Окислительное фосфорилирование, осуществляющийся в

Топик к лекции
ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ. АТФ-СИНТЕТАЗА
Слайд 1,2.
Окислительное фосфорилирование, осуществляющийся в живых клетках синтез
молекул аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) из аденозиндифосфорной (АДФ) и
фосфорной кислот за счёт энергии окисления молекул органических веществ (субстратов).
В результате О. ф. в клетках накапливается АТФ — важнейшее макроэргическое
соединение, расходуемое затем на обеспечение энергией различных процессов
жизнедеятельности. Основные субстраты О. ф. — органические кислоты, образующиеся в
цикле трикарбоновых кислот.
Слайд 3.
Энергия, образующаяся при прохождении потока электронов по дыхательной цепи,
используется для сопряженного фосфорилирования ADP. Эти два процесса
взаимозависимы: окисление не может протекать в отсутствии ADP. Соотношение
окисления и фосфорилирования определяется коэффициентом P/O (количество моль
фосфорилированного ADP на 1/2 моль кислорода) коэффициент Р/О называется
коэффициентом окислительного фосфорилирования и зависит от точки вхождения
восстановительных эквивалентов в цепь транспорта электронов. Например Р/О=3, для
субстратов, окисляемых NAD - зависимой дегидрогеназой , так как в дыхательной цепи
есть три участка, где перенос электронов сопряжен с синтезом АТР. Не все субстраты
передают электроны и протоны на NAD, некоторые окисляются FAD - зависимыми
дегидрогеназами, которые переносят протоны и электроны сразу на убихинон, минуя
первый комплекс. В этом случае Р/О=2.
В сутки человек потребляет в среднем 27 моль кислорода. Основное его количество
(примерно 25 моль) используется в митохондриях в дыхательной цепи. Следовательно,
ежесуточно синтезируется 125 моль ATP или 62 кг (при расчете использовали
коэффициент Р/О=2,5, то есть среднее значение коэффициента фосфорилирования). Масса
всей АТР, содержащейся в организме, составляет примерно 20-30 г. Следовательно,
можно сделать вывод, что каждая молекула АТР за сутки 2500 раз проходит процесс
гидролиза и синтеза, что и характеризует интенсивность обмена АТР
(http://www.ssmu.ru/ofice/f4/biochemistry/uthebnik/3.htm).
Слайд 4.
Локализация
АТФ-синтетаза является универсальным компонентом сопрягающих мембран и
располагается в митохондриях, хлоропластах, фотосинтезирующих и дышащих бактериях.
Ее можно увидеть в электронный микроскоп, на электронных снимках
(http://www.life.illinois.edu/crofts/bioph354/lect10.html)
комплексы
выглядят
как
грибовидные выросты, состоящие из 2 субкомплексов: F0 и F1 (Николс, 1985)
(http://mitochondria.hotmail.ru/mito.htm). Слайд 5.
АТФ-синтаза присутствует в "энергетических станциях" растительных и животных
клеток.
1
Рис. 1. АТФ-синтаза
На рисунке виден срез митохондрии (рис. 2). Внутри содержится матрикс и выросты
(складки) – кристы, на которых и расположена АТФ-синтаза. Зачем нужны складки?
Чтобы увеличить площадь поверхности. Количество складок внутри митохондрий зависит
от того, насколько интенсивно ей приходится работать, сколько энергии нужно клетке.
Митохондрии в клетках печени имеют гораздо меньше крист, чем, например, в клетках
сердца (http://www.transhumanism-russia.ru/content/view/84/94/).
Рис.2. Срез митохондрий
2
Рис.3. Сопряжение цепи транспорта электронов и фосфорилирования ADP посредством
протонного градиента
Слайд 6.
Фермент АТФ-синтетаза представляет собой встроенное во внутреннюю мембрану
грибовидное тельце с каналом в центре. Он составляет около 15% всего белка внутренней
митохондриальной мембраны.
