Е Кс п е р и м е н т а л ь н і р о б о т и УДК 577.152.3 фосфорилирование чувствительной к гамк а-Эргическим лигандам cl-, нсо3--стимулируемой mg2+-атр-азы плазматических мембран мозга карпа сyprinus carpio L. С. А. МЕНЗИКОВ, О. В. МЕНЗИКОВА Институт общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва, Россия; e-mail: menzikov@lansp.ru Исследовано фосфорилирование Cl-, НСО3 --стимулируемой Mg2+-АТР-азы плазматических мембран мозга рыб с помощью [g-32Р]АТР в присутствии Mg2+. Установлено, что образование фосфопротеи­ на при температуре 0–1 °С зависит от времени инкубации и концентрации Mg2+ в среде инкубации. Гидроксиламин (50 мМ) и рН 10 практически полностью ингибируют образование фосфорилированного интермедиата. Ионы Cl (10 мМ)+НСО3 (2 мМ), а также ГАМК (1–100 мкМ) дефосфорилируют АТР-азу. В присутствии бикукуллина дефосфорилирующий эффект ГАМК на мембранный препарат не проявляется. о-Ванадат (10 мкМ) устраняет дефосфорилирующее действие анионов и ГАМК на фосфопротеин. Методом Ds-Na-ПААГ-электрофореза и авторадиографии установлено, что исследуемое фосфорилирование и ГАМК А-индуцируемое дефосфорилирование осуществляет белок с молекулярной массой ~ 56 кДа, представляющей собой субъединицу, входящую в олигомерный состав чувствительной к ГАМК А-эргическим лигандам Cl-, НСО3 --АТР-азы мозга рыб. Полученные данные демонстрируют, что Cl-, НСО3 -- АТР-аза мозга рыб может напрямую фосфорилироваться АТР в присутствии Mg2+ и образовывать фосфорилированный интермедиат. К л ю ч е в ы е с л о в а: рыбы; мозг; Cl-, НСО3 --АТР-аза; ГАМК; бикукуллин; фосфорилирование; авторадиография. В плазматических мембранах мозга рыб выявлена чувствительная к ГАМК А-эргическим лигандам Cl-, НСО3--стимулируемая Mg2+-АТР-аза (Cl-, НСО3-АТР-аза), состоящая из активной “базальной” Mg2+-АТРазы, которая может активироваться одновременно Cl- и НСО3- [1,2]. Высокая чувствительность Cl-, НСО3- -АТР-азы к специфическим лигандам ГАМК А-рецепторов указывает на ее функциональную сопряженность с рецепторами торможения. В частности, активность этого фермента регулируется активаторами (ГАМК, пентобарбиталом, диазепамом) и блокаторами (пикротоксином, бику­куллином) ГАМК А-бензодиазепинового Cl-‑ка­нала,что про­ является в активировании или ингибировании активности “базальной” Mg2+-АТР-азы и ее стимуляции анионами [2–4]. Определение молекулярной массы субъединичного состава Cl-, НСО3- -АТР-азы из мозга рыб показало ее сходство с молекулярными свойствами ГАМК А­-ре­цепторов из мозга этих животных [5]. Такие данные предполагают структурную сопряженность исследуемого фермента с рецепторами торможения и близкое располоISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 1 жение его АТР-гидролизующих мест и мест связывания ГАМК А-эргических лигандов на молекуле белка. Механизм функционирования Cl-, НСО3- -АТР-азы в нейрональной мембране и природа ее регуляции ГАМК А-эргическими лигандами остаются неясными. Ранее мы предположили, что фермент может подвергаться фосфорилированию–дефосфорилированию в процессе каталитического цикла [6]. В пользу такого предположения указывают данные об ингибировании Cl-, НСО3- -АТР-азы SH-реагентами, о‑ванадатом и олигомицином [7]. Известно, что высокой чувствительностью к этим лигандам обладают транспортные АТРазы Р-типа (или типа Е1–Е2), для функционирования которых необходимо присутствие каталитической субъединицы, участвующей в многоэтапном гидролизе АТР и образующей в этом процессе фосфорилированные интермедиаты с различными свойствами [8,9]. В связи с этим представляет интерес выяснение способности исследуемого фермента, подобно транспортным АТР-азам Р-типа, напрямую фосфорилироваться АТР и образовывать в ходе ее гидролиза фосфорилированный интермедиат­. 