Âîçäåéñòâèå PRP-1 íà àêòèâíîñòü íåêîòîðûõ ôîñôàòàç êîñòíîãî ìîçãà
реклама
ÁÈÎÕÈÌÈß ÓÄÊ 577.15 Ë. Ï. Òåð-Òàòåâîñÿí, Ë. Â. Ñàðêèñÿí, È. Ã. Àñëàíÿí, àêàäåìèê À. À. Ãàëîÿí Âîçäåéñòâèå PRP-1 íà àêòèâíîñòü íåêîòîðûõ ôîñôàòàç êîñòíîãî ìîçãà áåëûõ êðûñ, ïîðàæåííûõ öèêëîôîñôàìèäîì (Ïðåäñòàâëåíî 19/XI 2007) Êëþ÷åâûå ñëîâà: ùåëî÷íàÿ ôîñôàòàçà, êèñëàÿ ôîñôàòàçà, íåîðãàíè÷åñêàÿ ïèðîôîñôàòàçà, ãëèêîãåíôîñôîðèëàçà, PRP-1, öèêëîôîñôàìèä Ïåðâè÷íûì ìåñòîì ãåìàòîïîåçà ÿâëÿåòñÿ êîñòíûé ìîçã – ìåñòî ðîæäåíèÿ âñåõ êëåòîê èììóííîé ñèñòåìû è ñîçðåâàíèÿ Â-ëèìôîöèòîâ. Êðîâåòâîðíàÿ ñòâîëîâàÿ êëåòêà, ÿâëÿþùàÿñÿ ðîäîíà÷àëüíèöåé âñåõ êëåòîê èììóííîé ñèñòåìû, îáåñïå÷èâàåò âîññòàíîâëåíèå ïîâðåæäåííûõ ó÷àñòêîâ îðãàíîâ è òêàíåé. Ðåãóëèðóåò ôóíêöèè èììóíèòåòà è çàùèòíûå ðåàêöèè ãèïîòàëàìîãèïîôèçîêîðòèêîòðîïíàÿ ñèñòåìà. Ïåïòèäíûå ãîðìîíû, âûðàáàòûâàåìûå â ãèïîòàëàìóñå è ïîñòóïàþùèå èç íåãî â ãèïîôèç, ñëóæàò ñâÿçûâàþùèì çâåíîì ìåæäó íåðâíîé è ýíäîêðèííûìè ñèñòåìàìè, èãðàþò âàæíóþ ðîëü â ðåãóëÿöèè è ðåàëèçàöèè ìíîãèõ ôóíêöèé îðãàíèçìà. Èììóíîñòèìóëèðóþùèå ïðîëèí-áîãàòûå ïåïòèäû, âûäåëåííûå À.À.Ãàëîÿíîì è ñîòð. èç ãèïîòàëàìóñà áûêà, ó÷àñòâóþò â ðåãóëÿöèè ôèçèîëîãè÷åñêèõ ôóíêöèé, ñâÿçàííûõ ñ äåÿòåëüíîñòüþ öåíòðàëüíîé è ïåðèôåðè÷åñêîé íåðâíîé ñèñòåìû [1-3]. Ñîãëàñíî íàøèì äàííûì íåêîòîðûå áèîàêòèâíûå ïåïòèäû îêàçûâàþò îïðåäåëåííîå âîçäåéñòâèå íà ðÿä ôåðìåíòîâ óãëåâîäíî-ôîñôîðíîãî îáìåíà [4, 5]. Ôîñôàòàçû – ôåðìåíòû, êàòàëèçèðóþùèå ðàçðûâ ñëîæíîýôèðíîé ñâÿçè â ìîíîýôèðàõ ôîñôîðíîé êèñëîòû ñ îáðàçîâàíèåì ñâîáîäíîãî ôîñôàòà, îòíîñÿòñÿ ê êëàññó ãèäðîëàç. Âìåñòå ñ ïðîòåèíêèíàçàìè îíè ïðèíèìàþò ðàâíîå ó÷àñòèå â ïîääåðæàíèè äèíàìè÷åñêîãî ðàâíîâåñèÿ è ôóíêöèîíàëüíîé ãîòîâíîñòè ôåðìåíòíûõ è äðóãèõ ôîñôîïðîòåèíîâ, íåîáõîäèìûõ äëÿ îáåñïå÷åíèÿ êëåòî÷íîãî ãîìåîñòàçà. Èçâåñòåí ðÿä çàáîëåâàíèé è ïàòîëîãè÷åñêèõ ñîñòîÿíèé, â îñíîâå êîòîðûõ ëåæèò íåäîñòàòî÷íîñòü òåõ èëè èíûõ ôåðìåíòîâ. 2 5 1 Îïðåäåëåíèå àêòèâíîñòè ìíîãèõ ôîñôàòàç â áèîëîãè÷åñêèõ æèäêîñòÿõ è òêàíÿõ èãðàåò çíà÷èòåëüíóþ ðîëü â ëàáîðàòîðíîé äèàãíîñòèêå ðàçëè÷íûõ çàáîëåâàíèé (òóáåðêóëåç, ëèìôîãðàíóëîìàòîç, àìèëîèäîç, ðàê ïðåäñòàòåëüíîé æåëåçû, ãëèêîãåíîëèç, áîëåçíü Õåðñà), à òàêæå ñëóæèò ïîêàçàòåëåì ýôôåêòèâíîñòè ëå÷åíèÿ ýòèõ áîëåçíåé [6-9]. Çàäà÷åé äàííîãî èññëåäîâàíèÿ ÿâèëîñü èçó÷åíèå ðîëè è ìåõàíèçìà äåéñòâèÿ ïðîëèí-áîãàòîãî ãèïîòàëàìè÷åñêîãî íåéðîïåïòèäà PRP-1 (ãàëàðìèíà) íà ôåðìåíòàòèâíóþ àêòèâíîñòü ùåëî÷íîé è êèñëîé ôîñôàòàç, íåîðãàíè÷åñêîé ïèðîôîñôàòàçû, ãëèêîãåíôîñôîðèëàçû ó çäîðîâûõ æèâîòíûõ, à òàêæå ïðè íåêîòîðûõ ïàòîëîãè÷åñêèõ ñîñòîÿíèÿõ (èçìåíåíèÿõ â îðãàíèçìå), âûçâàííûõ öèêëîôîñôàìèäîì (ÖÔÀ). Ìåòîäèêà. Îïûòû âûïîëíåíû íà 60 ñàìöàõ áåñïîðîäíûõ êðûñ. Ïåðâîé