Исследование роли ADP в регуляции F 1 F 0
реклама
Московский Государственный Университет им. М. В. Ломоносова Биологический факультет Кафедра биохимии Бродягина Наталья Александровна Исследование роли ADP в регуляции F1Fo-ATPазы Paracoccus denitrificans Дипломная работа Руководитель: кандидат биологических наук Жарова Т. В. Москва 2008 СОДЕРЖАНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ..................................................................................................................... 3 ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................................................ 4 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................................................................ 5 СТРОЕНИЕ И ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ F1·FO-АТРАЗЫ ................................................... 5 МЕХАНИЗМ СИНТЕЗА АТР ......................................................................................................................... 7 КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ F1·FО-АТРАЗЫ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ...................................................... 8 РЕГУЛЯЦИЯ РАБОТЫ F1·FO-АТРАЗЫ ........................................................................................................ 9 F1·FО-АТРАЗА РARACOCCUS DENITRIFICANS ......................................................................................... 15 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .............................................................................................................. 19 ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТА СУББАКТЕРИАЛЬНЫХ ЧАСТИЦ ................................................................... 19 АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ..................................................................................................................... 20 1. ИЗМЕРЕНИЕ ATPАЗНОЙ АКТИВНОСТИ .................................................................................................. 20 2. ИЗМЕРЕНИЕ АКТИВНОСТИ NADH-ОКСИДАЗЫ. ..................................................................................... 22 3. РЕГИСТРАЦИЯ МЕМБРАННОГО ПОТЕНЦИАЛА ........................................................................................ 22 4. ОБРАБОТКА СУББАКТЕРИАЛЬНЫХ ЧАСТИЦ P. DENITRIFICANS ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗОЙ ................... 22 5. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТА МЕМБРАН P. DENITRIFICANS, СВОБОДНОГО ОТ ADP ..................................... 23 6. ОПРЕДЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА .................................................................................................... 24 РЕЗУЛЬТАТЫ ......................................................................................................................................... 25 1. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГИДРОЛИЗА АТР И ЕГО СУБСТРАТНЫХ АНАЛОГОВ – ITP И GTP – МЕМБРАНАМИ P. DENITRIFICANS ................................................................................................ 25 2. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТА СУББАКТЕРИАЛЬНЫХ ЧАСТИЦ, СВОБОДНЫХ ОТ ADP, И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕГО СВОЙСТВ................................................................................................................ 30 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. ....................................................................................................... 42 ВЫВОДЫ .................................................................................................................................................. 49 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ..................................................................................................................... 50 2 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ F1·Fo-ATPаза – Н+-транслоцирующая АТРаза F1 – растворимый компонент АТРазы Fo – мембранный компонент АТРазы FССР – карбонилцианид-4-трифторметоксифенилгидрозон NTP – нуклеозидтрифосфат HEPES – N-2-гидроксиэтилпиперазин-N- этансульфоновая кислота СБЧ – суббактериальные частицы СМЧ – субмитохондриальные частицы Pi – неорганический фосфат ~ H - разность электрохимических потенциалов ионов водорода ПК – пируваткиназа ЛДГ – лактатдегидрогеназа ФЕП – фосфоенолпируват ТРИС – трис(гидрометил)метиламин ЩФ – щелочная фосфатаза ЭДТА – этилендиаминтетраацетат U – единица ферментативной активности 3 ВВЕДЕНИЕ F1·Fo-АТР синтетаза/АТРаза – полисубъединичный мембранный комплекс, катализирующий сопряженный с трансмембранным переносом протона синтез/гидролиз АТР, – давно и подробно изучается биологами, но в то же время остается одним из наиболее загадочных ферментов и интереснейшим объектом исследований. Это ключевой фермент, обеспечивающий клетку АТР, – ее энергетической валютой. Широко распространено мнение, что синтез АТР представляет собой простое обращение последовательности стадий реакции гидролиза нуклеотида. Однако известно, что существуют условия, в которых АТРаза теряет способность гидролизовать АТР, но сохраняет АТР-синтетазную активность. Одним из примеров необратимо функционирующего фермента является F1·Fo-АТРаза Paracoccus denitrificans. Гидролазная активность этого фермента составляет 1-2 % от синтетазной. АТРазная активность восстанавливается после энергизации мембраны частиц, но такие потенциал-активированные частицы теряют АТРазную активность после падения потенциала. Было установлено, что механизм энергозависимой де-активации/активации фермента включает ассоциацию/диссоциацию прочносвязанного с ферментом ADP. Однако было также показано, что если стационарную концентрацию ADP в ходе гидролиза АТР поддерживать на низком уровне (1-2 мкМ), то наблюдается торможение реакции во времени. Таким образом, с одной стороны, ADP выступает как ингибитор фермента, с другой стороны, можно предположить, что связывание ADP в одном из активных центров фермента необходимо для протекания гидролиза во втором активном центре. В нашей гидролитической работе мы активности исследовали F1·Fо-АТРазы. роль Мы свободный от ADP, и охарактеризовали его свойства. 4 ADP получили в регулировании препарат СБЧ, ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Строение и особенности функционирования F1·Fo-АТРазы Н+-F1·Fo-АТР синтетазы/АТРазы обнаружены в плазматической мембране прокариот, внутренней мембране митохондрий растений и животных и в мембранах тилакоидов хлоропластов растений. Этот фермент катализирует синтез АТР, используя энергию разности электрохимических потенциалов ионов водорода ( ~ ), создаваемую электрон-транспортной цепью на сопрягающих H мембранах. F1·Fo-АТРаза также катализирует гидролиз АТР, сопряженный с генерацией ~ , H энергозависимых которая может процессов: быть использована для веществ, обратного транспорта поддержания переноса электронов, трансгидрогеназной реакции. F1·Fо-АТРазы состоят из двух полисубъединичных белковых комплексов: F1 и Fо. F1-комплекс включает 5 различных субъединиц: , , и , с молекулярными массами 55, 51,5, 30, 21, 15 кДа, соответственно, представленных в стехиометрическом соотношении 3:3:1:1:1. Fо-комплекс бактериальных АТРаз, состоит из трех различных субъединиц: a, b и с с молекулярными массами 30, 17, 8 кДа, соответственно, в соотношении 1:2:10-12 (данные приведены для E. coli (E F1·Fо комплекс) [1,2]. F1·Fо-АТРазы хлоропластов (CF1·Fо) похожи на бактериальные. -, - и - субъединицы митохондриальной АТРазы (MF1·Fо) высоко гомологичные таковым хлоропластов и бактерий; -субъединица гомологична -субъединице бактерий и хлоропластов, а бактериальная -субъединица – это гомолог митохондриального белка, придающего чувствительность к олигомицину (OSCP). В свою очередь субъединица АТРаза митохондриального имеет более сложную фермента F1-часть, уникальна. включающую Митохондриальная 10-12 различных субъединиц. - и -субъединицы, чередуясь, образуют гексамер, расположенный над поверхностью мембраны, в который снизу входит -субъединица, связанная с субъединицей. Комплекс и -субъединиц образует центральную часть ножки. Образующие кольцо с-субъединицы Fо-комплекса погружены в мембрану. К этому кольцу примыкает а-субъединица, также находящаяся в мембране, вместе 5 они образуют протонный канал. субъединиц. Мембранные -субъединица взаимодействует с кольцом с- части димера b-субъединиц примыкают к а- субъединице; гидрофильные части субъединиц b примыкают к гексамеру, состоящему из - и -субъединиц. -субъединица расположена на вершине b- субъединицы. Таким образом получается, что F1 и Fо-комплексы соединены ножкой, состоящей из и -субъединиц. [2] Рис.1. Схема строения АТРазы/АТРсинтетазы [3]. На данный момент известно, что F1-комплекс несет шесть нуклеотидсвязывающих центров. Три из них с высокой скоростью обменивают АТР на ADP и являются каталитическими центрами; три других сайта медленно обменивают нуклеотиды, и являются некаталитическими. Некаталитические центры играют важную структурную роль и, возможно, принимают участие в регуляции АТРазной 6 или АТР-синтазной активности. Каталитические и некаталитические центры расположены между и -субъединицами. Большинство аминокислотных остатков, формирующих каталитические центры, находятся на -субъединицах, тогда как остатки, относящиеся к некаталитическим центрам, расположены в основном, на -субъединицах [4]. Механизм синтеза АТР Механизм кооперативного синтеза (гидролиза) АТР получил название «механизма чередующегося сродства». Согласно этому механизму: 1) наибольшей энергии требует не сам синтез АТР, происходящий в каталитическом центре, а освобождение продукта реакции; 2) связывание субстратов и освобождение продуктов происходит одновременно в различных, но взаимодействующих центрах. Вращение -субъединицы внутри гексамера сопрягает процесс переноса протона в Fо с чередующимся изменением сродства активных центров F1 [2]. Происходящие при этом конформационные изменения в структуре F1 сопряжены с транспортом протонов через Fо посредством вращения комплекса субъединиц · . Вращение -субъединицы в центре F1-комплекса способствует конформационным изменениям каталитических центров, вследствие чего происходит изменение сродства каталитических центров к субстратам и продукту. Считается, что в составе Fо-комплекса как а, так и с-субъединицы принимают участие в транспорте протонов. Вращение с-субъединиц относительно а-субъединицы необходимо для прохождения протонов сквозь мембрану по градиенту. П. Бойер предположил, что в центре F1-комплекса вращается ассиметричный стержень, оказывая влияние на конформацию каталитических центров [5]. В 1990 году методом криоэлектронной микроскопии было показано, что, действительно, в течение каталитического цикла «стержень» внутри F1комплекса ( -субъединица) по-разному взаимодействует с тремя -субъединицами [6]. В ходе катализа каталитические центры находятся в трех различных состояниях: состоянии высокого сродства (close), слабого сродства (tight) и открытого каталитического центра (open). В центре со слабым сродством 7 субстраты связаны не прочно. Центр с высоким сродством характеризуется прочным связыванием субстрата и переходом его в продукт без затраты энергии. В открытом Вращение каталитическом ассиметричной изменениям центре происходит -субъединицы каталитических центров. освобождение приводит Вращение к продукта. конформационным -субъединицы является потенциал-регулируемым. Считается, что ток протонов вызывает вращение кольца с-субъединиц относительно а-субъединицы. Движение передается на комплекс · -субъединиц. А -субъединица, входящая внутрь 3 3-гексамера, вращаясь, как бы поочередно «выталкивает» образовавшийся продукт (АТР) из каталитического центра [7]. Кинетические параметры F1·Fо-АТРазы млекопитающих F1·Fо-АТРаза катализирует синтез ATP из ADP и Pi, сопряженный с использованием трансмембранного градиента протонов. Субстратом являются комплекс ADP и Mg2+. Реакция синтеза ATP протекает в соответствии с уравнением: n (от 2 до 4) – стехиометрический коэффициент переносимых через Fo протонов, m - стехиометрический коэффициент, обусловленный различной кислотностью субстратов и продуктов реакции [8]. Для протекания реакции синтеза ATP, являющейся основной функцией F1·Fо-комплекса, необходим полный F1·Fо-комплекс, замкнутый липидный бислой и протонный градиент. Было показано, что фермент также катализирует окислительное фосфорилирование GDP и IDP [9,10]. F1·Fо-АТРсинтетаза способна катализировать реакцию гидролиза ATP, сопряженную с генерацией протонного градиента. Субстратом для гидролазной реакции служит комплекс АТР·Mg2+. Для СМЧ было показано, что кинетика гидролиза АТР КмАТР=10-4 М. происходит характеризуется Свободный гидролиз АТР простой фермент и гиперболической связывает фермент 8 комплекс переходит в зависимостью, АТР·Mg2+, состояние, затем когда в каталитическом центре одновременно находятся ADP·Mg2+·Pi. Далее комплекс Mg2+·Pi диссоциирует и фермент связывает свободный Mg2+ в участке, отличном от каталитического центра. Затем происходит диссоциация ADP, и фермент переходит в исходное состояние [8]. Для митохондриального фермента было показано, что F1·Fо-АТРсинтетаза гидролизует не только АТР, но и его аналоги ITP и GTP. Показано, что гидролиз этих нуклеотидов также сопряжен с генерацией мембранного потенциала. Скорости гидролиза аналогов были ниже, по сравнению со скоростью гидролиза АТР. Для митохондриального F1 было показано, что скорость гидролиза GТР и IТР составляет порядка 25% от скорости гидролиза АТР [11]. F1·Fo-АТРаза не гидролизует СТР и UTP [11]. Регуляция работы F1·Fo-АТРазы Существует несколько способов регуляции работы F1·Fo-АТРазы. Некоторые из них характерны для F1·Fo-АТРаз из любых или из большинства источников; другие же достаточно специфичны для АТРаз определенных организмов. 