ХИМИЯ БИООРГАНИЧЕСКАЯ

А.Г. ТЫРКОВ
БИООРГАНИЧЕСКАЯ
ХИМИЯ
Рекомендовано УМО Российской академии естествознания
по классическому университетскому и техническому образованию
в качестве учебного пособия
для студентов высших учебных заведений,
обучающихся по направлению подготовки «Химия»
и специальности «Фундаментальная и прикладная химия»
КНОРУС • МОСКВА • 2016
УДК577.1
ББК28.072
Т93
Рецензент
Е.В. Шинкарь, проф. кафедры органической, биологической и физколлоидной
химии Астраханского государственного технического университета, д-р хим. наук
Тырков А.Г.
Т93 Биоорганическая химия : учебное пособие / А.Г. Тыр­ков. — М. :
КНОРУС ; Астрахань : АГУ, ИД «Астраханский университет», 2016. —
126 c.
ISBN 978-5-4365-0310-3
DOI 10.15216/978-5-4365-0310-3
Включает 20 лабораторных работ, в которых отражены вопросы, связанные с выделением, изучением свойств и состава белков, ферментов, нуклеиновых кислот,
углеводов, липидов и низкомолекулярных биорегуляторов. По сравнению с предыдущим изданием в него вошли две новые лабораторные работы «Медицинские
аспекты биоорганической химии» и «Экстрактивные вещества мышц», углубляющие изучение раздела «Низкомолекулярные биорегуляторы».
Для студентов, обучающихся по направлению «Химия» и специальности «Фундаментальная и прикладная химия».
УДК 577.1
ББК 28.072
Тырков Алексей Георгиевич
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Сертификат соответствия № РОСС RU. AE51. H 16604 от 07.07.2014.
Изд. № 9648. Формат 60×90/16. Усл. печ. л. 8,0.
ООО «Издательство «КноРус».
117218, г. Москва, ул. Кедрова, д. 14, корп. 2.
Тел.: 8-495-741-46-28.
E-mail: office@knorus.ru http://www.knorus.ru
Издательский дом «Астраханский университет».
414056, г. Астрахань, ул. Татищева, 20.
Тел./факс 8-8512-54-01-89, тел. 8-8512-54-01-87.
E-mail: asupress@yandex.ru
Отпечатано в ООО «Контакт».
107150, г. Москва, проезд Подбельского 4-й, дом 3.
ISBN 978-5-4365-0310-3
 Астраханский государственный
университет, Издательский дом
«Астраханский университет», 2016
 Тырков А.Г., 2016
 ООО «Издательство «КноРус», 2016
СОДЕРЖАНИЕ
Введение........................................................................................................... 4
Лабораторная работа № 1. Приготовление растворов белка.
Качественные реакции белков и аминокислот ............................................... 5
Лабораторная работа № 2. Определение коэффициента
распределения аминокислот.......................................................................... 17
Лабораторная работа № 3. Определение изоэлектрической
точки казеина.................................................................................................. 20
Лабораторная работа № 4. Количественное определение
белка по биурету колометрическим методом............................................... 22
Лабораторная работа № 5. Разделение альбуминов и глобулинов
методом диализа и высаливания. Реакции осаждения белков .................... 26
Лабораторная работа № 6. Качественные реакции ферментов ................ 32
Лабораторная работа № 7. Свойства ферментов....................................... 41
Лабораторная работа № 8. Выделение нуклеопротеид из дрожжей
и качественное определение продуктов их гидролиза................................. 48
Лабораторная работа № 9. Качественные реакции углеводов ................. 55
Лабораторная работа № 10. Количественное определение
восстанавливающих сахаров по Фелингу..................................................... 63
Лабораторная работа № 11. Количественное определение
фруктозы реакцией Селиванова .................................................................... 66
Лабораторная работа № 12. Фосфолипиды. Выделение
лецитина. Качественные реакции лецитина ................................................. 70
Лабораторная работа № 13. Определение числа омыления,
кислотного и йодного числа жиров............................................................... 75
Лабораторная работа № 14. Качественные реакции витаминов .............. 78
Лабораторная работа № 15. Количественное определение
витамина С в растительных тканях методом Тильманса............................. 94
Лабораторная работа № 16. Алкалоиды .................................................... 97
Лабораторная работа № 17. Качественное определение
афлатоксина M1 в молочных продуктах ..................................................... 104
Лабораторная работа № 18. Количественное определение
рубомицина колометрическим методом ..................................................... 107
Лабораторная работа № 19. Медицинские аспекты
биоорганической химии............................................................................... 111
Лабораторная работа № 20. Экстрактивные вещества мышц ................ 118
Приготовление специальных реактивов................................................ 124
Библиографический список...................................................................... 126
3
ВВЕДЕНИЕ
Учебное пособие «Биоорганическая химия» отражает опыт
преподавания дисциплины «Химические основы жизни» студентам очного и очно-заочного отделений направления подготовки
«Химия».