ãðóïïå êðûñ (25 æèâîòíûõ ìàññîé 125 ã) ââîäèëè âíóòðèáðþøèííî ÖÔÀ â ôèçðàñòâîðå â äîçå 6 ìã. Âòîðîé ãðóïïå (25 æèâîòíûõ ìàññîé 220 ã) ââîäèëè âíóòðèáðþøèííî ÖÔÀ â ôèçðàñòâîðå â äîçå 10 ìã. ×åðåç ÷àñ èì æå ââîäèëè PRP-1 â äîçå 20°. Êîíòðîëüíîé ãðóïïå (10 êðûñ) ââîäèëè ðàâíîå êîëè÷åñòâî ôèçðàñòâîðà. Äåêàïèòèðîâàëè êðûñ â 1-é, 4-é, 7-é è 11-é äíè. Èçâëåêàëè êîñòíûé ìîçã èç áåäðà è ãîòîâèëè ãîìîãåíàò â ôèçðàñòâîðå â ñîîòíîøåíèè 1:50 (âåñ:îáúåì).  ýêñïåðèìåíòå áûëè èñïîëüçîâàíû êîììåð÷åñêèå î÷èùåííûå ôåðìåíòû: ùåëî÷íàÿ ôîñôàòàçà èç êèøå÷íèêà êîðîâû â ðàçâåäåíèè 1 ìã â 20 ìë äèñòèëëèðîâàííîé âîäû è ãëèêîãåíôîñôîðèëàçà à, âûäåëåííàÿ èç ìûøö êðîëèêà, â ðàçâåäåíèè 1 ìã â 5 ìë Í2 Î. Àêòèâíîñòü ùåëî÷íîé ôîñôàòàçû (êîýô. ôåðìåíòà 3.1.3.1) è êèñëîé ôîñôàòàçû (êîýô. ôåðìåíòà 3.1.3.2) îïðåäåëÿëè ìåòîäîì Øëûãèíà è Ìèõëèíà [10].  êà÷åñòâå ñóáñòðàòà èñïîëüçîâàëè ïàðà-íèòðîôåíèëôîñôàò (”Serva”) â êîíöåíòðàöèè 2 ¢ 1 0 ¡3 Ì â ìåäèíàëîâîì áóôåðå ñ ðÍ 9.6 äëÿ ùåëî÷íîé ôîñôàòàçû è ðÍ 4.6 äëÿ êèñëîé. Îá àêòèâíîñòè ýòèõ ôåðìåíòîâ ñóäèëè ïî íàðàñòàíèþ ïàðàíèòðîôåíîëà â òå÷åíèå 30 ìèí ïðè 30o Ñ. Àêòèâíîñòü íåîðãàíè÷åñêîé ïèðîôîñôàòàçû (êîýô. ôåðìåíòà 3.6.1.1) îïðåäåëÿëè ìåòîäîì Ãåïïåëÿ [11]. Ñóáñòðàòîì äëÿ äàííîãî ýíçèìà ñëóæèë íåîðãàíè÷åñêèé ïèðîôîñôàò Na â ìåäèíàëîâîì áóôåðå ñ ðÍ 7.2. Àêòèâíîñòü ôåðìåíòà îïðåäåëÿëè ïî íàðàñòàíèþ íåîðãàíè÷åñêîãî ôîñôîðà. Àêòèâíîñòü ãëèêîãåíôîñôîðèëàçû (êîýô. ôåðìåíòà 2.4.6.1) îïðåäåëÿëè ïî Èëëèíãâîðòó è Êîðè [12]. Èññëåäîâàííûé ìàòåðèàë ïðåäèíêóáèðîâàëè 2 ìèí ïðè 30o Ñ ñ 0.1 ìë 4% âîäíîãî ðàñòâîðà ãëèêîãåíà, 0,1 ìë ÒÝÌ áóôåðà, 0,1 ìë èññëåäóåìîãî ïåïòèäà è äàëåå äëÿ õîäà îïûòà äîáàâëÿëè 0.1 ìë 64 ìÌ ãëþêîçî-1 ôîñôàòà. ×åðåç 5 ìèí ðåàêöèþ ïðèîñòàíàâëèâàëè 1.6 ìë îõëàæäåííîé 5% ÒÕÓ. Àêòèâíîñòü ôåðìåíòà îïåðåäåëÿëè ïî óáûëè 2 5 2 íåîðãàíè÷åñêîãî ôîñôîðà â ðåàêöèîííîé ñìåñè. Âëèÿíèå ãîðìîíîâ íà îáìåí âåùåñòâ è ýíåðãèè îñóùåñòâëÿåòñÿ â îñíîâíîì ÷åðåç èçìåíåíèå àêòèâíîñòè îïðåäåëåííûõ ôåðìåíòîâ, ïðè÷åì ãîðìîíû âëèÿþò ëèáî íåïîñðåäñòâåííî íà èõ ñèíòåç, ëèáî íà ñèíòåç äðóãèõ âåùåñòâ, ó÷àñòâóþùèõ â êîíêðåòíîì ôåðìåíòàòèâíîì ïðîöåññå. ìêÌ ôåíîëà ã òê. ìèí. Ðèñ. 1. Âëèÿíèå ÖÔÀ è PRP-1 íà àêòèâíîñòü ùåëî÷íîé ôîñôàòàçû êîñòíîãî ìîçãà Ùåëî÷íàÿ ôîñôàòàçà E = êðûñ (in vivo): 1 – êðûñû âåñîì 125 ã (äîçà ÖÔÀ 6 ìã.); 2 – êðûñû âåñîì 220 ã (äîçà ÖÔÀ 10 ìã, PRP-1 20 ìêã).  