63 Експериментальні роботи Целью данной работы явилось исследование с помощью [g-32Р]АТР фосфорилирования мем­ браносвязанной Cl-, НСО3- -АТР-азы мозга рыб и влияние на образование фосфопротеи­ на анио­нов, ГАМК А-эргических лигандов и блокаторов фосфорилирования транспортных АТР-аз Р-типа – о-ванадата, гидроксиламина и щелочного рН. Материалы и методы Исследования проводили на мозге карпа Cyprinus carpio. После декапитации рыб мозг быстро извлекали и гомогенизировали при 4 °С в 10 мМ буфере Hepes-Tris (рН 7,0) в соотношении 1 : 8. Фракцию плазматических мембран, содержащих Cl-, НСО3- -АТР-азу, получали по ранее описанному методу [5], замораживали при –20 °С и использовали в течение 30 дней. Фосфорилирование фермента. Преинкубирование мембранных препаратов проводили с добавлением 10 мкМ о-ванадата, 5–75 мМ NaCl, 1–15 мМ NaНСО3, 1–100 мкМ ГАМК, 25 мкМ бикукуллина, 50 мМ гидроксиламина в течение 15 мин при температуре 0–1 °С в инкубационной среде, содержащей 25 мМ HepesTris (рН 7,0), 3 мМ MgSO4 и 10–20 мкг белка. Объем пробы составлял 30 мкл. Процесс фосфорилирования мембранного препарата проводили по схеме, описанной в литературе [8,10]. Реакцию начинали добавлением в среду инкубации 70 мкМ [g-32Р]АТР (удельная радиоактивность 10 -6 распад/мин/нмоль) и инкубировали 2 мин при 0–1 °С. Для определения уровня включения фосфата в белковый препарат из инкубационной среды отбирали аликвоты по 5 мкл и наносили их на хроматографическую бумагу Whatman 3 MM (15 × 15 мм). Белки фиксировали на бумаге в течение 20 мин в 10%-м растворе ТХУ, содержащем 10 мМ Na2P2О7 и 10 мМ NaH2РО4. Образцы отмывали от свободной метки в растворе того же состава четыре раза по 20 мин при постоянном перемешивании. Отмытые фильтры высушивали, помещали в стеклянные флаконы, содержащие по 5 мл толуольной сцинтилляционной жидкости ЖС-106, и просчитывали в фосфорном канале жидкостного сцинтилляционного счетчика “Delta” (CША). Образование фосфопротеина рассчитывали как разность включения 32 Р в мембранный препарат после инкубации с [g-32Р]АТР при отсутствии и в присутствии Mg2+ и выражали в пмоль 32Р на 1 мг белка. Ds-Na-ПААГ-электрофорез. После проведения фосфорилирования для остановки реакции к белковым препаратам добавляли равные объемы буфера, содержащего 0,01 М натрийфосфат (рН 7,0), 2%-й Ds-Na, 2%-й 2‑меркап64 тоэтанол, 10%-ю cахарозу, и инкубировали в течение 2 ч при 37 °С. Электрофорез проводили в 12%-м Ds-Na-ПААГ по методу Вебера и Осборна при силе тока 35 мА [11]. Электрофореграммы окрашивали 0,1%-м кумасси голубым. Окрашенные и высушенные гели помещали в авторадиографическую камеру («Sigma», США) и экспонировали 72–96 ч при комнатной температуре. Пленку проявляли стандартным проявителем до получения максимально конт­ растного изображения. Молекулярную массу белков определяли общепринятым методом, сравнивая их электрофоретическую подвижность с подвижностью стандартных маркерных белков (БСА, овальбумин, химотрипсиноген А, миоглобин и цитохром