Молекулярная биология Скоблов Михаил Юрьевич Лекция 2 нуклеиновых кислот.

Молекулярная биология
Лекция 2. Структура и свойства
нуклеиновых кислот.
Скоблов Михаил Юрьевич
Часть 1. Структура нуклеиновых
кислот
Состав клетки
Неорганические
•
•
Вода – 75-85%
Неорганические соли,
кислоты – 1-1,5%
Вещества в клетке
Органические
Малые молекулы
Биополимеры
• Моносахариды
(макромолекулы)
• Аминокислоты
• Полисахариды
0,5%
• Нуклеотиды
(углеводы)
- 0,2-2%
• Другие
• Белки
- 10-20%
• Липиды
• Нуклеиновые
(жиры) – 1-5%
кислоты (ДНК, РНК) - 1-2%
История открытия:
ДНК
• В 1869 году молодой швейцарский врач Фридрих
Мишер в Германии решил изучить химический состав
клеток животных, а в качестве материала выбрал
лейкоциты, которых было много в гное. Из местной
хирургической больницы ему стали привозить
корзины с гнойными повязками, снятыми с ран.
• В процессе работы он понял, что кроме белков в
лейкоцитах присутствует неизвестное соединение,
содержащееся в ядрах клеток.
• Фридрих Мишер назвал его нуклеином, от латинского
nucleus — ядро.
• Позже было обнаружено, что бактериальные клетки, в
которых нет ядра, тоже содержат нуклеиновые
кислоты.
Фридрих Мишер
РНК
• Джерард Маирбакс изолировал первую матричную РНК, кодирующую гемоглобин
кролика и показал, что при её введении в ооциты образуется гемоглобин.
• Северо Очоа получил Нобелевскую премию по медицине в 1959 году за открытие
механизма синтеза РНК
Строение нуклеозида и нуклеотидов
Строение нуклеозида и нуклеотидов
Строение нуклеозида и нуклеотидов
Строение рибонуклеотидов
Названия нуклеозидов и нуклеотидов
Сокращение
A
G
T
C
U
Нуклеозид
Аденин
Гуанин
Тимин
Цитозин
Урацил
Нуклеотид
Аденозин
Гуанозин
Тимидин
Цитидин
Уридин
Минорные основания нуклеозидов
Содержание нуклеотидов
Организм
A
G
C
T
G+C,
мол. %
Бактериофаг λ
26
23,8
24,3
25,8
48
Бактериофаг Т2
32,5
18,2
16,72
32,6
35
Escherichia coli
23,8
26
26,4
23,8
52
29
20,7
21,3
29
42
26,6
24,5
24,2
24,7
49
31,3
18,7
17,1
32,9
36
19,6
30,2
30
19,7
60
Цыпленок
27,9
21,2
21,5
29,4
43
Мышь
28,9
21,1
20,3
30
41
Корова
27,3
22,5
22,5
27,7
44
Пшеница
27,2
22,6
22,8
27,4
45
Bacillus subtilis
Вирус папилломы
Шоупа
Saccharomyces
cerevisiae
Chlamydomonas
Содержание динуклеотидов
За 400 млн лет
позвоночными
утрачено 75% CpG
динуклеотидов
Gentles AJ, Karlin S.
Genome-scale compositional
comparisons in eukaryotes.
Genome Res. 2001 Apr;11(4):540-6.
Модифицированные нуклеозиды
Ацикловир – самое распространенное противогерпетическое лекарственное
средство. Убирает симптомы заболевания, но не излечивает!
ТК вируса
герпеса
Ацикловир
?
?
Монофосфат
ацикловира
Дифосфат
ацикловира
Трифосфат
ацикловира
Вирусная ДНКполимераза
Вирус погибает
Вторичная структура ДНК
Джеймс Уотсон и Френсис Крик. 1953 год.