Включает 20 лабораторных работ, в которых отражены вопросы, связанные с выделением, изучением свойств и состава
белков, ферментов, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов и
низкомолекулярных биорегуляторов. В настоящее учебное пособие вошли две новые лабораторные работы – «Медицинские аспекты биоорганической химии» и «Экстрактивные вещества
мышц», углубляющие изучение раздела «Низкомолекулярные
биорегуляторы».
Пособие построено по единому принципу: к каждой работе
дается теоретическое введение, раскрывающее цели и задачи
опытов. Там, где это необходимо, приводятся уравнения реакций,
схемы или таблицы. Для облегчения приготовления лабораторных работ введен раздел «Приборы и реактивы», в котором отражено общее количество используемых в работе приборов и реагентов в расчете на одного студента. Экспериментальная часть
выделена заглавием «Выполнение опытов». Также изложены способы приготовления специальных реактивов, которые используются в лабораторных работах, и нормы их хранения.
Помимо студентов вышеназванного направления, может
быть рекомендовано студентам, обучающимся по направлению
«Фундаментальная и прикладная химия», а также может служить
пособием для молодых учителей по проведению факультативных
занятий по химии и биологии с учащимися 10–11 классов.
Автор глубоко признателен рецензенту – доктору химических наук, профессору Е.В. Шинкарь (Астраханский государственный технический университет) за внимательный и доброжелательный разбор рукописи и ценные указания. Буду также признателен всем, кто выскажет свои замечания и суждения по настоящему учебному пособию.
г. Астрахань, 2014 год
4
Лабораторная работа № 1
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАСТВОРОВ БЕЛКА.
КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ БЕЛКОВ
И АМИНОКИСЛОТ
Белковая молекула представляет собой органический биополимер. Она может состоять от 2–3 десятков до нескольких тысяч
аминокислотных остатков. Присутствие белка или белковых аминокислот в исследуемом биологическом материале может быть установлено рядом цветных качественных реакций, так как некоторые реагенты с белками и аминокислотами дают окрашенные продукты. Их образование обусловлено присутствием в молекуле белка или аминокислоты определенной химической группировки
(пептидная связь, ароматическое кольцо, аминогруппа). Качественные реакции на аминокислоты условно делят на две группы: универсальные и специфические. Универсальные реакции дают все αаминокислоты, а специфические реакции являются характерными
только на индивидуальные аминокислоты.
С помощью качественных реакций можно установить аминокислотный состав природных белков, белковую природу вещества, дать количественную оценку содержания той или иной аминокислоты в белке.
Цель работы: освоить методики приготовления растворов
белка из различных биологических объектов. Провести и изучить
качественные реакции белков и аминокислот.