çàâèñèìîñòè îò èñòî÷íèêà ýíçèìà, óñëîâèé ñðåäû èíêóáèðîâàíèÿ, êîíöåíòðàöèè èñïîëüçóåìûõ ñîåäèíåíèé îáíàðóæèâàåòñÿ êàê èõ àêòèâèðóþùèé ýôôåêò, òàê è èíãèáèðóþùèé. Ùåëî÷íàÿ ôîñôàòàçà (ÙÔ) ñ÷èòàåòñÿ îäíèì èç íàèáîëåå ðàñïðîñòðàíåííûõ ôåðìåíòîâ îðãàíè÷åñêîãî ìèðà ñ ñàìûìè ðàçëè÷íûìè ïðîÿâëåíèÿìè àêòèâíîñòè, çàâèñÿùèìè îò ëîêàëèçàöèè â ðàçëè÷íûõ îðãàíàõ è êëåòî÷íûõ ñòðóêòóðàõ. Íà ðàííèõ ýòàïàõ íàøèõ èññëåäîâàíèé ÙÔ îáíàðóæåíà â ãîìîãåíàòå êîñòíîãî ìîçãà êðûñû, à òàêæå óñòàíîâëåí ôàêò ðåãóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ íà àêòèâíîñòü äàííîãî ôåðìåíòà îäíîãî èç ãèïîòàëàìè÷åñêèõ íåéðîïåïòèäîâ – ãàëàðìèíà. Èçìåíåíèÿ â ñâîéñòâàõ ÙÔ â ýòîé òêàíè íàáëþäàëèñü íàìè òàêæå ïðè ôóíêöèîíàëüíûõ è ïàòîëîãè÷åñêèõ ñîñòîÿíèÿõ îðãàíèçìà (ðàçäðàæåíèå, ïåðåäîçèðîâêà). Ñ öåëüþ èçó÷åíèÿ õàðàêòåðà âîçìîæíûõ èçìåíåíèé àêòèâíîñòè ÙÔ ïîä äåéñòâèåì ïåïòèäà PRP-1 íàìè ïðîâåäåíû äâå ñåðèè îïûòîâ (in vivo): 1) c îäíîêðàòíîé èíúåêöèåé ÖÔÀ, 2) ñ èíúåêöèåé ÖÔÀ è PRP-1 (ðèñ.1). Êðèâûå ãðàôèêà ïîêàçûâàþò, ÷òî ââåäåíèå ÖÔÀ íà àêòèâíîñòü èññëåäóåìîãî ôåðìåíòà ñóùåñòâåííîãî âîçäåéñòâèÿ íå îêàçûâàåò: ïîíèæåíèå àêòèâíîñòè 2 5 3 îò 2 äî 12% ðåãèñòðèðóåòñÿ â 1-é, 4-é è 11-é äíè. Íà 7-é äåíü ïîñëå ââåäåíèÿ ÖÔÀ àêòèâíîñòü ùåëî÷íîé ôîñôàòàçû ïîäàâëÿåòñÿ íåñêîëüêî ñèëüíåå, äîõîäÿ äî 24% îò êîíòðîëüíîé âåëè÷èíû. ìêÌ ôåíîëà ã òê. ìèí. Ðèñ. 2. Âëèÿíèå ÖÔÀ è PRP-1 íà àêòèâíîñòü êèñëîé ôîñôàòàçû êîñòíîãî ìîçãà Êèñëàÿ ôîñôàòàçà E = êðûñ (in vivo): 1 – êðûñû âåñîì 125 ã (äîçà ÖÔÀ 6 ìã.); 2 – êðûñû âåñîì 220 ã (äîçà ÖÔÀ 10 ìã, PRP-1 20 ìêã). Âòîðàÿ ãðóïïà æèâîòíûõ, êîòîðîé äîïîëíèòåëüíî ââåäåí PRP-1, íåîäíîçíà÷íî ðåàãèðóåò íà äåéñòâèå ýòèõ ýôôåêòîðîâ: ñïàä àêòèâíîñòè ÙÔ, ïî ñðàâíåíèþ ñ ôîíîâîé, íàáëþäàåìûé â 1-é è 4-é äíè, ñêà÷êîîáðàçíî ïåðåõîäèò â ïðîöåññ àêòèâàöèè íà 7-é äåíü (+50%), çàòåì ñëåãêà ïîíèæàåòñÿ íà 11-é äåíü (+29%), îñòàâàÿñü âûøå ôîíîâîé. Ïðè äåéñòâèè ýòèõ äâóõ ðåàãåíòîâ íà î÷èùåííûé ôåðìåíò áûëà ïîëó÷åíà óìåðåííàÿ àêòèâàöèÿ ÙÔ ïðè âñåõ èñïîëüçóåìûõ äîçàõ ÖÔÀ è PRP-1. Âûÿâëåííûå â îïûòàõ íà ÷èñòîì ôåðìåíòå ðåçóëüòàòû íå ïîâòîðèëèñü íà ãîìîãåíàòå â îïûòàõ in vitro, ãäå ÙÔ ïðîÿâèëà ïîëíóþ ðåçèñòåíòíîñòü ê äàííûì âåùåñòâàì. Èç âûøåïðèâåäåííûõ äàííûõ ñëåäóåò, ÷òî õàðàêòåð äåéñòâèÿ PRP-1 (íà ôîíå ÖÔÀ) íà ÙÔ æèâîãî îðãàíèçìà è íà ÷èñòûé ôåðìåíò íåîäèíàêîâ. Î÷åâèäíî, â îáîèõ ñëó÷àÿõ íåîäíîçíà÷íàÿ ðåàêöèÿ ôåðìåíòà íà ýòè ðåàãåíòû äîëæíà ðàññìàòðèâàòüñÿ ñ òî÷êè çðåíèÿ ñòðóêòóðíûõ îñîáåííîñòåé ÙÔ â äàííîé ñðåäå. ÙÔ, ÿâëÿÿñü ìåòàëëîïðîòåèíîì [13], ðåãóëèðóåòñÿ ñïåöèôè÷åñêèìè è íåñïåöèôè÷åñêèìè àêòèâàòîðàìè è èíãèáèòîðàìè. Èçáèðàòåëüíîñòü èõ äåéñòâèÿ îáúÿñíÿåòñÿ òåì, ÷òî îíè ðåàãèðóþò ñî ñòðîãî îïðåäåëåííîé õèìè÷åñêîé ãðóïïèðîâêîé â àêòèâíîì öåíòðå ôåðìåíòà (Zn2+ , Mg2+ ), â ðåçóëüòàòå ÷åãî èìååò ìåñòî êîíôîðìàöèîííàÿ ïåðåñòðîéêà ìîëåêóëû, êîòîðàÿ ñîçäàåò îïðåäåëåííûå óñëîâèÿ äëÿ ôåðìåíò-ñóáñòðàòíîãî êîìïëåêñà. À âîçìîæíî, ýòè ðàçëè÷èÿ ñâÿçàíû ñ ñóùåñòâîâàíèåì â èññëåäóåìîé òêàíè íåñêîëüêèõ êàòàëèòè÷åñêè 2 5 4 