Аденозинтрифосфатсинта́за— класс ферментов, синтезирующих аденозинтрифосфат
(АТФ) из аденозиндифосфата (АДФ) и неорганических фосфатов с затратами энергии. Эту
энергию АТФ-синтаза часто получает от протонов, проходящих по электрохимическому
градиенту, например из просвета хлоропласта в его строму, или же из межмембранного
пространства в матрикс митохондрии. Реакция синтеза такова:
АДФ + Фн → АТФ + H2O
АТФ-синтазы очень важны для жизнедеятельности почти всех организмов, так как
АТФ — основная внутриклеточная «энергетическая валюта».
Антибиотик олигомицин подавляет активность FO-компонента АТФ-синтазы.
3
Слайд 7.
Структура и номенклатура
Рис.4. Молекулярная модель АТФ-синтазы
Структура АТФ-синтазы. Протонный канал FO и вращающаяся часть показаны синим,
компонент F1 — красным, мембрана — серым.
Имеющаяся в митохондриях АТФ-синтаза F1FO очень хорошо исследована.
•
•
компонент FO — трасмембранный домен,
компонент F1 находится вне мембраны, в матриксе.
АТФ-синтазный комплекс FOF1 по форме напоминает плодовое тело гриба, у которого
компонент F1 — это шляпка, ножка — это γ-субъединица компонента F1, а «корни»
гриба — компонент FO, заякоренный в мембране.
4
Номенклатура фермента имеет традиционное происхождение, поэтому довольно
непоследовательна.
Обозначение компонента F1 является сокращением от «Fraction 1» (часть 1), а символом
FO (в индексе записана буква O, а не ноль) обозначался участок связывания олигомицина.
Некоторые субъединицы фермента имеют также буквенные обозначения:
•
•
Греческие: α, β, γ, δ, ε
Латинские: a, b, c, d, e, f, g, h
OSCP — белок, чувствительный к олигомицину (от англ. the oligomycin sensitivity
conferral protein), ATP5O
Компонент F1 достаточно велик (диаметр его составляет 9 нм), чтобы быть видимым в
трансмиссионный электронный микроскоп при негативном окрашивании.
Частичками F1 усеяна внутренняя митохондриальная мембрана. Изначально считалось,
что они содержат весь дыхательный аппарат митохондрии. Однако после долгих
экспериментов группа Эфраима Рекера (впервые выделившая компонент F1 в 1961)
показала, что эти частички связаны с АТФазной активностью, в том числе и в
разделенных митохондриях, и в субмитохондриальных частицах, формирующихся при
ультразвуковом воздействии на митохондрии. Множество дальнейших исследований в
разных лабораториях подтвердили эту АТФазную активность.
Слайд 8.
Она состоит из двух частей – статора (на рисунке 5 помечено синим цветом), и ротора
(обозначен красным). Статор состоит из трех альфа субъединиц и трех бета субъединиц
5
(Слайд 9) – они занимаются химической частью работы: синтезом АТФ из АДФ и
фосфата. В собранном состоянии все вместе эти субъединицы по форме напоминают
слегка приплюснутый шар 8 нм в высоту и 10 нм в диаметре.
К ним примыкает дельта субъединица, и все вместе эта система образует F1 субъединицу
молекулярной машины. Здесь же есть опора, которая «якорит» всю систему в мембране.
Как известно, мембрана сделана из фосфолипидов (на рисунке показаны желтым).
Гидрофильные "головки" фосфолипидов обращены в водную поверхность, а гидрофобные
"хвосты" погружены внутрь мембраны, и именно они препятствуют перемещению
заряженных частиц через мембрану. Вращающаяся часть машины, ротор, состоит из
гамма и эпсилон субъединиц. Эта конструкция погружена в структуру, сделанную из
одинаковых белков, они обозначаются буквой с. Статор держится в мембране, а ротор
крутится. И энергия протона используется на то, чтобы прокрутить ротор этой машины.
Работа синтетазы
ATP-синтаза осуществляет «вращательный катализ», при котором поток протонов через
Fo
вызывает
высвобождение
ATP
из сайтов
связывающих
ADP
и Pi.
