инициирование и ингибирование свободнорадикальных

УДК 577.158+577.352+577 152.1
Посвящается создателю теории
окисления органических соединений
активированным кислородом
академику А.Н. Баху
ИНИЦИИРОВАНИЕ И ИНГИБИРОВАНИЕ
СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В БИОХИМИЧЕСКИХ
ПЕРОКСИДАЗНЫХ СИСТЕМАХ (ОБЗОР)
© 2007 г. Д. И. Метелица, Е. И. Карасёва
Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск 220141
e-mail: metelitza@iboch.bas-net.by
Поступила в редакцию 15.09.2006 г.
Обзор посвящен роли кислородных и пероксидных комплексов в монооксигеназных и моделирующих их системах, в пероксидазных и "псевдопероксидазных" процессах. Рассмотрены маршруты превращения этих промежуточных комплексов по одноэлектронному (свободнорадикальному) и двухэлектронному (гетеролитическому) механизму. Проведен анализ
сопряженного пероксидазно-го окисления ароматических аминов и фенолов и рассмотрены
количественные характеристики ингибирования и активации пероксидазных реакций: окисление пероксидазных хромогенных субстратов (АБТС, ФДА и ТМБ) в присутствии ингибиторов фенольной природы и полидисульфидов замещенных фенолов охарактеризовано константами ингибирования Кi в мкМ, а активация пероксидазного окисления тех же субстратов - степенью (коэффициентом) активации α в М-1, определенным для 2-аминотиазола, меламина, тетразола и его 5-замещенных производных. Приведены примеры практического
использования пероксидных ферментных и модельных систем в окислении органических
соединений, химическом и иммуноферментном анализе многих объектов и в тест-системах
общей антиоксидантной активности биологических жидкостей.
Исследования биологической роли кислорода начались более 230 лет назад работами
Лавуазье, который определял окисление как присоединение атомов кислорода к субстрату, а
обратный процесс - как восстановление. В 1896 г. Бертран показал, что живые организмы
содержат много ферментов, катализирующих окисление органических соединений. Эти
ферменты он назвал оксидазами, которые каким-то образом активируют молекулярный кислород, присоединяя его. А затем окисляют субстрат.
В 1894-1897 гг. выдающийся ученый академик А.Н. Бах предположил, что кислород
реагирует с акцептором А и образует органический пероксид, который затем превращает
субстрат X в оксид [1,2]:
Ферменты, катализирующие реакции (1) и (2), были названы оксигеназами и пероксидазами соответственно.
Через два десятилетия О. Варбург предложил теорию клеточного дыхания, согласно
которой этот процесс представляет собой активацию кислорода гемсодержащими ферментами, или "дыхательными энзимами" [3]. Теория О. Варбурга во многом аналогична представлениям А.Н. Баха. Следующим этапом в развитии теории биологического окисления
1
Принятые сокращения: АОТ - Аэрозоль ОТ или натриевая соль ди-(2-этил)гексилового эфира сульфоянтарной кислоты, ААП - 4-аминоантипирин, АБТС - 2,2'-азино-ди-(3-этил-2,3-дигидробензтиазолин-6-сульфоновая
кислота), АНФ - 2-амино-4-нитрофенол, ГК - галловая кислота, ГПК - гидропероксид кумила, ГПТБ - гидропероксид тpeт-бутила, ОАА - общая антиоксидантная активность, ОФС - 4,4'-ди-окси-дифе-нилсульфон, ПГ пропилгаллат, поли(АДСНФ) - поли(2-аминодисульфид-4-нитрофенол), поли(ДСГ) - полидисульфид галловой
кислоты, поли(ДСПГ) - полидисульфид пропилгаллата, поли(ДСОФС) - поли(дисульфид-4,4'-ди-оксидифенилсульфон), ПХ - пероксидаза корней хрена, ТМБ -3,3',5,5'-тетраметилбензидин, ФДА – офенилендиамин, ФБ - фосфатный буфер, ФЦБ - фосфатно-цитратный буфер, AmNH2 - ароматический амин,
PhOH - фенол, InH -ингибиторы свободнорадикальных процессов, f - стехио-метрический коэффициент ингибирования, α- коэффициент (степень) активации пероксидазной реакции
стали работы Г. Виланда, который показал, что окисление может происходить при полном
отсутствии кислорода и представляет собой дегидрирование субстратов [4]:
В дальнейшем усилиями многих исследователей в разных странах было доказано, что
роль окислительно-восстановительных ферментов сводится к восстановлению молекулярного
кислорода одним, двумя или четырьмя электронами. В этом заключается активация кислорода ферментами, как предполагал наш великий соотечественник А.Н. Бах. Все оксидоредуктазы имеют простетические группы, функцией которых является присоединение молекулы О2 и передача ей одного или нескольких электронов. Простетические группы можно
разделить на две большие подгруппы: первая включает ион или комплекс переходного металла
- ионы Си2+ в аскорбатоксидазе и тирозиназе, ионы молибдена и железа в ксантиноксидазе,
протопорфирины железа в пероксидазах, каталазах и цитохроме Р-450, который был открыт в 1958 г. независимо Гарфинкелем [5] и Клингенбергом [6] и оказался родоначальником огромного семейства гемопротеинов, катализирующих самые разнообразные окислительные процессы; вторая подгруппа содержит в качестве простетических групп ФАД,
ФМН или ФАД и ФМН вместе, а также птерины, сюда относятся оксигеназы ароматических аминокислот и многочисленные флавинзависимые монооксигеназы.
Прямое внедрение триплетной молекулы О2 (3∑) в субстраты с освобождением синглетного продукта реакции невозможно, так как является спинзапрещенным. Окислителем
.может быть только активированный кислород в форме супероксидного аниона О 2 (или
.
.
НО 2), пероксида водорода Н2О2 или образующегося из него радикала НО при последовательном восстановлении молекулы О2 одним, двумя или тремя электронами соответственно.
Часто механизмы окисления с участием различных форм активированного кислорода противопоставляются друг другу, особенно в присутствии ионов или комплексов металлов с
переменной валентностью. Однако между различными окисляющими агентами существует связь, как показано 35 лет назад на основе схемы восстановления молекулы О2 четырьмя электронами [7]:
Как видно, при восстановлении О2 одним электроном образуется супероксид-анион
.
О2 , которому соответствует в кислой среде радикал НО 2, а в присутствии ионов Fe3+ - так
называемый комплекс III (в терминологии, принятой в пероксидазном катализе); при восстановлении О2 двумя электронами образуется Н2О2, а в присутствии ионов железа или его
протопорфирина - комплекс I; восстановление О2 тремя электронами приводит к расщепле.
нию связи -О-О- и образованию радикала НО а в присутствии ионов Fe3+ -комплекса II
(FeO2+); наконец восстановление О2 четырьмя электронами приводит к образованию двух
молекул воды.
Активация молекулярного кислорода ферментами или металлокомплексами осуществляется тремя путями:
1. взаимодействие О2 с ионами металлов в восстановленной форме и получение им
электронов в координационной сфере металлкислородного комплекса (цитохромы Р-450);
2. взаимодействие ионов металлов с активированным двумя электронами кислородом
.-
в форме Н2О2 или ROOH (пероксидазы, каталазы);
3. взаимодействие О2 с восстановленными флавинами и птеринами с образованием
соединений гидропероксидной природы, несущих активированный кислород.
Ионы металлов, флавины и птерины являются необходимыми посредниками в восстановлении кислорода электронами, поступающими от природных доноров - НАДН, НАДФН,
аскорбиновой кислоты, дифенолов и т.д.
Во второй половине XX века интенсивно проводились исследования ферментных систем, активирующих молекулярный кислород и внедряющих один или два его атома в самые
различные субстраты (монооксигеназы и диоксигеназы соответственно), а также их функциональных и структурных моделей, построенных в соответствии с тремя путями активации
молекулярного кислорода, указанными выше. Громадный по объему экспериментальный
материал, накопленный за это время за рубежом и в нашей стране, нашел отражение и
обобщен в трудах многочисленных международных симпозиумов и конференций, обзорах и
монографиях, часть которых [8-24] стала основой первого раздела данного обзора, посвященного монооксигеназным ферментным системам и их моделям (1970-1990 гг.). Вторая и
третья часть обзора посвящены механизмам действия пероксидазных и "псевдопероксидазных" систем с акцентом на соотношение и роль гетеролитических и гемолитических стадий
распада пероксидных комплексов пероксидаз, инициирование и ингибирование свободнорадикальных процессов окисления субстратов разного строения и опираются, в первую очередь, на экспериментальные данные нашей лаборатории, полученные в 1990-2005 гг.
Мы цитировали только работы обобщающего характера и лишь те оригинальные статьи, которые имели приоритетное значение, но главной целью обзора было отражение роли
кислородных и пероксидных комплексов ферментов-монооксигеназ и их моделей, пероксидаз и "псевдопероксидаз" и механизмов превращения этих комплексов, а также действия
окисляющих агентов разной природы.
По нашему мнению, рассмотренные данные подтверждают ту большую роль промежуточных комплексов кислорода, пероксидов и гидропероксидов ферментов-оксидоредуктаз и
их моделей, которую впервые декларировал академик А.Н. Бах в своей теории медленного
окисления органических веществ [1,2].
МОНООКСИГЕНАЗНЫЕ ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ И ИХ МОДЕЛИ
Новый тип оксидоредуктаз, названных монооксигеназами, или оксидазами, со смешанной функцией, был открыт в 1955 г. Мейсоном [25] и Гаяиши [26]. Монооксигеназы требуют
обязательного присутствия восстановленных пиридин-нуклеотидов - НАДФН или НАДН и
окисляют различные субстраты, внедряя в них один атом из молекулы О2 и восстанавливая
до воды другой:
Монооксигеназы широко распространены в природе, входят в состав микросомальной
фракции клеток печени человека и млекопитающих и ответственны за метаболизм стероидов, простагландинов и громадного числа ксенобиотиков (канцерогены, лекарства, наркотики и др.). В коре надпочечников локализована стероидгидроксилирующая система, ответственная за ключевые стадии биосинтеза стероидных гормонов [8, 24]. Бактерии многих
штаммов содержат гидроксилирующие системы с цитохромом Р-450 в качестве терминальной оксидазы и способны окислять алифатические, алициклические и ароматические углеводороды [8, 10, 20, 22].
Особое внимание исследователей привлекает микросомальная гидроксилирующая система печени, состоящая из трех компонентов, каждый из которых выделен и полностью охарактеризован [8, 10,12,20,22]: НАДФН-цитохром-Р-450-редукта-за (КФ 1.6.2.4, ФПО, цитохром Р-450 (КФ 1.14.14.1) и фосфолипиды, главным компонентом которых является фосфатидилхолин (ФХ). Усилиями многих исследователей обоснована схема действия микросомальной гидроксилирующей системы [8, 12, 20, 22], представленная на рис. 1. В первой ста-
дии процесса субстрат АН взаимодействует с окисленной формой Р-450 с константами скорости 102-105 М-1 с-1 [8, 12, 20, 22]. Образование фермент-субстратного комплекса сопровождается для субстратов первого типа (углеводородов, полностью алкилированных аминов,
ненасыщенных соединений и др.) переходом гемового железа из низко- в высокоспиновое
состояние [20-22]. Во второй стадии фермент-субстратный комплекс (AH)Fe3+ восстанавливается первым электроном, который поставляет НАДФН-специфичная цепь переноса от
НАДФН с участием флавопротеина ФП1 при содействии цитохрома В5, содержащегося в
мембранах эндоплазматического ретикулума клеток печени [10,12,22]. В третьей стадии образуется тройной комплекс (AH)Fe2+(O2) с константой скорости ~106 М-1 с-1 [20-22] в полном
соответствии с теорией А.Н. Баха.
В четвертой стадии происходит восстановление тройного комплекса вторым электроном, который поставляет цепь переноса, включающая НАДН-цитохром В5-редуктазу или
ФП2 и цитохром В5. Доказано сопряжение двух цепей переноса электронов посредством
цитохрома В5
[10, 20, 22]. Пятая стадия может быть сложным процессом и состоять из нескольких ступеней: этот этап характеризуется внутримолекулярными превращениями восстановленного
тройного комплекса и его распадом с освобождением молекулы воды и гидроксилированного производного АОН (стадии 6-8). В тройном комплексе (AH)Fe2+(O2) происходит активация молекулярного кислорода, обеспечивающая возможность окисления самых разнообразных химических соединений в физиологических условиях с высокими скоростями и часто с
поразительной селективностью. Идентификация активной формы кислорода всегда была
центральной проблемой исследования цитохром Р-450-содержащих ферментных систем.