àêòèâíûõ ìîëåêóëÿðíûõ ôîðì ÙÔ, ñ ÷àñòè÷íî ïåðåêðûâàþùèìèñÿ, íî íå ñîâïàäàþùèìè ñâîéñòâàìè, ñëóæàùèõ äëÿ ãèáêîé è èçáèðàòåëüíîé ðåãóëÿöèè ðàçëè÷íûõ êëåòî÷íûõ ïðîöåññîâ [14]. ìêÌ ôåíîëà ã òê. ìèí. Ðèñ. 3. Âëèÿíèå ÖÔÀ è PRP-1 íà àêòèâíîñòü íåîðãàíè÷åñêîé ïèðîôîñôàòàçû Íåîðãàíè÷åñêàÿ ïèðîôîñôàòàçà E = êîñòíîãî ìîçãà êðûñ (in vivo): 1 – êðûñû âåñîì 125 ã (äîçà ÖÔÀ 6 ìã.); 2 – êðûñû âåñîì 220 ã (äîçà ÖÔÀ 10 ìã, PRP-1 20 ìêã). Êèñëàÿ ôîñôàòàçà (ÊÔ) êàòàëèçèðóåò ãèäðîëèç ñëîæíûõ ýôèðîâ ôîñôîðíîé êèñëîòû è îðãàíè÷åñêèõ ñîåäèíåíèé. Ýòîò ëèçîñîìàëüíûé ôåðìåíò ñîäåðæèòñÿ ïðàêòè÷åñêè âî âñåõ òêàíÿõ. Âûñîêàÿ êîíöåíòðàöèÿ åå îòìå÷àåòñÿ â ýðèòðîöèòàõ, òðîìáîöèòàõ, êîñòíîì ìîçãå è äð. Ïîäîáíî ÙÔ ÊÔ ÿâëÿåòñÿ ôåíîòèïè÷åñêèì ìàðêåðîì äëÿ äèôôåðåíöèàöèè ðÿäà çàáîëåâàåíèé [6, 15]. Îñîáîãî âíèìàíèÿ çàñëóæèâàþò äàííûå, ïîëó÷åííûå ïðè èññëåäîâàíèè ÊÔ êîñòíîãî ìîçãà – òêàíè, â êîòîðîé ñêîíöåíòðèðîâàíî íàèáîëüøåå êîëè÷åñòâî êðîâåòâîðíûõ êëåòîê (ðèñ. 2). Åñëè ïðîñëåäèòü çà àêòèâíîñòüþ äàííîãî ôåðìåíòà â äèíàìèêå, òî, ñîãëàñíî êðèâîé (ó 3-ìåñÿ÷íûõ êðûñ) ÖÔÀ âûñòóïàåò àêòèâàòîðîì ÊÔ, ïðè÷åì ïî ñðàâíåíèþ ñ êîíòðîëåì íàèâûñøèé ïèê ïðèõîäèòñÿ íà 4-å ñóòêè ïîñëå èíúåêöèè (+366%). Ââåäåíèå êðûñàì âòîðîé ãðóïïû (9-ìåñÿ÷íûå) 20° PRP-1 íà ôîíå ÖÔÀ çíà÷èòåëüíî íîðìàëèçóåò êàðòèíó: PRP ñíèìàåò àêòèâèðóþùèé ýôôåêò ÖÔÀ, ìàêñèìàëüíî ïðèáëèæàÿ ýòó âåëè÷èíó ê êîíòðîëüíîé. Àíàëîãè÷íûå äàííûå, ïîëó÷åííûå íàìè ðàíåå ïðè ðàçäðàæåíèè ãèïîòàëàìè÷åñêèõ ÿäåð ìîçãà êðûñû, ãäå ðåãèñòðèðîâàëàñü òàêæå ðåçêàÿ àêòèâàöèÿ ÊÔ, îäíîçíà÷íî óêàçûâàþò íà ðàçðóøèòåëüíûé 2 5 5 õàðàêòåð ÖÔÀ è çàùèòíûé ýôôåêò íåéðîïåïòèäà. Ýôôåêò äåéñòâèÿ PRP1, ïî-âèäèìîìó, îáóñëîâëåí îáðàçîâàíèåì áîëüøîãî êîëè÷åñòâà àêòèâíûõ ðàäèêàëîâ, êîòîðûå ìîãóò ïðèâåñòè ê áëîêèðîâàíèþ àêòèâíîñòè íå òîëüêî ôåðìåíòà, íî è âåùåñòâ, îòâåòñòâåííûõ çà îáðàçîâàíèå ôåðìåíò-ñóáñòðàòíîãî êîìïëåêñà. Âîçìîæíî, â ìåõàíèçìå äåéñòâèÿ äàííîãî ïåïòèäà íà ôåðìåíòàòèâíóþ àêòèâíîñòü ÊÔ ñóùåñòâóþò è äðóãèå ïóòè. ìêÌ ôåíîëà ã òê. ìèí. Ðèñ. 4. Âëèÿíèå ÖÔÀ è PRP-1 íà àêòèâíîñòü ãëèêîãåíôîñôîðèëàçû êîñòíîãî ìîçãà Ãëèêîãåíôîñôîðèëàçà E = êðûñ (in vivo): 1 – êðûñû âåñîì 125 ã (äîçà ÖÔÀ 6 ìã.); 2 – êðûñû âåñîì 220 ã (äîçà ÖÔÀ 10 ìã, PRP-1 20 ìêã). Íåîðãàíè÷åñêèå ïèðîôîñôàòû, ïðîñòåéøèå íàêîïèòåëè ýíåðãèè â æèâûõ êëåòêàõ, ðàñùåïëÿþòñÿ íåîðãàíè÷åñêîé ïèðîôîñôàòàçîé. Ýòîò ôåðìåíò ó÷àñòâóåò â ðÿäå áèîõèìè÷åñêèõ ïðîöåññîâ íà ðàçíûõ ñòàäèÿõ ýâîëþöèè ôîñôîðíîãî îáìåíà. Èññëåäîâàíèÿ íåîðãàíè÷åñêîé ïèðîôîñôàòàçû (ðèñ. 3) ïîêàçàëè, ÷òî ÖÔÀ äåéñòâóåò àêòèâèðóþùå íà ôåðìåíò, ïëàâíî ïîíèæàÿ åãî àêòèâíîñòü äî 7-ãî äíÿ, è íà 11-é äåíü ðåãèñòðèðóåòñÿ ðåçêèé ñïàä ôåðìåíòàòèâíîé àêòèâíîñòè ( ¡ 30%). PRP-1, ââåäåííûé