Рассмотрим, как АТФ-синтаза синтезирует АТФ. Оказывается, что прежде всего
совершается работа механическая, так как для осуществления синтеза АТФ в АТФсинтазе крутится белковая структура.
АТФ-синтаза является ферментом, преобразующим разность концентраций протонов по
разные стороны мембраны в энергию, запасённую в молекулах аденозинтрифосфата
(АТФ). Последняя используется практически всеми механизмами клетки в качестве
универсального носителя энергии.
АТФ-синтетаза может действовать в обратном направлении - расщеплять АТФ и
перекачивать протоны. Действие АТФ-синтетазы обратимо: онa способна использовать
как энергию гидролиза АТФ для перекачивания протонов через внутреннюю
митохондриальную мембрану, так и энергию потока протонов по электрохимическому
градиенту для синтеза АТФ. Таким образом, АТФ-синтетаза - это обратимая сопрягающая
система, которая осуществляет взаимопревращение энергии электрохимического
протонного градиента и химических связей.
АТФ-синтетаза получила свое название в связи с тем, что в обычных условиях npoтоннoro
градиента, поддерживаемого дыхательной цепью, синтезирует большую часть всего АТФ
клетки. Число протонов, необходимое для синтеза одной молекулы АТФ, в точности не
известно. При прохождении через АТФ-синтетазу протонов синтезируется одна
молекула АТФ.
Как будет работать в данный момент АТФ-синтетаза - в направлении синтеза или
гидролиза АТФ, - зависит от точного баланса между изменениями свободной энергии для
прохождения трех протонов через мембрану в матрикc и для синтеза АТФ в матриксе.
Предположим, что в связи с реакциями, требующими затраты энергии, в цитозоле
внезапно гидролизовалось большое количество АТФ, и это привело к падению отношения
АТФ:AДФ в матриксе митохондрии. АТФ-синтетаза вновь переключится на синтез АТФ,
пока не восстановится исходное отношение АТФ:AДФ. Если же протонодвижущая сила
внезапно снизится и будет поддерживаться на постоянном уровне, то АТФ-синтетаза
начнет расщеплять АТФ, и эта реакция будет продолжаться до тех пор, пока соотношение
между концентрациями ATФ и AДФ не достигнет какого-то нового значения и так далее.
6
Если АТФ-синтетаза в норме не транспортирует Н+ из матрикса, то дыхательная цепь,
находящаяся во внутренней митохондриальной мембране, при нормальных условиях
переносит через эту мембрану протоны, создавая таким образом электрохимический
протонный градиент, доставляющий энергию, для синтеза AТФ.
По мере накопления по обеим сторонам мембраны положительных и отрицательных
частиц нарастает разность потенциалов (протонный потенциал). Так же, как в мембраны
митохондрий, в мембраны гран встроены молекулы фермента, синтезирующего АТФ
(АТФ-синтетаза). Внутри АТФ-синтетазы имеется канал, через который могут пройти
протоны. При достижении критического уровня величины протонного потенциала
происходит перенос протона через канал в молекуле АТФ-синтетазы, а освобождающаяся
при этом энергия тратится на синтез АТФ. Далее АТФ используется на синтез углеводов.
Механизм изменения участка связывания Слайд 10
В 60-70 годах XX века Пол Бойер предположил, что синтез АТФ связан с изменениями
конфигурации АТФ-синтазы, вызываемыми вращением γ-субъединицы, так называемый
механизм
изменения
участка
связывания
(«перевертыш»,
англ.
flip-flop).
Исследовательской группе под руководством Джона Э. Уокера, относившейся тогда к
Лаборатории молекулярной биологии в Кембридже, удалось выделить АТФ-синтазный
каталитический комплекс F1 в кристаллической форме. На тот момент это была самая
крупная из известных науке асимметричная белковая структура. Ее исследования
показали, что модель вращающегося катализа, предложенная Бойером, соответствует
действительности. За это открытие Бойер и Уокер получили половину Нобелевской
премии по химии в 1997 году. Вторую половину получил Йенс Кристиан Скоу «за первое
открытие
фермента,
осуществляющего
транспорт
ионов —
Na+,K±аденозинтрифосфатазы».