1) в 1963 году в митохондриях сердца быка был обнаружен термостабильный, растворимый белок, который ингибировал АТР-гидролазную активность (цит. по [12]). Его назвали IF1. Он является обратимым неконкурентным ингибитором F1·Fо-АТРазы млекопитающих и связывается с ней в соотношении 1:1. Предполагается, что связывание IF1 с ферментом препятствует диссоциации нуклеотидов из каталитических сайтов F1. IF1 может ингибировать АТРазу, связываясь субъединицей) и с открытым приводя, таким (open) каталитическим образом, фермент центром в состояние, (с - когда кооперативного катализа нет. IF1 более выражено ингибирует мембраносвязанный фермент, по сравнению с изолированным ферментом. До сих пор до конца не ясно, с какими субъединицами АТРазы связывается IF1. Недавно было сделано предположение, что связывание происходит с -субъединицей [цит. по 12]. 9 2) S-S мостик в -субъединице хлоропластов. Фермент, у которого - субъединица находится в восстановленной форме (SH) активна в отношении гидролиза, в окисленной (S-S) – неактивна [13]. 3) -субъединица играет важную регуляторную роль в транспорте протонов и окислительном фосфорилировании. Удаление АТРазную активность изолированного F1. -субъединицы увеличивало Увеличение концентрации - субъединицы в этих опытах приводило к ингибированию гидролитической активности. Ингибирование было неконкурентным по отношению к субстрату (АТР), Ki была близка к 10 нМ. Известно, что -субъединица, равно как и , необходима для соединения F1 и Fо комплексов. Однако связывается она непосредственно с F1, а не с Fo. Было показано, что -субъединица не влияет на активность мембраносвязанная F1·FoАТРазы, а также что добавление эндогенной -субъединицы не ингибирует мембран-связанной фермент в различных условиях. Более того, реконструкция заторможенной под действием -субъединицы EFC1 к лишенным EFC1 мембранам обращали ингибирование АТРазы [14]. Было показано, что изолированная -субъединица F1-ATPазы термофильной бактерии Bacillus strain PS3 способна связывать АТР. Связывание АТР не зависит от присутствия ионов Mg2+ в среде. Предполагают, что - субъединица чувствует изменение концентрации АТР в среде и регулирует активность F1-Fo комплекса путем конформационных изменений. Однако против этой гипотезы говорят два факта. Во-первых, не показано связывание - субъединицы с АТР для других объектов. Во-вторых, не продемонстрировано связывание АТР с -субъединицей в составе полного комплекса F1·Fo [15]. Было также показано, что -субъединица претерпевает конформационные изменения, которые напрямую связаны с переходом фермента из синтетазной формы в гидролазную. Изменение конформации -субъединицы возможно является важным механизмом регуляции перехода от синтеза АТР к гидролизу, и, наоборот, в ответ на изменяющиеся условия среды и согласно потребностям организма. Возможно, такие конформационные изменения – лишь часть сложной регуляторной системы [16]. 10 4) ADP как регулятор гидролиза АТР В работах нашей лаборатории, было показано, что ходе гидролиза АТР наблюдается торможение реакции во времени [17]. После добавления в реакционную среду второй порции CМЧ гидролиз АТР протекал с такой же кинетикой. Было также обнаружено, что инкубация с ADP в присутствии ионов Mg2+ как изолированного фермента (F1), так и фермента в составе СМЧ, приводит к появлению заметной лаг-фазы в кинетике гидролизе АТР [18]. Был получен препарат F1, содержавший только прочно связанные нуклеотиды. Скорость гидролиза АТР как этим препаратом, так и исходным (содержавшим, помимо прочно связанных, свободные нуклеотиды) снижалась в присутствии Mg2+. Свободный от нуклеотидов фермент таким свойством не обладал. Чувствительность свободного от нуклеотидов фермента к Mg2+ могла быть восстановлена при добавлении ADP в низких концентрациях. Это явление было названо ADP·Mg2+-зависимое ингибирование. [18]. Было показано, что ингибирующий ADP обладает высоким сродством к ферменту (Ki менее 10-7 М) [17]. Начальная скорость гидролиза АТР препаратами, преинкубированными в присутствии ADP и Mg2+, была низка, но быстро увеличивалась при измерении в присутствии АТР-регенерирующей системы. Если препараты частиц предварительно инкубировали в присутствии ПК или неорганического фосфата и ЭДТА (освобождали от ADP и Mg2+, активированные СМЧ), то они имели начальную высокую скорость гидролиза АТР, которая снижалась в ходе реакции из-за накопления ADP и образование ADP·Mg2+-комплекса фермента. Интересно, что в тех же условиях скорость гидролиза IТР не менялась во времени. Если CМЧ предварительно не были освобождены от ADP и Mg2+, то гидролиз IТР, так же как и гидролиз АТР, протекал с лаг-фазой. Активированные СМЧ катализировали гидролиз IТР с постоянной скоростью. В дальнейшем было показано, что ADP ингибирует гидролиз всех нуклеозидтрифосфатов, тогда как IDP не влияет на АТРазную активность. [19]. Следовательно, ингибирующий эффект ADP строго специфичен в отношении нуклеотида. Было найдено, что гидролиз АТР активированным препаратом при измерении гидролитической активности в присутствии АТР-регенерирующей системы имеет двухфазный характер. Первая фаза – это начальная фаза, во время которой гидролиз протекает с 11 высокой скоростью. Вторая фаза характеризуется торможением реакции во времени. При гидролизе АТР в ходе первой, быстрой, фазы накапливается ADP, который способен связываться с ферментом и в присутствии Mg2+ образовывать интермедиат (E*·ADP), не способный к гидролизу. Активный (E) и неактивный (E*·ADP) интермедиаты находятся в равновесии между собой. Если следовать этому предположению, то равновесие между различными формами фермента должно зависеть от концентрации АТР. Действительно, если концентрация АТР в среде меньше или равна Km, гидролиз АТР идет с постоянной скоростью, при увеличении концентрации АТР проявляется двухфазность гидролиза [19]. Предполагается, что в образовании E*·ADP интермедиата участвует центр связывания ADP, отличный от каталитического [19]. Второй субстрат реакции – неорганический фосфат – не ингибирует гидролиз АТР даже в милимолярных концентрациях. Единственным объяснением этого факта является предположение о том, что Pi необратимо освобождается из активного центра [8]. Неорганический фосфат (10 мМ) увеличивает Ki для ADP в ADP·Mg2+-торможении с 7·10-7 М до 5·10-6 М [20]. Как уже говорилось, неорганический фосфат активирует ADP-заторможенный фермент так же эффективно, как и пируваткиназа+фосфоенолпируват. Было показано, что кроме фосфата на активацию и де-активацию фермента также влияют азид и сульфит. Начальная фаза гидролиза АТР АТФазой CМЧ не чувствительна к азиду, но азид значительно увеличивает скорость инактивации фермента в ходе гидролиза. Азид увеличивает продолжительность лаг-фазы в гидролизе АТР, катализируемым ADP·Mg2+-заторможенным ферментом. Важно отметить, что азид препятствует активации такого фермента в присутствии ПК и ФЕП [21]. До недавнего времени было неясно, где именно азид связывается с ферментов. Согласно данным рентгенструктурного анализа, азид связывается с фосфатом ADP и с аминокислотными остатками -субъединицы, входящими в состав ADP-связывающего каталитического центра [22]. Начальная фаза гидролиза АТФазой CМЧ также не чувствительна и к сульфиту. Сульфит предотвращает и обращает ADP·Mg2+-торможение гидролиза АТР, а также снимает торможение реакции, вызванное взаимодействием фермента с азидом [21]. На рис. 2 схематически представлен механизм образования неактивного ADP·Mg2+-заторможенного состояния фермента. В ходе реакции гидролиза 12 происходит образование интермедиата E·ADP, который может диссоциировать на свободные E и ADP, тогда фермент вступит в новый каталитический цикл, или E·ADP может изомеризоваться в неактивный комплекс E*·ADP. В ходе гидролиза АТР существует равновесие между каталитически-активными интермедиатами и каталитически неактивным комплексом фермента с ADP (E*·ADP). Азид стабилизирует E*·ADP-форму фермента, тогда как сульфит сдвигает равновесие в сторону активного E·ADP интермедиата (рис. 2). Рис. 2. Схема, показывающая равновесие между состояниями фермента в ходе гидролиза АТР, а также влияние на это равновесие азида и сульфита [21]. Также долгое время пытались выяснить, где фермент связывает ингибирующий активность ADP. В гипотезах о месте связывания ADP немалую роль отводили некаталитическим сайтам. Кросс и соавт. [23] объясняли ингибирование гидролиза АТР ADP взаимодействием между каталитическим и некаталитическим сайтами связывания нуклеотидов. Предполагалось, что при одноцентровом катализе ADP, изначально связавшийся с каталитическим центром, может быстро диссоциировать и связываться с некаталитическим центром [19] (см. далее). В результате опытов с аналогами АТР выяснили, что получившиеся динуклеотиды обнаружены как в каталитических, так и в некаталитических центрах. Поэтому они не смогли однозначно подтвердить эту гипотезу. Бойер и соавт. [24] при помощи флуоресцирующих аналогов АDP показали, что ингибирующий АТРазу ADP связывается с каталитическим сайтом. Черняк и Кросс [25] тоже работали с флуоресцирующим аналогом АDР и подтвердили эти 13 данные. Они показали также, что диссоциация ингибирующего ADP происходит в 2 фазы. Роль некаталитических сайтов остается до конца невыясненной. Этот вопрос до сих пор может представлять интерес для исследователей. ~ 5) H -зависимая регуляция АТРазы ~ В работе Галкина и Виноградова [26] было показано, что H может активировать ADP·Mg2+-заторможенный, негидролизующий фермент даже в присутствии азида. Потенциал-зависимый переход неактивной АТРазы в ее активную форму предотвращается свободным ADP с константой ингибирования порядка 20 μМ. Это далеко не единственный пример регуляции активности F1·Fо-АТРазы потенциалом. Для хлоропластов [27, 28] и хроматофоров Rhodspirillum rubrum [29] была показана активация гидролитической активности при освещении. Процесс активации сопровождался освобождением прочно-связанных нуклеотидов. Рассеивание потенциала приводило к быстрой де-активация F1·Fо-АТРазы. Для АТРазы обладающей фотосинтезирующей низкой АТРазной бактерии активностью, была Rhodobacter capsulatis, обнаружена активация гидролиза под действием освещения, приводящего к образованию ~ H на мембране. Для Rhodobacter capsulatis было сделано предположение о том, что энергизация мембраны ведет к формированию метастабильного, активированного состояния АТРазы. Такое стояние АТРазы в отсутствие потенциала существует в течение 30 секунд. Время существования увеличивается в присутствии 3 мМ Pi до 80 секунд, в присутствии 1 мМ ADP уменьшается до 15 секунд [30]. На основании этих данных было выдвинуто предположение о том, что переход между активной и неактивной в отношении гидролиза формами F1·FоАТРазы контролируется не только нуклеотидами, но и мембранным потенциалом. Было также предположено, что фермент несет группу, чувствительную к изменению заряда на мембране и существование промежуточной формы, не способной ни к синтезу, ни к гидролизу [8]. Схематически эта гипотеза представлена на рис. 3. . 14 Рис.3. Гипотетический механизм переключения каталитической активности F1·Fо-АТРазы. Комплекс F1·Fо изображен для простоты состоящим из трех частей: каталитической (одна из пар · ), протонного канала (с-субъединицы) и переключателя (a- и b-субъединицы Fо и и субъединицы F1). АН-группа ~ показана в виде сенсора . В центре изображено состояние фермента, не H обладающего ни синтетазной, ни гидролазной активностью. Справа – гидролазное состояние комплекса, слева – синтетазное [8]. F1·Fо-АТРсинтетаза, утратившая в присутствии ADP, Mg2+ и азида гидролитическую активность, полностью сохраняла способность синтезировать АТР [31]. Было выдвинуто предположение, что реакцию синтеза и гидролиза катализируют две различные формы фермента – синтетазная и гидролазная [21]. В природе существует организм, который синтезирует АТР с высокой скоростью, однако гидролизует АТР с очень низкими скоростями. Это почвенная бактерия Paracoccus denitrificans. F1·Fо-АТРаза Рaracoccus denitrificans Paracoccus denitrificans – это почвенная бактерия. Она способна расти как автотрофно (использует водород и CO2), так и гетеротрофно (гетеротрофный рост предполагает наличие различных органических соединений). Данная бактерия является факультативным аэробом, использующим нитрат, нитрит или N2O в качестве акцепторов электрона. Глюкоза превращается по пути ЭнтнераДудорова или по гексозо-монофосфатному пути. В обмене P. denitrificans отсутствует гликолиз. Пируват, сукцинат и малат окисляются до CO2 в цикле трикарбоновых кислот. На основании сходства дыхательных цепей и процессов 15 окислительного фосфорилирования считается, что метаболические процессы P. denitrificans очень похожи на таковые в митохондриях [32]. Давно известно, что F1·Fо-АТРаза Р. denitrificans имеет загадочную особенность, заключающуюся в том, что фермент обладает высокой синтетазной и практически не обладает гидролазной активностью [32]. Синтез АТР мембранами P. denitrificans, подчиняется кинетике Михаэлиса. KМ по ADP составляет 12 мкМ, KМ по неорганическому фосфату - 190 мкМ [33]. Латентная АТРазная активность СБЧ восстанавливается под действием мембранного потенциала. Было показано, что кратковременная инкубация частиц с сукцинатом приводит к значительному увеличению скорости гидролиза АТР, сопровождающегося генерацией трансмембранного потенциала [34,35]. Потенциал-активированный гидролиз характеризуется простой гиперболической зависимостью. Km по AТP составляет 30-100 мкМ [36]. Потенциал-активированный гидролиз АТР на 90 % ингибируется вентурицидином – специфическим ингибитором бактериальной АТРазы [35]. Активаторами АТРазы являются также оксианионы: сульфит, фосфат, арсенат, бикарбонат в