Автореферат Авилова Е. А. - Российский онкологический
реклама
На правах рукописи Авилова Екатерина Анатольевна Роль протеинкиназы PAK1 в регуляции роста эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы Специальность 14.01.12 – онкология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2015 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» (директор – д.м.н., проф., академик РАН М.И. Давыдов). Научный руководитель: Красильников Михаил Александрович, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярной эндокринологии научно-исследовательского института канцерогенеза, заместитель директора по научной работе – директор научноисследовательского института канцерогенеза федерального государственного бюджетного научного учреждения «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина». Официальные оппоненты: Сергеева Наталья Сергеевна, доктор биологических наук, профессор, руководитель отделения "Прогноза эффективности консервативного лечения" Московского научноисследовательского онкологического института имени П.А. Герцена – филиала федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации; Боженко Владимир Константинович, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный врач России, заведующий отделом патоморфологии и лабораторной диагностики федерального государственного бюджетного учреждения «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научноисследовательский институт онкологии им. Н.Н. Петрова" Министерства здравоохранения Российской Федерации. Защита диссертации состоится «__» ____________2015 года в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.017.02 Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24. С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» (115478, Москва, Каширское шоссе, 23) и на сайте www.ronc.ru Автореферат разослан «__» ________________________2015 года. Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.017.02, доктор медицинских наук, профессор Барсуков Юрий Андреевич 2 Общая характеристика работы Актуальность проблемы На сегодняшний день содержание рецепторов эстрогенов (ER) относится к основным критериям определения чувствительности больных раком молочной железы (РМЖ) к гормональным противоопухолевым препаратам [М.А. Красильников, 2004, N. Normanno et al., 2005, R. Clarke et al., 2003, V.C. Jordan, 2003, Е.С. Герштейн и др., 2005, B.E. Henderson et al., 2003]. Основной причиной снижения эффективности гормональной терапии РМЖ является переход опухолевых клеток от эстрогензависимого к эстрогеннезависимому росту, что может быть обусловлено как уменьшением содержания рецептора эстрогена, так и рядом других факторов, таких как нарушение баланса между белками-активаторами и супрессорами ER, лиганд-независимая активация ER, а также стимуляция митогенных сигнальных путей, идущих в обход ER и поддерживающих тем самым рост РМЖ в отсутствие эстрогенов. Среди последних ведущее значение принадлежит рецепторным тирозинкиназам. До сих пор остается неясным, какие из эффекторов тирозинкиназ являются ключевыми для поддержания эстрогеннезависимого роста и могут ли они играть самостоятельную роль в развитии гормональной резистентности РМЖ. Одним из важнейших эффекторов тирозинкиназных рецепторов является РАК (р21активированная киназа) 1 – серин-треониновая протеинкиназа, которая путем фософорилирования различных сигнальных белков участвует в регуляции ключевых функций клетки: роста, выживаемости, организации цитоскелета, клеточной подвижности [Z.S. Zhao, 2012]. Помимо этого, РАК1 фосфорилирует рецептор эстрогенов, причем независимо от лиганда, приводя тем самым к снижению гормональной зависимости ERположительных клеток РМЖ [A. Ghosh et al., 2013, M. Kok et al., 2011, J. Bostner et al., 2010]. Об участии PAK в регуляции роста ER-негативного РМЖ известно значительно меньше, хотя о возможном включении PAK в эстрогеннезависимые сигнальные пути косвенно свидельствует описываемая в литературе повышенная экспрессия PAK1 в ERнегативных опухолях молочной железы. Основной темой диссертации явилось исследование внутриклеточных сигнальных путей, ответственных за развитие гормональной резистентности злокачественных опухолей, в частности – изучение роли PAK-сигнального пути в регуляции и поддержании эстрогензависимого и эстрогеннезависимого роста опухолей молочной железы. Среди главных задач работы: исследование значения PAK для активации эстрогеннезависимых