с). Общий белок определяли методом Брэдфорд [12]. В таблице и на рисунках представлены среднеарифметические величины активности фермента (n = 3). Достоверность различия сравниваемых значений оценивали с помощью t-критерия Стьюдента при р < 0,05. В работе использовали Tris, Hepes, бикукуллин, ГАМК, Ds-Na, о-ванадат, гидроксиламин, набор маркерных белков: БСА, овальбумин, химотрипсиноген А, мио­глобин и цитохром с фирмы «ICN» (США), реактивы для электрофореза («Bio-Rad», США), меркаптоэтанол, сульфат магния («Sigma», США), остальные реактивы российского производства. Результаты и обсуждение Известно, что прямое фосфорилирование с помощью [g-32Р]АТР транспортных АТР-аз, в том числе анионактивируемых Mg2+-АТР-аз, происходит с участием катионов Mg2+ и зависит от времени инкубации фермента с субстратом [8]. Мы исследовали влияние ионов Mg2+ в диапазоне 0,2–4,0 мМ на включение 32Р в мембранный препарат при инкубации с 25, 70 и 100 мкМ [g-32Р]АТР и показали, что в заданном диапазоне концентраций Mg2+ образование фосфопротеина наблюдается начиная с концентрации его 0,5 мМ, а при 2–4 мМ достигает максимальных значений (рис. 1). Включение 32 Р в мембранный препарат регистрируется уже в первые 20 сек, через 1,5–2,0 мин достигает максимальной величины и выходит на плато (рис. 2). Исходя из полученных результатов в дальнейшем мы инкубировали образцы в течение 2 мин в присутствии в среде инкубации 3 мМ Mg2+ и 70 мкМ [g-32Р]АТР. При исследовании влияния Cl- и НСО3на включение 32Р в мембранный препарат мы установили, что эти ионы снижают уровень образования фосфопротеина с максимальным ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 1 С. А. МЕНЗИКОВ, О. В. МЕНЗИКОВА 150 2 100 32 Ɏɨɫɮɨɩɪɨɬɟɢɧ, ɩɦɨɥɶ Ɋ ɧɚ 1 ɦɝ ɛɟɥɤɚ 3 50 1 эффектом при концентрации их 10 мМ Cl-+ +2 мМ НСО3-, а также 15 мМ Cl-+3 мМ НСО3(рис. 3). В присутствии анионов в этих концентрациях уровень включения 32Р в мембранный препарат снижается на 82%, тогда как только ионы Cl- (10–15 мМ) снижают уровень фосфорилирования мембранного препарата на 53%. о-Ванадат в концентрации 10 мкМ устраняет дефосфорилирующий эффект Cl-+НСО3- на фосфопротеин, восстанавливая уровень фосфорилирования белка до контрольных значений, в то время как в отсутствие анионов о-ванадат практически не влияет на этот процесс (рис. 3). Химическую природу связывания Рi с белком мембранного препарата мы оценивали по его чувствительности к гидроксиламину и щелочному рН. В присутствии 50 мМ гидроксил­ амина и защелачивании среды инкубации до 0 0 1 2 3 4 150 2+ [Mg ], ɦɆ Рис. Ɋɢɫ. 1 1 100 2 32 100 32 Ɏɨɫɮɨɩɪɨɬɟɢɧ, ɩɦɨɥɶ Ɋ ɧɚ 1 ɦɝ ɛɟɥɤɚ 150 3 Ɏɨɫɮɨɩɪɨɬɟɢɧ, ɩɦɨɥɶ Ɋ ɧɚ 1 ɦɝ ɛɟɥɤɚ 1. Влияние концентрации Mg2+ на образование фосфопротеина в мембранном препарате из мозга рыб. 50 50 0 - Cl , ɦɆ 0 0 ɇɋɈ3-, ɦɆ 0 0 50 100 150 200 250 ȼɪɟɦɹ, ɫɟɤ Рис. 2. Влияние времени инкубации на образование фосфопротеина в мембранном препарате из мозга рыб. ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 1 10 2 20 4 30 6 40 50 60 8 10 12 70 14 80 16 [Ⱥɧɢɨɧɵ], ɦɆ Рис. 3. Влияние Сl- (1) и Сl- + НСО3 - (2) на образование фосфопротеина в мембранном препарате из мозга рыб при отсутствии и в присутствии (3) 10 мкМ о-ванадата. 