Цитохром Р-450-содержащие монооксигеназы катализируют реакции гидроксилирования по насыщенному углеродному атому - окисление алифатических соединений, ωокисление насыщенных жирных кислот, гидроксилирование эндогенных субстратов - стероидов и холестерина [8, 20, 24], гидроксилирование алициклических соединений и окисление алкильных боковых цепей. Второе место по распространенности принадлежит гидроксилированию ароматических соединений — бензола и его производных, полиядерных ароматических углеводородов и ароматических аминокислот. Большое значение для фармакологии имеют реакции окислительного N-, О- и S-деалкилирования, сопровождающие превращения многих лекарств и ксенобиотиков в организме человека и животных. Монооксигеназы катализируют также гидроксилирование гетероциклических соединений, окислительное дезаминирование, N-гидроксилирование и N-окисление, образование лактонов и сульфоокисей [10, 20-22].
Нами проведены систематические кинетические исследования окисления соединений
разной химической структуры с участием микросом печени кроликов и крыс, реконструированных ферментных систем, содержащих цитохром Р-450, редуктазу ФП1 и разные фосфолипиды, при температурах 20-37°С. Во всех случаях в условиях насыщения кофактором
НАДФ.Н измерены кинетические параметры процессов и определены эффективные величины энергии активации окисления разных субстратов и активационные термодинамические
характеристики процессов [20]. В деталях изучена кинетика окисления циклогексана в циклогексанол, нафталина - в 1-нафтол, эпоксидирование циклогексена с образованием его окиси в качестве единственного продукта и окислительное N-деалкилирование 7 аминов, среди
которых амидопирин, диметиланилин, моно-метиланилин и метилированные производные
ряда декагидрохинолола-4 [17, 20]. Для всех субстратов определена энергия активации их
окисления с участием цитохрома Р-450, которая минимальна при эпоксидировании циклогексена -9.8 ккал/моль и максимальна при деметилировании монометил анилина - 16.6
ккал/моль. Между энергетическими и энтропийными параметрами гидроксилирования углеводородов и деалкилирования аминов обнаружена четкая корреляция (компенсационный
эффект), которая выражается уравнением:
Полученная корреляция активационных параметров ∆Н* и ∆S* подтверждает, что при
окислении нафталина, циклогексана и деметилировании аминов возможна одна и та же лимитирующая стадия, в которой непременно участвует субстрат, так как его природа сказывается на активационных характеристиках фермент-субстратного комплекса. Такой лимитирующей стадией является акт внедрения атома кислорода по связи С-Н субстрата с последующим быстрым распадом фермент-субстратного комплекса (стадии 6-8 на рис. 1). Такая
точка зрения подтверждается величинами первичных изотопных эффектов при микросомальном окислении 4-нитроанизола, ω-окислении насыщенных жирных кислот и при гидроксилировании ароматических соединений, равными или больше -1.4, т.е. в лимитирующей
стадии реакции имеет место разрыв связи С-Н окисляемого субстрата [17, 20].
Примечательно, что микросомальное эпоксидирование циклогексена приводило только
к одному продукту реакции - эпоксиду, что означает отсутствие сободнорадикальных стадий
в этом процессе и внедрение активированного кислорода по двухэлектронному (оксеноидному) механизму [20].
Как видим, блестяще подтвердилось еще одно предположение А.Н. Баха о передаче активированного кислорода субстрату в фермент-субстратном комплексе.
Для изучения механизма активации молекулярного кислорода цитохромом Р-450
большое значение имела впервые обнаруженная Кадлубаром и соавт. [27] способность органических гидропероксидов к окислению N-алкилзамещенных аминов с участием одного
лишь Р-450 в окисленной форме. Использование окислителей, содержащих восстановленный
двумя электронами кислород - гидропероксидов, NaIO4, NaCIO2 и Н2О2 -для гидроксилирования органических соединений делает не нужной сложную электронтранспортную систему,
состоящую из макромолекулярных биокомпонентов – ФП1, ФП2 и цитохрома В5, так как они
не принимают никакого участия в гидропероксидном окислении, катализированном Р-450 в
так называемой "шунтированной" системе. На рис. 2 сопоставлены стадии каталитического
окисления и превращения активированных форм кислорода в полной микросомальной и
"шунтированной" гидропероксидной системе [16, 20, 21]. Как видим, в "шунтированной"
системе Комплекс I образуется напрямую при взаимодействии окисленного Р-450 с ROOH
(Н2О2), а дальнейшие стадии его превращения одинаковы в обеих системах. Схема на рис. 2
подтверждена многочисленными экспериментами по сравнению окисления одних и тех же
субстратов в полной микросомальной и "шунтированной" (гидропероксидной) системе в
аналогичных условиях, проведенными в нашей лаборатории [16, 20, 21].
В деталях изучено гидроксилирование анилина и нафталина, эпоксидирование циклогексена и окислительное деалкилирование шести N-алкиламинов с участием очищенного Р450 и органических гидропероксидов кумила (ГПК) или трет-бутила (ГПТБ), определены
кинетические параметры, энергия активации и вычислены активационные характеристики
окисления всех субстратов. Оказалось, что энергии активации реакции окисления каждого
из субстратов в полной микросомальной и гидропероксидных системах совпадают или близки по своим величинам и для окислительного деметилирования аминов меняются в пределах
12.0 для аминопирина и 16.1 ккал/моль для монометиланилина. Окисление аминов гидропероксидами с участием изолированного Р-450 характеризуется компенсационным эффектом,
который описывается уравнением:
Коэффициент α = З33/Тсред =1.11, где Тсред - средняя температура опытов.
Сам факт окисления разных по структуре соединений (циклогексан, нафталин, анилин,
циклогексен, N-алкиламины) и окислительного О-деалкилирования анизола, пнитроанизола, 7-этоксикумарина в полной микросомальной системе и гидропероксидами с
участием Р-450 и совпадение
энергетических и активационных
параметров в обоих случаях для
каждого из субстратов однозначно
подтверждают
одинаковую
природу окисляющих агентов в
обеих системах и аналогичную
лимитирующую стадию в обоих
каталитических циклах (ср. рис. 1
и 2) [16, 17, 20, 21].
Механизм биохимического
процесса не может считаться
окончательно доказанным, если
для каждой из его стадий не найдена и не изучена удовлетворительная химическая аналогия, что
достигается при удачном моделировании биохимических процессов. Понятие модели имеет строгое формально-логическое определение, сущность которого состоит в том, что между моделью и
объектом моделирования должно
быть установлено взаимно однозначное соответствие [9, 21]. Однако даже хорошая модель точно соответствует объекту
лишь в своих существенных свойствах. При моделировании функции монооксигеназ главным вопросом был механизм переноса атома кислорода в субстрат.
Функциональные модели монооксигеназ. При моделировании монооксигеназ целе-
сообразно придерживаться классификации модельных систем с учетом формы используемого кислорода, как это было сделано для других оксидоредуктаз, активирующих молекулярный кислород. Все функциональные модели монооксигеназ были разделены нами на три
группы в соответствии с тремя путями активации кислорода (см. введение): первая группа
включала системы, построенные с использованием иона или комплекса металла, редоксактивный лиганд и сам молекулярный кислород; во вторую группу систем входили органические гидропероксиды и надкислоты в сочетании с комплексами и ионами металлов;
третья группа состояла из соединений, содержащих кислород, активированный двумя электронами - гидропероксиды, надкислоты, NaIO4, NaCIO2, оксид азота, но не содержала никаких ионов или комплексов металлов [21].
В качестве критериев, которые следовало учитывать при оценке сходства и отличия
модельной системы от ферментной, были выбраны несколько тестов: селективность при
воздействии атакующего агента на первичные, вторичные и третичные связи углеводородов;
сохранение конфигурации при образовании продукта окисления углеводородов, имеющих
асимметричные атомы углерода; распределение образующихся изомерных фенолов при
окислении ароматических соединений; наличие или отсутствие так называемого NIH-сдвига
при окислении монозамещенных производных бензола и нафталина. Использование перечисленных критериев во многих случаях дало возможность отличать одноэлектронный (свободнорадикальный) путь реакции от двухэлектронного (оксеноидного) маршрута внедрения
активированного кислорода в субстрат.
Изучено и критически рассмотрено большое число модельных систем, включающих
ион или комплекс металла и молекулярный кислород [9, 21]. В нашей лаборатории были использованы те субстраты, которые окислялись микросомами и реконструированными системами, содержащими Р-450 - анилин, нафталин, циклогексан, циклогексен, анизол, толуол, Nалкиламины и др. для сравнения их окисления в модельной и ферментной системе.
В качестве ионов и комплексов металлов были использованы Fe2+ и Fe3+, Cu+ и Cu2+,
TiCI4, MoCI3, гемин, гемоглобин, SnCl2, SnHPO4, Mo(CO)6, диарилтриазеновые комплексы
меди и другие соединения [21].
В модельных системах второй и третьей группы использовали перечисленные выше
субстраты и пероксидные соединения в качестве доноров активированного кислорода - органические надкислоты, ГПК, ГПТБ, пероксидные комплексы молибдена OMo(O2)2L1L2, где
L1 - гексаметапол, L2 - вода и др.
В большинстве случаев модельные системы обеспечивают получение тех же продуктов
различных субстратов, что обнаружены при микросомальном окислении каждого их них, т.е.
исследованные модели имитируют функции Р-450-содержащих систем. Однако имелись
также различия в эффективности модельных систем в сравнении с ферментными и разница в
механизмах действия на одни и те же субстраты, что не стало неожиданным. На основании
обширного экспериментального материала нашей лаборатории и многочисленных данных
других авторов стало возможным обсуждение общей схемы окисления ионов и комплексов
металлов кислородом и пероксидами и сопряженного с ним гидроксилирования органических соединений [16, 17, 19-21], которая отражает решающую роль кислородных и пероксидных комплексов металлов и ферментов в окислении органических соединений разной
природы. Ряд концепций о роли промежуточных кислородных комплексов в окислении органических соединений, которые опережали эксперимент, получил опытное подтверждение.
В самом общем виде схема представлена на рис. 3 [21]. В модельных и ферментных
системах типа Мп+-О2, где Мп+ - восстановленная форма ионов меди, железа или их комплексов с редоксактивным лигандом L-, моноядерные кислородные комплексы характеризуются двумя крайними типами активных структур, которые в соответствии с качественной
теоретической интерпретацией Ю.И. Скурлатова [28] различаются по характеру ориентации
молекулы О2 относительно атома металла, степени π -связывания и спиновому состоянию.
Диамагнитный пероксидный кислородный π-комплекс закрытого типа 1 и парамагнитный супероксидный кислородный σ -комплекс открытого типа 2 в некоторых случаях
могут переходить друг в друга. Такая внутримолекулярная π - σ -кон-версия характерна для
кислородного комплекса Си+(α, α'-дипиридил)2 [28, 29]. Образование комплексов типа 1
происходит в случае ионов металлов с четным числом d-электронов, которые в водном окружении могут существовать в сверхокисленном состоянии. Супероксидные комплексы типа 2 образуются в случае ионов с нечетным числом d-электронов, координационное число
которых при окислении не изменяется совсем или меняется только на единицу. Какова судьба промежуточных кислородных комплексов ионов металлов? При отсутствии субстратов
происходит превращение комплексов под влиянием растворителя, ионов Н+ или НО- и свободного лиганда L-. Реакционная способность кислородных комплексов определяется несколькими факторами: симметрией лигандного окружения окисленного и восстановленного
иона металла, зарядом центрального иона и лабильностью координационной сферы иона металла в реакциях лигандного замещения. В присутствии субстратов становятся возможными
реакции их окисления кислородными комплексами обоих типов. Эти реакции могут происходить по одноэлектронному или двухэлектронному маршруту. Комплексы супероксидного
открытого типа склонны к реакциям внешнесферного переноса электронов и реагируют в основном по одноэлектронному пути, как аналоги перекисных радикалов RO2. Пероксидные
комплексы закрытого типа больше склонны к реакциям внутрисферного переноса электронов и в основном реагируют по двухэлектронному пути, как, например, при взаимодействии
L2(CuO+2) с аскорбиновой кислотой [28].
Моноядерные кислородные комплексы
ионов металлов закрытого и открытого типов
являются крайними активными структурами.
Естественно, что могут
существовать
кислородные комплексы промежуточного типа. Анализ элементарных механизмов взаимодействия ионов металлов с
двухэлектронными донорами (Н2О2, аскорбиновая кислота) и ионов
металлов в восстановленной форме с двухэлектронными акцепторами (Н2О2, О2) показал, что образующиеся
комплексы имеют свойства и реакционную
способность, промежуточную между свойствами и реакционной способностью исходных реагентов и продуктов электронного переноса.