митогенных путей; изучение влияния гиперэкспресссии PAK на развитие гормональной 3 резистетности и анализ возможного механизма подавления PAK в эстрогеннезависимых опухолях. Цель исследования Целью данной работы явилось изучение молекулярного механизма действия протеинкиназы PAK1 и ее роли в регуляции роста эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы. Задачи исследования 1. Сравнительный анализ экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы; изучение зависимости экспрессии PAK-1 от стадии роста клеточной культуры; 2. Изучение роли РАК1 в регуляции роста клеток эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы: влияние РАК1 на рост клеток и активность митогенных сигнальных путей: АР-1, бета-катенина и Snail1; роль α-Pix, ко-активатора РАК1, в регуляции активности клеточных сигнальных белков; влияние РАК1 на активность рецептора эстрогенов в клетках эстрогензависимого рака молочной железы MCF-7; 3. РАК1 и выживаемость клеток: изучение роли РАК1 в регуляции роста клеток в условиях гипоксии; 4. Анализ метилирования РАК1 и его роли в регуляции дифференциальной экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы. Научная новизна В настоящей работе был проведен сравнительный анализ изменений экспрессии РАК1 в эстрогензависимых и эстрогеннезависимых опухолях; выявлены возможные эпигенетические причины сниженной экспрессии РАК1 в ER-позитивных клетках рака молочной железы; исследован механизм поддержания эстрогеннезависимого роста ERнегативных клеток, в том числе с участием ключевых транскрипционных факторов AP-1, бета-катенина/TCF и Snail1; установлена роль Pix в регуляции эффектов РАК1; впервые продемонстрировано участие РАК1 в поддержании роста клеток РМЖ в условиях гипоксии. Полученные данные свидетельствуют, что РАК1 является важным фактором, участвующим в поддержании эстрогеннезависимого 4 роста РМЖ, и позволяют рассматривать РАК1 в качестве перспективного объекта таргетной терапии рака молочной железы. Практическая значимость работы Были получены новые данные о роли РАК-сигнального пути в развитии и поддержании гормональной резистентности клеток рака молочной железы, что позволяет установить роль РАК1 и его эффекторов в регуляции эстрогеннезависимого роста клеток РМЖ, а также оценить перспективность таргетной терапии РМЖ, направленной на подавление РАК. Апробация работы Диссертация апробирована и рекомендована к защите 30 марта 2015 года на объединенной научной конференции лабораторий молекулярной эндокринологии, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, механизмов гибели опухолевых клеток, молекулярной биологии вирусов, биохимии опухолей, цитогенетики и отдела химического канцерогенеза НИИ Канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина». Структура и объём диссертации Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 38 рисунков. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Список литературы содержит 286 источников. Публикации По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям учёной степени кандидата биологических наук. Личный вклад автора Автором самостоятельно проведен анализ отечественной и иностранной литературы по изучаемой теме, разработаны протоколы и проведены эксперименты, осуществлены анализ и интерпретация результатов исследования, статистическая обработка полученных данных, формулирование выводов и оформление диссертационной работы. Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.12. – «онкология», конкретно пунктам 2,3. 5 Основное содержание работы Обзор литературы Первый раздел обзора литературы включает в себя современные данные о механизмах действия стероидных гормонов. Вторая часть описывает возможные пути развития гормональной резистентности РМЖ: потеря рецептора эстрогена, лиганднезависимая активация рецептора эстрогена, активация митогенных сигнальных путей, поддерживающих рост РМЖ в отсутствие эстрогенов. обзора отражает использующиеся в настоящее Третий раздел литературного время подходы в терапии эстрогензависимых и эстрогеннезависимых РМЖ. Заключительные части посвящены современным представлениям о протеинкиназах семейства PAK: структуре, механизму регуляции, выше- и нижележащим эффекторам PAK1, особенностям экспрессии PAK1 в опухолях РМЖ, а также ее роли в регуляции гормональной чувствительности РМЖ. Обзор дает представление о состоянии исследования затронутой проблемы, ее актуальности и практической