Рис.6. Механизм действия АТФ-синтазы. АТФ показан красным, АДФ и фосфат —
розовым, вращающаяся субъединица γ — черным
Кристалл F1 состоит из перемежающихся α- и β-субъединиц (по 3 каждого вида),
расположенных как дольки апельсина вокруг асимметричной γ-субъединицы. В
соответствии с принятой моделью синтеза АТФ (также называемой моделью
непостоянного катализа), градиент электрического поля, направленный поперек
внутренней митохондриальной мембраны и обусловленный электронной транспортной
цепочкой, заставляет протоны проходить сквозь мембрану через АТФ-синтазный
компонент FO. Часть компонента FO (кольцо из c-субъединиц) вращается, когда протоны
проходят через мембрану. Это c-кольцо жестко связано с асимметричной центральной
ножкой (состоящей в основном из γ-субъединицы), которая в свою очередь вращается
внутри α3β3-участка компонента F1. Это приводит к тому, что три участка катализа,
связывающиеся с нуклеотидами, претерпевают изменения в конфигурации, приводящие к
синтезу АТФ.
7
Основные субъединицы (α3β3) компонента F1 соединены дополнительной боковой ножкой
с неподвижным участком FO, что предотвращает их вращение вместе с γ-субъединицей.
Структура неповрежденной АТФ-синтазы с низкой точностью выявлена при помощи
электронной криомикроскопии (ЭКМ). Показано, что боковая ножка — это гибкая
перемычка, похожая на канат, наматывающаяся на комплекс во время его работы.
В механизме изменения участка связывания задействован активный участок βсубъединицы, последовательно проходящий через три состояния.
В «открытом» состоянии АДФ и фосфат подходят к активному участку. Затем белок
охватывает эти молекулы и свободно связывается с ними («свободное» состояние).
Следующее изменение формы белка прижимает молекулы друг к другу («тесное»
состояние), что приводит к формированию АТФ. Наконец, активный участок снова
переходит в «открытое» состояние, освобождает АТФ и связывает следующую молекулу
АДФ и фосфата, после чего цикл производства АТФ повторяется.
Слайд 11.
Доказательство работы синтетазы
Как было сказано ранее АТФ-синтетаза вращается, это было доказано следующим:
Для того, чтобы доказать, что в АТФ синтазе вращается часть машины, F1 фрагмент
перевернули, «пришили» к неподвижной подложке, а к гамма-субъединице навесили
искусственным образом нить актина (длинный белок, который можно было увидеть в
микроскоп, так как он был мечен флуоресцентной меткой). Затем подали к этой системе
энергию в виде АТФ, и оказалось, что при наличии АТФ гамма субъединица начала
крутиться. Все это сняли на пленку. Было видно, как крутится флуоресцентная метка на
актиновом хвостике, и было показано, что действительно происходит вращение во время
работы этой молекулярной машины (рис. 7).
Рис.7. Схема
Как же используется протонный ток, чтобы крутить мотор? Оказалось, что в статоре
имеется протонный канал, т.е. такой белок, который образует проход для протона. Но этот
канал не сплошной. Если бы был канал, который пронизывал всю мембрану насквозь, то
из-за разницы потенциалов все протоны потекли бы внутрь митохондрии, и произошла бы
деэнергетизация мембраны, т.е. она бы разрядилась. Но канал устроен очень хитро. Он
8
состоит из двух половинок (полу-каналов) (Слайд 12), которые, к тому же, смещены одна
относительно другой (рис. 8).
Рис.8. Устройство канала АТФ-азы
Структура этой машины такова, что протон проваливается через полуканал с наружной
стороны митохондриальной мембраны, но попасть внутрь митохондрии он не может.
Сваливается протон на подставленную ему аминокислоту ротора и эту аминокислоту
протонирует, то есть на аминокислоте появляется дополнительный положительный заряд.
