора красителя нейтрального красного в концентрации 1:10000. При этом мертвые клетки окрашиваются в красный цвет, а в живых клетках окрашиваются только включения цитоплазмы. При окрашивании дрожжевой суспензии раствором нейтрального красного микроскопирование ведут через 15 мин после окраски. Процент жизнеспособных клеток: .......................................................................................................... 12.3.3 Определение биологической чистоты дрожжей Готовят фиксированный мазок из густой дрожжевой суспензии. Окрашивают его по Граму или простым методом. Далее препарат микроскопируют в иммерсионной системе с использованием объектива х100. Рассматривают препарат в 10 полях зрения. При микроскопировании обращают внимание на наличие посторонних бактерий и диких дрожжей. Определение биологической чистоты можно также вести путем приготовления препарата «раздавленная капля» с использованием фазово-контрастного микроскопа. В этом случае на предметное стекло наносят каплю дрожжевой суспензии и добавляют каплю 10% раствора КОН или 50% уксусной кислоты для растворения белков и жировых частиц, что облегчает просмотр препарата. Далее накрывают препарат покровным стеклом и микроскопируют с объективом х40 и рассматривают в 20 полях зрения. В поле зрения должно быть около 50 клеток дрожжей. Зарисовать дрожжевую клетку, сделать вывод о биологической чистоте дрожжей. .......................................................................... .......................................................................... .......................................................................... .......................................................................... .......................................................................... .......................................................................... .......................................................................... .......................................................................... 12.3.4 Определение запасных веществ (гликогена) в клетках дрожжей Основными запасными веществами дрожжевой клетки являются гликоген и волютин (зерна метахроматина). Гликоген – запасной полисахарид дрожжевой клетки. По содержанию гликогена судят об упитанности дрожжей. Если гликогена в дрожжах мало, то это свидетельствует о том, что они длительное время находились без питательного субстрата и имеют поэтому низкую бродильную активность. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛИКОГЕНА: На предметное стекло поместить каплю культуры хлебных дрожжей и добавить к ним каплю крепкого раствора Люголя (0,5% раствора йода) перемешать. Полученную смесь накрыть покровным стеклом, удалить избыток жидкости и рассматривать с объективом 40х. Через 2…3 мин цитоплазма клеток окрашивается в светло-желтый цвет, а гранулы гликогена – в красно-бурый. Препарат накрывают покровным стеклом и удаляют излишек жидкости фильтровальной бумагой и микроскопируют с объективом х40. При нагревании препарата до 60°С окраска исчезает, при охлаждении восстанавливается. ЗАНЯТИЕ 12. 51 Рис. клетки хлебных Химический состав гликогена: дрожжей с ................................................................................................................ гранулами гликогена. ................................................................................................................ ................................................................................................................ и его значение в клетке: ................................................................................................................ ................................................................................................................ ................................................................................................................ ................................................................................................................