значимости. Материалы и методы В работе использовались клеточные линии рака молочной железы человека: ERпозитивная эстрогензависимая линия MCF-7 и ER-негативные эстрогеннезависимые линии: MDA-MB-231, HBL-100, SKBR-3, а также устойчивая к гипоксии сублиния MCF7/H, полученная в результате длительного культивирования клеток MCF-7 в условиях низкого содержания кислорода. Методы исследования: транзиторная трансфекция экспрессионных и репортерных плазмидных конструкций, а также коротких интерферирующих РНК; определение транскрипционной активности методом репортерного анализа; определение скорости роста клеток МТТ-тестом; SDS-электрофорез белков в полиакриламидном геле с последущим определением уровня экспрессии белков методом иммуноблоттинга, определение метилирования гена в культуре клеток с помощью метилчувствительной ПЦР и бисульфитного секвенирования, статистическая обработка полученных данных. 6 Результаты исследования и обсуждение 1. Сравнительный анализ экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы 1.1. Определение содержания РАК1 и ER методом иммуноблотинга Целью первой части работы явилось исследование экспрессии PAK1 в различных линиях рака молочной железы, выявление возможной корреляции с ER-положительным или ER-отрицательным статусом и гормональной зависимостью РМЖ. Эксперименты проводились in vitro на клетках эстрогензависимого ER-позитивного рака молочной железы человека (линия MCF-7) и эстрогеннезависимого ER-негативного рака молочной железы (линии HBL-100, MDA-MB-231, SKBR-3), культивируемых в стандартных условиях, описанных выше. Анализ содержания РАК1 и ER проводился методом иммуноблотинга с использованием моноклональных антител к PAK1 и α-тубулину (рис. 1). Рисунок 1. Экспрессия PAK1 в клетках MCF-7, HBL-100, MDA-MB-231, SKBR-3. Результаты иммуноблоттинга и денситометрии, выполненной в программе ImageJ; за 1 принимали значение показателя в линии MCF-7. Определение уровня РAK1 выявило его высокое содержание в эстрогеннезависимых ER-негативных клеточных линиях РМЖ (HBL-100, MDA-MB-231, SKBR-3) по сравнению с клетками эстрогензависимой ER-позитивной линии MCF-7. Полученные результаты согласуются с данными других исследователей, демонстрировавших повышенный уровень PAK1 в ER-отрицательных клетках РМЖ, в то время как в ER-положительных он практически отсутствовал [C. Holm et al., 2006], а также с результатами исследования клинических образцов, показавших гиперэкспрессию PAK1 более чем в 50% случаев РМЖ [S. Balasenthil et al., 2004]. 1.2. Изучение зависимости экспрессии PAK1 от плотности клеточной культуры Для определения зависимости экспрессии PAK1 от стадии роста клеточной культуры клетки MCF-7, HBL-100 и MDA-MB-231 рассеивали в 3-х исходных вариантах 7 таким образом, что к моменту снятия плотность клеток составляла 60, 80 и 100 % от максимального монослоя. Иммуноблотинг образцов проводили с антителами к PAK1 и αтубулину (рис. 2). Рисунок 2. Влияние плотности клеточной культуры на уровень РАК1 в клетках MCF-7, HBL-100, MDA-MB-231. Результаты иммуноблоттинга. Как видно из полученных данных, экспрессия PAK1 практически не изменялась в зависимости от плотности клеточной культуры и, следовательно, различия в экспрессии РАК1 между отдельными линиями сохранялись на любой стадии роста клеток (рис.2). Для большинства последующих экспериментов были выбраны две линии клеток, максимально различающиеся по степени экспрессии PAK1: с низким уровнем PAK1 (ERпозитивная линия клеток MCF-7) и с максимально высоким уровнем PAK1 (ERнегативная линия клеток HBL-100). 2. Роль РАК1 в регуляции роста клеток эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы Для определения роли PAK1 в регуляции роста клеток рака молочной железы мы исследовали особенности роста клеток РМЖ при подавлении PAK1, а также влияние PAK1 на некоторые эффекторы, задействованные в передаче митогенного сигнала в клетках РМЖ, в частности АР-1, бета-катенин и Snail. 2.1. Влияние РАК1 на рост клеток Для изучения участия РAK1 в регуляции клеточного роста клетки MCF-7 и HBL-100 культивировали на 24-луночных планшетах в присутствии специфического ингибитора PAK1 IPA-3 в концентрации 10 мкМ в течение 3 суток, с последующим определением количества выживших клеток. Результаты показали, что ингибитор PAK1 IPA-3 приводит к торможению роста клеток, значительно более выраженному в ER-негативной линии HBL-100 по сравнению с ER-позитивной линией MCF-7, что свидетельствует об активном участии РАК1 в поддержании эстрогеннезависимого роста клеток (рис. 3) . 