Ю.И. Скурлатов выдвинул и обосновал концепцию комплексов частичного переноса заряда
(ЧПЗ), объединяющих по общим признакам комплексы ионов металлов с редокс-лигандами
в особый класс донорно-акцепторных соединений [28, 29]. Отличительная особенность комплексов ЧПЗ состоит в относительно малой разности энергий их основного и электронновозбужденного состояния и быстром переходе между этими состояниями. На основе современных квантово-механических теорий переноса электронов в полярных средах [30], координационных соединений и молекулярных донорно-акцепторных комплексов Ю.И. Скурлатов дал детальную теоретическую интерпретацию комплексов ЧПЗ [28, 29].
Концепция комплексов ЧПЗ оказалась чрезвычайно полезной при рассмотрении природы окисляющих агентов в реакциях с участием многих монооксигеназ и их моделей, так
как позволила качественно объяснить относительную роль каждой частицы в процессе гид-
роксилирования и показала значение внутрисферного переноса заряда для стабилизации активных промежуточных комплексов [21]. На схеме (рис. 3) представлено образование активных промежуточных частиц в микросомальной гидроксилирующей системе, содержащей
Р-450, при участии молекулярного кислорода и органических гидропероксидов ROOH (или
Н2О2) [21]. Эта схема справедлива также для многочисленных модельных систем, содержащих молекулярный кислород и редоксактивный лиганд L-. Схема носит общий характер и справедлива для систем, содержащих разные ионы металлов в восстановленном
Мп+ и окисленном Mn+1 состояниях. Как видно на схеме, в кислой среде кислородные металлокомплексы двух типов превращаются в известный в пероксидазном катализе комплекс
I, где железо находится в степени окисления +4. Существование комплекса I возможно благодаря лигандам, способным к внутри-сферному переносу электрона на ион железа. Такими
"стабилизирующими" комплекс I лигандами являются порфириновые кольца гемсодержащих ферментов (цитохромы Р-450, пероксидазы, каталазы) и редокс-активные лиганды, находящиеся в координационной сфере (цистеинил в Р-450 и гистидил в пероксидазах и каталазах). Стабилизация комплекса I пероксидаз и каталаз достигается образованием катионрадикалов порфирина в простетической группе ферментов. Комплекс I пероксидазы реагирует по одноэлектронному пути с редокс-активным субстратом. В результате этой реакции
осуществляется внешнесферный перенос одного электрона с субстрата на комплекс I: считается, что электрон получает порфириновый катион-радикал, а не ион Fe4+. В результате образуется комплекс II пероксидаз, в котором железо остается в степени окисления Fe4+ [20].
Цитохром Р-450 отличается от других гемсодержащих ферментов тем, что его комплекс I может превращаться в комплекс II в результате внутрисферного переноса электрона
с тиолового лиганда. Такая способность равновесного взаимопревращения комплексов I и II
Р-450 объясняет возможность окислять субстраты по одноэлектронному или двухэлектронному маршруту в зависимости от природы субстрата. Равновесие между комплексами I и II
Р-450 объясняет одноэлектронное окисление углеводородов, третичных аминов [20] и спиртов [13], в котором участвует комплекс II. С другой стороны, ароматические соединения и
ненасыщенные углеводороды (бензо[а]пирен, анилин, нафталин, циклогексен) окисляются
комплексом I по двухэлектронному механизму. Существование комплексов I и II Р-450 подтверждено получением их моделей. Замечательно, что некоторые функциональные модели
монооксигеназ образуют кислородные комплексы, которые способны к окислению редоксактивных субстратов. Существование кислородных комплексов Fе2+-ЭДТА-О2 и Си+(α, α 'дипиридил)-О2 доказано [28, 29].
Главным отличием функциональных моделей монооксигеназ от самих ферментов этого
типа является большая роль свободнорадикальных реакций в процессах окисления с участием модельных систем. Подавить эти радикальные процессы затруднительно, так как сама
природа промежуточных кислородных комплексов ионов металлов такова, что они с высо..
кими скоростями генерируют при своем распаде анион-радикал О 2 или радикал НО 2 в кислой среде. Эти радикалы дают начало цепному окислению редоксактивных соединений, где
.
главным окисляющим агентом становится радикал НО . Именно такой путь реакции реализуется при сопряженном окислении циклогексана и SnCl2 в водных и водно-органических
средах. Однако при переходе к органическим апротонным растворителям (ацетонитрил) доля радикальных процессов уменьшается и проявляется гидроксилирующая способность самих комплексов кислорода с ионами металлов. Существенно, что перенос электронов с редоксактивного соединения на кислородные комплексы не только возможен, но часто реализуется в модельных экспериментах [21].
В системах гидропероксидного (пероксидного) типа (см. рис. 3) главным фактором является соотношение гетеролитпческого и гомолитического маршрутов превращения промежуточных комплексов [Mn + l...HO-OR]. При гетеролитическом превращении образуются
комплексы I и II и их аналоги. Наличие и свойства таких комплексов для пероксидаз и каталаз общеизвестны. Особенность Р-450 состоит в том, что он способен к внутрисферному переносу электронов с аксиального тиолового лиганда на связь HO-OR. Впервые такая возможность была обоснована и постулирована нами [31], Высокая окислительно-
восстановительная активность цистеинила обусловила существование равновесия комплексов I и II. образующихся из промежуточного гидропероксндного соединения. Частичный перенос заряда с тиолового лиганда цитохрома Р-450 на гидропероксид. находящийся в координационной сфере фермента, обусловил двойственную реакционную способность систем
Fe3+-P-450-ROOH. С некоторыми субстратами (углеводороды, третичные амины, спирты)
реагирует комплекс II по одноэлектронному маршруту, в то время как с другими субстратами (бензо[а]пирен, нафталин, циклогексен) реагирует комплекс I по двухэлектронному маршруту [16, 17,21].
При гомолитическом распаде металлокомплексов гидропероксидов (рис. 3) возможно
.
восстановление иона металла (1) с образованием радикала RO 2. Внутрисферный перенос
электрона с редоксактивного лиганда L- на ион металла приводит к инициированию цепного
.
.
окисления за счет появления активных радикалов RO и НО (2,3) без изменения валентного
состояния центрального атома [21]. Весьма важно соотношение гомолитического распада с
.
.
образованием частиц RO и НО , которое определяется способом координации гидропероксида с центральным ионом. Р-450 координирует ROOH, образуя связь между гемовым железом и кислородом НО-группы [20]. Такой же способ координации считается более предпочтительным для ГПК и стеаратов кобальта. Однако на основании данных протонного магнитного резонанса сделан вывод, что при координации ГПК с карбоксилататами кобальта и рутения одинаково вероятна связь молекул ГПК как по кислороду НО-, так и по кислороду
RO-группы.
Гемолитический путь распада комплексов ионов металлов с гидропероксидами приво.
.
.
дит к генерированию радикалов НО , RO и RO 2, каждый из которых может инициировать
цепное окисление любого субстрата. Гемопротеиды можно разделить на три группы по типу
их реакций в гидропероксидных системах: миоглобин, гемоглобин инициируют радикалы из
гидропероксидов и участвуют в одноэлектронном окислении субстратов; пероксидазы и каталазы образуют комплексы I и II, реагирующие по одноэлектронному механизму, а Р-450
.
участвуют в двух направлениях процесса, т.е. генерируют комплексы I и П и радикалы НО ,
.
.
RO и RO 2 [16,21]. Модельные системы чаще всего реагируют по радикальному пути. Однако может реализоваться также двухэлектронное окисление некоторых субстратов системами
Cu+L2-H2O2 [28,29].
Во второй половине XX века усилиями многих исследователей для всех активных
промежуточных частиц, образующихся в ферментативных процессах с участием цитохромов
Р-450, пероксидаз и каталаз, были найдены удовлетворительные химические аналоги [21].
Как правило, модельные химические системы отличаются большим разнообразием реакций
в процессах окисления, что объясняется их произвольной в сравнении с ферментами организацией, и отсутствием тех барьеров, которые имеют ферментные системы для предотвращения нежелательных для клетки радикальных процессов. В большинстве случаев модельные
системы уступают ферментным по способности стабилизировать активные промежуточные
частицы и потенциальные гидроксилирующие агенты, что приводит к генерированию свободных радикалов и цепному окислению редоксактивных лигандов и субстратов.
Общность ферментативных и простых химических цепей переноса электронов состоит
в том, что в обоих случаях реализуется превращение субстратов, сопряженное с окислением
природных (НАДФН, НАДН, тетрагидроптеридины) и экзогенных (аскорбиновая кислота,
тиосалициловая кислота, пиримидины) доноров электронов при активном участии ионов металлов переменной валентности.
ПЕРОКСИДАЗНЫЕ СИСТЕМЫ
Пероксидазы широко распространены в животных, растительных организмах и аэробных микроорганизмах. Особенно богаты ими сок фигового дерева и корень хрена. В организме человека пероксидазы содержатся в слюне, соке поджелудочной железы, печени, почках и лейкоцитах. Пероксидазы катализируют многие реакции в микроорганизмах: дрожжи
содержат цитохром с-пероксидазу (КФ 1.11.1.5), которая отличается высокой субстратной
специфичностью и катализирует только окисление цитохрома с пероксидом водорода. Многие пероксидазы выделены в кристаллической форме: миелопероксидаза из лейкоцитов, цитохром с-пероксидаза из дрожжей, изоформы пероксидазы из корней хрена (КФ 1.11.1.7) и
репы.
Пероксидазы в самых различных реакциях активируют Н2О2 и гидропероксиды ROOH,
но не пероксиды ROOR. В свойствах и действии различных пероксидаз много общего, хотя
имеются также некоторые специфические особенности в отдельных стадиях, катализируемых ими процессов. Наиболее изучена пероксидаза хрена (ПХ), катализирующая окисление
самых разнообразных соединений по уравнению:
В прошлом веке получен огромный экспериментальный материал по составу, строению, свойствам и механизму действия пероксидаз различного происхождения, обобщенный
во многих монографиях и обзорах [8, 21, 32-35] и других. Детально исследованы свойства
различных состояний ПХ и их роль в пероксидазном катализе [8,21].
Состояние 2 - восстановленный фермент. ПХ легко восстанавливается в ферроформу
дитионитом натрия и образуется при взаимодействии окисленного фермента с супероксидным анионом:
Состояние 3 - окисленный фермент. Для него характерно для нативной ПХ, отличающейся известным характерным спектром поглощения. Состояние 6 - оксипероксидаза, или
комплекс III, реализуется при действии большого избытка пероксида водорода на ПХ. Окси.пероксидаза автоокисляется, образуя феррипероксидазу Fe3+ и О2 . Время гибели оксипероксидазы при комнатной температуре составляет несколько минут.
Состояние 5, или комплекс I. Образуется при взаимодействии ПХ с Н2О2, в ходе которого Fe3+ гема переходит в состояние Fe5+ с генерированием оксоиона Fe3+O (см. рис. 2 и 3).
Комплекс I образуется с константами скорости 106-107 М-1с-1 и отличается высокой реакционной способностью по отношению к множеству редокс-активных субстратов [8, 21, 32-35].
Состояние 4, или комплекс II. Комплекс пероксидаз образуется при взаимодействии
ПХ с Н2О2 в присутствии самых разнообразных восстановителей - ароматических аминов,
фенолов, нафтолов, аскорбиновой кислоты, ферроцианида, йодида, нитрита и многих других. Как правило, константы скорости взаимодействия комплекса II с субстратами значительно ниже, чем для комплекса I в реакции с теми же соединениями [8, 21, 32-35].
Во второй половине XX века были выделены и охарактеризованы пероксидазы из разных источников, получены рекомбинантные формы пероксидаз и проведено много работ по
использованию пероксидаз в разных областях (анализ, биотехнология, биосенсоры, тонкий
органический синтез) и исследований механизма действия различных пероксидаз [8, 21, 3235].
Работы нашей лаборатории были посвящены одной из важных проблем пероксидазного катализа - совместному (или сопряженному) окислению пар субстратов "амины-фенолы",
что представляет не только большой фундаментальный интерес, но и имеет практическое и
коммерческое значение в фотометрическом анализе фенолов и нафтолов [36] и особенно в
иммуноферментном анализе множества антигенов и антител [37-39]. В 1990-2005 гг. нами
были проведены детальные кинетические исследования пероксидазного окисления таких
пар, как 4-аминоантипирин (ААП)-галоидзамещенные фенолы [40-42], "люминол-фенолы"
[43, 44], а также совместного окисления хромогенных пероксидазных субстратов (ТМБ,
ФДА и АБТС) со многими замещенными одно- и многоатомными фенолами, их полидисульфидами, замещенными аминофенолами и флавоноидами гликозидной и негликозидной
природы [45-58].