миллимолярных концентрациях. Авторы объясняли это тем, что эти оксианионы имеют сходную пространственную конфигурацию, конкурируют между собой, а, следовательно, имеют одинаковый центр связывания на ферменте. Из оксианионов наибольшее увеличение активности вызывает сульфит. При этом происходит изменение сродства к АТР и возрастает Vmax. [34,37]. Считается, что сульфит и мембранный потенциал вызывают два различных активированных состояния фермента [34]. Активированный сульфитом фермент чувствителен к разобщителю. Активация сульфитом усиливается при обработке трипсином, и ослабевает в присутствии ADP, олигомицина и вентурицидина. Активированный потенциалом фермент был менее чувствителен к ADP, олигомицину, вентурицидину и трипсину. Предполагают, активные состояния, стимулируемые сульфитом и окислением сукцината, представляют различающиеся собой доступностью 2 различных ингибиторной конформации -субъединицы для фермента, действия трипсина [34]. Неожиданно обнаружилось, что неорганический фосфат необходим для стационарного гидролиза АТР ~ H -активированной АТРазой: в среде без 16 фосфата наблюдалось уменьшение скорости гидролиза АТР во времени и быстрое падение мембранного потенциала [37]. Разобщители полностью ингибируют [35,38]. Было предположено, что ~ H -активированный гидролиз АТР F1·Fо-комплекс СБЧ феноменологически соответствует синтетазному состоянию замороженной азидом F1·Fо-АТРазы СМЧ. Энергизация мембраны приводит к изменению конформации фермента и освобождению прочносвязанного ADP, де-энергизация – к обратной ассоциации ADP и де-активации фермента. Было показано, что при добавлении к препарату 1 мкМ ADP де-активация фермента происходит быстрее, чем без добавления ADP [38]. Скорость и полнота де-активации гидролиза АТР зависит также от количества вносимых в измерение частиц: чем больше вносили частиц, тем быстрее и полнее проходила деактивация фермента. Пируаткиназа снижает скорость де-активации гидролиза АТР [38]. С другой стороны, оказалось, что для сохранения активности в ходе реакции F1·Fо-ATPазе необходим ADP. Было показано, что если в ходе реакции ADP накапливался в среде, то реакция протекала с постоянной скоростью по нулевому порядку. Если же стационарную концентрацию ADP поддерживали на низком уровне (с помощью АТР-регенерирующей системы: пируваткиназа+фосфоенолпируват), то снова наблюдалось торможение реакции во времени. Компоненты АТР-регенерирующей системы не влияли на активность фермента. Торможение снималось при уменьшении количества добавляемой пируваткиназы [39]. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о противоречивой и неоднозначной роли ADP в гидролизе АТР. С одной стороны, ADP вовлечена в механизм де-активации АТРазы. С другой стороны, снижение концентрации ADP значительно тормозит стационарный гидролиз АТР. Это противоречие побудило нас подробнее изучить роль ADP регуляции F1·Fо-АТРазы P. denitrificans. 17 Цель нашей работы – установить роль ADP в механизме ингибирования гидролитической активности F1·Fо-АТРазы. Нами были поставлены следующие задачи: провести сравнительное исследование кинетики гидролиза АТР и его субстратных аналогов ITP и GTP; получить препарат СБЧ, свободный от ADP; исследовать гидролитическую активность F1·Fо-АТРазы препарата мембран, свободного от ADP. 18 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Получение препарата суббактериальных частиц [32, 40] Рост культуры клеток P. denitrificans Клетки, которые росли в течение трех суток при температуре 33°С на агаре на чашке Петри в присутствии рифампицина, для аэробного роста помещали в 60 мл среды, содержавшей 67 мМ К-фосфатный буфер рН 7,0, 35 мМ сукцинат, 5,5 мМ глутамат, 30 мМ NH4Cl, 0,6 мМ Na2MoO4, 0,3 мМ MgSO4 и раствор следовых элементов (буфер А). Клетки растили при перемешивании (200 rpm в течение 21 часа при температуре 30°С). Для анаэробного роста клетки переносили в 1,175 л среды, содержавшей буфер A с 0,1 М KNO3. Клетки росли при температуре 33°С в течение 17 часов. Когда оптическая плотность суспензии клеток при 660 нм достигала 0,8-1,0, начинали выделение. Выделение суббактериальных частиц. Клетки осаждали из двух литров культуры центрифугированием (6000 rpm, 10 минут), супернатант отбрасывали, осадки смывали буфером 1 (10 мМ трисHСl, 50 мМ NaCl pH 7,3), затем гомогенизировали. Доводили объем суспензии буфером 1 до 800 мл и снова центрифугировали (6500 rpm, 10 минут). Супернатант отбрасывали, осадки суспендирули в нагретом до 30°С буфере 2 (0,5 М сахароза, 10 мМ трис-HСl, 50 мМ NaCl pH 7,3) и гомогенизировали. Полученную суспензию разводили буфером 2 до оптической плотности D550=0,3 (конечный объем составлял порядка 300 мл), затем добавляли АТР (до конечной концентрации 1 мМ), лизоцим (25 мг на 100 мл суспензии) и инкубировали при 30оС до тех пор, пока оптическая плотность D550 не снижалась до 0,03 (10-15 мин). Все дальнейшие процедуры проводились на холоду. Полученные сферопласты осаждали центрифугированием 10 минут при 15000 rpm. Осадок гомогенизировали свободно-притертым тефлоновым гомогенизатором в 25 мл 100 мМ трис-ацетатного буфера, рН 7,3 (буфер 3). Затем добавляли бычий сывороточный альбумин (10 мг/мл) и АТР до конечной концентрации 10 мМ. Полученную суспензию разводили в 12 раз водой при перемешивании, инкубировали на льду в течение 5 минут, затем добавляли малонат до концентрации 0,1 мМ. Суспензия имела высокую вязкость, которая 19 быстро снижалась при добавлении ДНКазы (1 мг/мл ДНКазы на 50 мМ Mgацетатном буфере). Вносили 0,5 мг ДНКазы на 100 мл суспензии и инкубировали 15 минут. Суспензию центрифугировали 10 минут при 15000 rpm. К супернатанту добавляли ацетат Mg до конечной концентрации 5 мМ, инкубировали на льду 10 минут при перемешивании, затем центрифугировали 40 минут при 15000 rpm. В ходе центрифугирования происходило формирование двухслойного осадка. Супернатант отбрасывали. Верхний коричнево-красный слой осадка, который представлял собой СБЧ, собирали и суспендировали в буфере 4 (10 мМ трисацетат, 5 мМ Mg-ацетат и 1 мМ малонат, рН 7,3). Нижний белый слой осадка отбрасывали. Промытые частицы суспендировали в буфере 4 до концентрации белка 20 мг/мл. Полученный препарат СБЧ хранили при -196ºС в жидком азоте. Полученный нами препарат характеризовался высоким дыхательным контролем (порядка 5,0) и NADH-оксидазной активностью, равной 1,6 – 1,9 мкмоль/мин·мг белка. Разобщенное дыхание слабо активировалось аллометицином, что свидетельствует о получении большого процента правильно вывернутых частиц. Аналитические методы Измерения активностей препарата СБЧ проводили в стандартной среде, содержавшей 0,25 М сахарозу, 0,1 М KCl, 2,5 мМ HEPES-KOH (pH 8,0), 5 мМ MgCl2 и 0,1 мМ ЭДТА. Объем проб составлял 2 мл. Измерения проводили с помощью спектрофотометра «Hitachi-557» при 30°С. 1. Измерение ATPазной активности 1.1. Измерение ATPазной активности в присутствии AТP- регенерирующей системы. Скорость гидролиза АТР измеряли в системе сопряженных реакций по изменению поглощения NADH при 340 нм ( = 6220 М-1·см-1). 20 Стандартная среда содержала дополнительно 2,5 мМ сукцинат, 2,0 мМ фосфат (калиевые соли), 1 мМ АТР, 1,5 мМ ФЕП, 0,15 мМ NADH, ЛДГ и ПК (количество ПК и ЛДГ указано в подписях к рисункам). Для ингибирования NADH-оксидазной активности частицы преинкубировали с пьерицидином. СБЧ разводили до концентрации 7,5 мг/мл стандартной средой. К полученной суспензии добавляли пьерицидин в соотношении 2 нмоль на 1 мг белка и инкубировали при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 30 минут. 1.2. Измерение ATPазной активности по H+-иону В ходе реакции гидролиза ATP происходит закисление реакционной среды: При рН 8,0 стехиометрическое соотношение [H+]/[ADP]=1 [41]. За ходом реакции следили по изменению pH среды; поэтому регистрацию проводили в присутствии индикатора фенолового красного, депротонированная форма которого имеет максимум поглощения при 557 нм. Измерения проводили в двуволновом режиме при длинах волн 557 и 618 нм в стандартной среде, содержавшей дополнительно 2,5 мМ сукцинат, 2,0 мМ фосфат (калиевые соли) и 25 мкМ феноловый красный. Реакцию начинали добавлением 1 мМ АТР и 20 мМ малоната. По завершении каждого измерения в реакционную среду вносили стандартный раствор HCl для калибровки оптического ответа фенолового красного при различных условиях измерения. 21 1.3. Измерение ITPазной активности Измерение ITPазной активности проводили также, как и АТРазной, но концентрация ITP была равна 2 мМ, и в некоторых опытах увеличивали концентрацию белка в пробе, что указано в подписях к рисункам. 2. Измерение активности NADH-оксидазы. Измерения проводили в реакционной среде, содержавшей 0,25 мМ сахарозу, 0,1 М KCl, 5 мМ ТРИС (рН 8,0), 5 мМ MgCl2, 0,2 мМ ЭДТА и 150 мкМ NADH по окислению NADH при длине волны 340 нм. К 2 мл среды прибавляли СБЧ и регистрировали контролируемое дыхание (Vк); затем добавляли грамицидин (0,2 мкг/мл) и 15 мкМ ацетат аммония, которые использовали в качестве разобщителя, и регистрировали максимальную NADH-оксидазную активность (Vмакс). По отношению Vмакс к Vк рассчитывали дыхательный контроль, который служит мерой сопряженности частиц. 3. Регистрация мембранного потенциала Регистрацию трансмембранного потенциала проводили в двуволновом режиме при длинах волн 624 и 602 нм в 2 мл стандартной среды, содержавшей дополнительно 1,5 мкМ потенциал-чувствительного индикатора оксонола VI [42]. Прочие компоненты указаны в подписях к рисункам. Изменение оптического ответа оксонола VI зависит от мембранного потенциала нелинейно, поэтому метод позволяет оценить изменения величины мембранного пготенциала только качественно. 4. Обработка суббактериальных частиц P. denitrificans щелочной фосфатазой Суббактериальные частицы разводили до концентрации 6,75 мг/мл стандартной средой, в которой 2,5 мМ HEPES был заменен на 10 мМ ТРИС, дополнительно содержавшей 10 мМ сукцинат. К полученной суспензии СБЧ (240 мкл) при постоянном перемешивании добавляли 10 U/мл щелочной фосфатазы. Через определенные промежутки времени отбирали по 40 мкл суспензии СБЧ, вносили в 2 мл стандартной среды, содержавшей 2 мМ фосфат, 2,5 мМ сукцинат и 25 мкМ феноловый красный. 22 После 100 сек инкубации вносили 1 мМ IТР и 20 мМ малонат и регистрировали кинетику гидролиза СБЧ P. denitrificans, обработанных щелочной фосфатазой, (по изменению рН среды, см. п. 2.2). Через 3 минуты добавляли 2 мкМ FCCP и определяли скорость гидролиза IТР разобщенными мембранами. Контрольные частицы обрабатывали аналогичным образом, но среда не содержала щелочной фосфатазы, и регистрировали кинетику гидролиза ITP в тех же условиях. В опыте использовали щелочную фосфатазу кишечника теленка, «ICN» № 150034. За единицу активности препарата щелочной фосфатазы принимали 1 U активности, указанной в описании к препарату (1 U щелочной фосфатазы гидролизует 1 мкмоль п-нитрофенилфосфата в минуту при 25°С, рН=9,6). 5. Получение препарата мембран P. denitrificans, свободного от ADP Суббактериальные частицы разводили до концентрации 0,2 мг/мл и инкубировали в присутствии щелочной фосфатазы или апиразы в течение 10 – 20 минут. Затем частицы отделяли центрифугированием (1 час, 15000 rpm). Опыт проводили в двух постановках. 1) обработка щелочной фосфатазой. В опыте использовали щелочную фосфатазу кишечника теленка, «Sigma» № P7923. За единицу активности препарата щелочной фосфатазы принимали 1 U активности, указанной в описании к препарату (1 U щелочной фосфатазы гидролизует 1 мкмоль п-нитрофенилфосфата в минуту при 37°С, рН=9,8). Суббактериальные частицы суспендировали в 4 разных средах: 1) в стандартной среде; в стандартной среде, содержавшей дополнительно 2) 25 U/мл щелочной фосфатазы, 3) 50 мМ сукцинат или 4) 25 U/мл щелочной фосфатазы и 50 мМ сукцинат. Частицы инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре и перемешивании. Объем каждой пробы составлял 10 мл. После этого частицы осаждали центрифугированием. Полученные осадки суспендировали в 250 мкл стандартной среды. 2) обработка апиразой. В опыте использовали апиразу из картофеля, «Sigma» № A6535. За единицу активности препарата апиразы принимали 1 U активности, указанной в описании к препарату (1 U апиразы гидролизует 1 мкмоль п-нитрофенилфосфата в минуту при 37°С, рН=4,8). 23 Суббактериальные частицы инкубировали в течение 10 минут в 40 мл стандартной среды, содержавшей 3,3 U/мл апиразы или 3,3 U/мл апиразы и 2 мМ неорганический фосфат. Затем частицы отделяли от апиразы центрифугированием и промывали в 40 мл среды такого же состава, но не содержавшей апиразы, и снова центрифугировали в тех же условиях. Осадки суспендировали в 300 мкл стандартной среды. Если при обработке апиразой среда содержала неорганический фосфат, суспендирование проводили в среде, стандартной то промывание содержавшей 2 и мМ неорганический фосфат. Выход по белку составлял 75%. 6. Опредление концентрации белка Определение концентрации белка проводили с помощью бицинхонинового метода. Реактив А: 1% бицинхониновая кислота (Na соль), 2% Na2CO3·H2O, 0,95% NaHCO3, 0,16% виннокислый Na, 0,4% NaOH, рН 11,25. Перед использованием реактива А каждый раз проверяли рН (доводили концентрированным NaOH либо уксусной кислотой). Реактив В: 4% CuSO4·5H2O (водный раствор). Непосредственно перед измерением готовили рабочий раствор, который содержал 1 часть реактива В и 50 частей реактива А. В пробы вносили белок (20100 мкл) и ДОХ до общего объема 100 мкл. Затем добавляли 2 мл рабочего реактива и инкубировали 30 минут при 37ºС. Реакцию останавливали быстрым охлаждением пробы во льду. Поглощение проб измеряли при 562 нм на приборе «LKB-Ultraspec III». Данный метод позволяет определить 20-100 мгк белка в пробе. Для построения калибровочной прямой в качестве стандартного белка использовали бычий сывороточный альбумин известной концентрации. 