Вторичная структура ДНК
В формировании вторичной структуры ДНК участвуют
следующие типы взаимодействий:
• водородные связи между комплементарными основаниями (две
между аденином и тимином, три — между гуанином и цитозином);
Принцип
комплементарности
Вторичная структура ДНК
В формировании вторичной структуры ДНК участвуют следующие
типы взаимодействий:
• стэкинг-взаимодействия
• нековалентное взаимодействие между органическими
соединениями, содержащими ароматические компоненты.
• В ДНК параллельный стэкинг имеет место между соседними парами
нуклеотидов и повышает стабильность молекулярной структуры.
пурин-пурин>пиримидин-пурин>пиримидин-пиримидин
Неканонические формы ДНК
В-ДНК - основное состояние ДНК показанное
на кристаллах и в водных растворах.
С-ДНК - форма существующая при
пониженной концентрации Na и влажности
44-66%, если GC=31-72%.
А-ДНК - форма ДНК-РНК гибридов.
Z-ДНК - левозакрученная форма. Переходу B->Z способствует наличие GC-5'
последовательности являющейся местом
метилирования у организмов. Z-ДНК
обнаружена в междисках политенных
хромосом D. melanogaster.
G-квадруплексы
последовательности нуклеиновых кислот, обогащенные гуанином и способные
образовывать структуры из двух, трёх или четырех цепей.
Часть 2. Свойства нуклеиновых
кислот
Химические свойства
• ДНК и РНК - нуклеиновые кислоты, кислоты, слабые, но кислоты
• Молекулы нуклеиновых кислот содержат множество
отрицательно заряженных фосфатных групп и образуют
комплексы с ионами металлов; их калиевая и натриевая соли
хорошо растворимы в воде.
• 2’ гидроксил делает РНК уязвимой к щелочному и кислотному
гидролизу
• Концентрированные растворы нуклеиновых кислот очень
вязкие и слегка опалесцируют, а в твердом виде эти вещества
белые.
• Нуклеиновые кислоты сильно поглощают ультрафиолетовый
свет, и это свойство лежит в основе определения их
концентрации. С этим же свойством связан и мутагенный
эффект ультрафиолетового света.
Оптические свойства ДНК
• Поглощение нуклеиновых кислот в ближней УФ-области почти целиком обязано
пуриновым и пиримидиновым основаниям.
• Сахарофосфатный остов РНК и ДНК дает незначительный вклад в спектр
поглощения при длинах волн, превышающих 200 нм.
• Спектры всех четырех нуклеозидов чувствительны к рН. Протонирование С и G
приводит к значительному сдвигу поглощения в сторону больших длин волн
(красное смещение). Депротонирование U или Т при щелочных рН также
приводит к существенному красному смещению максимума поглощения.
Протонирование А сопровождается гораздо меньшими спектральными
изменениями.
Оптические свойства ДНК
• Наиболее часто измерения поглощения проводят для определения
концентрации.
• Это можно делать, если известен коэффициент молярной экстинкции и
соблюдается закон Ламберта-Бера. Например, для двухцепочечной ДНК D260=1
соответствует 50 мкг/мл, для РНК – 40.
Молекулярный коэффициент экстинкции.
OD - единица измерения количества
олигонуклеотидов, соответствует
количеству, которое в 1ml на пути 1см дает
А260=1
C [µmol/ml] = OD/E олигонуклеотида
E олигонуклеотида = сумма всех
(Eнуклеотидов)
dG
dC
dA
dT
dN
E [ml/µmol]
7
12
16
9,6
10,8
Плавление ДНК
Денатурация или плавление - расхождение цепей ДНК при нагревании ДНК или при
повышении pH.
•
•
•
Расхождение цепей происходит из-за разрушения слабых водородных связей и плоскостных
взаимодействий между основаниями.
На денатурацию также влияют: ионы одно- и двухвалентных металлов, белки,
нейтрализующие отрицательные заряды фосфатных групп.
Температура плавления GC выше чем АТ.