Совместное пероксидазное окисление аминов и фенолов в зависимости от их природы
и условий (рН и состав среды) может отличаться большим ростом скорости окисления аминов, как в случае пар "ААП-фенолы" и "люминол-фенолы" [40-44], или четко выраженным
ингибированием окисления аминов, интенсивность которого определяется природой аминов
и строением замещенных фенолов, их полидисульфидов, аминофенолов и флавоноидов [45-
61]. Главными задачами наших исследований было изучение механизмов инициирования
свободных радикалов, измерение скоростей их образования и ингибирование биохимических процессов зарождения этих радикалов в присутствии пероксида водорода и гидропероксидов ROOH с участием ПХ, других гемопротеинов, гемина и метгемальбуминов. Для
практики важно предотвратить или подавить генерирование высокотоксичных свободных
радикалов в реальных биохимических системах и их моделях. Для оценки скоростей инициирования радикалов in vitro и эффективности потенциальных ингибиторов (биоантиоксидантов) мы использовали метод ингибиторов свободнорадикальных реакций в жидкой фазе,
разработанный покойным академиком Н.М. Эмануэлем и его сотр. [62], а также метод конкурирующих реакций (МКР) активных радикалов с их акцепторами, в качестве которых мы
использовали амины ТМБ, ФДА и АБТС, и ингибиторами свободнорадикальных процессов
фенольной природы.
Для количественной характеристики ингибирования пероксидазного окисления аминов
замещенными фенолами использовали константы ингибирования Кi в мкМ, определенные
известными методами [63], продолжительность периодов индукции в накоплении продуктов
окисления аминов ∆τ в случае их наличия и стехиометрические коэффициенты ингибирования f, означающие число радикальных частиц, гибнущих на одной молекуле ингибитора.
Для вычисления f использовали известные соотношения из теории метода ингибиторов [62]:
где ∆ τ- продолжительность периода индукции, vi -скорость инициирования радикалов,
приближенно равная начальной скорости окисления амина v0 в отсутствие ингибитора и
[IпН]0 - начальная концентрация ингибитора. Детали метода многократно описаны в наших
работах [45-61].
В сопоставимых условиях исследованы принципиально различающиеся биохимические системы двух типов:
пероксидазная, включающая ПХ в качестве биокатализатора, Н2О2 в качестве окислителя, ТМБ, ФДА или АБТС в качестве восстанавливающих субстратов и ингибиторы (InH)
разной природы и разного строения (замещенные фенолы, их полидисульфиды, аминофенолы и флавоноиды гликозидной и негликозидной природы);
псевдопероксидазная, включающая метгемальбумины (МетНа) в качестве биокатализаторов, Н2О2 или гидропероксид трет-бутила (ROOH) в качестве окислителей, ТМБ или
ФДА в качестве акцепторов
свободных радикалов и ингибиторы разной природы и
строения
Выбор акцепторов свободных радикалов АБТС,
ТМБ и ФДА, формулы которых представлены ниже, определяется их широким
применением как субстратов
ПХ во многих биоаналитических методах (иммуноферментный анализ, иммуноцитохимия и др.), что объясняется простотой и высокой точностью спектрофотометрического определения
хорошо охарактеризованных
продуктов окисления этих
соединений, спектры погло-
щения которых не перекрываются с полосами поглощения самих субстратов. Это важное обстоятельство и высокие молярные коэффициенты поглощения продуктов окисления ТМБ,
ФДА и АБТС обеспечивают надежный, высокоточный и простой мониторинг расходующихся субстратов при их окислении с участием ПХ или метгемальбуминов.
Далее проведен сравнительный анализ полученных данных, сопоставление исследованных ингибиторов по их эффективности в пероксидазном окислении трех
субстратов и даны рекомендации по использованию отобранных ингибиторов в
качестве стоп-реагентов пероксидазного
окисления или в качестве калибраторов в
тест-системах общей антиоксидантной активности (ОАА) биологических жидкостей
(сыворотка крови человека, соки, продукты
питания, вина, природные биологически
активные вещества и т.д.).
В качестве потенциальных ингибиторов пероксидазного окисления ТМБ, ФДА и АБТС
были использованы замещенные производные одно-, двух- и трехатомных фенолов (рис. 4),
полидисульфиды замещенных фенолов (рис. 5), аминофенолы и их замещенные производные (рис. 6), а также флавоноиды гликозидной и негликозидной природы и водорастворимый аналог токоферола ТМХ (рис. 7). Далее использованы сокращенные символы фенольных соединений, приведенные на рис. 4-7, а также в табл. 1-4.
На основании литературных сведений и обширного экспериментального материала
[45-61] предложена общая схема сопряженного окисления пар "амины-фенолы", катализируемого ПХ (Е) с участием ее активных форм - комплексов I (EI) и II (ЕП) и использованием
следующих обозначений: AmNH2 - амины, PhOH - фенолы, Р1 и Р2 - продукты окисления
фенолов и аминов соответственно, Р3 - продукт совместного окисления аминов и фенолов.
Схема включает ферментативные и неферментативные стадии:
Первая реакция гетеролитического расщепления Н2О2 происходит практически необратимо с высокой константой скорости ~107 М-1 с-1 и образованием высокоактивного соединения I, содержащего гемовое железо в высшей степени окисления Fe5+O2- (EI). EI реагирует
по радикальному механизму с фенолами (реакция 2) или с аминами (реакция 2*) с образованием соединения ЕП с формальной структурой Fe4+ O2-, которое восстанавливается до исходного состояния Е по реакциям 3 и 3* с образованием феноксильных и аминильных радикалов соответственно.
Таким образом, каталитический, многократно повторяющийся цикл сопряженного пероксидазного окисления аминов и фенолов представляет собой совокупность радикальных
реакций, в ходе которого зарождаются и гибнут радикальные частицы - Комплексы пероксидазы I и II и первичные продукты окисления фенолов и аминов – фенок-сильные и аминильные радикалы.
.
В
неферментативных
стадиях
сопряженного окисления аминов и
фенолов образуются продукты реакции
Р1, Р2 и Р3 и происходит обменная
реакция феноксильных и аминильных
радикалов (5), открытая Н.М. Эмануэлем
и сотр. [64, 65], направление которой
существенным
образом
определяет
характер сопряженного окисления пар
"амины-фенолы": окисление
аминов
ускоряется, если реакция идет слева направо или ингибируется, если реакция (5)
идет справа налево. Во втором случае
могут появляться периоды индукции в
образовании продукта окисления амина
до тех пор, пока полностью не
израсходуется весь фенол [45-58].
Практика показала, что использованные величины Ki ∆τ и f адекватно отражают существо сопряженного процесса пероксидазного окисления пар "аминыфенолы" [45-61]
Константы ингибирования Кi определяли для разных типов ингибирования конкурентного, неконкурентного, смешанного и бесконкурентного. Тип и величина
констант ингибирования зависели от многих факторов. При конкурентном ингибировании амин и фенол конкурируют за связывание с активным сайтом ПХ и в реакциях с активными формами ПХ EI и ЕII,
при неконкурентном -только в реакциях с
EI и ЕП, при смешанном - частично конкурируют за связывание в гидрофобном канале фермента и в реакциях с его активными формами EI и ЕП. На величины Кi
сильно влияли перечисленные ниже факторы: температура, значение рН использованного буфера, присутствие и концентрация органических сорастворителей, присутствие примесных белков и ловушек
свободных радикалов – маннитола, первичных спиртов и др. По перечисленным причинам величины Кi носят эффективный характер и отражают влияние многих факторов на пероксидазный процесс.
Важно отметить также, что в большинстве случаев использованные в качестве ингибиторов фенольные соединения сами являются субстратами пероксидазы, что может стать поводом для формальных претензий к термину "ингибиторы" по отношению к фенолам, хотя
их ингибирующая роль в окислении аминов не только доказана, но и очевидна
Многие из мономерных замещенных
фенолов (табл. 1 и 2) - субстраты ПХ. Нами
получены прямые доказательства того, что
субстратами ПХ являются также полимерные
фенолы, например поли(ДСГ). Ниже представлены бимолекулярные константы скорости взаимодействия поли(ДСГ) и аналога его
мономерного звена ГК с комплексами I (k2) и
II (к3) пероксидазы при 25°С в 0.01 М ФБ, рН
6.0 [54]:k2 равны 2.9 х 106 и 3.0 х 107, а к3 - 1.5
х 105 и 2.4 х 106 М-1 с-1 для ГК и поли(ДСГ)
соответственно.
Как видим, поли(ДСГ) реагирует с EI с
константой скорости, в 10.3 раза превышающей ее величину для мономерной ГК, что в
1.47 раза больше числа мономерных звеньев в
поли(ДСГ), т.е. поли(ДСГ) является носителем синергического увеличения реакционной способности по отношению к EI. Синергический эффект наблюдался также для
константы к3 и составлял 2.28 раза. Установленное явление нестандартного усиления реакционной способности поли(ДСГ) в сравнении с ее величиной для суммы мономерных
звеньев названо "внутримолекулярным синергизмом" [54].
Далее приведен анализ ингибирования пероксидазного окисления трех субстратов - ТМБ,
ФДА и АБТС.
Системы "ПХ-ТМБ-InH" охарактеризованы в табл. 1: величины Кi представлены в порядке их увеличения для разных фенольных соединений, что соответствует снижению ингибирующей способности в пероксидазном окислении ТМБ при 20°С в среде соответствующего буфера с определенным рН в присутствии или без органического сорастворителя, использование
которого связано с ограниченной растворимостью ТМБ и ингибиторов.
Как видно из табл. 1, при рН < 7 максимальную ингибирующую эффективность обнаружили полимерные фенолы - поли(ДСР) и поли(ДСГ) с величинами Кi 0.78 и 1.3 мкМ соответственно: однако расчет Кi на одно мономерное звено дает 0.78 х 15 = 11.7 и 1.3 х 7 = 9.1 мкМ в
первом и втором случае соответственно. По этой причине рекордная ингибирующая эффективность принадлежит флавоноиду кверцетину (см. рис. 7), величина Кi для которого при рН 6.8
равна 2.2 мкМ, а при рН 7.4 - 0.53 мкМ. Другой флавоноид морин уступает кверцетину (Кi =
22.5 мкМ), так как его радикал-акцептирующие НО-группы в кольце В находятся в метаположении в отличие от кверцетина, у которого эти группы в орто-положении. Как видим, незначительные, на первый взгляд, структурные отличия двух флавоноидов приводят к сильному
уменьшению ингибирующей способности морина. Флавоноиды гликозидной природы астрагалин, нарингин и гесперидин не обнаружили высокой ингибирующей эффективности в
пероксидазном окислении ТМБ: Кi для астрагалина всего лишь 310 мкМ, а ингибирующее действие нарингина и гесперидина еще меньше. Гликозидные флавоноиды, судя по всему, не попадают в гидрофобный канал ПХ из-за удовлетворительной растворимости в водных средах, а углеводы, как известно, вообще не являются субстратами пероксидаз.
Кверцетин и морин имеют хорошие перспективы для практического применения при ингибировании пероксидазных реакций и других радикальных процессов, что не является неожиданным, так как высокая антиоксидантная активность растительных флавоноидов хорошо известна и в существенной степени определяет их выраженные антиаллергические, антиканцерогенные, противовоспалительные и противовирусные свойства [66, 67].
Наиболее активные ингибиторы, представленные в верхней части табл. 1, как правило, содержат несколько радикал-акцептирующих групп: ГК -три, IпН6 - три, IпН8 - четыре, ПГ - три,
IпН9 -две, IпН5 - две, ТМГХ - две. Замыкают табл. 1 астрагалин и InH10 - гликозид и пространственнозатрудненный пирокатехин, возможно, не попадающие в активный центр ПХ.
Блокирование радикал-акцептирующих НО-групп приводит к снижению ингибирующей
активности фенольных соединений. Это четко проявляется при использовании 2,4-ди-нитрозорезорцина (ДНР), для которого получена Ki равная 110 мкМ, так как обе гидроксильные группы образуют водородные связи с соседними нитрозо-группами, что приводит к сильному
снижению реакционной способности ДНР по отношению к радикальным частицам. В полидисульфиде ДНР (поли(ДСДНР)) водородные связи частично разрушаются, что способствует
относительно высокой ингибирующей эффективности этого полимера (Kt = 13.5 мкМ).
Большой интерес представляют потенциальные ингибиторы пероксидазных реакций, содержащие в одной молекуле НО- и NН2-группы, каждая из которых способна акцептировать
свободные радикалы.
В системах "ПХ-ТМБ-аминофенолы" (табл. 2): величины К{ представлены в порядке
их увеличения для аминофенолов разной структуры (рис. 6). Наиболее высокую ингибирующую эффективность в пероксидазном окислении ТМБ проявляли поли(2-аминодисульфид-4нитрофенол) (поли(АДСНФ)) и поли(З-аминодисульфид-фенол) (поли(АДСФ) с величинами
Кх 18 и 30 мкМ соответственно. Величины Кi в расчете на одно мономерное звено этих полидисульфидов возрастали до 285 мкМ в случае поли(АДСФ). Среди мономерных аминофенолов наибольшую ингибирующую эффективность обнаружили АДТБФ (36 мкМ) и IпНЗ (бутаминофен, 46 мкМ). АТБФ характеризовался величиной Кi 98 мкМ, т. е. существенно уступал
по эффективности ингибирования АДТБФ.