Приборы и реактивы: яичный белок (1 сырое яйцо); кусочки сырого мяса (10 г); молоко сырое (20 мл); 10 % раствор NaCl
(20 мл); нас. водн. раствор (NH4)2S04 (30 мл); конц. раствор глицина (3 мл); 5 % раствор NaNO2 (1 мл); конц. СН3СOOН (1 мл); раствор пролина 0,02 % (1 мл); 1 %. раствор нингидрина в ацетоне
(8 мл); сух. Nа2CO3 (1,5 г); нас. раствор пикриновой кислоты
(3 мл); 5 % раствор нитропруссида натрия (3 мл); 25 % раствор
NH4OH (2 мл); 0,1 % раствор сульфата меди (3 мл); 3 % раствор
сульфата меди (5 мл); 10 % раствор NaOH (20 мл); 0,02 % раствор
аргинина (2 мл); конц. раствор тирозина (2 мл); реактив Миллона
(5 мл); 0,02 % раствор триптофана (3 мл); конц. серная кислота
(2 мл); реактив Эрлиха (1 мл); 0,2 % спиртовый раствор α-нафтола
5
(1 мл); раствор гипобромита натрия (1 мл); 40 % раствор мочевины (1 мл); 1 % раствор сульфаниловой кислоты в 5 % растворе
HCl (1 мл); 0,5 % раствор NaNO2 (2 мл); 0,01 % раствор гистидина
(2 мл); 10 % раствор Nа2CO3 (6 мл); 0,02 % раствор фенилаланина
(1 мл); конц. HNO3 (6 мл); 20 % раствор NaOH (6 мл); 0,02 % раствор цистеина (1 мл); 0,02 % раствор метионина (1 мл); 10 % раствор ацетата свинца (1 мл); штатив с 30 пробирками; спиртовка;
стаканы на 50 мл (5 шт.); ножницы; ступка с пестиком; речной песок; фильтры марлевые (4 шт.); бумажные фильтры (2 шт.);
фильтровальные воронки (3 шт.).
Выполнение опытов
Опыт 1. Приготовление растворов белка
Яичный белок
Белок сырого куриного яйца отделяют от желтка и смешивают в стакане при перемешивании с 5–10-кратным объемом
дист. H2O, фильтруют через двойной слой марли.
Белок мяса
Кусочки сырого мяса измельчают ножницами, помещают в
фарфоровую ступку и растирают пестиком с речным песком постепенно приливая 20 мл 10 % раствора NaCl. Смесь выдерживают 10–15 минут и фильтруют через двойной слой марли.
Белки молока
К 20 мл сырого молока добавляют равный объем нас. раствора (NH4)2SO4. При этом выпадают в осадок казеин и глобулины.
Раствор с альбуминами фильтруют через бумажный фильтр. Полученные растворы белков используются в дальнейших опытах.
6
КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ БЕЛКОВ
Опыт 2. Нингидриновая реакция
К 2–3 мл раствора белка, полученного в опыте 1 приливают
1 мл 1 % раствора нингидрина в ацетоне. Содержимое нагревают,
развивается сине-фиолетовая окраска.
Опыт 3. Ксантопротеиновая реакция
К 1 мл раствора белка приливают 0,5 мл конц. HNO3, нагревают до появления желтой окраски. После охлаждения добавляют 2 мл 20 % раствора NaOH, растворы окрашиваются в оранжевый цвет (схема 1).
в цепь
в цепь
NH CH CO
в цепь
NH CH CO
CH 2
в цепь
CH 2
+
HNO3
O
+
H 2O
N
OH
OH
в цепь NH CH CO
O
в цепь
NaOH
CH2
O
N
+
O Na
O
Схема 1. Ксантопротеиновая реакция
Опыт 4. Реакция с пикриновой кислотой
К 2 мл раствора белка прибавляют 0,5 г Na2CO3, приливают
1 мл нас. водного раствора пикриновой кислоты, нагревают.
Желтая окраска раствора постепенно переходит в красную,
вследствие восстановления пикриновой кислоты в пикраминовую
кислоту.
7
Опыт 5. Нитропруссидная реакция
К 3 мл раствора белка приливают равный объем нас. водного
раствора (NH4)2SO4 и 2–3 капли 5 % раствора нитропруссида натрия, смесь подщелачивают несколькими каплями 25 % раствора
NH4OH. Если в исследуемом белке присутствует цистеин, то развивается пурпурное окрашивание.
Опыт 6. Биуретовая реакция
К 2 мл раствора белка добавляют 4 мл 10 % раствора NaOH
и несколько капель 0,1 % раствора сульфата меди. На границе
раздела слоев появляется розово-фиолетовое кольцо.
Опыт 7. Миллонова реакция
К 1 мл раствора белка приливают 0,5 мл реактива Миллона
(не допускать избыток реактива). Перемешивают, нагревают до
появления красного окрашивания.
Опыт 8. Реакция Молиша
Многие белки в качестве компонентов содержат углеводы.
Поэтому такие белки в присутствии конц. серной кислоты и
α-нафтола дают характерное фиолетовое окрашивание.