24 РЕЗУЛЬТАТЫ В нашей лаборатории было показано, что скорость гидролиза АТР падает во времени, если стационарную концентрацию ADP в реакционной среде поддерживать на уровне 1-2 мкМ [39]. Этот экспериментальный факт объяснили тем, что для того, чтобы гидролиз АТР протекал в одном из активных центров ATPазы, необходимо чтобы в другом активном центре связался ADP. Если эта гипотеза верна, то можно ожидать, что гидролиз аналогов АТР – ITP и GTP – будет протекать с такой же кинетикой. Для проверки этого предположения мы провели сравнительный анализ кинетики ATP и ITP в разных условиях. 1. Сравнительное исследование гидролиза АТР и его субстратных аналогов – ITP и GTP – мембранами P. denitrificans В литературе нет данных о субстратной специфичности АТРазы P. denitrificans, поэтому на первом этапе нашей работы мы охарактеризовали кинетику гидролиза ITP и GTP в сравнении с гидролизом АТР. В верхней части рисунка 4 показана регистрация реакции по изменению рН среды. В среду, содержавшую сукцинат, добавляли СБЧ, инкубировали в течение 100 секунд. Как показано в нижней части рисунка 4, добавление СБЧ приводит к генерации потенциала в результате окисления сукцината сукцинатдегидрогеназой. Затем в среду вносили АТР или ITP и малонат – конкурентный ингибитор сукцинатдегидрогеназы. Видно, что в этих условиях частицы поддерживают мембранный потенциал, хотя величина его снижается. Как видно из верхней части рисунка 4, генерация потенциала в этих условиях поддерживается гидролизом АТР. Кинетика гидролиза ITP и АТР в этих условиях качественно не отличалась, на рис. 4 показано, что скорость гидролиза нуклеотидов не меняется во времени. Гидролиз ITP так же, как и гидролиз АТР, сопровождался генерацией мембранного потенциала. В тех же условиях мы исследовали кинетику гидролиза GTP, которая была такой же, как для гидролиза ITP (данные не приводятся). Как видно из рис. 4, скорость гидролиза ITP ниже, чем скорость гидролиза АТР. Мы определили кинетические параметры реакции для разных нуклеотидов. 25 Максимальные скорости гидролиза и константы Михаэлиса для АТР и его аналогов представлены в таблице 1. Таблица 1. Синтез и гидролиз АТР, ITP и GTP мембранами P. denitrificans Окислительное фосфорилирование Активность, Потенциал-активированный гидролиз КМ по NDP, мкмоль/мин·мг Активность, КМ по NТP, мкмоль/мин·мг мкМ мкМ АТР 0,42 13 0,15-0,22 30-100 ITP 0,21 36 0,08-0,15 300 GTP 0,23 41 0,08 - Измерения проводили, как описано в главе «Методы исследования». Данные по окислительному фосфорилированию были любезно предоставлены Кегяриковой К.А. Из таблицы 1 видно, что скорости гидролиза и константы Михаэлиса для гидролиза АТР и его аналогов – величины одного порядка. Как видно из табл. 1 F1·Fo-АТРаза P. denitrificans, катализирует окислительное фосфорилирование ADP, IDP и GDP с сопоставимыми скоростями и сродством. Следовательно, мембраны P. denitrificans с одинаковой эффективностью используют в качестве субстратов как АТР, так и его аналоги – ITP и GTP. Таким образом, при регистрации реакции по изменению рН среды мы не обнаружили качественных различий между гидролизом АТР и ITP. Существует другой способ регистрации гидролиза нуклеозидтрифосфатов – регистрация по изменению поглощения NADH в присутствии NTP- регенерирующей системы (см. главу «Методы исследования»). Преимущество этого метода состоит в том, что при протекании реакции гидролиза АТР концентрация ADP в реакционной среде остается постоянной, и может быть изменена заданным образом, в результате изменения соотношения активностей F1·Fo-АТРазы и пируваткиназы. В верхней части рис. 5 показана кинетика гидролиза АТР и ITP, которую регистрировали в присутствии (фосфоенолпируват+пируваткиназа). Ранее NTP-регенерирующей было показано [39], системы что при уменьшении стационарной концентрации ADP в среде в результате увеличения 26 количества вносимой в пробу пируваткиназы наблюдается торможение гидролиза АТР. Результаты аналогичных экспериментов приведены в левой части рисунка 5. Видно, что, если в пробу вносили 10 U пируваткиназы, то реакция протекала с постоянной скоростью. Однако увеличение пируваткиназы до 160 U вызывало торможение реакции во времени (с 0,17 до 0,06 мкмоль/мин·мг белка). Мы исследовали, как зависит кинетика гидролиза ITP от количества внесенной в пробу пируваткиназы. Мы ожидали увидеть такое же снижение скорости реакции во времени при гидролизе ITP. Однако как показано в правой части рисунка 5, гидролиз ITP протекал по нулевому порядку как в присутствии 10 U ПК, так и при десятикратном увеличении количества пируваткиназы. В нижней части рис. 5 показана генерация мембранного потенциала в тех же условиях. Как показано на рис. 5, гидролиз обоих нуклеозидтрифосфатов сопровождался генерацией мембранного потенциала и в этих условиях. Однако мы обнаружили значительное снижение АТР-зависимого мембранного потенциала во времени при увеличении количества вносимой в пробу пируваткиназы. ITPзависимый мембранный потенциал значительно снижался даже в присутствии небольшой пируваткиназы в пробе. Таким образом, мы показали, что снижение стационарной концентрации IDP не приводит к торможению гидролиза ITP, что противоречило нашей гипотезе. В этом эксперименте был также установлен удивительный факт, что гидролиз ITP протекает с постоянной скоростью, несмотря на то, что потенциал на мембране был значительно снижен. Ранее было показано, что разобщение мембран P. denitrificans приводит к де-активации его АТРазы [35]. Известно также, что и удаление фосфата из реакционной среды также приводит к глубокому торможению АТРазной активности СБЧ [37]. Мы провели сравнительное исследование влияния разобщителя и неорганического фосфата на гидролиз АТР и ITP. На рисунке 6 представлены результаты экспериментов по исследованию влияния разобщителя на гидролиз АТР и ITP мембранами P. denitrificans. В верхней части рисунка представлена регистрация реакции по протону, в нижней – по изменению поглощения NADH в NTP-регенерирующей системе. При регистрации реакции по протону мы видим, что добавление разобщителя вызывает торможение гидролиза как АТР, так и ITP, что согласуется с нашим предыдущими результатами [33]. Эффект разобщителя на гидролиз АТР не 27 зависел от метода измерения реакции. При регистрации реакции в NTPрегенерирующей системе при внесении разобщителя мы наблюдали быстрое торможение гидролиза АТР. Однако разобщитель не только не тормозил, но даже слабо активировал гидролиз ITP. Концентрация разобщителя была подобрана таким образом, чтобы полностью рассеять мембранный потенциал. Таким образом, мы экспериментально подтвердили, что полностью разобщенные СБЧ катализируют гидролиз ITP. На рис. 7 показано влияние неорганического фосфата на гидролиз АТР и ITP. В верхней части рисунка 7 представлена регистрация реакции гидролиза АТР или ITP по протону, в нижней – по изменению поглощения NADH в NTPрегенерирующей системе. Как было показано на рис. 7, удаление неорганического фосфата из среды измерения приводит к значительному торможению гидролиза АТР, что согласуется с нашим предыдущими результатами [37]. К такому же результату приводит удаление неорганического фосфата из реакционной среды при гидролизе ITP. Видно, что при регистрации реакции по протону в среде, не содержавшей неорганический фосфат, скорость гидролиза как АТР, так и ITP значительно снижается (верхняя часть рисунка 7). Как показано в левой нижней части рисунка 7, при регистрации реакции по поглощению NADH в присутствии NTP-регенерирующей системы мы также наблюдаем торможение гидролиза АТР в среде, не содержавшей фосфат. Начальная скорость гидролиза АТР в среде, не содержавшей неорганический фосфат, совпадает по величине со скоростью гидролиза нуклеотида в среде с фосфатом. Однако в ходе реакции происходит быстрое и значительное торможение гидролиза АТР (с 0,14 до 0,06 мкмоль/мин·мг белка). В правой нижней части рисунка 7, показано, что при регистрации реакции в присутствии NTP-регенерирующей системы гидролиз ITP протекает с постоянной скоростью в среде, не содержавшей неорганический фосфат. Торможение гидролиза ITP во времени мы не наблюдали. Следовательно, неорганический фосфат не влияет на кинетику гидролиза ITP. Мы проанализировали, чем отличаются условия, в которых протекает реакция при регистрации по протону и в присутствии NTP-регенерирующей системы. Нужно отметить, что в случае регистрации реакции по изменению рН среды при гидролизе АТР происходит накопление ADP в среде измерения. Нельзя забывать о том, что используемый нами в работе препарат АТР содержит в 28 качестве примеси ~0,5% ADP, а, следовательно, вместе с 1 мМ АТР мы вносим в среду ~5 мкМ ADP. Известно, что ADP вовлечен в регуляцию гидролитической активности фермента, так называемое ADP·Mg-торможение АТРазы (см. раздел «Обзор литературы»). Было показано, что потенциал-зависимая активация-деактивация фермента связана с потенциал-зависимой ассоциацией-диссоциацией ADP [38]. Показано также, что фосфат снижает сродство фермента к ингибирующему ADP [20]. На препаратах митохондриальных мембран было показано [19], что эффект ADP специфичен по нуклеотиду и не воспроизводится IDP или GDP. Следовательно, можно было ожидать, что внесение разобщителя или удаление фосфата не повлияют на гидролиз ITP P. denitrificans. Однако как мы показали (рис. 6 и 7), при регистрации реакции по изменению рН кинетика гидролиза ITP также характеризуется торможением реакции при разобщении или в среде без фосфата. Известно, что практически все препараты АТРазы, полученные из разных источников содержат прочносвязанные нуклеотиды [43, 44], которые, как было показано, могут диссоциировать под действием потенциала [29]. Эти факты позволили нам предположить, что ADP, в концентрации достаточной для торможения активности фермента, мог быть внесен в среду измерения вместе с препаратом частиц. Связывание этого ADP в среде без фосфата или с разобщителем могло вызвать торможение ITPазной активности. С другой стороны, мы обнаружили, что кинетика гидролиза ITP СБЧ P. denitrificans зависела от условий регистрации. При регистрации в присутствии IТРрегенерирующей системы, ни в среде без фосфата, ни после добавления разобщителя мы не наблюдали торможение гидролиза IТР, хотя торможение IТРазной реакции наблюдалось в аналогичных экспериментах при регистрации по протону (рис. 6 и 7). Мы предположили, что при гидролизе IТР в присутствии ФЕПа и пируваткиназы концентрация АDР, вносимого вместе с ферментом, значительно снижается. При измерении реакции по протону этого не происходит, привнесенный с ферментом и освобожденный под действием потенциала АDР вновь связывается с ферментом после рассеивания потенциала или удаления фосфата. 29 2. Получение препарата суббактериальных частиц, свободных от ADP, и исследование его свойств. Мы предположили, что если освободить фермент от ADP, то мы получим препарат частиц, АТРазная активность которого не будет зависеть от энергизации мембраны и присутствия фосфата. Мы предполагали исследовать гидролазную активность такого препарата в присутствии ITP, чтобы избежать появления ингибирующего ADP в среде измерения активности. Мы также ожидали, что кинетика гидролиза ITP таким свободным от ADP препаратом СБЧ не будет зависеть от способа регистрации. С этой целью мы решили получить препарат фермента, свободный от ADP. Существует несколько возможных подходов для освобождения АТРазы от прочно связанных нуклеотидов: 1) Гель-фильтрация [45] 2) Диализ 3) обработка препарата ферментом, расщепляющим ADP [46]. Мы посчитали, что концентрация прочно связанных с ферментом нуклеотидов чрезвычайно мала, поэтому первые два способа могли оказаться неэффективными. Мы предпочли обработку нашего препарата ферментом, необратимо расщепляющим ADP. В природе существует не так много ферментов, которые могут справиться с этой задачей. В наших экспериментах для обработки СБЧ P. denitrificans мы использовали щелочную фосфатазу и апиразу. Мы исследовали влияние апиразы и щелочной фосфатазы на гидролиз различных нуклеотидов в тех же условиях, в которых мы измеряем гидролитическую активность частиц. Данные представлены в таблице 2. Мы видим, что щелочная фосфатаза и апираза гидролизуют все исследованные нуклеотиды с сопоставимыми скоростями. Однако в наших условиях апираза была на порядок более активна по сравнению со щелочной фосфатазой. Мы определили, что в присутствии неорганического фосфата скорость гидролиза NTP щелочной фосфатазой падает в 2,5 раза. Апираза была практически не чувствительна к фосфату. 30 Таблица 2. Гидролиз некоторых нуклеотидов апиразой и щелочной фосфатазой. Vmax, мкмоль/мин мг белка Щелочная фосфатаза Апираза АТР 2,4 20,6 ADP 3,8 16,5 ITP 2,0 - IDP 2,0 - Регистрацию реакции проводили в стандартной реакционной среде, не содержавшей сукцината и неорганического фосфата, по изменению рН среды (см. главу «Методы исследования»). Концентрация нуклеотидов составляла 1 мМ. В пробу вносили 21 мкг щелочной фосфатазы или 8 мкг апиразы. Мы также измерили константу Михаэлиса по ADP для щелочной фосфатазы. Она составила 80 мкМ. Мы предполагаем, что активация гидролиза нуклеотидов связана с тем, что при энергизации сродство активных центров к ADP сильно снижается, и ADP диссоциирует из активных центров. Следовательно, после энергизации СБЧ ADP становится доступна для щелочной форсфатазы или апиразы. Наша гипотеза проиллюстрирована на рисунке 8. 