Затем, когда протонированная аминокислота на вращающемся роторе доедет до
следующей половинки канала, ведущей уже внутрь митохондрии (а внутри протонов мало
и, кроме того, там протон поджидают отрицательно заряженные ионы), то протон наконец
"падает" внутрь и аминокислота освобождается от положительного заряда. Заряды в
роторе и статоре расположены таким образом, что протонирование – депротонирование
приводит к повороту машины. Таким образом, протон в два приема проваливается внутрь
митохондрии, и за счет этого мотор проворачивается.
В хлоропластах происходит точно такой же процесс синтеза АТФ, также работает АТФсинтаза, как и в митохондриях, но источником протонного потенциала является
уловленная энергия света. Там тоже есть складки, они называются тилакоидами. Только в
хлоропластах все как бы вывернуто наизнанку. То есть протоны за счет энергии света
накапливаются снаружи этих образований.
Весьма сходные АТФ-синтетазы имеются в мембранах хлоропластов и бактерий. Такой
белковый комплекс содержит трансмембранные каналы для протонов, и происходит
только тогда, когда через эти каналы проходят протоны вниз по своему
электрохимическому градиенту.
Слайд 13.
9
АТФ-синтаза разных организмов
АТФ-синтаза растений
У растений АТФ-синтаза CF1FO присутствует в хлоропластах. Она встроена в мембрану
тилакоида, причем компонент CF1 выступает в строму, где протекают реакции тёмного
фотосинтеза (также называемые светонезависимыми реакциями Кальвиновского цикла).
Структура и механизм катализа АТФ-синтазы хлоропластов почти такая же, как и в
митохондриях. Однако электрохимический потенциал у хлоропластов формируется не
дыхательной электротранспортной цепочкой, а фотосинтетическими белками.
АТФ-синтаза E. coli
АТФ-синтаза кишечной палочки — самая простая из всех известных АТФ-синтаз. Она
состоит всего из 8 видов субъединиц.
Имеются различные типы АТФ-синтетазы, которые отличаются функциями (синтез
АТФ или гидролиз), структурой (F-, V- A- АТФ-азы содержат вращательный мотор) и
типом транспорта ионов.
•
•
•
•
•
F- АТФ-азы (F1F0-АТФ-азы) в митохондрии, хлоропластах и плазматических
мембранах бактерий являются первичными источниками АТФ, используя градиент
протонов, полученный с помощью окислительного фосфорилирования
(митохондрия) или фотосинтеза (хлоропласты).
V-АТФ-азы (V1V0- АТФ-азы) найдены в основном в эукариотических вакуолях,
катализирующих гидролиз АТФ в транспорте растворов и низком pH в органеллах.
А-АТФ-азы (А1А0-АТФ-азы) найдены в Archaea и функционируют как F-АТФазы.
Р-АТФ-азы (Е1Е2-АТФ-азы) найдены в бактерии и в эукариотических
плазматических мембранах и органеллах, и функционируют в транспорте
различных ионов через мембрану.
Е-АТФ-азы ферменты клеточной поверхности, которые гидролизуют ряд
нуклеозид трифосфатов, включая внеклеточную АТФ.
α и β-субъединицы были найдены в F1, V1 и A1 комплексах F, V, A-АТФ-аз,
соответственно. F-АТФ-азы (или V1V0-АТФ-азы) и А-АТФ-азы (или А1А0-АТФ-азы)
состоят из 2х связанных комплексов: F1, V1, A1 комплекс содержит каталитическое
ядро, которое синтезирует/гидролизирует АТФ, и F0, V0, A0 комплекс, который
формирует пору в мембране.
Дельта субъединица АТФ-синтетазы является субъединицей АТФ-азы бактерии и
хлоропласта, или OSCP (олигомицин чувствительный белок) в митохондриальной
АТФ-азе
P-АТФ-аза (Е1-Е2)
Найдены в бактериях и в плазматических мембранах и органеллах эукариот. Р-АТФ-азы
функционируют в транспорте различных соединений, включая ионы и фосфолипиды,
через мембрану, используя гидролиз АТФ для энергии.