К 1 мл раствора белка приливают 1 мл спиртового раствора
α-нафтола и осторожно, по стенке, подслаивают 1–2 мл конц.
серной кислотой. На границе раздела слоев появляется фиолетовое окрашивание.
Сделайте общий вывод для опытов 1–8.
УНИВЕРСАЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ АМИНОКИСЛОТ
Опыт 9. Реакция Ван-Слайка
Аминокислоты, содержащие первичную аминогруппу, реагируют с азотистой кислотой с образованием неустойчивого диазосоединения, разлагающегося с выделением свободного азота и
образованием оксикислоты.
8
К 1 мл раствора глицина приливают равный объем 5 % раствора NaNO2 и 0,5 мл конц. СH3COOH. Смесь осторожно взбалтывают. Выделяются пузырьки газа (схема 2).
HO2CCH2NH2
+
O=NOH
HO2CCH 2 N=NOH
H2 O
NaNO2
+
HO2CCH2 OH
N2
CH3CO2H
Схема 2. Реакция Ван-Слайка
Опыт 10. Нингидриновая реакция
Аминокислоты, реагируя с нингидрином, образуют синефиолетовый комплекс (пурпур Руэманна). Пролин и оксипролин,
содержащие замещенные α-аминогруппы, образуют с нингидрином производные, окрашенные в желтый цвет (схема 3).
В пробирку приливают 1 мл раствора глицина, в другую –
такой же объем раствора пролина. В обе пробирки прибавляют по
0,5 мл 1 % раствора нингидрина в ацетоне. Содержимое пробирок
нагревают до появления окраски. В первой пробирке появляется
сине-фиолетовое окрашивание, во второй – ярко-желтое.
O
H2NCHCO2H
+
O
NH3
OH
R
O
CO2
RCOH
OH
NH3
+
O
H
OH
OO
H
OH
N
OH
O
OH
пурпур Руэманна
O
O
+
O
+
O
O
+
O
+
OH
O
O
+
+
HN
N
CO2H
O
Схема 3. Нингидриновая реакция
9
+
H 2O
+
CO2
Опыт 11. Образование комплексов с металлами
α-Аминокислоты образуют внутрикомплексные соли с катионами двухвалентных металлов (схема 4). Самыми устойчивыми являются соли меди, образующиеся в результате взаимодействия
аминокислот с гидроксидом меди (II).
В три пробирки наливают по несколько капель 3 % раствора
сульфата меди (II) и в каждую пробирку прибавляют по несколько капель 10 % раствора NaOH до образования осадка. Затем в
одну пробирку добавляют 0,5 мл конц. раствора глицина, во вторую 0,5 мл раствора аргинина.
Сравните окраску образовавшихся комплексных солей.
+
NH 3
O
+
)
CH
(
R
Cu OH
C
O
+
2
O
C
CH
+
R
H3N
O
2H2O
NH2
R
O
O
CH
O
C
Cu
C
CH
O
R
H2N
Схема 4. Комплексы аминокислот с катионами двухвалентных металлов
Сделайте общий вывод для опытов 9–11.
10
СПЕЦИФИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ АМИНОКИСЛОТ
Опыт 12. Реакция Миллона на тирозин
Тирозин образует с реактивом Миллона (раствор ртути в
азотной кислоте) ртутную соль динитротирозина (схема 5).
К 1 мл конц. раствора тирозина прибавляют 0,5 мл реактива
Миллона, перемешивают и нагревают до появления красного окрашивания.
OH
O
+
NOO Hg
O2N
HgNO3
CH 2 CHCO2 H
CH 2 CHCO2 H
NH 2
NH 2
тирозин
ртутная соль динитротирозина
Схема 5. Реакция Милона
Опыт 13. Реакция Адамкевича на триптофан
Реакция триптофана с альдегидами и альдегидокислотами в
кислой среде приводит к образованию окрашенных продуктов
конденсации. Это качественные реакции на индольное кольцо
триптофана (схема 6).
К 1 мл раствора триптофана приливают 0,5 мл конц.
CH3COOH, перемешивают и осторожно по стенке пробирки, наклонив ее, приливают 1 мл конц. серной кислоты так, чтобы не
происходило смешения жидкостей. На границе раздела слоев через некоторое время появляется красно-фиолетовое кольцо.