31 Рисунок 8. Схема, иллюстрирующая гипотезу о влиянии потенциала на сродство фермента к ADP. Розовым квадратом на рисунке обозначен неактивный фермент, содержащий прочносвязанный ADP (мембрана де-энергизована); желтым кружочком показан активный фермент, освободивший ADP (мембрана энергизована); розовым кружочком показан активный фермент, не содержащий ADP (мембрана де-энергизована). D обозначает ADP, D с крестом – удаление ADP, под действием щелочной фосфатазы или апиразы. Нами была проведена обработка СБЧ P. denitrificans щелочной фосфатазой в присутствии сукцината с целью получить препарат фермента, свободный от ADP. СБЧ инкубировали в небольшом объеме в присутствии сукцината при перемешивании для постоянной аэрации суспензии, а, следовательно, в условиях, необходимых для поддержания потенциала на мембране частиц. К таким СБЧ добавляли щелочную фосфатазу, через разное время отбирали аликвоты и регистрировали кинетику гидролиза ITP. Контрольные частицы также инкубировали в аэрируемой суспензии в присутствии сукцината, но щелочную фосфатазу не добавляли. 32 Мы исследовали влияние фосфата и разобщителя на кинетику гидролиза ITP частицами, обработанными щелочной фосфатазой. Регистрацию гидролиза ITP проводили по протону. Мы пытались изучить влияние фосфата на кинетику гидролиза ITP частицами, обработанными щелочной фосфатазой. Однако данные опыты осложнялись тем, что при регистрации реакции в среде без фосфата активность привнесенной щелочной фосфатазы была слишком велика, и сравнима со скоростью гидролиза нуклеотидов частицами. Мы отказались от такой постановки и решили исследовать влияние разобщителя на кинетику гидролиза ITP препаратом СБЧ, свободным от ADP. Такие измерения проводили в среде с фосфатом. Как показано на рис. 9, обработка суббактериальных частиц щелочной фосфатазой привела к следующим изменениям в кинетике гидролиза ITP: 1) длительная инкубация со щелочной фосфатазой лишь частично предотвращала торможение гидролиза ITP в присутствии разобщителя; 2) мы также наблюдали снижение скорости потенциал-активированного гидролиза ITP сопряженными частицами в этих условиях. Однако, как видно на рисунке 9, скорости гидролиза IТР до и после добавления разобщителя почти сравнялись. Мы предположили, что снижение ITPазной активности сопряженных частиц обусловлено повреждением АТРазы в результате активности примесных ферментов (например, протеаз), которые могут содержаться в препарате щелочной фосфатазы. Мы воспроизвели эксперимент, представленный на рис. 9, в присутствии щелочной фосфатазы, добавленной в увеличивающихся количествах (5, 20 и 50 U/мл), и получили одинаковые результаты (данные не приводятся). Следовательно, предположение о примесях не подтвердилось. Ранее было показано, что скорость деактивация фермента после деэнергизации суббактериальных частиц зависит от концентрации ADP [38]. Добавление ADP заметно (в 6 раз) увеличивало, а удаление нуклеотида в пируваткиназной реакции на порядок замедляло скорость деактивации АТРазы. Щелочная фосфатаза также удаляет ADP из среды, и мы решили сравнить влияние пируваткиназы и щелочной фосфатазы на скорость деактивации фермента после де-энергизации мембран. В предварительном эксперименте мы подобрали активность вносимых щелочной фосфатазы и пируваткиназы так, 33 чтобы оба фермента удаляли АDP из среды с одинаковой скоростью (рисунок 10, пунктирные кривые). Как показано на рис. 10, частицы, которые были предварительно энергизованы в присутствии сукцината, после добавления малоната (нулевой момент на графике) теряют свою активность в течение 1 минуты на 50-60%. Видно, что инкубация частиц в присутствии пируваткиназы (+ФЕП) сильно замедляла скорость деактивации АТРазы. Как видно на рисунке 10, кратковременная инкубация частиц со щелочной фосфатазой также предотвращает деактивацию АТРазы после де-энергизации. Однако более длительная инкубация со щелочной фосфатазой приводит к полной потере АТРазной активности. Мы показали, что при одинаковой скорости уборки ADP из среды происходит полная инактивация гидролиза АТР уже после двухминутной обработки щелочной фосфатазой. Однако все используемые нами ранее постановки для исследования влияния удаления ADP имели один существенный недостаток. Фоновая активность щелочной фосфатазы оставалась высокой и иногда была сравнима с АТРазной и ITРазной активностями F1·Fo-ATPазы P. denitrificans. Можно было бы использовать ингибитор щелочной фосфатазы, однако в литературе нет данных о существовании специфического ингибитора для этого фермента. Поэтому далее нами была поставлена задача, с одной стороны, подвергнуть СБЧ обработке щелочной фосфатазой до полного удаления нуклеотидов, а с другой стороны, избавиться от фоновой фосфатазной активности. Для достижения этих целей был разработан метод получения препарата, свободного от ADP, включающий обработку СБЧ щелочной фосфатазой, и последующее отделение СБЧ при помощи центрифугирования (см. главу «Методы исследования»). Мы инкубировли частицы в стандартной среде в разных условиях: 1) без дополнительных добавок (контрольный препарат), 2) в присутствии сукцината, 3) в присутствии щелочной фосфатазы 4) в присутствии сукцината и щелочной фосфатазы. 34 Для этих экспериментов мы использовали суббактериальные частицы с дыхательным контролем, равным примерно 3,0. Полученные в результате такой обработки препараты сравнивали по различным критериям: 1) дыхательный контроль; 2) сукцинат-поддерживаемая генерация потенциала; 3) скорость гидролиза АТР и IТР не-энергизованными частицами (стандартная среда дополнительно содержала 1 мМ АТР или 1 мМ IТР, реакцию начинали частицами). 4) скорость гидролиза АТР и IТР энергизованными частицами (частицы инкубировали 100 сек в присутствии сукцината, реакцию начинали одновременным добавлением нуклеотида и малоната); 5) скорость гидролиза АТР и IТР разобщенными частицами (частицы инкубировали 100 сек в присутствии сукцината, реакцию начинали одновременным добавлением нуклеотида и малоната, затем через 3 мин вносили 5 мМ FCCP). Дыхательный контроль является характеристикой того, как повлияла описанная выше обработка на интактность мембран суббактериальных частиц. Все измерения гидролазных активностей проводили по изменению рН среды в присутствии фенолового красного. Исследование гидролиза проводили с ITP с целью разделить собственно реакцию гидролиза и ADP-зависимую регуляцию фермента. ADP, образующийся в ходе гидролиза АТР, мог вызывать торможение реакции и повлиять на полученные результаты. Мы ожидали, что скорости гидролиза ITP не-энергизованными и разобщенными частицами вырастут и сравняются по величине со скоростями гидролиза, катализируемого сопряженными частицами. Ожидалось, что обработка не повлияет на кинетику гидролиза АТР. Как показано в таблице 3, после инкубации СБЧ в присутствии сукцината или сукцината и щелочной фосфатазы дыхательный контроль препаратов сильно упал по сравнению с дыхательным контролем препаратов, обработанных в отсутствие сукцината (таблица 3). Из таблицы видно, что обработка щелочной фосфатазой не повлияла на сопряженность препарата. 35 Таблица 3. Влияние щелочной фосфатазы на дыхательный контроль СБЧ P. denitrificans в разных условиях. Контрольный препарат Сукцинат Щелочная фосфатаза Сукцинат+щелочная фосфатаза 2,4 1,3 2,5 1,1 Дыхательный контроль СБЧ инкубировали с щелочной фосфатазой, затем частицы отделяли центрифугированием и измеряли дыхательный контроль (см. главу «Методы исследования»). Концентрация белка в пробах составляла 25 – 35 мкг/мл. Мы исследовали способность полученных препаратов генерировать мембранный потенциал. Как видно на рисунке 11, препараты суббактериальных частиц, полученные после инкубации в присутствии сукцината, не генерируют потенциал. Частицы, обработанные только щелочной фосфатазой, способны генерировать потенциал, который, однако, достигает максимального значения гораздо медленнее, чем потенциал, генерируемый, контрольным препаратом. Мы предполагали, что после удаления ADP из препаратов СБЧ предварительная энергизация частиц для проявления АТРазной активности не потребуется. Мы сравнили потенциал-активированный и потенциал- неактивированный гидролиз АТР полученными препаратами. Как показано на рис. 12, исходная АТРазная активность контрольного препарата была примерно в 3 раза ниже потенциал-активированной АТРазной активности (рис. 12 А). Инкубация с сукцинатом не повлияла на неактивированный потенциалом гидролиз АТР. В присутствии сукцината и щелочной фосфатазы были получены аналогичные результаты. К тому же, скорость потенциалактивированного гидролиза АТР в обоих случаях тоже заметно упала. Как показано на рис. 12 А, СБЧ, обработанные щелочной фосфатазой в среде без сукцината, не требовали предварительной энергизации мембраны для проявления высокой АТРазной активности. Обработка щелочной фосфатазой практически не повлияла на скорость потенциал-активированного гидролиза и заметно увеличила скорость гидролиза АТР неэнергизованными частицами. Как показано на рис. рис. 12 Б, высокая АТРазная активность контрольного препарата снижалась в 5-6 раз после добавления разобщителя, т.е. разобщения вызывало быстрое и глубокое торможение гидролиза АТР. АТРазная активность препаратов, полученных после инкубации в присутствии сукцината, была низкой как до, так и после разобщения мембран. В препарате, обработанном одной 36 щелочной фосфатазой, АТРазная активность в присутствии разобщителя была выше, чем в контроле. Мы исследовали гидролиз ITP в тех же условиях и показали, что обработка СБЧ щелочной фосфатазой привела к аналогичным изменениям и в кинетике гидролиза ITP (рис. 13). Как показано на рис. 13 Б, если при инкубации в пробах присутствовал сукцинат, то это приводило к снижению скорости потенциал-активированного гидролиза IТР. Скорость гидролиза IТР не энергизованными частицами (рис. 13, А) или разобщенными частицами (рис. 13, Б) увеличивалась после обработки только щелочной фосфатазой. Таким образом, результаты экспериментов, представленных на рис. 12 и 13, позволяют сделать следующие заключения: 1) инкубация частиц в присутствии сукцината приводит к значительному разобщению их мембран и значительному снижению АТРазной и ITPазной активностей СБЧ. 2) инкубация частиц в присутствии только щелочной фосфатазы практически не влияет на потенциал-активированный гидролиз АТР и ITP, но заметно увеличивает скорость гидролиза нуклеозидтрифосфатов не энергизованными мембранами и, в меньшей степени, увеличивает скорость разобщенного гидролиза. 3) эффекты сукцината и щелочной фосфатазы в одинаковой степени проявляются как при гидролизе ITP, так и при гидролизе АТР. Нас удивил тот факт, что ожидаемые эффекты щелочной фосфатазы были получены для препарата, который инкубировали в среде без сукцината. Следовательно, освобождение препарата от ADP можно проводить в неэнергизованных условиях. Исходя из полученных данных, мы в дальнейшем отказались от обработки частиц ферментами, разрушающими ADP, в присутствии сукцината, что, как было показано, приводило к практически полному разобщению частиц. Неожиданным явилось также то, что мы не наблюдали качественных различий при гидролизе АТР и ITP частицами, обработанными щелочной фосфатазой. Как было показано на рис. 11, препарат, обработанный одной щелочной фосфатазой, хуже генерировал потенциал, чем контрольный препарат частиц. Мы 37 решили подробнее исследовать, как влияет удаление ADP на сопряженность частиц. Нужно отметить, что гидролиз нуклеотидов, катализируемый удаляющим ADP ферментом, который мы вносим с препаратом частиц, не мешает измерениям мембранного потенциала. В наших дальнейших исследованиях в качестве фермента, удаляющего ADP, мы использовали апиразу, которая была более активна в наших условиях. Мы планировали изучать влияние удаления ADP на мембранный потенциал, генерируемый в результате гидролиза АТР. Однако мы обнаружили, что обработка апиразой влияет даже на генерацию потенциала в присутствии сукцината. Как видно на рисунке 14, в присутствии сукцината частицы генерируют высокий мембранный потенциал, который незначительно снижается во времени. При обработке СБЧ апиразой происходит быстрое падение мембранного потенциала. В кинетике рассеивания потенциала хорошо видно 2 фазы: быстрая фаза, продолжительностью около 100 секунд (в присутствии 0,25 U/мл апиразы), и медленная фаза, 10-12 минут до полного падение потенциала. Если вместо апиразы вносили щелочную фосфатазу в количестве, равном активности апиразы, то получали аналогичные результаты (рис. 10). Мы также исследовали, как влияет на мембранный потенциал удаление ADP в присутствии пируваткиназы + ФЕП. Генерация мембранного потенциала в этих условиях не отличалась от таковой в контроле (рис. 14). Можно предположить, что это вызываемое апиразой разобщение вызвано удалением нуклеотидов, связанных с F1·Fo-АТРазой. Мы исследовали влияние субстратов и ингибиторов F1·Fo-АТРазы на поведение мембранного потенциала СБЧ в присутствии апиразы. Как показано на рис. 15, неорганический фосфат и вентурицидин способны предотвращать падение мембранного потенциала. Защитный эффект ADP снимался во времени, что связано, по-видимому, со снижением концентрации нуклеотида в присутствии апиразы. В отдельных экспериментах было показано, что чем больше была концентрация ADP в среде, тем позже наступало падение мембранного потенциала. Как показано на рис. 16, падение мембранного потенциала полностью обращается вентурицидином. Сопрягающий эффект вентурицидина не зависел от того, насколько глубоко прошло падение 38 потенциала. Вентурицидин восстанавливал потенциал, как во время первой быстрой фазы, так и во время второй, медленной, фазы. Мы обнаружили, что ADP и неорганический фосфат также обращают падение мембранного потенциала (рис. 16 и 17). Однако полное обращение наблюдали только в течение быстрой фазы падения мембранного потенциала. В течение медленной фазы мы можем добиться лишь частичного обращения рассеивания мембранного потенциала Было интересно оценить концентрационную зависимость эффектов субстратов реакции, но концентрация ADP быстро снижается в присутствии апиразы. Поэтому мы исследовали влияние фосфата. Как показано на рисунке 17, фосфат способен полностью предотвратить вызванное апиразой падение мембранного потенциала в концентрациях 0,5-2 мМ и частично – в концентрациях порядка 20 мкМ. Если в опытах по влиянию удаления ADP на генерацию мембранного потенциала вместо апиразы использовали щелочную фосфатазу, то ADP, фосфат и вентурицидин также эффективно предотвращали и обращали разобщение (данные не приведены). Учитывая тот факт, что инкубация СБЧ только со щелочной фосфатазой ухудшает генерацию потенциала (см. рис. 11), мы исследовали, нужна ли энергизация частиц для эффекта апиразы. Как показно на рисунке 18, суббактериальные частицы инкубировали в среде, не содержавшей сукцинат, но содержавшей апиразу. Через указанные на рисунке промежутки времени к частицам добавляли сукцинат и регистрировали генерацию мембранного потенциала. Если частицы инкубировали в среде без апиразы, то через 4-5 минут величина мембранного потенциала была такая же, как в контроле. Потенциал, генерируемый частицами, которые инкубировали с апиразой, был заметно ниже. Через 10 минут такие частицы практически не генерировали мембранный потенциал. Таким образом, мы видим, что инкубация частиц в присутствии одной апиразы, приводит к значительному разобщению частиц. Следовательно, возможно удалить адениловые нуклеотиды из неэнергизованных СБЧ. Таким образом, мы заключили, что освобождение частиц от нуклеотидов можно проводить в среде без сукцината. Мы предположили, что введение в среду фосфата поможет нам избежать разобщения частиц, из которых был удален ADP (см. рис 15). 