æèâîòíûì ÷åðåç ÷àñ ïîñëå ÖÔÀ, ãëîáàëüíî ìåíÿåò êàðòèíó. Àêòèâíîñòü ôåðìåíòà ñóùåñòâåííî ïîäàâëÿåòñÿ, äîõîäÿ äî íóëÿ íà 7-é äåíü, çàòåì ïåïòèä ñòèìóëèðóåò ïðîöåññ àêòèâàöèè ôåðìåíòà, äîâåäÿ åãî ïî÷òè äî íîðìû (11-é äåíü), ÷òî ïî ñðàâíåíèþ ñ ôîíîâîé ñîñòàâëÿåò 60%. Ðÿäîì èññëåäîâàòåëåé ïîêàçàíî, ÷òî ïðè âîçäåéñòâèè íà íåîðãàíè÷åñêóþ ïèðîôîñôàòàçó íåêîòîðûõ òêàíåé, â òîì ÷èñëå è ýðèòðîöèòîâ, âåùåñòâàìè, áëîêèðóþùèìè ñóëüôãèäðèëüíûå ãðóïïû, óãíåòàåòñÿ åå àêòèâíîñòü [16]. Ðîëü æå PRP-1, âåðîÿòíî, ñâîäèòñÿ ê 2 5 6 ñâÿçûâàíèþ èîíîâ äâóõâàëåíòíûõ ìåòàëëîâ, ÷òî ïðèâîäèò ê ñïàäó ôåðìåíòàòèâíîé àêòèâíîñòè íåîðãàíè÷åñêîé ïèðîôîñôàòàçû. Äåéñòâèå PRP-1 íà àêòèâíîñòü ôîñôàòàç, î÷èùåííûõ èç òêàíåé æèâîòíûõ, íà ôîíå öèêëîôîñôàìèäà (ÖÔÀ); ìêÌ ôåíîëà 1 – E = ìã áåëêà ìèí , Ôåðìåíòû Íîðìà PRP-1 ìêÌ P 2 – E = ìã áåëêà ìèí ÖÔÀ 100 ° ÖÔÀ 50 ° ÖÔÀ 20 ° 0.01° - +PRP-1 - +PRP-1 - +PRP-1 5600 3980 3897 3745 3801 3502 4580 +60% +13% +11% +7% +8% 0 +31% 2734 3042 4563 2432 3039 1 Ùåëî÷íàÿ ôîñôàòàçà 3500 (èç ñëèçèñòîé êèøîê 100% êîðîâû) 2 Ãëèêîãåíôîñôîðè- 1520 2124 4566 ëàçà (èç ìûøö êðî- 100% +80% +140% +200% +100% +200% +60% +100% ëèêà) Ãëèêîãåíôîñôîðèëàçà (ÃÔ) êàòàëèçèðóåò ïîñëåäîâàòåëüíîå îòùåïëåíèå ãëèêîçèëüíûõ îñòàòêîâ ñ íåðåäóöèðóþùåãî êîíöà à-1,4 ãëèêîçèëüíîé öåïè ãëèêîãåíà ñ âûñâîáîæäåíèåì ãëþêîçû-1-Ð. Ôåðìåíò ñóùåñòâóåò â àêòèâíîé (à) è íåàêòèâíîé (á) ôîðìàõ. Ãîðìîíàëüíàÿ ðåãóëÿöèÿ ÃÔ îñóùåñòâëÿåòñÿ íå ïðÿìî, à ÷åðåç êàñêàäíóþ ñèñòåìó óñèëåíèÿ ñèãíàëîâ, âêëþ÷àþùèõ ñîîòâåòñòâóþùèå ïðîòåèíêèíàçû è ôîñôàòàçû [17]. Ïîñëåäíèå ÿâëÿþòñÿ êëþ÷åâûìè ôåðìåíòàìè êëåòî÷íîãî ìåòàáîëèçìà, ôîñôîðèëèðîâàíèå-äåôîñôîðèëèðîâàíèå êîòîðûõ ïðèâîäèò ê îïåðàòèâíîé ìîäèôèêàöèè èõ ôóíêöèé è ïîñëåäóþùèì ôèçèîëîãè÷åñêèì îòâåòaì. Êðèâàÿ, ïðåäñòàâëåííàÿ íà ðèñ.4, ñâèäåòåëüñòâóåò î òîì, ÷òî ÖÔÀ â îïûòàõ in vivo äëÿ ÃÔ êîñòíîãî ìîçãà âûñòóïàåò èíãèáèòîðîì; ðàçâèâàþùååñÿ ïîðàæåíèå îðãàíèçìà ïðèâîäèò ê çíà÷èòåëüíîìó ñïàäó ôåðìåíòàòèâíîé àêòèâíîñòè â áîëåå ïîçäíèå ñðîêè (ê 11-ìó äíþ), ãäå ÃÔ ïîêàçûâàåò íóëåâóþ âåëè÷èíó. Äðóãàÿ ãðóïïà æèâîòíûõ, êîòîðîé âìåñòå ñ ÖÔÀ ââåäåí PRP-1, ðåàãèðóåò îäíîòèïíî ñ ãðóïïîé, ïîëó÷èâøåé ÖÔÀ. PRP-1 íå òîëüêî ñíèìàåò èíãèáèðóþùèé ýôôåêò ÖÔÀ, íî è äîâîäèò àêòèâíîñòü ýíçèìà äî íóëÿ íà 4-å è 7-å ñóòêè.  èòîãå ïîä äåéñòâèåì îáîèõ âåùåñòâ â àêòèâíîñòè ÃÔ íàáëþäàåòñÿ ñäâèã ìåòàáîëè÷åñêèõ ïðîöåññîâ îò àíàáîëèçìà ê êàòàáîëèçìó. Äëÿ âûÿâëåíèÿ õàðàêòåðà äåéñòâèÿ PRP-1 íà ÃÔ áûëà ïîñòàâëåíà ñåðèÿ îïûòîâ íà î÷èùåííîì ôåðìåíòå.  