11
NH2
NH2
CHO
CH2CHCO2
+
HO2CCHCH2
+
CO2H
N
N
H
H
H 2O
NH2
NH2
HO2CCHCH2
CH2CHCO2H
CH
N
N
CO2H
H
H
Схема. 6. Реакция Адамкевича
Опыт 14. Реакция Эрлиха на триптофан
К 1 мл раствора триптофана приливают 0,5 мл раствора пдиметиламинобензальдегида в серной кислоте. Смесь нагревают
до фиолетового окрашивания (схема 7).
NH 2
CHO
CH2CHCO2
+
NH 2
+
HO2CCHCH2
N
N
H
H
CH 3NCH 3
H 2O
H2SO4
NH 2
NH2
HO2CCHCH 2
CH2CHCO2H
N
CH
H
N
H
CH 3NCH 3
Схема 7. Реакция Эрлиха
12
Опыт 15. Реакция Сакагучи на аргинин
Эта реакция применяется для идентификации гуанидиновой
груп-пировки аргинина. Аргинин с нафтолом и гипобромитом натрия образуют продукт конденсации – нафтохинониминовое производное аргинина (схема 8).
К 1 мл раствора аргинина прибавляют 3 капли 10 % раствора
NaOH, 2 капли спиртового раствора α-нафтола. Хорошо перемешивают и прибавляют 2 капли раствора гипобромита Na, снова перемешивают. Для стабилизации ярко-красного окрашивания прибавляют 0,5 мл 40 % раствора мочевины.
OH
H 2NCNHCH2CH2CH2 CHCO2H
NH
NaBrO
+
H2O , NaBr
NH2
OH
O
NaBrO
H2O , NaBr
NH2
NHCNHCH2CH2CH 2CHCO2H
NH2
NCNHCH 2CH2CH2CHCO2H
NH
NH
Схема 8. Реакция Сакагучи
Опыт 16. Реакция Паули на гистидин
Гистидин в щелочной среде реагирует с диазобензолсульфокислотой с образованием 2,5-(бис)-азобензолсульфокислоты
гистидина (схема 9).
К 1 мл 1 % раствора сульфаниловой кислоты в 5 % растворе
HCl прибавляют 2 мл 0,5 % раствора NaNO2, сильно встряхивают
и сразу же приливают 2 мл раствора гистидина. После перемешивания содержимого пробирки приливают 6 мл 10 % раствора
Na2CO3. Развивается интенсивно вишнево-красная окраска.
13
+
NH 3
N
NaNO2
+
N
+
HCl
2 H 2O , NaCl
SO3
SO3
H2 NCHCO2H
+
N
O3 S
N
+
CH 2
N
+
N
+
N
SO3
N
H
H 2NCHCO2H
N
O3 S
N
N
CH 2
N
N
N
SO3
H
Схема 9. Реакция Паули
Опыт 17. Ксантопротеиновая реакция
Эта реакция служит для обнаружения α-аминокислот, содержащих ароматические радикалы. Тирозин, фенилаланин,
триптофан при взаимодействии с конц. HNO3 образуют нитропроизводные (схема 10).
К 1 мл раствора тирозина приливают 0,5 мл конц. HNO3 и нагревают до появления желтой окраски. После охлаждения добавляют 1–2 мл 20 % раствора NaOH до появления оранжевой окраски.
Почему оранжевая окраска не возникает в случае фенилаланина и триптофана?
14
CH 2CHCO2H
NH 2
CH 2CHCO2H
NH2
HNO3
H2 O
NH 2
NaOH
NO2
OH
CH 2CHCO2H
H2 O
+
NOO Na
OH
O
Схема 10. Ксантопротеиновая реакция
Опыт 18. Реакция Фоля на цистеин и цистин
При щелочном гидролизе «слабосвязанная сера» в серусодержащих аминокислотах легко отщепляется с образованием сероводорода, который реагирует со щелочью, образуя сульфиды калия
или натрия. При добавлении ацетата свинца происходит образование осадка сульфида свинца (схема 11).
К 1 мл раствора цистеина приливают 0,5 мл 20 % раствора
NaОH. Смесь нагревают до кипения, а затем добавляют 0,5 мл
1,0 % раствора ацетата свинца. Наблюдается выпадение серочерного осадка.