39 Мы инкубировали частицы в присутствии апиразы в среде, не содержавшей сукцинат. Параллельно мы поставили эксперимент в тех же условиях, но среда дополнительно содержала неорганический фосфат. Мы получили два препарата частиц, один из которых был обработан апиразой в присутствии неорганического фосфата. В качестве контрольного препарата использовали исходный препарат СБЧ, который не подвергали никакой обработке. Дыхательный контроль исходного препарата был равен 5,3. При обработке апиразой величина дыхательного контроля обоих препаратов упал до значений 1,8-1,9. (таблица 4). Таблица 4. Влияние апиразы на дыхательный контроль СБЧ P. denitrificans Исходный препарат 5,3 Дыхательный контроль Апираза (+ фосфат) 1,9 Апираза (– фосфат) 1,8 СБЧ инкубировали с апиразой в среде, содержавшей и ли не содержавшей 2 мМ фосфат, затем частицы отделяли центрифугированием и определяли дыхательный контроль (см. главу «Методы исследования»). Концентрация белка в пробах составляла 25 – 35 мкг/мл. Исходный препарат не подвергали обработке и переосаждению. Как видно из таблицы 4, вопреки нашим ожиданиям, неорганический фосфат не смог защитить препарат суббактериальных частиц от разобщения и дыхательный контроль все равно сильно упал. Мы исследовали сукцинат-зависимую генерацию потенциала препаратами, полученными в результате переосаждения, и исходным препаратом частиц. На рис. 19 видно, что величина потенциала генерируемая препаратами, обработанными апиразой, значительно ниже, чем в исходном препарате частиц. Фосфат незначительно защитил частицы от разобщения в присутствии апиразы. Мы исследовали АТРазную активность суббактериальных частиц во всех трех препаратах частиц. Как показано на рис. 20 А, скорость гидролиза АТР предварительно энергизованными частицами снизилась после обработки апиразой по сравнению с исходным препаратом Гидролиз АТР не-энергизованными частицами после обработки апиразой был существенно 40 выше, чем скорость реакции, катализируемая исходным препаратом СБЧ (рис. 20 А). Скорость гидролиза АТР в присутствии разобщителя была существенно выше в частицах, обработанных апиразой, по сравнению со скоростью реакции в исходном препарате (рис. 20 Б). Таким образом, удаление нуклеотидов, во-первых, приводит к некоторому снижению скорости потенциал- активированного гидролиза АТР и ITP (рис. 20 и 21), во-вторых, мембранам (т.е. активирует собственную увеличивает скорость не гидролитическую активированного активность потенциалом гидролиза) (рис. 20 А и 21 А), наконец, увеличивает скорость гидролиза разобщенными частицами (в присутствии разобщителя) (рис. 20 Б и 21 Б). При сравнении данных, представленных на рис. 12 и 13, и на рис. 20 и 21, видно, что результаты, полученные после обработки частиц щелочной фосфатазой или апиразой, не противоречат друг другу. Мы получили препарат СБЧ, обладающий необычным свойством: АТРаза этого препарата утрачивает чувствительность к ADP. Поэтому мы решили проверить, сохранил ли фермент чувствительность к специфическим ингибиторам. Мы исследовали влияние вентурицидина на гидролиз АТР и ITP полученными препаратами. Как показано на рис. 22, оказалось, что препарат суббактериальных частиц, свободный от ADР, практически нечувствителен к вентурицидину. 41 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. В нашей лаборатории было показано, что активность АТРазы Р. denitrificans контролируется мембранным потенциалом: энергизация мембран активирует фермент, после де-энергизации он теряется активность. ADP не влияет на процесс активации фермента, но, наряду с неорганическим фосфатом, вовлечен в механизм де-активации фермента после де-энергизации [38]. Под действием потенциала происходит диссоциация ADP, свободный фермент проявляет высокую активность: Как только потенциал рассеивается, происходит обратное связывание ADP с ферментом, и комплекс E•D не обладает гидролазной активностью. Однако также было показано, что если стационарную концентрацию ADP в ходе гидролиза АТР поддерживать на низком уровне (1-2 мкМ), то наблюдается торможение реакции во времени [39]. Таким образом, с одной стороны, согласно нашим данным и данным других групп, ADP выступает как ингибитор фермента, с другой стороны, мы предполагаем, что связывание ADP в одном из активных центров фермента необходимо для протекания гидролиза во втором активном центре. Если это предположение верно, то при гидролизе других нуклеотидов – субстратных аналогов АТР – можно было ожидать аналогичную кинетику реакции в присутствии АТР-регенерирующей системы, т.е. торможение реакции во времени при увеличении пируваткиназы. Применение субстратных аналогов АТР позволил нам также разделить собственно процесс гидролиза и эффект ADP. Мы показали, что в условиях, когда гидролиз тринуклеотида сопровождается накоплением динуклеотида (по закислению среды) и когда стационарная концентрация динуклеотида в среде достаточно велика (~ 10-20 мкМ) (в присутствии небольшой пируваткиназы), для АТР и его аналогов кинетика реакции качественно не отличается. Однако если поддерживать стационарную концентрацию динуклеотида на низком уровне (в присутствии высокой пируваткиназы), то различия в кинетике гидролиза АТР и ITP становятся хорошо видны. Мы показали, что ни увеличение количества вносимой пируваткиназы (см. рис. 5), ни уменьшение количества частиц в пробе (данные не приведены) не 42 вызывает торможение гидролиза ITP, хотя оба приема приводят к снижению стационарной концентрации IDP. Следовательно, результаты этих экспериментов опровергают сделанное нами ранее предположение [39]. Как показано на рис. 5, торможение АТРазной активности в присутствии высокой пируваткиназы сопровождается падением поддерживаемого гидролизом АТР мембранного потенциала, причем, чем больше внесено пируваткиназы, тем быстрее и глубже происходит де-энергизация. Мы предполагали, что рассеяние потенциала есть следствие торможения АТРазной. Однако можно предположить и обратное. Инкубация фермента в этих условиях сначала приводит к разобщению мембраны, а как следствие к инигибированию АТРазы. При гидролизе ITP в тех же условиях, мы видим разобщение частиц (левая часть рис. 5), но не видим торможения реакции. Де-энергизация частиц, а также удаление фосфата приводит к увеличению сродства фермента к «ингибирующему» ADP [37, 38]. Как показано на рис. 6 и 7 (левые части), оба воздействия приводят к ингибированию АТРазной активности при любом способе измерения активности. ITPазная падает при разобщении или удалении фосфата только при регистрации реакции по протону. В присутствии ITP-регенерирующей системы АТРазы Р. denitrificans гидролизует субстрат как разобщенными мембранами, так и в среде без фосфата. При гидролизе АТР ADP появляется в ходе реакции, а также привносится с препаратом СБЧ. Когда скорость гидролиза АТР измеряли в присутствии ПК+ФЕП, то даже при самой высокой из использованных активностей ПК концентрация ADP не падает ниже 2 – 4 мкМ [39]. Следовательно, нельзя исключить роль ADP в инактивации фермента в присутствии АТР-регенерирующей системы. При гидролизе ITP ADP может быть привнесено с препаратом СБЧ. В препарате СБЧ Р. denitrificans содержится 0,6-0,9 нмоль нуклеотидов/мг белка [43]. Следовательно, в среде измерения можно ожидать ~ 0,1 мкM ADP. Возможно, такой концентрации ингибитора достаточно для инактивации фермента после де-энергизации мембран разобщителем или в среде без фосфата. С другой стороны, можно предположить, что в присутствии ФЕПа и пируваткиназы концентрация примесного ADP снижается до величин, значительно ниже Кi. Таким образом, мы заключили, что главную роль в торможении гидролиза ATP играет именно ADP. Мы предположили, что если освободить СБЧ от прочносвязанного ADP, обработав его щелочной фосфатазой или апиразой, то 43 можно будет получить препарат АТРазы, активность которого не будет зависеть от потенциала. Мы также предполагали, изучить кинетику взаимодействия такого препарата фермента с ADP. Мы считали, что под действием мембранного потенциала сродство к ADP ухудшается и существующее в нашей системе равновесие: E*•D ↔ Е + D (где E*•D прочный комплекс фермента с ADР, Е - свободный фермент) сдвигается в сторону свободных форм, и ADP становиться доступен для ферментов, разрушающих нуклеотиды. Уже в предварительных экспериментах мы показали, что хотя обработка фермента щелочной фосфатазой действительно увеличивала скорость разобщенного гидролиза (рис. 9) и защищала фермент от де-активации после деэнергизации (рис. 10), удаление ADP приводило к заметному снижению скорость потенциал-активированного гидролиза (рис. 9) или даже к полной инактивации фермента на более длительных временах инкубации со щелочной фосфатазой (рис. 10). В этих экспериментах в пробы для измерения активности фермента с аликвотой частиц попадала щелочная фосфатаза, что затрудняло расчет скоростей гидролиза из-за высокой активности разрушающего нуклеотиды фермента. Мы изменили постановку эксперимента: СБЧ после инкубации щелочной фосфатазой отделяли центрифугированием. В этих экспериментах мы обнаружили, что длительная инкубация частиц под потенциалом (в нашем случае в присутствии сукцината) приводит к их разобщению и потере гидролитической активности (рис. 11, 12 и 13). Давно известно, что при генерации мембранного потенциала происходит саморазобщение частиц – потенциал медленно падает во времени. Недавно были получены данные, объясняющие это явление. Было показано, что в потенциалзависимом саморазобщении важную роль играет белок UCP3 и переносчик адениловых нуклеотидов [47]. Они активируются под потенциалом, возможно, под действием жирных кислот или других молекул, накапливающихся в митохондриях в течение 5-минутной инкубации под потенциалом. Из-за нарушений, вызванных разобщением частиц под действием мембранного потенциала, мы не можем заключить, влияет ли потенциал на диссоциацию комплекса E•D. 44 Мы также обнаружили важный факт, что обработка щелочной фосфатазой неэнергизованного препарата (в среде без сукцината) оказывает заметный и ожидаемый эффект на свойства АТРазы. Полученный препарат имел сравнимые гидролитические активности до и после энергизации мембран, а также увеличенную активность в присутствии разобщителя (рис. 12 и 13). Таким образом, активный фермент был получен нами при обработке апиразой или щелочной фосфатазой в среде без сукцината. Однако нужно отметить, что эти препараты тоже были частично разобщены (рис. 11 и 19). Мы попытались установить причину разобщения мембран Р. denitrificans, возникающую в результате удаления ADP. Оказалось, что не только ADP, но и второй субстрат АТРазы, неорганический фосфат, а также ингибитор бактериальной АТРазы – вентурицидин, способны предотвращать и обращать индуцированное удалением ADP разобщение. (рис. 15, 16, 17). На основании этих данных, можно заключить, что причиной разобщения является нарушение в структуре АТРазы. Индуцированное ADP разобщение протекает в две фазы (рис. 14). Мы показали, что субстраты реакции способны обращать разобщение достаточно эффективно во время первой фазы, и лишь частично во время второй фазы. Разобщение было чувствительно к венутирицидину на всех этапах разобщения. Можно предположить, что при удалении ADP нарушается структуре АТРазы, так что проводимость протонного канала больше не сопряжена с работой фермента. На начальном этапе это нарушение обратимо, при добавлении субстратов реакции структура фермента и сопряженность между F1 и Fo восстанавливается. На втором этапе структурные нарушения становятся настолько серьезными, что уже фермент не способен связывать субстраты, и разобщение может быть обращено только инактивацией протнонного канала вентурицидином. Мы предполагали, для характеристики свойств препарата фермента, освобожденного от ADP, необходимо определять его активность в присутствии ITP, т.