Примечательно, что АТБФ с Кi 98 мкМ почти в два раза превосходит по эффективности
ингибирования окисления ТМБ свой структурный аналог IпН5 (см. табл. 1): то есть соседние
НО- и NН2-группы в АТБФ эффективнее двух соседних НО-групп в IпН5
(Кi 188 мкМ) или 4-трет-бутилзамещенный 2-аминофенол эффективнее 4mpem-бутил-пирокатехина.
Четыре аминофенола АФ-1-АФ-4
(см. рис. 6) не обнаружили ингибирующей способности в окислении
ТМБ, что связано, вероятно, с образованием водородной связи единственной НО-группы с кислородом карбонильной группы. Отметим, что не
имеющий такой карбонильной группы
IпНЗ (бутаминофен) удовлетворительно ингибировал пероксидазное
окисление ТМБ (Кi = 46 мкМ), так как
НО-группа в его молекуле доступна
для радикалов.
Системы "ПХ-ФДА-InH" представлены в табл. 3, из которой следует,
что максимальную ингибирующую
способность в пероксидазном окислении ФДА обнаружили IпН6 и ТМГХ,
содержащие 3 и 2 радикал-акцептирующие центра Флавоноиды морин и
нарингин и трет-бутил-замещенные
пирокатехины InH5, InH9 оказались
слабыми ингибиторами, a InH10 вообще не проявил ингибирующих
свойств в пероксидазном окислении
ФДА. Гликозид ТМХ (см. рис. 7)
также оказался слабым ингибитором
окисления ФДА.
Системы "ПХ-АБТС-InH" рассмотрены в табл. 4, из которой следует, что максимальную ингибирующую способность в пероксидазном окислении АБТС проявили полидисульфид
пропилгаллата (поли(ДСПГ)) и дисульфид IпН8, содержащий 4 НО-группы, потенциально
участвующих в акцептировании радикалов. Удовлетворительную ингибирующую активность
показали ПГ, ТМГХ и замещенный пирокатехин 1пН6. Замещенные пирокатехины 1пН9 и
InH10 не ингибировал и пероксидазное окисление АБТС вообще.
Все изученные в пероксидазных реакциях ингибиторы расположены в 4 ряда по убывающей эффективности ингибирующего действия (по возрастающей величине Кi или, в ряде
случаев, по глубине ингибирующего действия в пероксидазном окислении трех субстратов).
Анализ четырех приведенных последовательностей показывает, что одни и те же или сходные
ингибиторы возглавляют ряды и одни и те же ингибиторы их замыкают в пероксидазном окислении
всех трех субстратов. Во всех случаях явными
'аутсайдерами" являются замещенные пирокатехины IпН9 и InH10, флавоноиды гликозидной природы, гликозид ТМХ и мета-аминофенол. Возглавляют ряды полидисульфиды замещенных фенолов,
кверцетин, пропилгаллат, АДТБФ, IпНЗ (бутаминофен).
На основании обширного экспериментального
материала [45-61] можно дать конкретные рекомендации по практическому использованию пар
субстрат-ингибитор в пероксидазном окислении:
1. При массовых и автоматизированных определениях многих антигенов методом
иммуноферментного анализа целесообразно использовать пары ТМБ-поли(ДСР), ТМБполи(ДСГ), ТМБ-поли(ДСПГ), ТМБ-кверцитин, АБТС-поли(ДСПГ), АБТС-IпН8, в которых указанные ингибиторы выполняют функцию стоп-реагента в микромолярных концентрациях и являются безвредными, устойчивыми и дешевыми реагентами;
2. В тест-системах общего антиоксидантного статуса биологических жидкостей целесообразно использовать следующие пары субстрат-ингибитор (калибратор): АБТСIпН8, АБТС-ТМГХ, АБТС-ПГ; ФДА-IпН5, ФДА-InHl, ФДА-IпН6;ТМБ-ТМГХ, ТМБIпН6, ТМБ-IпН8, ТМБ-АТБФ, ТМБ-АДТБФ, в которых ингибиторы показывают умеренную активность, сопоставимую с ингибирующими потенциями биологических жидкостей, а хромогенные субстраты АБТС,ТМБ и ФДА обеспечивают надежный спектро-фотометрический мониторинг пероксидазной активности калибровочных растворов и
тестируемых проб.
Характер влияния фенолов на пероксидазное окисление аминов существенным образом зависит от обменной реакции (5) в схеме сопряженного окисления пар "амины-фенолы":
если реакция идет слева направо, то наблюдается ускоренное окисление амина и регенерация фенола, как при окислении пар ААП-галоидзамещенные фенолы [40-42] и люминолзамещенные фенолы [43, 44] (первый вариант); если реакция идет справо налево, то наблюдается ускоренное окисление фенола и регенерация амина, т.е. ингибирование его окисления,
как это происходит при окислении пар ТМБ, ФДА и АБТС со многими замещенными фенолами и их полидисульфидами [45-61] (второй вариант). Ясно, что для предсказания характера
взаимного влияния фенолов и аминов в пероксидазном процессе их сопряженного окисления
необходимо знать константы скорости обменной реакции в обоих направлениях для каждой
из пар "амин-фенол". Величины этих констант скорости, чаще всего, не известны. По этой
причине до сих пор подбор активаторов ("усилителей") окисления ароматических аминов, с
одной стороны, и эффективных ингибиторов превращения аминов, с другой стороны, проводится эмпирическим путем, тем более что не только неферментативная обменная реакция определяет общее направление сопряженного окисления пар "амин-фенол".
В этой связи было важно найти такие пары "амин-фенол", в которых при изменении условий окисления (рН среды, органический сорастворитель, мицеллы вместо буферного рас-
твора и т.д.) один из компонентов был бы как ускорителем, так и ингибитором окисления второго компонента при изменении условий, т.е. необходимо изучить окисление одного и того же
амина с разными фенолами в различных условиях. В табл. 5 сопоставлено влияние монофенола (2-амино-4-нитро-фенол (АНФ)), дифенола (4,4'-диоксидифенил-сульфон (ОФС)), трехатомного фенола (галловая кислота (ГК)) и их полидисульфидных производных - поли(АДСНФ), поли(ДСОФС), поли(ДСГ) на пероксидазное окисление ТМБ в буферных растворах и обращенных мицеллах ПАВ в органических растворителях. ГК и ее полидисульфид
эффективно ингибируют окисление ТМБ как в водной среде, так и в обращенных мицеллах
АОТ в гептане [46, 48, 59], дифенол (ОФС) и его полидисульфид эффективно активируют
окисление того же амина как в водной среде, так и в обращенных мицеллах АОТ. Особый интерес представляет монофенол (АНФ) и его полидисульфид, которые ингибируют окисление
ТМБ в водном растворе, но значительно активируют превращение этого амина в обращенных
мицеллах АОТ в гептане, а при определенных концентрациях ингибируют окисление ТМБ в
смешанных обращенных мицеллах АОТ-Тритон Х-100, т.е. меняют характер своего влияния
на пероксидазное превращение ТМБ в зависимости от среды от глубокого ингибирования реакции до ее существенной активации [60].
Из анализа полученных нами данных [40-61] и схемы сопряженного окисления пар
"ароматические амины-фенолы" следует, что общий характер пероксидазного окисления таких пар определяется многими факторами [54, 60]: во-первых, реакционной способностью
аминов и фенолов по отношению к пероксидазным комплексам I и II (константами скорости
реакций (2) и (2*), (3) и (3*)); во-вторых, начальными концентрациями фенола и амина или их
.
соотношением; в-третьих, реакционной способностью феноксильных (PhO ) и аминильных
.
(AmNH ) радикалов в обменной реакции (5), т.е. значениями констант к5 (реакция слева направо) и к_5 (реакция справа налево); в четвертых, стационарными концентрациями комплексов I и II в конкретном пероксидазном процессе сопряженного окисления пар "аминыфенолы" и, в-пятых, средой проведения сопряженного пероксидазного окисления аминов и
фенолов, что доказано нами на примере пар "ТМБ-поли(АД-СНФ)" (см. табл. 5).
По принципиально отличному от выше описанного механизму реализуется активация
пероксидазного окисления хромогенных субстратов АБТС, ФДА и ТМБ органическими основаниями [68-73]. Активаторы этого типа являются нуклеофилами, меняют рК функциональных групп пероксидазы и расширяют рН-оптимум каталитической активности фермента. В
качестве активаторов в проведенном нами цикле исследований [68-73] были использованы 2-
аминотиазол, меламин, тетразол, 5-аминотетразол и ещё 9 замещенных производных тетразола [71-73]. Характер зависимостей начальной скорости окисления аминов от их начальных
концентраций в присутствии разных концентраций активаторов, как правило, подтверждал
бесконкурентный тип активации пероксидазного окисления субстратов: кинетические параметры реакции в присутствии активатора (А) кaкат и Кам симбатно возрастают, а их зависимости от концентрации активатора хорошо описываются уравнениями:
где [А]о - начальная концентрация активатора, а -коэффициент (степень) активации процесса, означающий увеличение кинетических параметров Кaкат и Кaм при концентрации активатора 1 М. Линейные зависимости кинетических параметров от начальной концентрации активатора позволили во всех случаях вычислить коэффициент а. В табл. 6 сравнены коэффициенты а для разных активаторов при пероксидазном окислении АБТС, ФДА и ТМБ. Выбор активаторов определялся их свойствами, указанными ниже.
2-Аминотиазол характеризуется свойствами ароматических аминов и ярко выраженной
нуклеофильностью при рН ≥ 6, а также легкостью электрофильного замещения в положении 5.
Выбор меламина обусловлен сильной зависимостью его нуклеофильности от рН и широким
применением этого соединения в самых разных производствах, что обусловливает необходимость его аналитического определения. Выбор тетразолов, структурные формулы которых
представлены ниже, связан с их строением и амбидентными свойствами как нуклеофилов:
тетразол (Т) и 5-аминотетразол (5-АмТ) имеют ароматический характер и являются NHкислотами средней силы и одновременно слабыми основаниями:
Окисление всех трех субстратов активировалось
при рН > 6. Меламин при рН < 5 из-за протонирования
трех аминогрупп теряет свойства нуклеофила и превращается в ингибитор пероксидазного окисления ФДА.
Коэффициент активации а сильно зависит от рН среды и отражает изменение нуклеофильности активаторов
с увеличением рН. При всех рН в диапазоне 6.0-7.4 коэффициент а для ФДА выше, чем для ТМБ, т.е. эффективность активации одним и тем же нуклеофилом (меламином) зависит от природы окисляемого амина [68,
69]. Для 2-аминотиазола и меламина изменения величины а не велики и находятся в пределах одного порядка- (1.9-3.54) х 103 М-1 (см. табл. 6). Это
означает, что меламин и 2-аминотиазол влияют на пероксидазу как нуклеофилы приблизительно одинаковой силы. Считается, что в большинстве случаев лимитирующей стадией
пероксидазного процесса является взаимодействие комплекса II (ЕП) пероксидазы с молекулой восстанавливающего субстрата (реакции 3 и 3* в схеме сопряженного окисления):
Мы считаем, что промотирующее действие активаторов-нуклеофилов на пероксидазное окисление ТМБ и ФДА связано с их влиянием именно на реакцию (3*). Нельзя исключать,
что лимитировать скорость этой реакции может не перенос электрона, а перенос протона в
активном центре ПХ, для чего в последнее время имеются веские основания [74]: в таком
случае нуклеофилы ускоряют перенос протона в активном центре ПХ по механизму кислотно-основного катализа.
На основании полученных данных по
активации меламином пероксидазного окисления ТМБ нами предложен метод количественного определения меламина в растворе в
интервале его концентраций 0.08-1.0 мМ,
который имеет ряд несомненных преимуществ перед известными методиками: метод
является экспрессным, простым и реализуется с использованием простейших спектрофотометров (колориметров) при измерении
оптической плотности растворов, содержащих меламин, ~455 нм [70].
Активирующее действие всех тетразолов на окисление ТМБ носило бесконкурентный характер и охарактеризовано коэффициентом а при рН 6.4 и 7.2. Коэффициенты α при окислении ТМБ снижались в следующем ряду АмТ > МеТ > > БТ > ДТП > Т > PhH > ДТЭ > ДМАЭТ > CF3-T и менялись от
3750 для АмТ до 62 М-1 для ДТЭ при рН 7.2 [73]. При окислении ТМБ в присутствии тетразолов наблюдается хорошая корреляция между величинами lgα и константами Гам-мета σ мета
для мета-заместителей в бензольном ряду NH2, CH3, С6Н5 и CF3 [72]. Показано полное соответствие уменьшения коэффициента а и снижения нуклеофильности тетразолов, которое
определяется изменением электрон-донорных и электрон-акцепторных свойств заместителей, выраженных в виде констант Гам-мета σмета.