65 Експериментальні роботи 120 32 Ɏɨɫɮɨɩɪɨɬɟɢɧ, ɩɦɨɥɶ Ɋ ɧɚ 1 ɦɝ ɛɟɥɤɚ 160 80 40 1 2 0 5 7 9 11 ɪɇ Рис. 4. Влияние рН и 50 мМ гидроксиламина на Ris-4 образование фосфопротеина в мембранном препарате из мозга рыб. 66 140 32 32 1 мг белка Фосфопротеин, пмоль Р на Ɏɨɫɮɨɩɪɨɬɟɢɧ, ɩɦɨɥɶ Ɋ/ ɦɝ ɛɟɥɤɚ рН 10 практически не наблюдается включения Pi в мембранный препарат (рис. 4). При исследовании влияния ГАМК А-эргических лигандов на фосфорилирование мембранного препарата установлено, что ГАМК (1–100 мкМ) снижает уровень включения 32Р в мембранный препарат с максимальным эффектом при концентрации в пределах 10–100 мкМ (рис. 5). В присутствии 25 мкМ бикукуллина эффект ГАМК на образование фосфопротеина не проявляется и остается на уровне контроля. о-Ванадат (10 мкМ) также устраняет дефосфорилирующий эффект ГАМК на фосфопротеин (рис. 5). Идентификацию белка, который фосфорилируется [g-32Р]АТР в присутствии Mg2+ и дефосфорилируется Cl-+НСО3- и ГАМК А-эргическими лигандами, мы проводили методом авторадиографии с использованием Ds-Naэлектрофореза в 12%-ом полиакриламидном геле. Обработанный Ds-Na исходный белковый препарат представлен на электрофореграмме более чем 24 белками (рис. 6). Авторадиографическое исследование­ спе­к­ т­­­ра фосфорилируемых [g-32Р]АТР белков плазматических мембран показало, что 32Р, который включается в мембранный препарат и дефосфорилируется бикукуллином, обнаруживается 2 120 3 100 80 60 1 40 20 0 0 1 10 100 log [ȽȺɆɄ], ɦɤɆ Рис. 5. Влияние ГАМК на образование фосфо­ протеина в мембранном препарате мозга рыб при отсутствии (1) и в присутствии 25 мкМ бикукуллина (2) или 10 мкМ о-ванадата. в мажорной белковой полосе с молекулярной массой ~ 56 кДа. Таким образом, результаты наших исследований показали, что максимальное включение 32Р в белковый препарат регистрируется через 1,5–2,0 мин инкубации с [g-32Р]АТР в присутст­вии 3 мМ Mg2+. При фосфорилировании Cl--АТР-азы из эпителиальных клеток моллюска включение 32Р тоже наблюдается после 2 мин инкубации фермента с 2,2 мкМ [g-32Р]АТР в присутствии высоких концентраций Mg2+ (>2 мМ) [13]. Известно, что ионы Cl ингибируют образование фосфопротеина с максимальным эффектом 80% при концентрации 10 мМ. Кроме того, при исследовании Na+,K+-АТР-азы из мозга морской свинки было показано, что ионы Na увеличивают, а ионы K снижают фосфорилирование фермента в присутствии 50 мкМ [g-32Р]АТР и 50 мкМ Mg2+, а при совместном действии эти катионы ингибируют фосфорилирование фермента [14]. В наших опытах Cl- и Cl-+НСО3- также снижали уровень образования фосфопротеина в мем­бранных препаратах мозга рыб на 53% и 82% соответственно. Максимальный эффект ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 1 С. А. МЕНЗИКОВ, О. В. МЕНЗИКОВА 1 67 кДа 2 3 4 56 кДа 45 24 18 13 Рис.6. Электрофореграмма маркерных белков (1) – БСА, овальбумина, химотрипсиногена А, миоглобина и цитохрома с; мембранного препарата мозга рыб (2) и его авторадиограмма при отсутствии (3) и в присутствии (4) 25 мкМ бикукуллина. анионов­ наблюдался при концентрациях 10 мМ Cl-+2 мМ НСО3- и 15 мМ Cl-+3 мМ НСО3-. При увеличении концентрации анионов их эффект уменьшается. Важно отметить, что эти данные сходны с результатами, полученными нами ранее при исследовании активности Cl-, НСО3- АТР-азы плазматических мембран мозга рыб. Так, максимальная стимуляция фермента анионами также наблюдается при концентрации 10 мМ Cl-+2 мМ НСО3- [1,2], а при увеличении их концентрации совместный эффект стимуляции ферментативной активности снижается и в диапазоне высоких