8 Рисунок 3. Влияние ингибитора РAK1 - IPA-3 в концентрации 10 мкМ на рост клеток MCF7 и HBL-100. 2.2. Влияние РАК1 на активность митогенных сигнальных путей Для дальнейшего изучения механизма рост-стимулирующих эффектов РАК1 исследовалось его влияние на активность митогенных транскрипционных факторов: АР-1, бета-катенина и Snail1. Был применен метод репортерного анализа, позволяющий оценить транскрипционную активность факторов по их способности взаимодействовать со специфическими участками связывания на ДНК и активировать экспрессию генарепортера люциферазы. Для изучения роли РАК1 в регуляции активности АР-1 проводилась котрансфекция эстрогензависимых ER-положительных клеток MCF-7 и эстрогеннезависимых ERотрицательных клеток HBL-100 плазмидными конструкциями, содержавшими дикий вариант гена РАК1 (контроль – пустой вектор CMV6), ген люциферазы под контролем AP-1-чувствительного промотора (AP1/Luc), а также плазмидой с геном β-галактозидазы (для контроля эффективности трансфекции). Для исследования роли РАК1 в регуляции бета-катенина были использованы клеточные линии: MCF/TCF и HBL/TCF (клеточные линии MCF7 и HBL-100, стабильно экспрессирующие репортерную конструкцию, содержащую ген люциферазы под контролем TCF/LEF- промотора, чувствительного к бета-катенину), которые также были котрансфицированы плазмидами с диким вариантом гена РAK и β-галактозидазой. 9 Рисунок 4. Влияние трансфекции РАК1 на транскрипционную активность АР-1 (а) и βкатенина (б). Результаты репортерного анализа. Мы обнаружили, что гиперэкспрессия РАК1 приводит к выраженной стимуляции транскрипционной активности АР-1 и бета-катенина, причем в обеих линиях клеток: MCF-7 и HBL-100 (рис.4). Полученные результаты согласуются с литературными данными о роли PAK1 в стимуляции клеточного цикла и пролиферации [L.E. AriasRomero et al., 2010, L.E. Arias-Romero et al., 2008, Z. Wang et al., 2013]. Последним из митогенных белков был исследован транскрипционный фактор Snail1, один из ключевых белков эпителиально-мезенхимального перехода [V. Stemmer et al., 2008], повышенная экспрессия которого характерна для многих эстрогеннезависимых опухолей молочной железы, в том числе – для клеток HBL-100 [A.M. Scherbakov et al., 2013]. Примечательно, что фосфорилирование и активация Snail1 регулируются с участием PAK1-сигнального пути [Z. Yang et al., 2005]. Клетки MCF-7 и HBL-100 трансфицировали плазмидными конструкциями, содержавшими дикий вариант гена РAK1, ген-репортер люциферазы под контролем Snail1-чувствительного промотора (E-cad/Luc) и β-галактозидазу. Результаты репортерного анализа показали, что РАК1 стимулирует трансрепрессорную активность Snail1, определяемую по степени подавления экспрессии репортерного гена E-cad/Luc [E. Batlle et al., 2000], но только в ER-негативных клетках HBL-100, тогда как в клетках MCF7 активность Snail-1 практически не менялась (рис.5). 10 Рисунок 5. Влияние трансфекции РАК1 на транскрипционную активность Snail1. Проведенный нами генетический нокдаун Snail1 в присутствии малых интерферирующих РНК приводил к значительному, более чем в 2 раза, снижению скорости роста ER-негативных клеток HBL-100, свидетельствуя о важной роли, которую играет Snail1 в регуляции роста эстрогеннезависимых клеток (рис. 6). Рисунок 6. Влияние si-Snail1 на скорость роста клеток HBL-100. Таким образом, на этом этапе работы было продемонстрировано участие PAK1 в регуляции эстрогеннезависимого роста клеток РМЖ, в том числе через активацию митогенных сигнальных путей: AP-1, β-катенин и Snail1. 2.3. Роль α-Pix, ко-активатора РАК1, в регуляции активности клеточных сигнальных белков Мы исследовали роль ко-активатора PAK1 – PIX, в регуляции митогенных сигнальных путей. Регуляция активности РAK1 происходит путем присоединения малых Rho- ГТФаз: Rac1 и Cdc42, переведенных с помощью гуанин нуклеотид-обменных факторов (GEF) в ГТФ-связанную активную форму; таким GEF-фактором для PAK1 является PIX, в частности, α-Pix. Ранее было показано, что PAK1, несмотря на то, что он является «downstream» эффектором α-Pix-Rac1(Cdc42), в то же время фосфорилирует α11 Pix по серину в 488-м положении [U.E. Rennefahrt et al., 2007]. Значение такого фосфорилирования для клетки до сих пор изучено не было. Мы предположили, что данное фосфорилирование может определять митогенные