Таким образом, активация пероксидазного окисления хромогенных субстратов может
быть достигнута двумя совершенно разными путями: при сопряженном превращении ароматических аминов с замещенными фенолами и их полидисульфидами [54, 60] и при введении в реакционную среду азотсодержащих органических оснований (2-аминотиазола, меламина, тетразола и его 5-замещенных производных) [68-73].
ПСЕВДОПЕРОКСИДАЗНЫЕ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ
СИСТЕМЫ
Псевдопероксидазными принято называть системы, содержащие в качестве биокатализаторов гемин, метмиоглобин, метгемоглобин или метгемальбумины (МетНа) и Н2О2 или органический гидропероксид (ROOH) в качестве окислителей. Нами проведен цикл исследований
по инициированию и ингибированию радикальных процессов в системах "гемин (метгемальбумины)-Н2О2(RООН)", результаты которых подробно изложены в работах [75-83]. На
основании полученных данных предложена
схема инициирования радикалов в системах на
основе гемина и его комплексов с альбуминами. В схеме обозначены: PFe3+ - гемин или его
комплекс с бычьим сывороточным альбумином (БСА), AmNH2 - ароматический амин,
.
R -реакционноспособная радикальная частица,
Р -продукт превращения ароматических аминов, ОР -органический растворитель,f5 и f6 - стехиометрические коэффициенты взаимодейст.
вия R с БСА и ОР соответственно.
На начальной стадии процесса происходит образование метгемальбумина (1) и инициирование свободных радикалов (2-3). Реакции (4-6) - стадии линейной гибели радикалов на молекулах аминов, альбуминов и органических сорастворителей. В соответствии
с предложенной схемой пе-роксидный комплекс X может распадаться как гетеролитически (3'), так и гомолитически (3", 3'"), в отличие от пероксидазного комплекса, распадающегося только гетеролитически.
Псевдопероксидазные системы "гемин(метгемальбумины)-Н2О2-(AmNH2)" были
использованы в качестве тестирующих потенциальные ингибиторы фенольной природы
[77, 78]. Метод конкурирующих реакций радикалов, образующихся в гем-белковых пероксидных системах, с ТМБ (или ФДА), с одной стороны, и с ингибиторами InHl, InH2 и поли(ДСГ), с другой стороны, был успешно использован нами для характеристики последних.
Очень важно отметить, что все три ингибитора эффективно взаимодействуют с БСА. В
табл. 7 приведены константы ассоциации гемина и фенольных ингибиторов с БСА. Как видно, величины Кa для четырех лигандов меняются в пределах одного порядка: Кa максимальна
для гемина и несколько ниже для InHl.
В соответствии с приведенной выше схемой активные радикалы взаимодействуют с
амином, ингибитором и альбумином, а также с органическим сорастворителем.
Из всех испытанных нами пар "акцептор радикалов-ингибитор" для тест-систем определения ОАА сыворотки крови человека были отобраны три: ТМБ-поли(ДСГ), ТМБ-InHl и
ФДА-InHl, а затем по совокупности всех требований к тест-системам ОАА биологических
жидкостей из трех использована последняя ФДА-InHl. После оптимизации эта система в
окончательном варианте характеризуется следующими компонентами и их концентрациями:
среда- ЗФР, рН 7.4, с содержанием 2% ДМСО;
компоненты - 10 мкМ метгемальбумина, 2 мМ Н2О2, 1 мМ ФДА и различные концентрации InHl [81]. Система прошла лабораторные испытания и использована для определения
ОАА сыворотки крови здоровых лиц и
больных с разными патологиями [81].
При 20°С в ЗФР, рН 7.4, с содержанием 5% этанола и 0.25% ДМФ с использованием 10 мкМ комплекса гемин-БСА
(1: 3) и 6 мМ Н2О2 показано ингибирующее действие АТБФ в окислении ФДА,
характеризующееся константой ингибирования Кi равной 1.26 х 10-4 М. Сравнимым ингибирующим эффектом в этих условиях характеризуется также АДТБФ. Бутаминофен (IпНЗ) не обнаружил ингибирующего действия в окислении 0.8 мМ
ФДА вплоть до концентраций 10 мкМ
IпНЗ (см. табл. 8).
Ингибирующий эффект в псевдопероксидазной системе обнаружили при
окислении ФДА аминофенолы АФ-1 и
АФ-2, а также гликозидные флавоноиды - нарингин и гесперидин. Напомним, что в пероксидазной системе эти соединения не показали ингибирующей активности в окислении ТМБ,
что объясняется другой природой радикальных частиц в пероксидазном процессе.
В псевдопероксидазных системах часто затруднительно определить константу ингибирования для некоторых фенольных соединений. По этой причине ряд убывающей активности исследованных ингибиторов носит пока что предварительный (полуколичественный) характер: поли(ДСГ) >InHl > InH2 > АТБФ > АДТБФ > АФ-2> АФ-1 >нарингин = гесперидин >
IпНЗ.
Пероксидазная активность ферритина в окислении ароматических аминов [84-91].
Ферритин -железосодержащий олигомерный белок с мол. массой ~500кДа, широко распространен в тканях животного и растительного происхождения. Апоферритин большинства белков состоит из 24 суъ-единиц, образующих сферу, внутри которой имеется полость, способная
принять и сохранять в виде кластера до 4000 атомов железа. Большая часть ферритина содержится внутри клетки, а небольшие, но клинически значимые количества этого белка находятся
в сыворотке крови. Повышенный уровень ферритина выявляется при первичной или вторичной перегрузке железом, многих заболеваниях печени, лейкемии, ревматоидном артрите, неспецифических тканевых повреждениях и злокачественных процессах.
Показано, что функция сохранения и транспорта железа в организме является далеко не
единственной для ферритинов разного происхождения. Ферритины участвуют во многих важнейших процессах клеток всего организма, и в частности, катализируют некоторые окислительно-восстановительные реакции: апоферритин ускоряет окисление ионов Fe2+ молекулярным кислородом до состояния Fe3+; сам ферритин проявляет су-пероксиддисмутазную актив.ность, ускоряя диспропорционирование анион-радикалов О 2 до Н2О2 и О2; железо ферритина
участвует в инициировании перекисного окисления липидов (ПОЛ) и разрушает гидропероксиды липидов на токсичные активные радикалы. В 1987 г. нами впервые было показано, что
ферритин в присутствии пербората натрия может окислять о-дианизидин, т.е. проявляет каталитическую активность в окислении типичного субстрата пероксидазы [92]. Механизмы окислительно-восстановительных реакций с участием ферритинов долгое время оставались не изученными. В конце 90-х годов XX века в нашей лаборатории была детально исследована пероксидазная активность ферритина из селезенки лошади в окислении 5 ароматических аминов бензидина (БД), бензидинсульфата (БДС), о-толидина (ТЛ), ТМБ и ФДА [84]. В качестве
окислителей использовали Н2О2, гидропероксид трет-бутила (ГПТБ) и гидропероксид кумила
(ГПК).
Каталитическая эффективность ферритина в окислении ТМБ пероксидом водорода
(ккат/Км) характеризуется при 20°С и рН 4.2 величиной, равной 2.82 х 103 М-1 с-1, что сопоставимо по порядку с феррооксидазной эффективностью апоферритина в окислении Fe2+ кислородом. При катализе ферритином пероксидазного окисления метилзамещенных бензидинов
имеет значение не число метальных заместителей, а их влияние на окислительновосстановительные характеристики этих соединений. Использованные окислители по своей
активности располагаются в такой последовательности Н2О2 > ГПТБ > ГПК, что полностью
соответствует относительной реакционной способности образующихся из них радикалов: НО*
> RO' (ГПТБ) > RO* (ГПК) во многих бимолекулярных реакциях.
Количественный подход к характеристике стадий инициирования радикалов в системе
"ферритин-ROОН(Н2О2)-амины" позволяет оценить их истинную "радикальную токсичность",
а также реакционную способность радикалов по отношению к различным ксенобиотикам.
Важной проблемой в механизме каталитического действия ферритина было выяснение
возможной роли апобелка в процессе биокатализа. С этой целью изучено влияние температуры, ПАВ разной природы и органических растворителей на структуру и пероксидазную активность ферритина [86, 87]. В результате кинетических исследований влияния перечисленных факторов на пероксидазное окисление ТЛ, ТМБ и ФДА с участием ферритина была доказана важная роль апобелка в реализации его пероксидазной функции: апоферритин участвует
в координации отдельных ионов Fe3+ карбоксильными группами остатков глутаминовой кислоты или другого лиганда. Лимитирующей стадией инактивации ферритина является разрыв
координационных связей ионов железа с апобелком. Из данных, полученных методом кругового дихроизма (КД), следует что при термоинактивации ферритина резко снижается содержание α-спиральных участков белка и наблюдается сначала его обратимая инактивация, а за-
тем необратимая денатурация.
Активность ферритина в окислении ФДА и ТМБ пероксидом водорода в обращенных
мицеллах АОТ в гептане значительно ниже, чем в водной среде [87]. Формальное рассмотрение
Км по субстратам-восстановителям (ТМБ, ФДА) не дает оснований для утверждений о каких-либо затруднениях при их взаимодействии с ферритином в мицеллах АОТ. В случае
окислителей (ГПТБ, ГПК) такие затруднения есть, но в то же время мицеллы способствуют
прочному и продуктивному связыванию с ферритином гидропероксида Тритона Х-45.
Главная причина снижения пероксидазной активности ферритина в обращенно-мицеллярной
среде связана с модуляцией мицеллами его конформации [87].
Впервые без восстановления ионов железа из молекулы ферритина был выделен железосодержащий кластер (Fе3+-кристаллит) с использованием микроэмульсии АОТ в гептане и
охарактеризована его каталитическая активность в окислении ТМБ пероксидом водорода в
терминах ккат и отношения (ккат/Км), которая оказалась сравнимой с активностью цельного
ферритина в обращенных мицеллах АОТ в гептане, но почти в 500 раз ниже активности
цельного белка в ацетатном буфере, рН 4.2, что подтверждает важную роль апобелка в катализе [89-91]. Каталитическая активность ферритина в окислении ТМБ пероксидом водорода
была реконструирована с использованием изолированного Fе3+-кристаллита, смешанных обращенных мицелл ПАВ в гептане и экстралигандов -аминокислот, предположительно координированных с ионами Fe3+ ферритина (тирозин, гистидин и др.) [89-91].
Установлен тип и определены константы ингибирования Кi окисления ТМБ перокси.
дом водорода с участием ферритина как ловушек свободных радикалов НО - этанола и маннитола, анионов F-, а также для мочевины, биурета, галловой кислоты и их полидисульфидных производных поли(ДСМ), поли(ДСБ), поли(ДСГ), а также для полидисульфида тиомочевины поли(ДСТМ) (см. табл. 9). Эффективность ингибирующего действия полидисульфидных антиоксидантов резко возрастает в ряду поли(ДСМ) < поли(ДСБ) < поли(ДСТМ) <
поли(ДСГ), определяемом реакционной способностью мономерных звеньев по отношению к
радикалам НО' [84, 88].
Впервые был количественно доказан "внутримолекулярный" синергизм ингибирующего
действия полидисульфидных антиоксидантов (неаддитивность антирадикальной активности по
отношению к своим мономерным аналогам), количественный параметр которого у возрастает от 1.5 до 5.18 в ряду полимерных антиоксидантов поли(ДСГ) < < поли(ДСМ) < поли(ДСБ)
[88] (см. табл. 9).
Общая схема действия системы "ферритин-H2O2(ROOH)" аналогична уже представленной в этом разделе схеме псевдопероксидазного процесса: железосодержащий перок.
.
сидный комплекс разрушается с генерированием радикалов НО 2 и НО , которые атакуют
субстраты и/или ингибиторы, связанные с апоферритином в его каналах вблизи Fе3+.
центров железосодержащего кластера [88]. Если ловушки радикалов НО , такие, как этанол и
маннитол, не связываются с апоферритином в области активных центров, эффективность их
.
ингибирующего действия невелика, так как не все радикалы НО выходят в объем растворителя. Большим преимуществом полидисульфидных антиоксидантов является их связывание с
апоферритином в области активных центров Fе3+-кластера, что резко повышает эффектив.
ность ингибирующего действия, так как радикалы НО , реагируют с ингибиторами, прежде
чем выйти в объем растворителя.
Многократное увеличение ингибирующей эффективности полидисульфидных антиоксидантов в сравнении с мономерными звеньями (табл. 9) и синергизм их ингибирующего действия делают полидисульфидные ингибиторы перспективными для торможения свободнорадикальных процессов в биохимических системах.
