УРОВНИ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ

УРОВНИ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ
БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ
Последовательность чередования аминокислотных остатков в полипептидной цепи
называется ПЕРВИЧНОЙ структурой белка (или первым уровнем структурной
организации белковой молекулы).
Закручивание полипептидной цепи белка в спиралеобразную структуру происходит
вследствие
взаимодействия
посредством
образования
водородных
связей
между
кислородом карбонильной группы i-того аминокислотного остатка и водородом
амидогруппы i+4 аминокислотного остатка. Наряду с альфа-спиралями в образовании
вторичной структуры белка принимают также участие b- структуры параллельная и
антипараллельная, b- изгиб.
Параллельные
и
антипараллельные
бетта-структуры
образуются
за
счет
водородных связей между двумя протяженными участками ОДНОЙ И ТОЙ ЖЕ
полипептидной нити. Если направление взаимодействующих участков совпадает, говорят
о параллельной бетта-структуре и наоборот. На рисунках принято участки альфаспирализованной полипептидной нити обозначать в виде цилиндров (на наших рисунках
они изображены в виде спиралей), а участки бетта-структур- в виде стрелок.
При упаковке вторичной структуры белка в пространстве образуется третичная
структура белка, состоящая из всех компонентов вторичной структуры. При образовании
третичной структуры белка участвуют гидрофобные (I), ионные (электростатические) (II),
водородные (III) ковалентные (IV) взаимодействия между группировками в боковых
радикалах аминокислотных остатков полипептидной цепи.
С появлением третичной структуры, у белка появляются и новые свойствабиологические. В частности, проявление каталитических свойств связанно именно с
наличием у белка третичной структуры. И наоборот, нагревание белков, приводящее к
разрушению третичной структуры (иначе известно как денатурация) одновременно
приводит и к утрате биологических свойств.
Четвертичная структура белка подразумевает такое объединение белков третичной
структуры, при котором появляются НОВЫЕ биологические свойства, не характерные для
белка в третичной структуре. В частности, такие эффекты, как КООПЕРАТИВНЫЙ и
АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЙ, очень часто характерны лишь для белков четвертичной
структуры. Каждый из белков-участников третичной структуры при образовании
четвертичной
структуры
называют
СУБЪЕДИНИЦЕЙ
или
ПРОТОМЕРОМ.
В
образовании четвертичной структуры белка принимают участие те же связи, что и при
образовании третичной структуры, за исключением ковалентных.
Объединение белковых молекул третичной структуры без появления НОВЫХ
биологических свойств называют АГРЕГИРОВАННЫМ состоянием. Как четвертичная
структура, так и агрегированное состояние могут быть обратимо разрушены с
применением детергентов, в частности, ДОДЕЦИЛСУЛЬФОНАТА НАТРИЯ или
неионных детергентов типа ТРИТОНА. Очень часто для разрушения четвертичной
структуры исследуемый белок нагревают при 100 С в присутствии 1% 2-меркаптоэтанола
и 2% додецилсульфоната натрия (SDS). В таких условиях восстанавливаются
дисульфидные связи между остатками цистеина, которые в некоторых случаях
удерживают субъединицы четвертичной структуры.
Биологический смысл появления четвертичной структуры у белков- экономия
“генетического материала”, поскольку каждая из субъединиц кодируется только одим
геномом ДНК. К тому же, в случае появления ошибки при трансляции у одной из
субъединиц, отпадает необходимость РЕСИНТЕЗА остальных субъединиц. Четвертичная
структура в таком случае распадается на субъединицы, дефектная субъединица удаляется
и вновь образуется четвертичная структура с участием нормальной субъединицы. В конце
концов, появление ошибки менее вероятно при синтезе (трансляции) сравнительно
небольшой полипептидной цепи.
Практически все белки-ферменты имеют четвертичную структуру и состоят, как
правило, из четного числа протомеров (двух, четырех, шести, восьми).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКА
Определение первичной структуры белка требут предварительного проведения
ряда операций. Белок должен быть тщательно очищен, чистота материала должна быть
подтверждена как минимум двумя независимыми методами. Чаще всего использется гельэлектрофорез на полиакриламиде (ПААГ) и ультрацентрифугирование. После очистки
белка его делят на две-три или более частей. Каждую часть обрабатывают разными
ферментами-
протеиназами
(трипсин,
химотрипсин)
или
реагентами
(бромциан,
иодозобензойная кислота). В результате получают два-три (или более) наборов
полипептидов (отрезков белка). К ферментам-протеиназам предъявляются особые
требования
по
чистоте,
иначе
будет
затруднено
последующее
определение
последовательности чередования отрезков пептидов в нативной цепи белка. Особые
сложности представляет распознавание мест дисульфидных мостиков между остатками
цистеина. Полученная смесь пептидов разделяется электрофорезом, после чего возможно
начать непосредственно процедуру севенирования. Длина отдельного пептида не должна
превышать 40 АК-остатков.
Наиболее часто используемым методом секвенирования пептидов (установления
последовательности АК-остатков в них) является процедура П. Эдмана , с использованием
фенилизотиоцианата (ФИТЦ). Процедура лежит в основе работы автоматических
секвенаторов. Образец очищенного пептида наносится на поверхность реакционного
сосуда в виде пленки. Часто осуществляют ковалентное пришивание пептида с конца
свободной СООН-группы с материалом поверхности реакционного сосуда. После чего
проводят повторяющиеся циклы из серии реакций. Одна серия реакций включает:
- взаимодействие ФИТЦ с концевым АК-остатком, имеющим свободную NH2группу, при этом образуется так называемое ФТК-(фенилтиокарбамоил)-производное;
- избыток ФИТЦ удаляется, меняется рН среды добавлением гептафтормасляной
кислоты, при этом происходит превращение ФТК в ФТГ (фенилтиогидантоин)производное;
- ФТГ-производное аминокислоты удаляется из реакционной среды экстракцией с
1-хлорбутаном и серия реакций повторяется в следующем цикле.
За один цикл удаляется один аминокислотный остаток с NH2-края пептида. Поскольку,
реакции с ФИТЦ протекают не количественно, а в лучшем случае, на 95 процентов,
постепенно
накапливаются
мешающие
факторы-
ФТГ-производные
от
не
прореагировавших в предыдущие циклы АК-остатков. В самых благоприятных случаях
удается надежно идентифицировать последовательность всего только около 40 АК-
остатков. Однако, благодаря автоматизации процесса, работа все же существенно
облегчается.
РАСШИФРОВКА ПРИ ПОМОЩИ ПЕПТИДАЗ:
а) с N-концевых остатков при помощи АМИНОПЕПТИДАЗ (хроматографическая
идентификация и кинетика накопления соответствующих АК.
б) с С-концов при помощи карбоксипептидаз (аналогично).
ГИДРАЗИНОЛИЗ (в безводной среде при 100 град С) за исключением последнего
остатка со свободной СООН, все превращаются в гидразиды кислот:
Порядок чередования пептидов в молекулах белков определяется по перекрыванию
фрагментов пептидов:
G-W-V-R A-O-V-K C-E-C-D триптические пептиды (трипсин)
G-W V-R-A-O V-K-C-E-C-D химотриптические пептиды (химотрипсин)
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА:
1. Строев Е.А. Биологическая химия. М., 1986.
2. Страйер Л. Биохимия, в 3-х т. М., Мир, 1984.
3. Уайт, Хендлер, Смит и др. Основы биохимии, в 3-х т. М., Мир, 1981.
4. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия, М., Просвещение, 1987.
5. Анисимов и др. Основы биохимии. М., Высшая школа, 1986.