HSCH 2CHCO2H
+
2 NaOH
HOCH 2CHCO2H
NH2
Na2S
+
Pb OH
+
H 2O
)
(
Pb OH
+
2 +
2 CH3CO2Na
2 NaOH
2NaOH
Na2PbO2
+
Na2PbO2
2 H 2O
PbS
)
2 +
(
)
(
NH 2
серин
Pb CH3COO
Na2S
+
+
2 H2 O
+
4 NaOH
2
Схема 11. Реакция Фоля
Напишите уравнения реакции Фоля с метионином.
Сделайте общий вывод для опытов 12–18.
После выполнения всех опытов качественные реакции белков и аминокислот обобщить в виде таблицы 1.
15
Таблица 1
№
п/п
Белок или
аминокислота
Формула
Реагент
Наблюдаемое
явление
Качественные реакции белков
1
2
3
4
5
6
Универсальные реакции аминокислот
1
2
3
Глицин
Пролин
Аргинин
1
2
3
4
5
Специфические реакции аминокислот
Тирозин
Аргинин
Гистидин
Фенилаланин
Цистеин
16
Чем вызвана реакция
Качественные реакции белков и аминокислот
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Анисимов А. А. Основы биохимии / А. А. Анисимов, А. Н. Леонтьева и др. – М. : Высшая школа, 1986. – 381 с.
2. Румянцев Е. В. Химические основы жизни / Е. В. Румянцев,
Е. В. Антина и др. – М. : Химия, КолосС, 2007. – 560 с.
3. Березов Т. Т. Биологическая химия / Т. Т. Березов, В. Ф. Коровкин. – М. : Медицина, 1983. – 750 с.
4. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами / под ред.
Е. С. Северина, А. Я. Николаева. – М. : Гэотар-Мед, 2001. – 448 с.
5. Комов В. П. Биохимия / В. П. Комов, В. Н. Шведова. – М. : Дрофа, 2004. – 640 с.
6. Мусил Я. Современная биохимия в схемах / Я. Мусил, О. Новакова, К. Кунц. – М. : Мир, 1984. – 216 с.
7. Овчинников Ю. А. Биоорганическая химия / Ю. Я. Овчинников. –
М. : Просвещение, 1987. – 815 с.
8. Тырков А. Г. Биоорганическая химия: курс лекций / А. Г. Тырков. – Астрахань : Астраханский ун-т, 2009. – 236 с.
9. Строев Е. А. Биологическая химия / Е. А. Строев. – М. : Высшая
школа, 1986. – 479 с.
10. Тырков А. Г. Аминокислоты : метод. рек. / А. Г. Тырков. – Астрахань : Астраханский гос. пед. ин-т, 1991. – 20 с.
11. Тырков А. Г. Биоорганическая химия : программа, методические
указания и контрольные задания для специальности «Химия» и «Биология» с дополнительной специальностью «Химия» / А. Г. Тырков,
Н. М. Алыков. – Астрахань : Астраханский гос. пед. ин-т, 1992. – 47 с.
12. Тюкавкина Н. А. Биоорганическая химия / Н. А. Тюкавкина,
Ю. И. Бауков. – М. : Медицина, 1991. – 528 с.
13. Тырков А. Г. Химические основы жизни. Химические основы
биологических процессов: Методические рекомендации к выполнению
курсовой работы / А. Г. Тырков. – Астрахань : Астраханский ун-т, 2011. –
16 с.
14. Тырков А. Г. Витамины: Методические рекомендации
/ А. Г. Тырков. – Астрахань : Астраханский ун-т, 2011. – 20 с.
15. Тырков А. Г. Биоорганическая химия: сборник задач и упражнений / А. Г. Тырков, Н. А. Щурова. – Астрахань : Астраханский ун-т, 2008. –
199 с.
16. Тырков А. Г. Биоорганическая химия: учебные программы
/ А. Г. Тырков. – Астрахань : Астраханский ун-т, 2011. – 121 с.
17. Тырков А. Г. Алкалоиды: Методические рекомендации
/ А. Г. Тырков. – Астрахань : Сорокин Р. В., 2012. – 16 с.
126