концентраций не выявляется. Известно, что о-ванадат является специфическим конкурентным ингибитором переходного состояния связывания фосфора транспортными АТР-азами Р-типа [15]. Было показано, что активность Na+, K+- АТР-азы из клеток различного происхождения [8], а также К+-индуцируемое дефосфорилирование Na+, K+-АТР-азы, выделенной из почек собаки, ингибируются в присутствии 10–110 мкМ о‑ванадата [16]. Кроме того, фосфорилирование встроенной в искусственные липосомы Сl-АТР-­азы из эпителиальных клеток кишечника моллюска в присутствии 2,2 мкМ [g‑32Р]АТР и 3 мМ Mg2+ также ингибируется 0,01 мкМ о‑ваISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 1 надатом [13]. В нашем исследовании 10 мкМ о-ванадат не влиял на фосфорилирование мем­ бранного препарата в присутствии Mg2+, однако устранял эффект дефосфорилирования белка в присутствии ионов Cl-+НСО3-, а также ГАМК А-­эргических лигандов, что указывает на наличие на молекуле белка места связывания Рi. Показано, что Na+, К+-АТР-аза микросомального препарата из мозга морской свинки [14] и Cа2+, Mg2+-АТР-азы из гладкой мускулатуры [17] и саркоплазматического ретикулума [8] различных видов животных фосфорилируются через высокоэнергетическую ацил-фосфатную связь, которая разрушается в присутствии 50 мМ гидроксиламина и щелочного рН (>10). Фосфорилирование Cl--АТР-азы из эпителиальных клеток кишечника моллюска [13] и желудка кролика [18] также ингибируется 50 мМ гидроксиламином и рН 10. В нашем исследовании в присутствии 50 мМ гидроксил­ амина и при защелачивании среды инкубации до рН 10 также практически не наблюдалось включения Pi в мембранный препарат, что предполагает фосфорилирование белка через высокоэнергетическую ацилфосфатную связь. В предварительных исследованиях мы обнаружили, что ГАМК увеличивает “базальную” Mg2+-АТР-азную активность плазматических мембран мозга рыб и ее стимуляцию Clи НСО3- в концентрациях, которые являются эффективными при действии этого медиатора на ГАМК А-рецепторы мозга крыс [2–4]. Кроме того, нами ранее было обнаружено, что эффект ГАМК на Cl-, НСО3--АТР-азу мозга рыб, подобно действию этого медиатора на тормозные рецепторы, не проявляется в присутствии бикукуллина и пикротоксина [1–4]. В настоящем исследовании эффект ГАМК на включение 32Р в белок мембранного препарата мозга рыб не проявлялся в присутствии 25 мкМ бикукуллина, что указывает на зависимый от рецептора путь действия лигандов ГАМК А-рецепторов на образование фосфопротеина. Результаты проведенного нами авторадиографического исследования мембранного препарата мозга рыб показали, что субъединица, которая фосфорилируется АТР и дефосфорилируется анионами и ГАМК А-эргическими лигандами, имеет молекулярную массу ~56 кДа, что подтверждает результаты, полученные нами ранее. Так, при хроматографическом исследовании субъединичного состава Cl-, НСО3--АТР-азы плазматических мембран мозга рыб нами было обнаружено, что олигомерная структура этого фермента состоит из 67 Експериментальні роботи полипептида с молекулярной массой ~ 56 кДа [5]. В то же время известно, что транспортные АТР-азы Р-типа, такие как Na+, K+-АТР-аза, Сa2+, Mg2+-АТР-аза и Н+-АТР-аза имеют един­ ственную каталитическую субъединицу с молекулярной массой ~100 кДа [8, 15], а Cl--АТР-аза кишечника моллюска – каталитическую субъединицу с молекулярной массой ~ 110 кДа [13]. Эти данные