ëèòåðàòóðå ñóùåñòâóþò ðàçíîãëàñèÿ îòíîñèòåëüíî ìåõàíèçìà ðåãóëÿöèè 2 5 7 ÷èñòûõ ôåðìåíòîâ, ôåðìåíòîâ â ãîìîãåíàòå è ôåðìåíòîâ îðãàíèçìà. Ïðè ãîìîãåíèçèðîâàíèè òêàíåé ïðîèñõîäèò ðÿä èçìåíåíèé â ñòðóêòóðå êëåòîê, ïðè ýòîì íàðóøàåòñÿ èõ öåëîñòíîñòü, ÷òî ìîæåò ðåçêî ïîâëèÿòü íà ïîëó÷åííûå äàííûå è âûçâàòü ðÿä èçìåíåíèé ñ ôåðìåíòîì. Òàáëèöà äåìîíñòðèðóåò ìàêñèìàëüíóþ àêòèâàöèþ ÃÔà ïîñëå äîáàâëåíèÿ â èíêóáàöèîííóþ ñðåäó îïðåäåëåííûõ äîç ÖÔÀ è PRP-1. Êàæóùèéñÿ ïàðàäîêñàëüíûì ôàêò ìîùíîãî àêòèâèðîâàíèÿ ÃÔà íà ÷èñòîì ôåðìåíòå ïîä äåéñòâèåì ýòèõ æå ðåàãåíòîâ ìîæíî îáúÿñíèòü ñëåäóþùèì îáðàçîì. Åñëè ôåðìåíò íàõîäèòñÿ â ñèñòåìå, òî àêòèâèðóþùèå è èíãèáèðóþùèå ðåàãåíòû íå ïðîÿâëÿþò ñâîåãî äåéñòâèÿ ïîëíîñòüþ, ïîñêîëüêó ôåðìåíò çàùèùåí âíóòðåííèìè ðåãóëÿòîðàìè, ïðåäîõðàíÿÿ åãî îò âíåøíèõ âîçäåéñòâèé. Íà î÷èùåííûé ôåðìåíò àêòèâàòîðû è èíãèáèòîðû îêàçûâàþò ïîëíîå äåéñòâèå â ðåçóëüòàòå îñâîáîæäåíèÿ îò âíóòðåííèõ ðåãóëÿòîðîâ. Òêàíåâàÿ ÃÔ êîíòðîëèðóåòñÿ ñîîòâåòñòâóþùèìè ïðîòåèíêèíàçàìè è ïðîòåèíôîñôàòàçàìè, êîòîðûå â ñâîþ î÷åðåäü ðåãóëèðóþòñÿ íèçêîìîëåêóëÿðíûìè ëèãàíäàìè, ðåãóëÿòîðíûìè áåëêàìè è íåéðîãóìîðàëüíûìè ôàêòîðàìè. Ïîýòîìó ìíîãèå íàðóøåíèÿ ïðîöåññà ôåðìåíòàòèâíîé äåãðàäàöèè è ñèíòåçà ãëèêîãåíà ìîãóò áûòü îáóñëîâëåíû íå òîëüêî íàðóøåíèÿìè áèîñèíòåçà ÃÔ è ãëèêîãåíñèíòàçû, íî è ðÿäà áåëêîâ, ó÷àñòâóþùèõ â èõ ðåãóëÿöèè. Ïîëó÷åííûå íàìè ñâåäåíèÿ îá èçìåíåíèè àêòèâíîñòè ôîñôàòàç ïðè ïàòîëîãè÷åñêèõ ñîñòîÿíèÿõ îðãàíèçìà è ðåãóëèðóþùåì ýôôåêòå PRP-1 â ïðîöåññàõ äåôîñôîðèëèðîâàíèÿ ïðåäñòàâëÿþò èíòåðåñ, ñ ó÷åòîì âàæíîãî çíà÷åíèÿ ýòèõ ôåðìåíòîâ â êëèíè÷åñêîé áèîõèìèè. Èíñòèòóò áèîõèìèè èì. Ã.Õ.Áóíÿòÿíà ÍÀÍ ÐÀ Ë. Ï. Òåð-Òàòåâîñÿí, Ë. Â. Ñàðêèñÿí, È. Ã. Àñëàíÿí, àêàäåìèê À. À. Ãàëîÿí Âîçäåéñòâèå PRP-1 íà àêòèâíîñòü íåêîòîðûõ ôîñôàòàç êîñòíîãî ìîçãà áåëûõ êðûñ, ïîðàæåííûõ öèêëîôîñôàìèäîì Èçó÷àëîñü âëèÿíèå ïðîëèí-áîãàòîãî íåéðîïåïòèäà PRP-1 íà àêòèâíîñòü ùåëî÷íîé è êèñëîé ôîñôàòàç (ÙÔ è ÊÔ), ïèðîôîñôàòàçû (ÏÔ), à òàêæå ãëèêîãåíôîñôîðèëàçû (ÃÔ) â ãîìîãåíàòàõ êîñòíîãî ìîçãà êðûñ, ïîðàæåííûõ öèêëîôîñôàìèäîì (ÖÔÀ) â óñëîâèÿõ in vivo è in vitro. Äàííûå, ïîëó÷åííûå â ýêñïåðèìåíòàõ, ïîêàçàëè íåîäíîçíà÷íîå äåéñòâèå PRP-1 íà àêòèâíîñòü èññëåäóåìûõ ôåðìåíòîâ êàê â íîðìå, òàê è ó êðûñ, èíúåöèðîâàííûõ ÖÔÀ â ïðîöåññå äèíàìèêè (1, 4, 7, 11 äíè).  äîçå 20° (íà æèâîòíîå) ïåïòèä ïîäàâëÿåò àêòèâíîñòü ÙÔ, ÏÔ è ÃÔ ó êðûñ ñ ÖÔÀ.  òî æå 2 5 8 âðåìÿ àêòèâíîñòü ÊÔ, ïîâûøåííàÿ â òðè ðàçà ïîñëå ââåäåíèÿ ÖÔÀ, ïîä äåéñòâèåì ïåïòèäà PRP-1 íîðìàëèçóåòñÿ, äîõîäÿ äî êîíòðîëüíîé âåëè÷èíû. Äëÿ î÷èùåííûõ ôåðìåíòîâ (ÙÔ, ÊÔ è ÃÔ) ýòè îáà ðåàãåíòà âî âñåõ èñïîëüçóåìûõ äîçàõ âûñòóïàþò àêòèâàòîðàìè. Äàííûå, ïîëó÷åííûå íà ÷èñòûõ ôåðìåíòàõ, íå ïîâòîðèëèñü â îïûòàõ in vitro íà ãîìîãåíàòàõ òêàíè êîñòíîãî ìîçãà, ãäå âñå ÷åòûðå ôåðìåíòà ïðîÿâèëè ïîëíóþ ðåçèñòåíòíîñòü ê ÖÔÀ è PRP-1. Ðåçóëüòàòû îïûòîâ ãîâîðÿò î òîì, ÷òî