к. привнесенный с АТР и появившийся в ходе реакции ADP вернет фермент к исходному состоянию. Однако фермент, свободный от ADP, обладал необычными свойствами. Как мы и ожидали, скорость разобщенного гидролиза ITP и гидролиза ITP в условиях де-энергизации практически сравнялись со скоростью потенциал-активированного гидролиза ITP (рис. 21). Однако удивительно, что те же свойства фермент демонстрировал в отношении 45 гидролиза АТР (рис. 20). Мы заключили, что фермент потерял чувствительность к ADP, как к ингибитору. К тому же, хотя вентурицидин обращал индуцированное удалением нуклеотидов разобщение, гидролиз АТР таким препаратом был нечувствителен к вентурицидину (рис. 22). Это может говорить о том, что в результате удаления ADP в структуре фермента произошли очень глубокие перестройки. Возможно, произошла ADP-зависимая диссоциация какой-нибудь субъединицы. Мы не можем сказать, какой из нуклеотидов играет первостепенную роль в регуляции гидролиза АТР, поскольку апираза и щелочная фосфатаза с равным успехом удаляют из среды как АТР, так и ADP. Нельзя пока с точностью говорить о местах связывания регуляторных нуклеотидов. Возможно, в регуляцию гидролиза АТР вовлечены и регуляторные некаталитические сайты, и - субъединица, и, возможно, какие-то другие структуры. Однако концентрационная зависимость эффекта неорганического фосфата указывает на участие каталитическоего центра в этом явлении, поскольку известно, что Км для фосфата F1·Fo-АТРазы P.denitificans равна 150 мкМ [36]. Нужно учесть, что при помощи щелочной фосфатазы/апиразы мы удаляем не только АDP, но и АТР. Известно, что в регуляцию синтеза-гидролиза АТР вовлечена -субъединица, ингибирующая активность которой находится под контролем мембранного потенциала и, как было обнаружено недавно, АТР. Было показано, что изолированная -субъединица F1-ATPазы термофильной бактерии Bacillus strain PS3 способна связывать АТР. Связывание АТР не зависит от присутствия ионов Mg2+ в среде и связывает АDР [15]. Ранее нами обсуждалась и то, что е субъединица претерпевает конформационные изменения, которые напрямую связаны с переходом фермента от синтетазной формы к гидролазной. АТР стимулирует гидролиз АТР [16]. Однако мы показали, что ADP снимает разобщение, следовательно, маловероятно, что наблюдаемые нами эффекты связаны с нуклеотид-зависимой регуляцией -субъединицы. К тому же, мы не знаем, откуда мы удаляем нуклеотиды. ADP и АТР могут связываться, помимо каталитических, с некаталитическими центрами связывания фермента (см раздел «Обзор литературы»). Известно, что заполнение некаталитических сайтов нуклеотидами не влияет на гидролитическую активность F1·Fo-АТРазы E. coli [48]. Существуют данные, которые свидетельствуют о взаимодействии между каталитическими и некаталитическими сайтами F1ATPазы Schizosaccharomyces pombe. Предполагается, что связывание АТР в 46 некаталитических сайтах модулирует сродство каталитических сайтов к ADP [48 Jault BBA 2004]. Существует также такое явление как утечка протонов. В норме синтез АТР и генерация мембранного потенциала сопряжены с большой эффективностью. Однако бывает и так, что гидролиз АТР слабо сопряжен с генерацией мембранного потенциала. Это и есть утечка протонов. Данное явление наблюдали на Rhodobacter capsulatis [50]. Утечка протонов имела место при очень низких, <1мкМ, концентрациях нуклеотидов в среде и при предварительной энергизации мембраны. Она сопровождается освобождением 0,25 моль ADP на 1 моль фермента. При этом не происходило отделения F1 от Fо. Это явление частично можно обратить добавлением АТР или ADP в концентрации >1мкМ [50]. Рис. 23. Роль ADP в регуляции активности АТРазы. Коричневым цветом на рисунке обозначен неактивный в отношении гидролиза фермент, содержащий прочно связанный ADP. Желтым цветом на рисунке обозначена АТРаза, свободная от ADP. Голубой круг – гипотетическая субъединица, диссоциирующая в результате удаления ADP 47 На основании наших данных мы предполагаем, что удаление ADP приводит к значительным изменениям в структуре АТРазы, что в свою очередь приводит к диссоциации какой-то субъединицы фермента. Как показано на схеме (рис. 23), фермент под действием щелочной фосфатазы или апиразы теряет ADP. АТРаза обладает высоким сродством к нуклеотиду, но под действием ферментов, разрушающих ADP, равновесие сдвигается в сторону свободной АТРазы. Мы не может ответить на вопрос, требуется ли на этой стадии мембранный потенциал. Возможно, энергизация облегчает освобождение нуклеотида, снижая его сродство к ферменту. АТРаза, свободная от ADP, претерпевает значительные структурные изменения, приводящие к утрате сопряжения между мембранной и гидрофильной частями фермента и появлению протонной утечки. На этой стадии структура фермента может быть восстановлена добавлением субстратов реакции. Затем такая АТРаза теряет связь с какой-то своей субъединицей, что приводит к дальнейшим изменениям в ее структуре и свойствам (утрата чувствительности вентурицидину и «ингибирующему» ADP). На этой стадии добавление субстратов уже не может восстановить исходный фермент. Таким образом, мы обнаружили, что ADP играет важную роль в поддержании структуры фермента, и связанных с этим функциональных свойств АТРазы. Развитие этой работы в дальнейшем может привести к решению проблемы о роли ADP в регуляции функционирования АТРазы. 48 ВЫВОДЫ 1. Удаление фосфата из окружающей среды и (или) разобщение приводят к ингибированию гидролиза АТР и ITP F1·Fо-ATPазой P. denitrificans, регистрируемого по появлению скалярного Н+-иона. При регистрации гидролиза в присутствии АТР(ITP)-регенерирующей системы (фосфоенолпируват + пируваткиназа) кинетика гидролиза АТР не меняется, а гидролиз ITP оказывается не чувствителен к удалению фосфата и (или) разобщению. 2. Снижение стационарной концентрации ADP при гидролизе АТР, достигаемое увеличением количества регенерирующей системы, приводит к ингибированию реакции, но не влияет на кинетику гидролиза ITP; при этом происходит падение мембранного потенциала, поддерживаемого гидролизом обоих нуклеотидов. 3. Получен препарат F1·Fо-ATPазы P. denitrificans, истощенный по ADP. Удаление ADP сопровождается чувствительным к ADP, фосфату и вентурицидину появлением протонной проводимости мембран P. denitrificans. 4. Истощенный по ADP препарат F1·Fо-ATPазы характеризуется a. увеличением не активируемой потенциалом разобщенной гидролитической активности; b. потерей чувствительности гидролиза АТР к вентурицидину 5. Полученные данные показали, что истощение по ADP приводит к нарушению структуры F1·Fо-ATPазы P. denitrificans, сопровождающемуся разобщением гидролиза и переноса протонов. 49 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Senior A.E. (1988) ATP synthesis by oxidative phosphorylation. Physiol. Rev., 68, 177-231. 2. Walker J.E., Fearnley I.M., Gay N.J., Gibson B.W., Northrop F.D., Powell S.J., Runswick M.J., Saraste M., Tybulewicz V.L. (1985) Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria. J. Mol. Biol. , 184(4), 677-701. 3. Weber J., Senior A. E. (2003) ATP synthesis driven by proton transport in F1·Fo -ATP synthase. FEBS Letters, 545, 61 – 70. 4. Capaldi R.A., Aggeler R., Turina P., Wilkens S. (1994) Coupling between catalitic sites and the proton channel in F1·Fo-type ATPases. TIBS, 19, 284289. 5. Boyer P.D. (1993) The binding change mechanism for ATP synthase – some probabilities and possibilities. Biochim. Biophys. Acta, 1140, 215-250. 6. Lücken U., Gogol E.P., Capaldi R.A. (1990) Structure of the ATP synthase complex (ECF1·Fo) of Escherichia coli from cryoelectron microscopy. Biochemistry, 29, 5339 – 5343. 7. Cross R.L., Duncan T.M. (1996) Subunit rotation in F1·Fо-АТР synthases as a means of coupling proton transport through Fo to the binding changes in F1. J. Bioenrg. and Biomembr., 28, 403 – 407. 8. Виноградов A.Д. (1999) Митохондриальная АТРсинтезирующая машина: пятнадцать лет спустя. Биохимия, 64, 1443 – 1456. 9. Perlin D.S., Latchney L.R., Wise J.G., Senior A.E. (1984) Specifity of the proton adenosinetriphosphatase of Escherichia coli for adenine, guanine and inosine nucleotides in catalysis and binding. Biochemistry, 23, 4999-5003. 10. Pedersen P.L. (1976) ATP-dependent reactions catalyzed by inner membrane vesicles of rat liver mitochondria. Kinetics, substrate specificity, and bicarbonate sensitivity. J. Biol. Chem., 251, 934 – 940. 11. Fernandez-Belda F.J., Garcia-Carmona F., Garcia-Canovas F., Lozano J.A., Gomez-Fernandez J.C. (1982) Mitochondrial ATPase inactivation by interaction with its substrate. Arch. Biochem. Biophys., 215, 40-46. 12. Green D.W., Grover G.J. (2000) The IF1 inhibitor protein of the mitochondrial F1·F0-ATPase. Biochim. Biophys. Acta, 1458, 343 – 355. 50 13. Hisabori T., Ueoka-Nakanishi H., Konno H., Koyama F. (2003) Molecular evolution of the modulator of chloroplast ATP-synthase: origin of the conformational change dependent regulation. FEBS Letters, 545, 71 – 75. 14. Sternweis P.C., Smith J.B. (1980) Characterization of the inhibitory (epsilon) subunit of the proton-translocating adenosine triphosphatase from Escherichia coli. . Biochemistry, 19, 526 – 531. 15. Kato-Yamada Y., Yoshida M. (2003) Isolated Subunit of Thermophilic F1- ATPase Binds ATP. J. Biol. Chem., 278, 36013-36016 16. Suzuki T., Murakami T., Iino R., Suzuki J., Ono S., Shirakihara Y., Yoshida M. (2003) F1·Fo-ATPase/Synthase Is Geared to the Synthesis Mode by Conformational Rearrangement of Subunit is Response to Proton Motive Force and ADP/ATP Balance. J. Biol. Chem., 278, 46840-46846. 17. Fitin A. F., Vasilyeva E. A., Vinogradov A. D. (1979). An inhibitory high affinity binding site for ADP in the oligomycin-sensitive ATPase of beef heart submitochondrial particles. Biochem. Biophys. Research Communications, 86, 434 – 439. 18. Minkov I.B., Fitin A.F., Vasilyeva E.A., Vinoqradov A.D (1979) Mg2+-induced ADP-dependent inhibition of the ATPase activity of beef heart mitochondrial coupling factor F1. Biochem. Biophys. Research Communications, 89, 1300 – 1306. 19. Vasilyeva E.A., Minkov I.B., Fitin A.F., Vinogradov A.D. (1982) Kinetic mechanism of mitochondrial adenosine triphosphatase. ADP-specific inhibition as revealed by the steady-state kinetics. Biochem. J., 202, 9-14. 20. Yalamova M.V., Vasilyeva E.A., Vinogradov A. D. (1982) Mutually dependent influence of ADP and Pi on the activity of mitochondrial adenosine triphosphatase. Biochemistry International, 4, 337 – 344. 21. Vasilyeva E.A., Minkov I.B., Fitin A.F., Vinogradov A.D. (1982) Kinetic mechanism of mitochondrial adenosine triphosphatase. Inhibition by azide and activation by sulphite. Biochem. J., 202, 15-23. 22. Walker J.E., Leslie A.G.W., Montgomery M.G., Bowler M.W. (2006) How azide inhibits ATP hydrolysis by the F-ATPases. J. Biol. Chem., 103, 86468649. 23. Vogel P.D, Cross R.L, (1991) Adenine nucleotide-binding sites on mitochondrial F1-ATPase. Evidence for an adenylate kinase-like orientation of catalytic and noncatalytic sites. J. Biol. Chem., 266, 6101-6105 51 24. Milgrom Y.M, Boyer P.D. (1990) The ADP that binds tightly to nucleotidedepleted mitochondrial F1-ATPase and inhibits catalysis is bound at a catalytic site. Biochim. Biophys. Acta, 1020, 43 – 48. 25. Chernyak B.V., Cross R.L. (1992) Adenine nucleotide-binding sites on mitochondrial F1-ATPase: studies of the inactive complex formed upon binding ADP at a catalytic site. Arch. Biochem. Biophys., 295, 247 – 252. 26. Galkin M. A., Vinogradov A. D. (1999) Energy-dependent transformation of the catalytic activities of the mitochondrial F1·Fo-ATPsynthase. FEBS Lett., 448, 123 – 126. 27. Strotmann H., Bickel S., Huchzermeyer B. (1976) Energy-dependent release of adenine nucleotides tightly bound to chloroplast coupling factor CF 1. FEBS Lett., 61, 194 – 198. 28. Shoshan V., Selman B.R. (1979) The Relationship between Light-induced Adenine Nucleotide Exchange and ATPase Activity in Chloroplast Thylakoid Membranes. J. Biol. Chem., 254, 8801 – 8807. 29. Slooten L., Nuyten A. (1981) Activation-deactivation reactions in the ATPase enzyme in Rhodospirillum rubrum chromatophores. Biochim. Biophys. Acta, 638, 305 – 312. 30. Turina P., Rumberg B., Melandri B.A., Gräber P. (1992) Activation of the H(+)-ATP synthase in the photosynthetic bacterium Rhodobacter capsulatus. J. Biol. Chem., 267, 11057 – 11063. 31. Syroeshkin A.V., Vasilyeva E.A., Vinogradov A.D. (1995) ATP synthesis catalyzed by the mitochondrial F1·Fo ATP synthase is not a reversal of its ATPase activity. FEBS Lett., 366, 29-32. 32. John P., Whatley F. R. (1970) Oxidative phosphorylation coupled to oxygen uptake and nitrate reduction in Micrococcus denitrificans. Biochim. Biophys. Acta, 216, 342 – 352. 33. Perez J. A., Ferguson S.J. (1990) Kinetics of Oxidative Phosphorylation in Paracoccus denitrificans. Mechanism of ATP Synthesis at the Active Site(s) of FoF1-ATPase, Biochemistry, 29, 10503-10518. 34. Pacheco-Moisés F., Garcia J. J., Rodriguez-Zavala J. S. and MorenoSánchez R. (2000). Sulfite and membrane energization induce two different active states of the Paracoccus denitrificans F0F1-ATPase. Eur. J. Biochem. 267, 993 – 1000. 52 35. Жарова Т.В., Виноградов А.Д. (2003) Протон-транслоцирующая АТРсинтетаза Paracoccus denitrificans: АТР-гидролазная активность. Биохимия, 68, 1370 – 1380. 36. Беженар М.В. (2005) Влияние энергизации мембраны на взаимодействие F1·Fo-АТРазы Paracoccus denitrificans с субстратом и продуктами реакции. Дипломная работа. МГУ, Москва. 37. Zharova T.V., Vinogradov A.D. (2006) Energy-linked binding of Pi is required for continuous steady-state proton-translocating ATP hydrolysis catalyzed by Fо·F1 ATP synthase. Biochemistry 45, 14552 – 14558. 38. Zharova T.V., Vinogradov A.D. (2004) Energy-dependent transformation of F1·Fo-ATPase in Paracoccus denitrificans plasma membranes. J. Biol. Chem., 279, 12319 – 12324. 39. Zharova T.V., Vinogradov A.D. (2006) Requirement of medium ADP for the steady-state hydrolysis of ATP by the proton-translocating Paracoccus denitrificans Fo·F1-ATP synthase. Biochim. Biophys. Acta, 1757, 304-310. 40. John P., Hamilton W.A. (1970) Respiratory control in membrane particles of Micrococcus denitrificans. FEBS Lett., 10, 246 – 248. 41. Chance B., Nishimura M. (1967) Sensitive measurements of changes of hydrogen concentration. Methdods Enzymol., 10, 641 – 650. 42. Waggoner A.S. (1979) The use of cyanine dyes for the determination of membrane potentials in cells, organelles, and vesicles. Methods Enzymol., 55, 689 – 695. 