Главное отличие системы "ферритин-Н2О2" от пероксидазной состоит в том, что пероксидный комплекс в первой преимущественно превращается по гомолитическому (радикальному) механизму, а во второй - по гетеролитическому с очень незначительным образованием
свободных радикалов.
ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПЕРОКСИДНЫХОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ СИСТЕМ
Применение пероксидных каталитических и ферментных систем широко и многообразно
от многотоннажного органического синтеза, получения физиологически активных веществ,
химического анализа, определения ОАА биологических жидкостей, продуктов питания, вин,
напитков, природных и синтетических лекарственных препаратов до важнейшей области современной иммуно-биотехнологии - иммуноферментного анализа (ИФА) множества низкомолекулярных и белковых антигенов и антител. В рамках данного обзора невозможно подробно
рассмотреть успехи в разных областях использования пероксидных окислительновосстановительных систем и мы ограничились лишь некоторыми характерными примерами их
применения.
Химикам хорошо известна каталитическая способность комплексов металлов с переменной валентностью в гидроперикисном окислении важных для фармакологии и медицины ненасыщенных соединений [93, 94]. Еще 40 лет назад гидропероксидное окисление олефинов,
катализированное комплексами молибдена, стало основой известного многотоннажного производства окиси пропилена, разработанного фирмой "Halcon" [95]. Система ПХ-Н2О2 используется для окисления многих фенольных соединений до полимерных продуктов [96].
Сопряженное окисление фенолов и аминов пероксидом водорода с участием металлокомплексов широко применяется при аналитическом определении многих замещенных фенолов и нафтолов [36]. Примером аналитического применения активации пероксидазного окисления ТМБ органическими основаниями является простая и удобная тест-система меламина в
растворах [70]. Разные варианты тест-систем ОАА биологических жидкостей и многих других
объектов
разработаны
при
использовании
каталитических
систем
"метмиоглобин(метгемоглобин)-Н2О2-хромогенный субстрат-ингибитор-калибратор", в которых АБТС
-субстрат, а замещенные фенолы применены в качестве калибраторов [82, 83]. Тест-система
ОАА сыворотки крови здоровых лиц и больных с разной патологией создана с применением
пары мет-гемальбумин-Н2О2 в качестве инициатора радикалов, ФДА как субстрата и замещенного пирокатехина InHl - в качестве ингибитора-калибратора [81]. На основании работ
[45-61] по сопряженному пероксидазному окислению пар "амин-замещенный фенол" и значениям определенных в них констант ингибирования окисления хромогенных аминов предложены 11 пар "хромогенный субстрат ПХ-ингибитор фенольной природы" для использования в
тест-системах ОАА биологических жидкостей и других объектов в зависимости от их свойств
и условий тестирования.
Однако наиболее широко пероксидные системы "ПХ-Н2О2-хромогенный субстрат" используются в настоящее время в иммуноферментном анализе огромного числа антигенов разной природы и антител [37-39, 97]. Современный ИФА -одно из самых бурно развивающихся
направлений аналитической биотехнологии, без которого немыслимы иммунодиагностика и
терапия множества заболеваний человека и животных, аналитическая экология и микроанализ
огромного числа органических объектов. Самым применяемым ферментом в ИФА-системах
является пероксидаза, окислителем Н2О2, а субстратами АБТС, ТМБ, ФДА и др.
Только в нашей лаборатории разработаны 33 ИФА-системы для микроопределения в
разных вариантах различных антигенов - стероидных гормонов кортизола [98, 99] и прогестерона [100, 101], сердечного гликозида строфантина [97,102], белковых антигенов - ферритина
[92,103], тирок-синсвязывающего глобулина (ТСГ) [104, 105] и других. Сопряженное пероксидазное окисление люминола и его конъюгатов с фенолами успешно использовано в хемилюминесцентном иммуноферментном анализе (ХИФА) белкового антигена ТСГ, который отличается рекордной чувствительностью и позволяет определять в сыворотке крови ~10-9 М
антигена [106].
Сопряженное пероксидазное окисление пар "ААП-галоидзамещенные фенолы" использовано при гомогенном ИФА-определении иммуноглобулинов G человека в растворе без разделения твердой и жидкой фаз [107]. С использованием пары ПХ-Н2О2 впервые разработан
гомогенный метод ИФА кортизола и прогестерона в обращенных мицеллах ПАВ в органических растворителях [108, 109].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Во всех гидроксилазных процессах при последовательном восстановлении двумя электронами тройного комплекса "субстрат-Р-450-О2" и в пероксидазных реакциях из пероксидных комплексов образуется одинаковая активная частица - комплекс I, характеризующийся
высокой степенью окисления иона железа. В пероксидазных процессах комплекс I получает
один электрон от субстрата, превращаясь в комплекс II, а в гидроксилазных процессах - два
электрона, превращаясь в исходную форму - Fe3+-P-450. Соотношение между пероксидазным
и гидроксилазным (оксеноидным) превращением комплекса I определяется, в первую очередь, природой гемопротеина: миоглобин, гемоглобин и цитохром с в реакциях с участием
гидропероксидов реагируют по пероксидазному пути с промежуточным образованием радикалов, что подтверждается замедляющим действием на эти реакции ингибиторов радикальных процессов. Оксеноидный механизм характеризуется отсутствием радикальных стадий, что подтверждается действием тех же ингибиторов в гидроксилазных реакциях.
Комплекс I, существующий в различных формах: Fe2+O2, Fe3+O 2, Fe3+O, Fe4+O-, содержит кислород в триплетном или синглетном состоянии. Синглетный оксеноид внедряет
атом кислорода в субстрат по трехцентровому синхронному механизму с образованием
синглетного продукта реакции:
Если оксеноид является триплетным, то
прямое внедрение кислорода в субстрат невозможно, так как такая реакция является спинзапрещенной. В этом случае окисление происходит по механизму "отрыв атома водорода-рекомбинация" или по скрыторадикальному
механизму, который может быть нечувствительным к действию ингибиторов радикальных
процессов:
Различные состояния кислорода в комплексе
I определяются природой пятого лиганда гемового железа в гемопротеинах. Гистидин в пятом положении у гемоглобина, миоглобина и цитохрома с в существенной степени определяет пероксидазный (радикальный) путь реакции с участием этих гемопротинов и гидропероксидов.
Цистеинил в пятом положении у цитохромов Р-450 определяет спектральные различия комплексов этих гемопротеинов с гидропероксидами от комплексов других гемопротеинов и
гидроксилазный путь реакции, характеризующийся одновременным акцептированием комплексом I двух электронов от молекулы субстрата.
Как видим, в обширнейшей области окислительно-восстановительного биокатализа
многие проблемы удалось тщательно рассмотреть, "...стоя на плечах гигантов" - наших
выдающихся соотечественников академиков А.Н. Баха и Н.М. Эмануэля: первый предсказал активацию молекулярного кислорода в составе промежуточных комплексов с фермента-
ми и его внедрение в окисляемые органические соединения, а второй -важнейшую роль свободнорадикальных реакций в биохимических процессах и пути их регулирования.
Авторы считают своим приятным долгом выразить благодарность нашим коллегам,
которые на разных этапах работы внесли большой вклад в получение фактического материала, рассмотренного в обзоре, - профессорам CA. Усанову и О.И. Шадыро, доктору хим. наук
А.Н. Еремину, кандидатам наук В.П. Курченко, Ю.П. Лосеву, М.И. Савенковой, В.Л. Маркиной, А.В. Пучкаеву, О.Б. Русь, И.В. Наумчик, Е.И. Тарун и многим другим.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бах А.Н. II Журн. Русского физико-хим. об-ва.1894. Т. 26. № 1.С. 101-106.
2. Бах А.Н. II Журн. Русского физико-хим. об-ва.1897. Т. 29. №2. С. 373-398.
3. Warburg О. Heavy Metal Prostetic Groups and Enzyme Action. London, New York: Oxford
Univ. Press, 1949.230 p.
4. Wieland H. On the Mechanism of Oxidation. New Haven: Yale Univ. Press, 1932. P. 26-30.
5. Gatfinkel D. // Arch. Biochem. and Biophys. 1958.V. 77. № 3. P. 493-509.
6. Klinqenberg M. // Arch. Biochem. and Biophys. 1958.V. 75. № 2. P. 376-387.
7. Метелица Д.И. // Успехи химии. 1971. Т. 40. № 7.С.1175-1210.
8. Molecular Mechanisms of Oxygen Activation / Ed.O. Hayaishi. New York-London: Acad. Press,
1974 613 p.
9. Ахрем А.А., Метелица Д.И., Скурко М.Е. // Успехи химии. 1975. Т. 44. № 5. С. 868-896.
10. Арчаков А.И. Микросомальное окисление. М.: Наука, 1975. 327 с.
11. Ляхович В.В., Цырлов И.Б. Структурные аспекты биохимии монооксигеназ. Новосибирск:
Наука, 1978. 236 с.
12. Cytochrome Р-450 / Eds. R. Sato, T. Omura. New York: Acad. Press, 1978. 227 p.
13. Метелица Д.И., Попова Е.М // Биохимия. 1979.Т. 44. №11. С. 1923-1935.
14. Ляхович В.В., Цырлов И.Б. Индукция ферментов метаболизма ксенобиотиков. Новосибирск: Наука, 1981.240 с.
15. Головенко Н.Я. Механизмы реакций метаболизма ксенобиотиков в биологических мембранах. Киев: Наукова думка, 1981. 219 с.
16. Метелица Д.И. //Успехи химии. 1981. Т. 50. № 11.С. 2019-2048.
17. Метелица Д.И. II Успехи химии. 1982. Т. 51. № 11.С. 1819-1848.
18. Метелица Д.И. // Успехи современной биологии.1982. Т. 94. № 3. С. 345-359.
19. Метелица Д.И. Окислительно-восстановительные металлоферменты и их модели. Черноголовка: ИХФ АН СССР, 1982. Т. 1. С. 39-52.
20. Метелица Д.И. Активация кислорода ферментными системами. М.: Наука, 1982. 255 с.
21. Метелица Д.И. Моделирование окислительно-восстановительных ферментов. Минск: Наука и техника, 1984. 293 с.
22. Cytochrome Р-450 / Eds. К. Ruckpaul, H. Rein. Berlin:Akademie-Verlag, 1984. 405 p.
23. Мишин В.М., Ляхович В.В. Множественные формы цитохрома Р-450. Новосибирск: Наука.
1985.180 с.
24. Usanov S.A., Chashchin V.L.,Akhrem A.A. Cytochrome P-450-dependet Pathways in Steroid
Hormones Biosynthesis. Fronties in Biotransformation / Ed. K. Ruckpaul. Berlin—London: Taylor
and Francis, 1990. V. 3.P. 1-57.
25. Mason H.S., Fowlkes W.L, Peterson E. // J. Amer.Chem. Soc. 1955. V. 77. № 9. P. 2914-2915.
26. Hayaishi O., Katagiri M., Rothberg S. I I J. Amer.Chem. Soc. 1955. V. 77. № 11. P. 5450-5451.
27. Kadlubar F.F., Morton K.C., ZieglerD.M. // Biochem.Biophys. Res. Communs. 1973. V. 54. № 8.
P. 1255-1261.
28. Скурлатов Ю.И. Элементарные механизмы активации кислорода и перекиси водорода в
водных растворах. Дис. ... доктора хим. наук. М.: ИХФАН СССР, 1980.320 с.
29. Сычев А.Я., Травин CO., Дука Т.Г., Скурлатов Ю.И. Каталитические реакции и охрана окружающей среды. Кишинев: Штиинца, 1983.271 с.
30. Догонадзе P.P., Кузнецов A.M. // Журн. ВХО им. Д.И. Менделеева. 1974. Т. 19. № 3. С. 242250.
31. Metelitza D.I., Akhrem A.A., Eryomin A.N., Kisel M.A.,Usanov S.A. II Acta Biol. Med. Germanica. 1979. B. 38 H.2/3.S. 511-518.
32. Dunford H.B., Stillman J.S. //Coord. Chem. Rev. 1976.V. 19. №1. P. 187-240.
33. Frew J.E., Jones P. II Adv. in Inorganic and Bioinor-ganic Mechanisms / Ed. A.G. Sykes. New
York: Acad.Press, 1984. V. 3. P. 175-212.
34. Биотехнология пероксидаз растений и грибов /Ред. A.M. Егоров. Итоги науки и техники.
Биотехнология. М.: ВИНИТИ, 1992. Т. 36. 170 с.
35. Dunford H.B. Heme Peroxidases. New York: Wiley-VCH, 1999.230 р.
36. Коренман И.М. // Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений М.: Наука, 1975. С. 74-79.
37. Enzyme-Immunoassays / Ed. E. Maggio. Boca Raton:CRC Press, 1983. 295 p.
38. Неизотопные методы иммуноанализа / Ред.A.M. Егоров. Итоги науки и техники. Биотехнология. М.: ВИНИТИ, 1987. Т. 3. 170 с.