ïåïòèä PRP-1 îáëàäàåò ðåãóëèðóþùèì äåéñòâèåì äëÿ ôåðìåíòîâ – ôîñôàòàç êîñòíîãî ìîçãà êàê ó íîðìàëüíûõ, òàê è ó êðûñ ñ ïàòîëîãèåé. È. ä. î»ñ-³¹¨áëÛ³Ý, È. ì. ê³ñ·ëÛ³Ý, Æ. ¶. ²ëɳÝÛ³Ý, ³Ï³¹»ÙÇÏáë ². ². ¶³ÉáÛ³Ý PRP-1-Ç ³½¹»óáõÃÛáõÝÁ óÇÏÉáýáëý³Ùǹáí íݳëí³Í ëåÇï³Ï ³éÝ»ïÝ»ñÇ áëÏñ³ÍáõÍÇ áñáß ýáëý³ï³½Ý»ñÇ ³ÏïÇíáõÃÛ³Ý íñ³ àõëáõÙݳëÇñí»É ¿ åñáÉÇÝáí ѳñáõëï Ý»Ûñáå»åïǹ PRP-1-Ç ³½¹»óáõÃÛáõÝÁ ÑÇÙݳÛÇÝ »õ ÃÃáõ ýáëý³ï³½Ý»ñÇ (Ðü »õ Âü), ³Ýûñ·³Ý³Ï³Ý åÇñáýáëý³ï³½Ç, ÇÝãå»ë ݳ»õ ·ÉÇÏá·»Ý ýáëýáñÇɳ½Ç ³ÏïÇíáõÃÛ³Ý íñ³‘ óÇÏÉáýáëý³Ùǹáí (òü) íݳëí³Í ³éÝ»ïÝ»ñÇ áëÏñ³ÍáõÍÇ ÑáÙ᷻ݳïáõÙ in vivo »õ in vitro å³ÛÙ³ÝÝ»ñáõÙ: òáõÛó ¿ ïñí»É, áñ PRP-1-Á áõÝÇ áã ÙdzÝÙ³Ý ³½¹»óáõÃÛáõÝ áõëáõÙݳëÇñíáÕ ý»ñÙ»ÝïÝ»ñÇ ³ÏïÇíáõÃÛ³Ý íñ³. ³Û¹ å»åïǹÁ ×ÝßáõÙ ¿ ·ÉÇÏá·»Ý ýáëýáñÇɳ½Ç »õ ³Ýûñ·³Ý³Ï³Ý åÇñáýáëý³ï³½Ç ³ÏïÇíáõÃÛáõÝÁ òü Ý»ñ³ñÏí³Í ³éÝ»ïÝ»ñÇ Ùáï: ÜϳïíáõÙ ¿ ݳ»õ Ðü-Ç ³ÏïÇíáõÃÛ³Ý ³ñ·»É³ÏáõÙ òü-áí, ë³Ï³ÛÝ PRP-1Ç (in vivo) Ý»ñ³ñÏáõÙÇó Ñ»ïá 7- »õ 11-ñ¹ ûñ»ñáõÙ ï»ÕÇ ¿ áõÝ»Ýáõ٠黳ÏódzÛÇ ëïÇÙáõɳóáõ٠ѳٳå³ï³ë˳ݳµ³ñ 29 »õ 72%-áí: Ü»Ûñáå»åïÇ¹Ç ³Ù»Ý³Ù»Í ³½¹»óáõÃÛáõÝÁ ÝϳïíáõÙ ¿ Âü-Ç íñ³, áñï»Õ òü-Ý ý»ñÙ»ÝïÇ ³ÏïÇíáõÃÛáõÝÁ ÏïñáõÏ µ³ñÓñ³óÝáõÙ ¿ 4-ñ¹ ûñÁ (+336%), ÇëÏ PRP-1-Á ѳݹ»ë ¿ ·³ÉÇë áñå»ë Âü-Ç ³ÏïÇíáõÃÛ³Ý Ï³ñ·³íáñÇã‘ Ýí³½»óÝ»Éáí ³ÛÝ ÙÇÝã»õ ÝáñÙ³: سùñí³Í ý»ñÙ»ÝïÇ íñ³ ³Û¹ »ñÏáõ 黳·»ÝïÝ»ñÇ ³½¹»óáõÃÛ³Ý Å³Ù³Ý³Ï (Ðü »õ Âü) ·ñ³ÝóíáõÙ ¿ Ðü-Ç ã³÷³íáñ ³ÏïÇíáõÃÛáõÝ òü-Ç »õ PRP-1-Ç û·ï³·áñÍí³Í µáÉáñ ¹»åù»ñáõÙ »õ, ϳñáÕ ¿ å³ñ³¹áùë³ÛÇÝ Ãí³É, ï»ÕÇ ¿ áõÝ»ÝáõÙ ·ÉÇÏá·»ÝýáëýáñÇɳ½³ - aÇ Ù³ùëÇÙ³É ³ÏïÇí³óáõÙ: سùáõñ ý»ñÙ»Ýïáí ϳï³ñí³Í ÷áñÓ»ñÇ ³ñ¹ÛáõÝùáõÙ ëï³óí³Í ïíÛ³ÉÝ»ñÁ ãÏñÏÝí»óÇÝ in vitro ÷áñÓ»ñáõÙ, áñï»Õ ý»ñÙ»ÝïÝ»ñÁ ïíÛ³É ¿ý»ÏïáñÝ»ñÇ Ýϳïٳٵ ¹ñë»õáñ»óÇÝ é»½Çëï»ÝïáõÃÛáõÝ: öáñÓ»ñÇ ³ñ¹ÛáõÝùÝ»ñÁ íϳÛáõÙ »Ý ³ÛÝ Ù³ëÇÝ, áñ PRP-1 å»åïǹÁ áõÝÇ Ï³ñ·³íáñÇã ³½¹»óáõÃÛáõÝ ³éáÕç »õ å³ÃáÉá·Ç³Ûáí ³éÝ»ïÝ»ñÇ áëÏñ³ÍáõÍÇ ýáëý³ï³½Ý»ñÇ íñ³: 2 5 9 L. P. Ter-Tadevosyan, L. V. Sarkissyan, I. A. Aslanyan, academician A. A. Galoyan Action of PRP-1 on the Activity of Some Phosphatases in Bone Marrow of White Rats Injured by Cyclophosphamide Study of the action of proline-rich peptide PRP-1 on the activity of alkaline and acid phosphatases, inorganic pyrophosphatase, as well as the glycogenphosphorilase in bone marrow homogenates of injured with cyclophosphamide (CPA) rats in vivo and in vitro, demonstrated the significant influence of PRP-1 on the activity of enzymes investigated. It was shown that PRP-1 exerts the different influence on the activity of the enzymes mentioned. Thus, the peptide inhibits the activity of glicogenphosphorilase and inorganic pyrophosphatase in bone marrow of injured with CPA rats. Inhibition by CPA is also observed regarding the alkaline phosphatase, however, the dramatic changes