40%
60%
•
•
•
•
•
Денатурация – процесс обратимый, последующее восстановление двухцепочечной
структуры ДНК может происходить даже при полном расхождении цепей. Процесс
воссоединения, называемый ренатурацией, реассоциацией или отжигом, происходит при
понижении температуры или рН
При резком понижении температуры или рН правильное воссоединение комплементарных
цепей затрудняется из-за спаривания оснований локально комплементарных участков в
пределах одной или разных цепей.
При ренатурации сначало соединяются участки цепей с повторенной ДНК и затем с
уникальными участками
Если совместно. отжигают одноцепочечные ДНК, происходящие из различных точников, то
формирование двухцепочечной структуры ДНК называют гибридизацией.
Плавление ДНК
Tm — температура, при которой половина ДНК-матриц имеет двухцепочечную структуру
Плавление ДНК
• Плавление ДНК - процесс перехода
регулярной двойной спирали
линейной молекулы ДНК в
клубкообразное состояние.
• При переходе ДНК из спирального
состояния в клубкообразное
поглощение раствора A в области
250-270 нм увеличивается на 30-40%
• Суммарная длина различных
присутствующих в геноме
последовательностей, оценивается
по их реассоциации в процессе
ренатурации ДНК
• Метод реассоциации ДНК позволяет
судить о близком родстве по
способности денатурированных
отдельных нитей ДНК одних бактерий
реассоциировать перекрестно при
инкубации в определенных условиях
с нитями ДНК других, образовывая
спиральную гибридную молекулу.
Вторичная и третичная структуры РНК
Вторичная структура – распределение
вторичных структур рибозофосфатного
скелета вдоль цепи
Третичная структура – 3D
структура молекулы РНК
Вторичная и третичная структуры тРНК кодированы одним цветом
Элементы вторичной структуры
C A
A
A
C G
| |
C G
|
G
C G
| |
A U
/
\
Петля-шпилька
G
G
G
|
A
\
/
C-A
U-G
G-C-A-A-G
G-G-U-U-C
/
\
G
|
C
|
A
C
|
G
|
U
C
U
\
A
Внутреняя петля
A
Спирали
A
A
Выпячивание
G
|
A
|
G
|
C
C
|
U
|
U
|
G
/
Множественная петля
\
/
C
|
G
|
C
|
/
G
|
C
|
G
G A
Псевдоузел
\
/
A
|
U
|
C
|
A
Вторичная структура HIV-1
Часть 3. Методы исследования
первичной и вторичной
структуры нуклеиновых кислот.
Секвенирование ДНК
Терминаторы элонгации цепи
1980г
Вторая Нобелевская
премия по химии:
«for their contributions
concerning the
determination of base
sequences in nucleic acids»
Дидезоксинуклеотиды
Фредерик Сенгер
Секвенирование ДНК по Сенгеру
Капилярное секвенирование с флуоресцентными терминаторами
Обратная транскрипция
Обратная транскриптаза
(также известная как ревертаза или РНКзависимая ДНК-полимераза)
• Фермент класса трансфераз,
осуществляющий ДНК-зависимый синтез
ДНК на матрице РНК (обратная
транскрипция).
• Обладает активностью РНКазы Н (т.е.
разрушает цепь РНК, входящую в состав
ДНК/РНК-дуплекса).
• Подобно всем ДНК-полимеразам
функционирует только при наличии
затравки.
Потенциал вторичной структуры РНК
Более чем для 3000
транскриптов
определены элементы
вторичной структуры,
что составляет около
50%
всех
генов
Saccharomyces
cerevisiae.
SHAPE (selective 2-hydroxyl acylation analysed by
primer extension
Предсказание вторичной структуры
• Перебор вариантов (жадные алгоримы)
• Минимизация свободной энергии/
Максимизация числа пар (Динамическое программирование)
• Стохастические алгоритмы (Монте-Карло, генетические
алгоритмы)
• Поиск консервативных структур
Реальность:
• Проблема формирования вторичной структуры РНК –
сложная комбинаторная и физическая задача
• Результаты минимизации энергии не всегда дают
биологически осмысленную структуру
• Наилучшие результаты дает поиск консервативных
структур