Есть много разных классов Р-АТФ-азы, каждый из которых транспортирует
специфический тип ионов:H+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Ag+, Ag2+, Zn2+, Co2+, Pb2+, Ni2+,
Cd2+,Cu2+, Cu+.
P-АТФ-азы могут состоять из одного или двух полипептидов, и могут обычно принимать
2 главные конфигурации, называемые Е1 и Е2.
10
Слайд 14.
Вакуолярная АТФ-синтаза
Является высоко эволюционно преобразованным древним ферментом многообразыми
функциями в эукариотических организмах. V-АТФ-азы подкисляют большую область
внутриклеточных органелл и переносят протоны через плазматические мембраны
различных типов клеток. V-АТФ-азы могут преобразовывать энергию гидролиза АТФ в
транспорт протонов через внутриклеточные и плазматические мембраны эукариотических
клеток.
V-АТФ-азы найдены в пределах многих органелл, таких как эндосомы, лизосомы и
экскреторные везикулы, где они играют различные ключевые роли в функционировании
этих органелл.
Например, протонный градиент через мембрану вакуоли дрожжей создается с помощью
движения (перемещения) Са2+ V-АТФ-азой в вакуоль вследствие H+/Ca2+ системы
антипорта. V-АТФ-азы также могут играть важную роль в синаптической передаче в
нервных клетках. Норпинефрин проникает в везикулы с помощью V-АТФ-азы.
V-АТФ-азы также найдены в плазматической мембране многих клеток, таких как клетки
почки, остеокластов, макрофагов, нейтрофилов, сперматозоида, средней кишки насекомых
и некоторых клеток опухолей.
V-АТФ-аза включена в процессы такие как pH гомеостаз, связанный транспорт, метастаза
опухолей. V-АТФ-азы в акросомальной мембране сперматозоида подкисляет акросому.
Подкисление активирует протеазы необходимые для проникновения через
плазматическую мембрану яйцеклетки.
В V- и А-АТФ-азах, α и β субъединицы V1 или A1 комплекса являются гомологичными α
и β субъединицам в F1 комплексе F-АТФ-аз, полагая что α является каталитической и β
субъединица- регуляторной.
α и β субъединицы могут каждая делиться на 3 региона, или домена, сосредоточенные
около АТФ-связывающих углублений, и основанные на структуре, и функции.
Центральный домен содержит нуклеотид-связывающие остатки, которые могут прямо
взаимодействовать с АДФ/АТФ молекулой
АТФ-аза дрожжей
АТФ-аза дрожжей является наиболее лучше изученной. Имеются, по крайней мере, 13
идентифицированных субъединиц для формирования функционального комплекса VАТФ-азы, которая состоит из 2х доменов.
V1 включает 8 субъединиц, А-H, с 3 копиями каталитических А и В субъединиц, 3
копиями субъединицы Е статора и G и 1 копией регуляторной С и H субъединиц.
В дополнении V1 домен также содержит субъединицы D и F, которые формируют
центральный ротор
Домен V1 содержит тканеспецифичные изоформы субъединиц, включая В, С, Е и G.
V0 домен содержит 6 различных субъединиц a, d, c, ć, c", и е, с кольцом с. V0 домен
млекопитающих содержит тканеспецифичные изоформы для субъединиц а и d.
V1 домен ответственен за гидролиз АТФ, а V0 домен за перенос протонов.
11
Гидролиз АТФ на каталитических местах связывания на субъединице А ведет к вращению
центральной ножки, состоящей из субъединиц D, F, который приводит к повороту
субъединицы С относительно субъединицы а (http://en.wikipedia.org).
Источники:
http://mitochondria.hotmail.ru/mito.htm
http://en.wikipedia.org
http://www.life.illinois.edu/crofts/bioph354/lect10.html
http://www.transhumanism-russia.ru/content/view/84/94/
http://www.ssmu.ru/ofice/f4/biochemistry/uthebnik/3.htm
12