43. Harris D.A., John P., Radda G.K. (1977) Tightly bound nucleotides of the energy-transducing ATPase, and their role in oxidative phosphorylation. 1. The Paracoccus denitrificans system. Biochim. Biophys. Acta, 459, 546-559 44. Harris D.A., Radda G.K., Slater, E.C. (1977) Tightly bound nucleotides of the energy-transducing ATPase, and their role in oxidative phosphorylation. 2. The beef heart mitochondrial system. Biochem.Biophys.Acta., 459, 560-572. 45. Garret N.E., and Penefsky H.S. (1975) Interaction of Adenine Nucleotides with Multiple Binding Sites on Beef Heart Mitochondrial Adenosine Triphosphatase, J. Biol. Chem., 250, 6640 – 6647.. 46. Digel J.G., Kishinevsky A., Ong A.M., McCarty R.E. (1996) Differences between two tight ADP binding sites of the chloroplast coupling factor 1 and their effects on ATPase activity. J. Biol. Chem. 271, 19976–19982 53 47. Parker N., Affourtit C., Vidal-Puig A., Brand M.D. (2008) Energizationdependent endogenous activation of proton conductance in skeletal muscle mitochondria. Biochem. J., 412, 131 – 139. 48. Weber J., Senior A.E. (1995) Location and properties of pyrophosphatebinding sites in Escherichia coli F1-ATPase. J. Biol. Chem., 270, 12653 – 12653. 49. Falson P., Goffeau A., Boutry M., Jault J.M. (2004) Structural insight into the cooperativity between catalytic and noncatalytic sites of F1-ATPase. Biochim. Biophys. Acta, 1658, 133 – 140. 50. Feniouk, B.A., Mulkidjanian, A.Y., Junge, W. (1995) Proton slip in the ATP synthase of Rhodobacter capsulatus: induction, proton conduction, and nucleotide dependence. Biochim. Biophys. Acta, 1706, 184 – 194. 54 Рисунок 4. Сравнение гидролиза ATP и ITP параллельная генерация трансмембранного потенциала мембранами P. denitrificans. Измерения проводили в стандартной среде, дополнительно содержавшей 2,5 мМ сукцинат и 2,0 мМ фосфат (см. раздел «Методы исследования»). На верхних рисунках приведена регистрация гидролиза АТР и IТР по Н+-иону в присутствии рН-индикатора фенолового красного; на нижних – генерация трансмембранного потенциала в присутствии Оксанола VI (см. «Методы исследования»). Стрелками показано добавление 1 мМ АТР или 2 мМ ITP, 20 мМ малоната и СБЧ (37,5 мкг/мл). Цифры у кривых – скорость гидролиза NTP в мкмоль/мин на 1 мг белка СБЧ. 55 Рисунок 5. Влияние пируваткиназы на гидролиз ATP и ITP и генерацию потенциала СБЧ P. denitrificans, регистрируемые в присутствии NTPрегенерирующей системы. Измерения проводили, как описано в «Методах исследования». Среда измерения дополнительно содержала 2,5 мМ сукцинат и 2,0 мМ фосфат, а также ЛДГ 20 U и пируваткиназу: 10 U (черные кривые), 160 U (оранжевые кривые) или не содержала пируваткиназу (красные кривые). При регистрации изменений мембранного потенциала среда дополнительно содержали 1,5 мкM Оксонол VI (нижняя часть рисунка). Концентрации ATP и ITP в среде были равны 1 мМ и 2 мМ, соответственно. Реакцию начинали добавлением 20 мМ малоната. Концентрация СБЧ – 67,5 мкг/мл. 56 Рисунок 7. Влияние неорганического фосфата на гидролиз ATP и ITP и генерацию потенциала СБЧ P. denitrificans. Синий цвет – среда дополнительно содержала 2 мМ фосфат, зеленый – среда не содержала фосфат. Измерения проводили в стандартной среде с феноловым красным (верхние кривые), условия измерения как на рис. 4, или в присутствии NTPрегенерирующей системы (нижние кривые), условия измерения как на рис. 5. В последнем случае стандартная среда дополнительно содержала 20 U ЛДГ, 12 U ПК. 57 Рисунок 6. Влияние разобщителя на гидролиз ATP и ITP СБЧ P. denitrificans. Измерения проводили в стандартной среде с феноловым красным (верхние кривые), условия измерения, как на рис. 4, или в присутствии NTPрегенерирующей системы (нижние кривые), условия измерения, как на рис. 5. В последнем случае стандартная среда дополнительно содержала 20 U ЛДГ, 12 U ПК, 1 мМ АТР и 2 мМ ITP. Где указано, вносили 5 μМ FCCP. 58 V, мкмольITP/мин*мг белка 0,08 V0 0,04 V1 0 10 20 30 время, мин Рисунок 9. Зависимость скорости гидролиза IТР от времени инкубации СБЧ с щелочной фосфатазой. СБЧ инкубировали со щелочной фосфатазой в течение указанного на графике времени (условия инкубации см. в «Методах исследования»). Контрольные частицы инкубировали в тех же условиях, но без щелочной фосфатазы. Аликвоту частиц вносили стандартную среду, дополнительно содержавшую 2,5 мМ сукцинат и 2,0 мМ фосфат, и после 100 сек инкубации регистрировали гидролиз ITP по ответу фенолового красного (см. рис. 1) обработанными щелочной фосфатазой (сплошная линия) и контрольными частицами (пунктир). Реакцию начинали добавлением 20 мМ малоната и 2 мМ ITP и измеряли скорость гидролиза ITP сопряженными частицами (обозначено синим). По ходу реакции вносили 1 μМ FCCP и измеряли скорость гидролиза разобщенными частицами (обозначено красным). Постановка эксперимента схематически представлена на правой части рисунка. 59 0,15 ADP, мкM V,мкмольАТР/мин*мг белка СБЧ 5 4 0,10 3 2 0,05 1 0 50 100 150 200 250 300 время, сек Рисунок 10. Влияние пируваткиназы и щелочной фосфатазы на де-активацию АТРазы после де-энергизации частиц Измерения проводили в стандартной среде по Н+-иону в присутствии рНиндикатора фенолового красного. Частицы разводили средой, содержавшей 0,5 М сахарозу, 10 мМ ТРИС-HСl (рН 8,0), 0,2 М KCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ фосфат, 10 мМ сукцинат, 0,2 мМ ЭДТА, а также щелочную фосфатазу (100 U/мл, красная кривая) или пируваткиназу (20 U/мл) и фосфоенолпируват (1,5 мМ), синяя кривая), в соотношении 1:2, до конечной концентрация 5 мг/мл. После 2 минут инкубации в условиях хорошего перемешивания суспензии добавляли 20 мМ малонат (нулевое время). Одновременно с малонатом в среду вносили 5 мкМ ADP. Через промежутки времени, указанные на оси абсцисс, из преинкубации отбирали аликвоту частиц и вносили в стандартную среду, содержавшую 2,5 мМ сукцинат, 2,0 мМ фосфат, 1 мМ АТР, а также 20 мМ малонат. Концентрация белка в измерении – 62,5 мкг/мл. Пунктирными кривыми на рисунке обозначена убыль ADP (синяя кривая – пируваткиназа, красная - щелочная фосфатаза). 60 Рисунок 11. Генерация мембранного потенциала препаратами мембран P. denitrificans, полученными после обработки щелочной фосфатазой в разных условиях СБЧ инкубировали в стандартной среде, 1) без дополнительных добавок (контроль); или содержавшей 2) 50 мМ сукцинат (сукцинат), 3) 25 U/мл щелочной фосфатазы (ЩФ), 4) 25 U/мл щелочной фосфатазы + 50 мМ сукцинат (ЩФ + сукцинат) Аликвоту одного из препаратов СБЧ, полученного после переосаждения и суспендирования в стандартной среде, вносили в 2 мл стандартной среды, дополнительно содержавшей 2,5 мМ сукцинат, 2,0 мМ фосфат, а также 1,5 мкM Оксонол VI. Концентрация белка в пробах – 75 мкг/мл. 61 активность, мкмольATP/мин*мг белка СБЧ А. 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 контроль сукцинат ЩФ сукцинат + ЩФ активность, мкмольATP/мин*мг белка СБЧ Б. 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 контроль сукцинат ЩФ сукцинат + ЩФ Рисунок 12. Влияние ~ (А) и влияние разобщителя (Б) на гидролиз АТР СБЧ H P. denitrificans после обработки щелочной фосфатазой в разных условиях Измерения проводили в стандартной среде, содержавшей 2,0 мМ фосфат, в присутствии рН-индикатора фенолового красного. Синим цветом на рисунке (А и Б) показан потенциал-активированный гидролиз АТР. Частицы инкубировали 100 сек в среде указанного состава, содержавшей также 2,5 мМ сукцинат. Гидролиз начинали одновременным добавлением 20 мМ малоната и 1 мМ АТР Оранжевым цветом (А) обозначен не активированный потенциалом гидролиз АТР. Частицы инкубировали 100 сек в среде указанного состава. Реакцию начинали добавлением 1 мМ АТР. Красным цветом (А) обозначена АTPазная активность препаратов, измеренная через 3 мин после внесения разобщителя. Частицы инкубировали 100 сек в среде указанного состава, содержавшей также 2,5 мМ сукцинат. Гидролиз начинали одновременным добавлением 20 мМ малоната и 1 мМ АТР, затем через 2 минут вносили 5 мкМ СCCP (см. рис. 6). Концентрация СБЧ (обозначения препаратов см. на рис. 11) – 45 мкг/мл. 62 активность, мкмольITP/мин*мг белка СБЧ А. 0,10 0,05 0,00 контроль сукцинат ЩФ сукцинат + ЩФ активность, мкмольITP/мин*мг белка СБЧ Б. 0,10 0,05 0,00 контроль сукцинат ЩФ сукцинат + ЩФ Рисунок 13. Влияние ~ (А) и влияние разобщителя (Б) на гидролиз IТР СБЧ P. H denitrificans после обработки щелочной фосфатазой в разных условиях Обозначения, как на рис. 12, но вместо 1 мМ АТР, вносили 2 мМ IТР и концентрация СБЧ в пробах была равна 90 мкг/мл. 63 Рисунок 14. Влияние апиразы, щелочной фосфатазы и пируваткиназы+ФЕП на сукцинат-зависимую генерацию мембранного потенциала СБЧ P. denitrificans. Стандартная среда дополнительно содержала 2,5 мМ сукцинат, а также 1,5 мкM Оксонол VI. Синим цветом на рисунке обозначена генерация мембранного потенциала контрольным препаратом СБЧ. Красным цветом – препаратом СБЧ в присутствии 0,5 U апиразы, зеленым цветом – в присутствии 50 U пируваткиназы и 1,5 мМ ФЕП, коричневым - в присутствии 50 U щелочной фосфатазы. Концентрация белка в пробах – 77,5 мкг/мл. Где указано, добавляли 5 мкМ FCCP. 64 Рисунок 15. Влияние ADP, фосфата и вентурицидина на индуцированное апиразой падение мембранного потенциала СБЧ P. denitrificans. Синим цветом на рисунке обозначена генерация мембранного потенциала препаратом СБЧ в стандартной среде, содержавшей 2,5 мМ сукцинат. Красным цветом –·препаратом СБЧ в стандартной среде, содержавшей 2,5 мМ сукцинат и 0,5 U апиразы. Где указано, среда измерения дополнительно содержала 2,0 мМ фосфат (Pi), 100 мкМ ADP или вентурицидин (0,25 мкг/мл). Концентрация белка в пробах –·77,5 мкг/мл. Где указано, добавляли 5 мкМ FCCP. 65 Рисунок 16. Обращение вентурицидином и ADP индуцированного апиразой падения мембранного потенциала СБЧ P. denitrificans. Условия регистрации и обозначения, как на рис. 15. Где указано, в среду вносили 100 мкМ ADP или вентурицидин (0,25 мкг/мл), а также 5 мкМ FCCP. Концентрация белка – 77,5 мкг/мл. 66 А. Б. Рисунок 17. Обращение (А) и предотвращение (Б) фосфатом индуцированного апиразой падения мембранного потенциала СБЧ P. denitrificans. Условия регистрации и обозначения, как на рис. 15. А. Где указано, в среду вносили 2 мМ фосфат. Б. Среда измерения дополнительно содержала фосфат, концентрация которого обозначена цифрами у кривых (мМ). Концентрация – 77,5 мкг/мл. Где указано, добавляли 5 мкМ FCCP. 67 Рисунок 18. Влияние апиразы на генерацию сукцинат-зависимого мембранного потенциала СБЧ P. denitrificans. Частицы инкубировали в стандартной среде, содержавшей апиразу (0,25 U/мл) (красные кривые) или не содержавшей апиразу (синие кривые). Через 0, 3 и 7 мин в среду вносили 2,5 мМ сукцинат. Где указано, добавляли 5 мкМ FCCP. Концентрация белка –77,5 мкг/мл. 68 активность, мкмольATP/мин*мг белка СБЧ А. 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 контроль апираза + Pi апираза - Pi 0,25 активность, мкмольATP/мин*мг белка СБЧ Б. 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 контроль апираза - Pi апираза + Pi Рисунок 20. Влияние ~ (А) и влияние разобщителя (Б) на гидролиз АТР СБЧ P. H denitrificans после обработки апиразой в разных условиях СБЧ инкубировали в стандартной среде, 1) без дополнительных добавок (контроль); или содержавшей 2) 25 U/мл апиразы + 2 мМ фосфат (апираза + Pi) 4) 25 U/мл апиразы (апираза - Pi) Аликвоту одного из препаратов, полученных после переосаждения и суспендирования СБЧ в тех же средах, но без апиразы, отбирали для измерения АТРазной активности. Условия измерения гидролиза АТР и обозначения, как на рис. 12. Концентрация СБЧ – 40-50 мкг/мл. 69 активность, мкмольITP/мин*мг белка СБЧ А. 0,15 0,10 0,05 0,00 контроль апираза - Pi апираза + Pi активность, мкмольITP/мин*мг белка СБЧ Б. 0,15 0,10 0,05 0,00 контроль апираза - Pi апираза + Pi Рисунок 21. Влияние ~ (А) и влияние разобщителя (Б) на гидролиз IТР СБЧ P. H denitrificans после обработки апиразой в разных условиях Препараты описаны на рис. 21. Условия измерения гидролиза IТР и обозначения, как на рис. 13. Концентрация СБЧ в пробах составляла 80 – 90 мкг/мл. 70 Рисунок 19. Генерация мембранного потенциала препаратами мембран P. denitrificans, полученными после обработки апиразой в разных условиях СБЧ инкубировали в стандартной среде, 1) без дополнительных добавок (- апираза); или содержавшей 2) 25 U/мл апиразы + 2 мМ фосфат ( + Pi) 4) 25 U/мл апиразы ( - Pi) Аликвоту одного из препаратов СБЧ, полученного после переосаждения и суспендирования в стандартной среде, вносили в 2 мл стандартной среды, дополнительно содержавшей 2,5 мМ сукцинат, а также 1,5 мкM Оксонол VI. Синими кривыми на рисунке обозначена генерация мембранного потенциала контрольным препаратом СБЧ. Концентрация белка – 90 мкг/мл. Красными кривыми представлена регистрация мембранного потенциала препаратами, переосажденными после обработки апиразой в присутствии (+Pi) и в отсутствие (-Pi) неорганического фосфата. Концентрация белка – 81 и 84 мкг/мл соответственно. 71 активность, мкмольАTP /мин*мг белка СБЧ А. 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 контроль апираза контроль апираза активность, мкмольITP /мин*мг белка СБЧ Б. 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 Рисунок 22. Влияние вентурицидина на гидролиз АТР (А) и IТР (Б), катализруемым контрольным препаратом СБЧ P. denitrificans и препаратом после обработки апиразой. Синим на рисунке показан потенциал-активированный гидролиз АТР и IТР. Измерения проводили в стандартной среде, дополнительно содержавшей 2,5 мМ сукцинат и 2,0 мМ фосфат, а также феноловый красный. Гидролиз начинали после 100 сек инкубации одновременным добавлением 20 мМ малоната и 1 мМ АТР или 2 мМ IТР. Желтым цветом обозначена NTPазная активность, измеренная через 3 минуты после добавления вентурицидина (0,25 мкг/мл). Концентрация СБЧ в пробах составляла 45 – 90 мкг/мл. 72