эффекты PAK1, в том числе влияние PAK1 на активность транскрипционных факторов АР-1, бета-катенина и Snail1. Действительно, было обнаружено, что трансфекция α-Pix-содержащей плазмиды в клетки MCF-7 и HBL-10 приводит к активации бета-катенина (рис. 7б), но никак не влияет на транскрипционную активность АР-1 (рис. 7а). Рисунок 7. Влияние трансфекции α-Pix на транскрипционную активность АР-1 –а; βкатенина –б. Результаты репортерного анализа. С помощью репортерного анализа мы показали, что α-Pix стимулирует трансрепрессорную активность Snail1, но только в ER-негативных клетках HBL-100 (рис. 8а), что согласуется с данными, полученными нами ранее в отношении PAK1. Для исследования роли PAK1-зависимого фосфорилирования α-Pix в регуляции Snail была использована мутантная форма α-Рix, в которой серин в 488-ом положении был заменен на аланин (α-Рix-A), что препятствует фосфорилированию киназой PAK1. Оказалось, что, если трансфекция α-Pix дикого типа приводит к повышению трансрепрессорной активности Snail1, то замена 488-го серина на аланин блокирует этот эффект, возвращая трансрепрессорную активность Snail1 практически к исходному уровню (рис. 8б). 12 Рисунок 8. Влияние трансфекции α-Pix на транскрипционную активность Snail1 - а; роль PAK-зависимого фосфорилирования α-Pix по S488 в активации Snail - б. Результаты репортерного анализа. Полученные данные свидетельствуют о важной роли PAK1-зависимого фосфорилирования α-Pix (S488) в стимуляции трансрепрессорной активности Snail1. 2.4. Влияние РАК1 на активность рецептора эстрогенов в клетках эстрогензависимого рака молочной железы MCF-7 Мы изучали возможные изменения содержания ER при трансфекции в клетки MCF7 плазмиды PAK1 или при действии на клетки специфического ингибитора PAK1 – IPA-3. Результаты иммуноблоттинга образцов показали, что трансфекция РAK1 приводит к заметному увеличению экспрессии ER в клетках MCF-7; при добавлении IPA-3 экспрессия ERα возвращается к исходному уровню (рис. 9). Рисунок 9. Экспрессия ERα в клетках MCF-7 при трансфекции PAK1+/- IPA-3. Результаты иммуноблоттинга и денситометрии, выполненной в программе ImageJ; за 1 принимали значение показателя в контроле. 13 Аналогичные данные были получены относительно влияния PAK1 на транскрипционную активность ER, для определения которой применялся репортерный анализ с использованием гена-репортера люциферазы под контролем эстрогенреспонсивного элемента (ERE) (ERE/Luc). Мы продемонстрировали, что гиперэкспрессия РАК1 приводит к стимуляции активности ER, а подавление РАК1 в присутствии IPA-3 сопровождается ее снижением (рис. 10). Рисунок 10. Анализ транскрипционной активности ER после трансфекции РАК1 или действия ингибитора РАК1 IPA-3 в клетках MCF-7. Результаты репортерного анализа. В целом, полученные данные показали, что рост-стимулирующее действие РАК1 на клетки ER-позитивного РМЖ ассоциировано как со стимуляцией канонических митогенных сигнальных путей: AP-1 и β-катенин, так и с активацией эстрогенового сигналинга. 3. РАК1 и выживаемость клеток: роль РАК1 в регуляции роста клеток в условиях гипоксии Выше отмечалось, что ER-негативные клетки РМЖ характеризуются высоким уровнем экспрессии PAK1 [C. Holm et al., 2006] и Snail1 [A.M. Scherbakov et al., 2013], в то время как ER-позитивные клетки, напротив, имеют низкий уровень экспресии этих белков. Вероятно, причина низкого уровня экспрессии PAK1 и Snail1 в ER- положительных клетках может быть связана с особенностями внутриклеточного сигналинга, ответственного за негативный контроль этих белков. Одним из механизмов такой негативной регуляции является подавление рецептором эстрогенов активности Snail1 через ER-зависимую активацию специфического белка-супрессора Snail1 – MTA3 [A. Dhasarathy et al., 2007, N. Fujita et al., 2003]. 14 В наших исследованиях мы продемонстрировали активацию рецептора эстрогенов под действием РАК1, что можно рассматривать в качестве одного из факторов, ограничивающих уровень Snail1 в ER-позитивных клетках РМЖ. Участие РАК1 в поддержании роста клеток MCF-7 было продемонстрировано в экспериментах с IPA-3, специфическим ингибитором РАК1: оказалось, что добавление IPA-3 существенно снижает скорость роста клеток MCF-7. Для дальнейшего изучения протективной роли РАК1 и путей его физиологической регуляции в клетках РМЖ мы исследовали активность РАК1 в клетках MCF-7 в условиях гипоксии. 