демонстрируют, что молекулярная масса каталитической субъединицы исследуемого фермента отличается от молекулярной массы каталитической субъединицы транспорт­ ных АТР-аз Р-типа, но сходна с молекулярной массой субъединицы, входящей в состав олигомерной структуры ГАМК А-рецепторов мозга рыб. В частности, было показано, что субъединица, образующая гомоолигомерную структуру ГАМК А-бензодиазепинового рецептора из мозга рыб и связывающая [3H]ГАМК и [3H]флунитразепам, имеет молекулярную массу ~56 кДа [19] . Таким образом, чувствительная к ГАМК А­ эргическим лигандам Cl-, НСОз--АТР-аза моз­ га рыб, подобно транспортным АТР-азам Р-типа, может напрямую фосфорилироваться АТР и образовывать фосфорилированный интермедиат. Реакция гидролиза АТР такими хорошо изученными транспортными системами, как Na+, K+-АТР-аза и Са2+, Mg2+-АТРаза, является многоступенчатой и состоит из присоединения субстрата, фосфорилирования, дефосфорилирования и высвобождения субстрата [8,15]. Исходя из этого можно предположить, что гидролиз АТР исследуемой Cl-, НСО3--АТР-азой вероятно также является многоступенчатым, в котором ионы Mg2+ отвечают за начальную стадию фосфорилирования фермента, а ионы Cl- и НСО3- – за стадию его дефосфорилирования. Дефосфорилирующий эффект ГАМК А-ергических лигандов на уровень фосфорилирования Сl-, НСО3--АТР-азы скорее всего, также как и эффект анионов, связан с переходным состоянием фосфата на молекуле белка. Дальнейшие исследования, направленные на непосредственное выяснение участия фермента в транспорте анионов, позволят установить сопряженность переноса ионов с реакцией гидролиза АТР. 68 Работа выполнена при финансовой под­ держке РФФИ (грант 03-04-48056). фосфорилювання чутливої до гамк а-ергічних лігандів стимульованої mg2+ cl-, нсо3--атр-ази плазматичних мембран мозку коропа сyprinus carpio L. С. А. Мензіков, О. В. Мензікова Інститут загальної патології та патофізіології РАМН, Москва, Росія; e-mail: menzikov@lansp.ru Досліджено фосфорилювання стимульованої Cl- та НСО3- Mg2+-АТР-ази плазматичних мембран мозку риб за допомогою [g-32Р]АТР за додавання Mg2+. Визначено, что утворення фосфопротеїну при температурі 0–1 °С залежить від часу інкубації та концентрації Mg2+ в середовищі інкубації. Гідроксиламін у кількості 50 мМ при рН 10 практично повністю інгібує утворення фосфорильованого інтермедіату. Іони Cl (10 мМ)+НСО3 (2 мМ), а також ГАМК (1–100 мкМ) дефосфорилюють АТР-азу. За присутності бікукуліну цей ефект дефосфорилювання не виявляється. о-Ванадат у кількості 10 мкМ усуває дефосфорилюючу дію аніонів і ГАМК на фосфопротеїн. Методом Ds-NaПААГ-електрофорезу та авторадіографії визначено, що досліджене фосфорилювання та ГАМК А­-­індуковане дефосфорилювання забезпечує білок з молекулярною масою ~56 кДа, який є субодиницею, що є складовою чутливої до ГАМК А-ергічних лігандів Cl-, НСО3- -АТРази мозку риб. Одержані дані демонструють, що Cl-, НСО3--АТР-аза мозку риб здатна безпосередньо фосфорилюватися АТР у присутності Mg2+ і таким чином утворювати фосфорильований інтермедіат. К л ю ч о в і с л о в а: риби, мозок, Cl-, НСО3- -АТР-аза, ГАМК, бікукулін, фосфорилювання, авторадіографія. ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 1 С. А. МЕНЗИКОВ, О. В. МЕНЗИКОВА phosphorylation of cl-, hco3--stimulated Mg2+-atpase of plasma membranes of carp (cyprinus carpio l.) brain sensitive to gaba а-ergic Ligands S. A. Menzikov, O. V. Menzikova Institute of General Pathology and Phathophysiology of Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, Russia; e-mail: menzikov@lansp.ru Summary Phosphorylation of the sensitive to GABA Aergic ligands Cl-, HCO3--stimulated Mg2+-ATP­ ase of the plasma membranes from fish brain by [g‑32Р]АТР was investigated in the presence of Mg2+. It was established, that formation of the phosphoprotein at 0–1 °C is dependent on time incubation and concentration of Mg2+ in the incubation medium. Hydroxylamine (50 mM) and pH (10) completely inhibited formation of phosphory­ lated intermediate. Ions of Cl- (10 mM)+HCO3(2 mM) and also GABA (1–100 mM) dephosphorylated the enzyme. The dephosphorylating effect of GABA on the membrane samples did not appear in the presence of bicuculline. o-Vanadate (10 mM) eliminates the dephosphorylating effect of anions and GABA on the phosphoprotein. It was established by SDS-PAAG electrophoresis and autoradiographia that investigated phosphorylation and GABA A-induced dephosphorylation is performed by the protein with molecular weight ~56 kDa. Such molecular weight has a subunit which forms oligomer composition of the sensitive to GABA Aergic ligands Cl-, HCO3--ATP­ase from fish brain. The obtained data demon­strated that Cl, HCO3ATPase from fish brain can be directly phosphory­ lated by [g-32Р]АТР in the presence of Mg2+ and forms the phosphorylation intermediate. K e y w o r d s: fish, brain, plasma membranes, Cl-, HCO3--ATPase, GABA, bicuculline, phosphorylation, autoradiographya, molecular mass, o-vanadate, hydroxylamine. ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 1 1. Мензиков С. А., Мензикова О. В. // Укр. біохім. журн. – 2004. – 76, № 1. – C. 53– 58. 2. Мензиков С. А., Мензикова О. В. // Докл. АН. – 2002. – 382, № 6. – C. 833–835. 3. Мензиков С. А., Мензикова О. В. // Био­ химия.– 2002.– 67, № 2. – C. 278–282. 4. Menzikov S. A., Menzikova O. V. // Neurosci. Let. – 2002. – 334. – P. 161–164. 5. Мензиков С. А., Мензикова О. В. // Известия РАН. Серия биологическая. – 2006. – № 1 (в печати). 6. Мензиков С. А., Мензикова О. В. // Докл. АН. – 2002. – 385, № 5. – C. 708–710. 7. Мензиков С. А., Мензикова О. В. // Докл. АН. – 2002. – 382, № 1. – C. 134–137. 8. Stekhoven F. S., Bonting S. L. // Physiol. Re­ views.– 1981. – 61. – P. 1–76. 9. Глебов Р. Н., Крыжановский Г. Н. Функ­ циональная биохимия синапсов. – M.: Медицина, 1978. – 328 c. 10. Кондрашев-Луговский А. С., Малышева А. Н., Стори К. Б. и др. // Биологические мембраны.– 2004. – 21. – C. 491–497. 11. Weber K., Osborn M. // J. Biol. Chem. – 1970. – 244. – Р. 4406–4410. 12. Bradford M. M. // Anal. Biochem. – 1976. – 72. – P. 248–254. 13. Gerencser G. A., Zelezna B. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1993. – 90. – P. 7970–7974. 14. Hokin L. E., Sastry P. S., Galsworthy P. R., Yo­ da A. // Ibid.– 1965. – 54. – P. 177–184. 15. Геннис Р. Биомембраны: молекулярная струк­ тура и функции. – М.: Мир, 1997. – 624 c. 16. Forbush B. // J. Biolog. Chem. – 1987. – 262. – P. 11116–11127. 17. Carsten M. E., Miller J. D. // Arch. Biochem. Biophys. – 1984. – 232. – P. 616–623. 18. Tanisawa A. S.,Forte J. G. // Ibid. – 1971. – 147. – P. 165–175. 19. Deng L., Nielsen M., Olsen R. W. // J. Neu­ rochem. – 1991. – 56. – P. 968–977. Получено 29.11.2005 69