Приложение 4.1 3 Хряпова Е.В. Лабораторная работа для студентов РГМУ, специальность Биохимия “Идентификация белка в геле методом масс-спектрометрических пептидных карт” Гидролиз проб Необходимые материалы и оборудование: Оборудование Пробирка типа Эппендорф на 1.5 ml, 0.2 ml. Автоматические пипетки на 20 mkl, 200 mkl, 1000 mkl. Термостат-шейкер Eppendorf 37 0С и термостат на 60 0 С Ламинарный шкаф Масс-спектрометр Ultraflex c MALDI мишенью Реактивы: Буфер для отмывки: 50 мМ NH4 HCO3 в 50 % ацетонитриле Буфер для гидролиза: 50 мМ бикарбонат аммония Дегидратирующий буфер: ацетонитрил Трипсин: свиной модифицированный трипсин 200 mkg/ml, 5 мкл Трифторуксусная кислота (ТФУ) 2,5 - Дигидроксибензойной кислоты (DHB) Триптический гидролиз белка в полиакриламидном геле (рис 1) Отрежьте носик наконечника автоматической пипетки так, чтобы внутренний диаметр был приблизительно 2 мм (рис. 1). Вырежьте часть пятна-белка в геле с помощью пипетки с укороченным наконечником (рис. 2). Вырезанный кусок геля помещается в пробирку объемом 200 мкл. (рис. 3). 1 Приложение 4.1 3 (рис 2) (рис 3) Проведение специфического триптического гидролиза белка в геле Отмывка: Проведите отмывку используя отмывочный буфер: 2 раза по 15 мин в 150 mkl а термостате-шейкере при t=370 C. Дегидратация: После отмывки удалите остатки отмывочного буфера. Проведите дегидратацию добавляя в пробирку 150 mkl ацетонитрила. Удалите ацетонитрил через 15 мин. и подсушите на воздухе. Проведите гидролиз: добавьте в пробу с высушенным куском геля 5 mkl трипсина, так чтобы раствор трипсина впитался в гель. Рабочий раствор трипсина: 30 mkg/ml в 50 мМ NH4 HCO3. Оставьте на ночь в термостате при t=370 C. Приблизительно через 18 часов остановите реакцию добавив в пробирку 7 mkl 0.7% раствора ТФУ. Проинкубируйте 2 Приложение 4.1 3 пробирку при комнатной температуре 2 часа. Надгелевый раствор используйте для получения MALDI-масс-спектров. Подготовка образцов для масс-спектрометрического исследования Приготовьте раствор матрицы 10 mkg/ml 2,5 - дигидроксибензойной кислоты в 50% ацетонитриле в 3% трифторуксусной кислотой. Нанесите на мишень 1 mkl раствора DHB с помощью пипетки. Тщательно перемешайте раствор в пробирке с гелем и добавьте 1 mkl надгелевого раствора к еще не высохшей капле DHB на мишени. Дождитесь пока высохнет смесь матрицы (DHB) и образца, нанесенных на мишень. Вставьте масс-спектрометрическую мишень в масс-спектрометр Ultraflex для этого: Нажмите кнопку Load/Enject на корпусе масс-спектрометра (рис.4). (рис 4) Дождитесь пока лоток манипулятора шлюза выйдет наружу и займет горизонтальное положение (рис.5). (рис 5) 3 Приложение 4.1 3 Положите мишень на лоток и нажмите кнопку Load/Enject еще раз. Подождите пока завершиться процесс перемещения мишени в ионный источник. Запустите программу Flex Control управления масс-спектрометром на управляющем компьютере (контролере) масс-спектрометра. О готовности прибора к работе будут свидетельствовать зеленые прямоугольные флажки Sample IN и Systm Ready в верхнем левом углу окна программы Bruker Flex Control. Внимание! Если в течение продолжительного времени прямоугольные флажки остаются окрашенными в желтый или красный цвет обратитесь к руководителю практической работы. На закладке Sample Selection выберите ту позицию на мишени, на которой нанесен образец (рис.6). (рис 6) Нажав кнопку Select Metod вызовите меню выбора метода (режима) работы прибора и выберите метод Student PMF 2006.par (рис.7). 4 Приложение 4.1 3 (рис 7) Выберите с помощью мышки конкретный участок образца, для регистрации спектра в окне видеомонитора. Нажмите кнопку Start в главном окне Bruker_FlexControl. Вы увидите накапливающий спектр (рис.8). 5 Приложение 4.1 3 Наилучшего результата соотношения интенсивности сигналов и разрешения можно добиться, регулируя мышкой мощность лазера. Увеличить выбранный вами пептидный пик можно с помощью инструмента Zoom на мышке компьютера (рис 9). (рис 9) Обработка спектров Сохраните те спектры, которые считаете достаточно хороши в директории /Student/_ ваша фамилия. Воспользуйтесь кнопкой Save As. Выберите инструмент разметки спектров. Произведите разметку основных сигналов в спектре. Осуществите калибровку спектра по сигналам пептидов автолиза трипсина Воспользуйтесь для этого инстремантом “внутренняя калибровка” (Calibrate – Internal) (рис 10). 6 Приложение 4.1 3 (рис 10) Для обработки зарегистрированного спектра запустите программу Bruker FlexAnalysis. Откройте в этой программе снятые вами спектры. Сохраните те спектры, которые считаете достаточно хороши в директории Student_ ваша фамилия. Воспользуйтесь кнопкой Save As. Сделайте разметку остальных пиков вручную. Внизу (рис.11) вы сможете увидеть помеченные вами пептидных пиков. 7 Приложение 4.1 3 (рис 11) Идентификация белка с использованием программы Mascot Откройте окно запроса Mascot Peptide Mass Fingerprint на локальном или удаленном сервере Mascot. Скопируйте в программе Bruker Flex Analisis список пептидных масс и поместите его в графу Query окна запроса Mascot (рис.12). Выберите необходимую базу данных, укажите вид организма (или поиск во всех известных геномах). Используемый фермент (трипсин) и точность, с которой было осуществлено измерение молекулярных масс Удалите из списка массы известные вам как контаминантные массы (трипсин и кератин). 8 Приложение 4.1 3 (рис 12) Нажмите кнопку “Start Search”. Через 1-2 мин. Вы увидите результаты поиска в базе данных выполненные системой Mascot (рис 13). 9 Приложение 4.1 3 (рис 13) Щелкнув на ссылку “Protein Summary Repot” вы сможете увидеть более подробные результаты поиска 10 Приложение 4.1 3 (рис 14) Через 1-2 мин. вы увидите результаты поиска в базах данных выполненные системой Mascot. Подготовлено в соответствии п. 4.7. Государственного контракта от «10» февраля 2006 г. № 02.451.11.7058 в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы» 11