3.1. Сравнительный анализ чувствительности к гипоксии клеток MCF-7 и HBL-100 (эксперименты выполнены совместно с В.А.Шатской) Эксперименты проводились in vitro на клетках эстрогензависимого рака молочной железы человека MCF-7 и эстрогеннезависимого ER-негативного рака молочной железы линии HBL-100. Анализ скорости роста клеток после перевода в условия гипоксии (1% О2) показал резкое снижение роста клеток MCF-7 при сохранении относительно устойчивой пролиферации ER-негативных клеток HBL-100 (рис. 11). Как уже отмечалось, клетки HBL-100 отличаются высоким уровнем РАК1, что позволило предположить количество клеток отн.ед. участие последнего в регуляции чувствительности клеток к гипоксии. контроль гипоксия, 1%О2 MCF-7 HBL-100 Рисунок 11. Сравнительный анализ чувствительности к гипоксии клеток MCF-7 и HBL-100. 15 3.2. Роль РАК1 в адаптации клеток MCF-7 к гипоксии Участие PAK1 в ответе клеток на гипоксию было подтверждено в экспериментах по сравнительному анализу содержания РАК1, показаших выраженное увеличение экспрессии РАК1 в клетках MCF-7 в условиях острой гипоксии (1% О2, 18 час) (рис.12). Рисунок 12. Влияние острой гипоксии на содержание РАК1 в клетках MCF-7. Результаты иммуноблоттинга и денситометрии, выполненной в программе ImageJ; за 1 принимали значение показателя в контроле. В какой мере РАК1 участвует в поддержании роста клеток при гипоксии – для ответа на этот вопрос следующая серия экспериментов была проведена на клетках MCF-7, культивированных в условиях хронической гипоксии. Для моделирования условий хронической гипоксии клетки эстрогензависимого рака молочной железы MCF-7 культивировали в атмосфере с пониженным (до 1%) содержанием кислорода в течение 30 сут. Ранее мы продемонстрировали, что если острая, в течение 3 сут, гипоксия вызывает значительное торможение клеточной пролиферации, то на фоне хронической гипоксии торможение роста оказывается существенно меньшим. Полученная в условиях хронической гипоксии сублиния клеток получила название MCF-7/H; в предыдущих работах мы показали, что подобная толерантность к гипоксии может сохраняться в течение не менее 60 суток после возвращения клеток в среду с нормальным содержанием кислорода [Д.В.Сорокин и др., 2015]. Было установлено, что базальный уровень РАК1 в клетках MCF-7/H значительно выше, чем в MCF-7 (рис.13). 16 Рисунок 13. Сравнительный анализ содержания РАК1 в клетках MCF-7 и MCF-7/H. Результаты иммуноблоттинга и денситометрии, выполненной в программе ImageJ; за 1 принимали значение показателя в в линии MCF-7. Подавление PAK1 в клетках MCF-7/H в присутствии IPA3 приводит к увеличению 50 100 контроль гипоксия 1% 0 количество клеток отн.ед. 150 чувствительности клеток к гипоксии (рис. 14). - IPA +IPA Рисунок 14. Влияние IPA-3 на чувствительность к гипоксии клеток MCF-7/Н. Результаты МТТ теста. Для дальнейшего изучения механизма протективного действия РАК1 в условиях гипоксии был проведен анализ влияния РАК1 на активность HIF-1, одного из ключевых факторов, индуцируемых в условиях гипоксии. С помощью репортерного анализа с использованием плазмиды HRE/Luc, содержавшей ген люциферазы под контролем гипоксия-респонсивного элемента (HRE), мы обнаружили, что трансфекция РАК1 в клетки приводит к увеличению транскрипционной активности HIF-1 на фоне острой гипоксии, демонстрируя непосредственное участие РАК1 в активации HIF-1-сигнальных путей (рис. 15). 17 1500 500 1000 wPak1 0 активность люциферазы (HRE/luc), усл.ед. контроль Норма Гипоксия Рисунок 15. Влияние трансфекции wPAK1 на транскрипционную активность HIF-1. Результаты репортерного анализа. Как уже отмечалось, подобный протективный эффект РАК1 характерен и для клеток ER-негативного рака молочной железы: так, исследованные нами ER-негативные опухоли молочной железы отличались повышенной конститутивной экспрессией РАК1 и высокой чувствительностью к антипролиферативному действию IPA-3. Таким образом, гиперэкспрессия РАК1, как приобретенная (в случае клеток MCF-7/H), так и конститутивная (в случаях ER-негативных опухолей) может выступать в роли одного из факторов, поддерживающих автономный рост и выживаемость клеток. 4. Метилирование РАК1 и его роль в регуляции дифференциальной экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы В качестве одного из вероятных путей регуляции РАК1 в клетках опухолей молочной железы мы исследовали специфических цитозин-гуанин возможность метилирования/деметилирования богатых участков гена, располагающихся в 5’- регуляторных регионах [X. Zhang et al., 2013, C. Yi et al., 2008, Н.