in the inhibition of this enzyme activity occur in vivo in 7 and 11 days after the i/m administration of PRP-1. The most effect of peptide influence is observed regarding the acid phosphatase activity when PRP-1 reduces the strongly activated by CPA enzyme activity (per 366 At the action of CPA and PRP-1 on the purified enzymes being under the investigation the moderate activation of alkaline phosphatase, and, paradoxically, of glycogenphosphorilase a, is registered with all doses of these two agents used. The present results testify that under the normal and pathological conditions, PRP-1 possesses the regulatory properties on (for) the activity of the phosphatases studied in rat bone marrow. Ëèòåðàòóðà 1. Galoyan A. Neurosecretory hypothalamus - bone marrow neurohumoral axic: chemistry and biology of the mediators. 2-ISSMPS. 2006. Armenia-Germuk. 4-5. 2. Galoyan A.A., Grigoryan S.L., Badalyan K.V. - Neurochemical Research. 2006. V. 31. N 6. P. 795-803. 3. Galoyan A.A. Signal molecules of the brain neuroendocrine immune system against infection and tumor cells. Proceedings of the Int. conf. Advanced Biotechnology. Perspectives of Development in Armenia. Yerevan. 2006. 18 p. 4. Òåð-Òàòåâîñÿí Ë.Ï., Ñàðêèñÿí Ñ.Â., Àñëàíÿí È.Ã., Ãàëîÿí À.À. - Äîêëàäû ÍÀÍ Àðìåíèè. 2004. Ò. 104. N 4. Ñ. 343-347. 5. Òåð-Òàòåâîñÿí Ë.Ï., Ñàðêèñÿí Ë.Â., Àñëàíÿí È.Ã., Ãàëîÿí À.À. - Äîêëàäû ÍÀÍ Àðìåíèè. 2006. Ò.106. N 4. Ñ.349-354. 6. Tarie M., Kovacic K., Strelkov-Alfirevic A. - Prostate. 1989. V. 15. N 3. P. 211219. 7. Tokiva Takayoshi, Endo Akiro, Sato Jiron. - Experim. cell. Biol. 1989. V. 57. N 6. P. 324-329. 2 6 0 8. Davie M.W.I., Worsfold M., Shorp C.A. - Ann. Cein. Biochem. 1991. V. 28. N 2. P. 194-195. 9. Tsavaris N., Pangalis Gerassimos A., Kosmidis P., Konstantopoulos K., Variami E., Ganotakies M., Tsoutsos E., Dimitriadis G., Raptis S. - Acta histochem. at cytochem. 1991. V. 24. N 3. P. 329-334. 10. Øëûãèí Ã.Ê., Ìèõëèí Ñ.ß. - Âîïðîñû ìåä. õèìèè. 1955. N 1. Ñ. 461-465. 11. Heppel L.A. - Methoda in Enzynology. 421. N.-Y. 1955. V. 2. P. 570-574. 12. Illingwort B.I., Cori C.T. - Biochem., Preparations. 1953. V. 3. P.1-9. 13. Petit C.C., Deliste M., Martel M., Fectean C., Brier N., Can. J. - Biochem. 1975. V. 53. N 10. P. 1089-1100. 14. Anderson David J., Branum Fare L., O‘Brjen John F. - Clin. Chem. 1990. V. 36. N 2. P. 240-248. 15. Hammond K.D., Mohmed E., Gregor R.T. - Biochem. Med. and Metab. Biol. 1990. V. 43. N 1. P. 75. 16. Naganna B., Narayana K., Menon V.K. - J. Biol. Chem. 1948. V. 174. N 2. P. 501. 17. Sim A., Collins E., Mudge L.M. - J. Neurochemistry. 1997. V. 69. P. 163. 2 6 1