39. Егоров A.M., Осипов АЛ., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высшая школа, 1991. 288 с.
40. Литвинчук А.В., Савенкова М.И., Метелица Д.И. II Кинетика и катализ. 1991. Т. 32. №
3.С. 535-540.
41. Метелица Д.И., Литвинчук А.В., Савенкова М.И. II Весщ АН БССР. Сер. xiм. навук.
1991.№ 2. С. 75-82.
42. Metelitza D.I., Litvinchuk A.V., Savenkova M.I. //J. Molec. Catalysis. 1991. V. 67. № 3. P. 401411.
43. Метелица Д.И., Литвинчук А.В., Савенкова М.И. II Биохимия. 1992. Т. 57. № 1. С. 103113.
44. Литвинчук А.В., Метелица Д.И., Савенкова М.И., Чередникова Т.В., Ким Б.Б., Писарев
В.В. II Биохимия. 1992. Т. 57. № 4. С. 804-815.
45. Kapaceвa E.И., Лосев Ю.П., Метелица Д.И. // Биоорган, химия. 2002. Т. 28. № 2. С. 147155.
46. Kapaceва Е.И., Лосев Ю.П., Метелица Д.И. // Биохимия. 1997. Т. 62. № 10. С. 1255-1263.
47. Григоренко Ю.А., Kapaceвa Е.И., Метелица Д.И. //Межд. конф. "Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем"(VII съезд Белорусского объединения
фотобиологов и биофизиков). Минск, 2006. С. 69-71.
48. Карасёва Е.И., Никифорова Т.В., Метелица Д.И. //Прикл. биохимия и микробиология.
2001. Т. 37. № 4. С. 472-479.
49. Метелица Д.И., Наумчик И.В., Kapaceвa E.И.,Полозов Г.И., Шадыро О.И. // Прикл. биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. № 4. С. 401-412.
50. Наумчик И. В., Kapaceвa E. И., Метелица Д. И.,Полозов Г. И., Шадыро О. И. // Биоорг. химия.2004. Т. 30. № 5. С. 537-546.
51. Гринцевич Е.Э., Сенчук В.В, ПучкаевА.В., Метелица Д.И. Ц Биохимия. 2000. Т. 65. № 8. С.
1088-1098.
52. Наумчик И.В. Активация и ингибирование пероксидазного окисления ароматических аминов. Автореф. дис.... канд. хим. наук. Минск: Ин-т биоорганической химии НАН Беларуси,
2004. 24 с.
53. Карасева Е.И., Никифорова Т.В.,Лосев Ю.П., Метелица Д.И. II Биоорган, химия. 1999. Т.
25. № 9.С. 665-672.
54. Metelitza D.I, Karasyova E.I., Grintsevich E.E., Thor-neley R.N.F. //J. Inorg. Biochemistry. 2004.
T. 89. № 1.C. 1-9.
55. Наумник И.В., Карасева Е.И., Метелица Д.И.,Полозов Г.И., Шадыро О.И. // Весцi НАН Беларусь Сер. xiм. навук. 2002. № 3. С. 85-91.
56. Наумник И.В., Карасева Е.И., Метелица Д.И.,Едимечева И.П., Сорокин В А., Шадыро О.И.
IIБиохимия. 2005. Т. 70. № 3. С. 397-405.
57. Гринцевич Е.Э., Сенчук В.В., Пучкаев А.В., Шадыро О.И., Метелица Д.И. // Биоорган, химия.2000. Т. 26. № 11. С. 825-837.
58. Наумчик И.В., Карасева Е. И., Метелица Д.И. //Перикл. Биохимия и микробиология. 2005.
Т. 41.№ 4. С. 376-382.
59. Карасева Е.И., Метелица ДМ. // Биохимия. 1999.Т. 64. № 1.С. 68-75.
60. Карасева Е.И., Лосев Ю.П., Метелица Д.И. // Биохимия. 2001. Т. 66. № 6. С. 751-761.
61. Карасева ЕМ., Лосев Ю.П., Метелица Д.И. //Прикл. биохимия и микробиология. 2001. Т.
37. №6. С. 713-721.
62. Эмануэль Н.М., Бучаченко А.Л. Химическая физика старения и стабилизации полимеров.
М.: Наука, 1982. 359 с.
63. Келети Т. Основы ферментативной кинетики.М.: Мир, 1990. С. 183-223.
64. Карпухина Г.В., Майзус З.К., Эмануэль Н.М. IIДокл. АН СССР. 1963. Т. 152. № 1. С. 110114.
65. Карпухина Г.В., Майзус З.К., Эмануэль Н.М. //Докл. АН СССР. 1965. Т. 160. № 1. С. 158162.
66. Flavonoids: Chemistry, Biochemistry and Applications / Eds. D.M. Andersen, K.R. Markham.
Boca Raton: CRC Press, 2005. 1200 p.
67. Yang Ch. S., Prabhu S., Landau J. // Drug Metabolism Rev. 2001. V. 33. P. 237-245.
68. Карасева Е.И., Наумчик И.В., Метелица Д.И. //Биоорган, химия. 2003. Т. 29. № 1. С. 49-56.
69. Карасева Е.И., Наумчик И.В., Метелица Д.И. //Биохимия. 2003. Т. 68. № 1. С 66-75.
70. Наумчик И.В., Карасева Е.И., Метелица Д.И. IIВесцi НАН Беларусь Сер. xiм. навук. 2004.
№ 4.С. 76-78.
71. Карасева Е.И., Гапоник П.Н., Метелица Д.И. IIБиоорган, химия. 2004. Т. 30. № 3. С. 316323.
72. Карасева Е.И., Гапоник П.Н., Метелица Д.И. IIПрикл. биохимия и микробиология. 2005. Т.
41.№2. С. 148-157.
73. Карасева Е.И., Гапоник П.Н., Войтехович С.В.,Метелица Д.И. // Весцi НАН Беларусь Сер.
xiм.навук. 2005. № 1. С 67-73.
74. Kulys Ju., Henrys A. II ВМС Struct. Biol. 2001. V. 1.№ 1. Р 3.
75. Русь О.Б., Пучкаев А.В., Метелица Д.И. // Биохимия. 1996. Т. 61. № 10. С. 1813-1824.
76. Метелица Д.И., Русь О.Б., Пучкаев А.В. // Журн.прикл. химии. 1997. Т. 70. № 10. С. 17131720.
77. Метелица Д.И., Русь О.Б., Пучкаев А.В., Шадыро О.И. II Биохимия. 1997. Т. 62. № 3. С.
323-333.
78. Русь О.Б., Пучкаев А.В., Лосев Ю.П., Метелица Д.И. II Журн. прикл. химии. 1998. Т. 71.
№ 5.С. 842-848.
79. Русь О.Б., Пучкаев А.В., Иванов A.И., Метелица Д.И. II Прикл. биохимия и микробиология.2000. Т. 36. № 1.С. 44-54.
80. Русь О.Б., Пучкаев А.В., Метелица Д.И. // Прикл.биохимия и микробиология. 2000. Т. 36.
№ 2.С. 143-152.
81. Русь О.Б., Метелица Д.И. // Весцi НАН Беларусi. Сер. xiм. навук. 2001. № 4. С. 75-82.
82. Метелица Д.И., Еремин А.Н., Свиридов Д.О., Камышников B.C. II Биохимия. 2001. Т. 66.
№ 5.С. 628-639.
83. Свиридов Д.О., Камышников B.C., Еремин A.M.,Метелица Д.И. // Весцi НАН Беларусi Сер.
xiм.навук. 2001. №2. С. 60-63.
84. Метелица Д.И., Арапова Г.С II Биохимия. 1996.Т. 61. №2. С. 308-321.
85. Метелица Д.И., Арапова Г.С, Еремин А.Н. IIБиохимия. 1997. Т. 62. № 4. С. 460-470.
86. Арапова Г.С, Еремин А.Н., Метелица Д.И. IIБиохимия. 1997. Т. 62. № 12. С. 1655-1665.
87. Арапова Г.С, Еремин А.Н., Метелица Д.И. //Биохимия. 1998. Т. 63. № 10. С. 1400-1409.
88. Метелица Д.И., Арапова Г.С, Еремин А.Н., Лосев Ю.П. Ц Биохимия. 1999. Т. 64. № 10. С.
1420-1431.
89. Арапова Г.С, Еремин А.Н., Метелица Д.И //Биоорган, химия. 1999. Т. 25. № 5. С. 369-376.
90. Еремин А.Н., Арапова Г.С, Метелица Д.И. IIБиоорган, химия. 1999. Т. 25. № 7. С. 469-476.
91. Арапова Г.С, Еремин А.Н., Метелица Д.И. //Вестник Фонда фундаментальных исследований (Беларусь). 2000. № 1. С. 45-62.
92. Денисов В.Н., Метелица Д.И. // Биохимия. 1987.Т. 52. №8. С. 1248-1257.
93. Метелица Д.И. // Успехи химии. 1972. Т. 41. № 10.С. 1737-1765.
94. Скибида И.П. II Успехи химии. 1975. Т. 44. № 10.С. 1729-1741.
95. Landau R. //Hydrocarbon. Proc. 1967. V. 56. P. 141-144.
96. Халгаш Я. Биокатализаторы в органическом синтезе. М.: Мир, 1991. С. 142-162.
97. Метелица Д.И., Савенкова М.М., Курченко В.П. //Прикл. биохимия и микробиология. 1987.
Т. 23.№ 1.С. 116-124.
98. Карасева Е.И., Еремин А.Н., Метелица Д.И. //Журн. аналитич. химии. 1990. Т. 45. № 4. С.
749-756.
99. Еремин А.Н., Былина Г.С.,Шманай В.В., Метелица Д.И. Ц Журн. аналитич. химии. 1993.
Т. 48. № 1. С. 137-144.
100. Артемчик В.Д., Савенкова М.И., Метелица Д.И.,Пивень Н.В., Шостак Н.Ю. А. с. №
1381402 СССР // Б. И. 1988. № 10. С. 15-16.
101. Брилъ Э.Е., Семенов В.Я., Метелица Д.И. // Изв.АН БССР. Сер. сельхоз. наук. 1990. № 1.
С. 103-108.
102. Тарун Е.И., Савенкова М.И., Метелица Д.И. //Журн. аналитич. химии. 1993. Т. 48. № 1. С.
145-149.
103. Денисов В.Н., Метелица Д.И. // Биотехнология.1990. Т. 6. № 5. С 85-88.
104. Метелица Н.М., Мярцева Е.В., Смирнов А.В., Метелица Д.И. II Изв. АН БССР. Сер. биол.
наук. 1989. № 6. С. 72-79.
105. Метелица Н.М., Мярцева Е.В., Шуляковская Е.В.,Смирнов А.В., Метелица Д.И. // Журн.
аналитич.химии. 1991. Т. 46. № 1. С. 149-155.
106. Шибаев В.А., Метелица Н.М., Метелица Д.И. //Изв. АН БССР. Сер. хим. наук. 1991. № 3.
С. 57-63.
107. Савенкова М.И. // Прикл. биохимия и микробиология. 1991. Т. 27. № 2. С. 265-273.
108. Еремин А.Н., Метелица Д.И. // Докл. АН БССР.1989. Т. 33. № 10. С. 932-935.
109. Еремин A.Н. Карасева Е.И., Метелица Д.И. // Докл. АН БССР. 1991. Т. 35. № 6. С. 549552.
Initiation and Inhibition of Free-Radical Processes in Biochemical Peroxidase
Systems: A Review
D. I. Metelitza and E. I. Karasyova
Institute of Bioorganic Chemistry, National Academy of Science of Belarus, Minsk, 220141 Belarus;
e-mail:
metelitza@iboch.bas-net.by Received September 15, 2006
Abstract—The role of complexes containing oxygen or peroxide in monooxygenase systems
and models thereof, as well as in peroxidase- and quasi-peroxidase-catalyzed processes, has been reviewed. Pathways of conversion of these intermediate complexes involving single-electron (radical)
and two-electron (heterolytic) mechanisms are dealt with. Coupled peroxidase-catalyzed oxidation of
aromatic amines and phenols is analyzed; inhibition and activation of peroxidase-catalyzed reactions
are characterized quantitatively. Oxidation of chromogenic substrates (ABTS, OPD, and TMB) in the
presence of phenolic inhibitors or polydisulfides of substituted phenols is characterized by inhibition
constants (Ki,μmol). Activation of peroxidase-catalyzed oxidation of the same substrates is characterized by the degree (coefficient) of activation (α, M-1), which was determined for 2-aminothiazole,
melamine, tetrazole, and its 5-substituted derivatives. Examples of applied use of peroxidasecatalyzed enzyme and model systems are given (oxidation of organic compounds, chemical analysis,
enzyme immunoassay, tests for antioxidant activity of biological fluids).