П. Киселева и др., 2007] и определяющих эффективность экспрессии РАК1. Был проведен сравнительный анализ метилирования промотера гена РАК1 в клетках MCF-7 и HBL-100 методом метичувствительной ПЦР, основанной на использовании метилчувствительных рестриктаз, которые разрезают ДНК по определенным сайтам при отсутствии в них метилированных цитозинов; в результате последующая ПЦР соответствующего фрагмента ДНК будет приводить к образованию продукта только в случае метилирования сайтов метилчувствительных рестриктаз рестрикции. Применение двух независимых (HpaII и HhaI) продемонстрировало наличие метилирования гена РАК1 в клетках MCF-7 и его отсутствие в клетках HBL-100 (рис. 16). 18 Рисунок 16. Анализ метилирования промотора РАК1 методом метилчувствительной ПЦР. а) ПЦР после рестрикции HpaII. Определяются два фрагмента, верхний соответствует промотору РАК1, нижний - внутреннему контролю CUX1; б) ПЦР после рестрикции HhaI. Определяется один фрагмент, соответствующий промотору РАК1. В клетках MCF-7 рестрикции ДНК не происходит из-за метилирования цитозинов в СG-динуклеотидах, синтез фрагмента РАК1 сохраняется. В клетках HBL-100 происходит рестрикция ДНК, фрагмент с промотора РАК1 не синтезируется. Полученные данные были подтверждены с помощью бисульфитного секвенирования, в основе которого лежит бисульфитная конверсия неметилированного цитозина в тимин (рис. 17). а б Рисунок 17. а) Нуклеотидная последовательность СpG-островка, расположенного в промоторной области PAK1. Цветом выделены метилированные цитозины, которые не изменяются в результате бисульфитной конверсии. б) Бисульфитное секвенирование промотора РАК1 в клетках HBL-100 и MCF-7. Результаты метил-специфического секвенирования CpGостровка, расположенного в промоторе РАК1 в культурах клеток HBL-100 и MCF-7. Метилированный цитозин обнаруживается только в промоторе РАК1 клеток MCF-7. 19 Вместе с тем, аналогичное исследование метилирования РАК1 в клетках MCF-7/H не выявило существенных изменений в уровне метилирования РАК1 – несмотря на увеличение содержания РАК1 в клетках MCF-7/H по сравнению с клетками MCF-7 (рис.18). MCF-7/H Рисунок 18. Бисульфитное секвенирование промотора РАК1 в клетках MCF-7/Н . Каков механизм активации РАК1 в случае клеток MCF-7/H – остается до конца непонятным, скорее всего подобная активация РАК1 может быть результатом действия определенных сигнальных белков – позитивных регуляторов РАК1. Мы предполагаем, что в качестве таких регуляторов могут выступать белки, ассоциированные с гипоксией, в том числе – HIF-1. Учитывая описанную выше способность РАК1 стимулировать активность HIF-1, можно предположить, что эти белки связаны положительными регуляторными связями, которые и обеспечивают конститутивное повышение их уровня при хронической гипоксии. Заключение На сегодняшний день основным критерием определения чувствительности к гормональным противоопухолевым препаратам является содержание рецепторов эстрогенов [М. А. Красильников, 2004, N. Normanno et al., 2005, R. Clarke et al., 2003, V.C. Jordan, 2003, Е.С. Герштейн и др., 2005, B.E. Henderson et al., 2003]. Однако, гормональная резистентность может развиваться и при сохранении ER: в результате дисбаланса белковкорегуляторов ER, лиганд-независимой активации ER, стимуляция сигнальных путей, независимых от ER и поддерживающих тем самым рост РМЖ в отсутствие эстрогенов. Развитие гормональной резистентности рака молочной железы связано с переходом опухолевых клеток от эстрогензависимого к эстрогеннезависимому росту. В настоящей работе при исследовании факторов, регулирующих развитие гормональной резистентности клеток рака молочной железы, мы продемонстрировали участие серин-треониновой протеинкиназы РАК1 в поддержании эстрогеннезависимого роста опухолевых клеток. Мы установили, что подобные митогенные эффекты РАК1 ассоциированы со стимуляцией ключевых сигнальных путей опухолевой клетки: MAPK/ AP-1 каскада, WNT-β-катенинового пути, Snail1-сигнального пути. Продемонстрировано, что для реализации действия РАК1 ключевым фактором является фосфорилирование α20 Pix, ко-активатора РАК1, по серину в положении 488. Показано значение РАК1сигнальной системы в регуляции выживаемости опухолевых клеток, в том числе в условиях гипоксии. Полученные данные легли в основу предлагаемой схемы действия PAK1 с участием его некоторых вышележащих и нижележащих эффекторов, а также значения РАК1 в поддержании роста клеток РМЖ (рис. 19). Рисунок 19. Роль PAK1 и его эффекторов в поддержании эстрогензависимого и эстрогеннезависимого роста рака молочной железы. В целом, полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования РАК1 в качестве маркера развития гормональной резистентности РМЖ и потенциального объекта таргетной терапии опухолей молочной железы. Выводы 1. Сравнительный анализ содержания серин-треониновой протеинкиназы РАК1 в клетках культивируемых in vitro эстрогензависимой и эстрогеннезависимых линий рака молочной железы показал значительное превышение уровня РАК1 в эстрогеннезависимых сублиниях 2. Продемонстрировано, что РАК1 является одним из факторов, необходимых для поддержания роста клеток рака молочной железы, в большей степени – для роста эстрогеннезависимых опухолей молочной железы 3. Установлено, что митогенный эффект РАК1 ассоциирован со стимуляцией ключевых сигнальных путей опухолевой клетки: MAPK/ AP-1 каскада, WNT-β-катенинового пути, 21 Snail1-сигнального пути. Для реализации действия РАК1 необходимым фактором является фосфорилирование α-Pix, ко-активатора РАК1, по серину в положении 488. 4. Продемонстрировано участие РАК1 в регуляции выживаемости клеток рака молочной железы, в частности – в условиях хронической гипоксии. Одним из возможных механизмов участия РАК1 в поддержании роста опухолевых клеток в условиях гипоксии является обнаруженная нами способность РАК1 стимулировать транскрипционную активность HIF-1, одного из основных гипоксия-зависимых протективных факторов клетки. 5. При определении статуса метилирования промотора гена РАК1 установлено, что низкий уровень РАК1 в эстрогензависимых линиях ассоциирован с высоким уровнем метилирования, в то время как в эстрогеннезависимых линиях, отличающихся высоким содержанием РАК1, его промотор полностью деметилирован. 6. В целом, полученные данные свидетельствуют, что эпигеномная регуляция РАК1, в частности – метилирование ДНК, может являться одним из факторов, определяющим повышение уровня РАК1 в эстрогеннезависимых клетках рака молочной железы. Продемонстрированная нами протективная функция РАК1 позволяет рассматривать его в качестве перспективной мишени для таргетной терапии рака молочной железы. Список работ по теме диссертации в журналах, рекомендованных ВАК 1. Авилова, Е.А. Значение протеинкиназы PAK1 в регуляции эстрогеннезависимого роста клеток рака молочной железы / Е.А. Авилова, О.Е. Андреева, В.А. Шатская, М.А. Красильников // Биомедицинская химия – 2014. – Т. 60, №3 – C.322-331 (статья также опубликована в английском переводе в Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry (Avilova, E.A. The Role of Protein Kinase PAK1 in the Regulation of Estrogen-Independent Growth of Breast Cancer Protein Kinase Pak1 and Breast Cancer / E.A. Avilova, O.E. Andreeva, V.A. Shatskaya, M.A. Krasil’nikov // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry – 2015. - Vol. 9 - No. 1 – P. 58-62). 2. Авилова, Е.А. Метилирование РАК1 в клетках опухолей молочной железы / Е.А. Авилова, Е.Б. Кузнецова, М.В.Немцова, А.М.Щербаков, В.А. Шатская, М.А. Красильников // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии – 2015. – № 5 – С. 39-46. 22 Тезисы конференций: 1. Авилова, Е.А. Роль РАК1-α-Pix-сигнального пути в регуляции роста опухолевых клеток/ Авилова Е.А. // Биология – наука ХХI века: 19-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых Сборник тезисов. Пущино, 2015. – 2015. – С. 215. 2. Авилова, Е.А. Роль РАК1-сигнального пути в развитии гормональной резистентности клеток рака молочной железы / Е.А. Авилова, О.Е. Андреева, В.А. Шатская, М.А. Красильников // 1-й Российский онкологический научнообразовательный форум с международным участием «Белые Ночи – 2015». Сборник тезисов. М., 2015. – C. 418. 3. Авилова, Е.А. РАК1 и выживаемость клеток: роль РАК1 в регуляции роста клеток в условиях гипоксии / Е.А. Авилова, В.А. Шатская, М.А. Красильников // 1-й Российский онкологический научно-образовательный форум с международным участием «Белые Ночи – 2015». Сборник тезисов. М., 2015. – C. 419. 4. Сорокин, Д.В. Молекулярные механизмы регуляции чувствительности клеток рака молочной железы к противоопухолевым агентам в условиях гипоксии / Д.В. Сорокин, С.Е. Семина, Е.А. Авилова, И.А. Якушина, М.А. Красильников // Экспериментальная и фундаментальная онкология – 2014. – C. 123. 23
