Отзыв-оппонента-Склярова-О.Д.

отзыв
официального оппонента на диссертационную работу Плотниковой Елены Михайловны «Индикация факторов вирулентности энтеробактерий, дифференциальная диагностика эшерихиоза
птиц» на соискание ученой степени кандидата ветеринарных
наук по специальности: 06.02.02 - ветеринарная микробиология,
вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и
иммунология
На сегодняшний день промышленное птицеводство в России основано на поточной системе выращивания, при которой птица, как правило, содержится на ограниченных площадях с искусственным микроклиматом,
что способствует распространению инфекционных болезней, в том числе,
вызываемых патогенными энтеробактериями. Так, в 2012 г. удельная доля
эшерихиоза в структуре инфекционных болезней птиц составила 53,9 %.,
падеж среди заболевшего поголовья - 92,0 %; в 2013 г. удельная доля
сальмонеллеза составила 12,0 %, эшерихиоза - 40,0 %.
терогеморрагических штаммов эшерихий,
Количество эн-
выделение при исследовании
патологического материала от кур и индеек составила 9,3 % от общего
числа изолятов.
С учетом этого, работу соискателя, посвященную изучению факторов
вирулентности энтеробактерий и исследованию динамики патологических
процессов при диссеминации в ткани и органы птиц с целью использовать
эти данные для оптимизации схемы бактериологической диагностики инфекционных болезней птиц, в том числе эшерихиоза, следует считать, выполненной на актуальную тему.
Диссертация Елены Михайловны, изложенная на 160 страницах компьютерного текста и иллюстрированная таблицами, построена по традиционному плану, состоит из введения, литературного обзора, собственных
исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и практических предложений, библиографии и 2-х приложений, иллюстрирована 27ю таблицами, 30-ю рисунками.
Раздел «Введение» автор посвящает краткой характеристике проблемы инфекционных болезней птиц, вызываемых патогенными энтеробактериями, ставит цель и задачи исследования, формулирует его научную
новизну и практическую значимость, а так же сообщает читателю необходимые сведения о полноте опубликованного материала и публичных сообщениях по теме диссертационной работы.
В литературном обзоре диссертант проанализировал и обобщил данные
218 научных публикаций, в т.ч. 98 зарубежных, посвященных раз-
ным аспектам изучения инфекционных болезней птиц, вызываемых патогенными энтеробактериями. В частности, представлен анализ актуальных
данных по изучению этиологической структуры бактериальных болезней
птиц, методов изучения факторов патогенности энтеробактерий, эпизоотологические данные, патогенез, особенности иммунного ответа, основные
методы дифференциальной диагностики бактериальных инфекций птиц.
В целом, приведенный обзор показывает, что автор критически проанализировал литературный материал и, тем самым, подтверждает и обосновывает необходимость проведения настоящей работы.
Главе «Собственные исследования» предшествует раздел «Материалы
и методы», из которого становится очевидным, что в процессе выполнения
диссертации автором освоены методы эпизоотологического анализа, современные методы клинико-морфологических и бактериологических исследований, методы изучения факторов вирулентности энтеробактерий, в
том числе изучение колициногенных свойств E.coli, проведение экстракции и индикации ДНК патогенных бактерий.
Первым этапом выполнения диссертационных исследований стало
изучение этиологической структуры болезней органов пищеварения птиц,
вызываемых патогенными энтеробактериями. С этой целью диссертантом
был проведен ретроспективный анализ этиологической структуры болезней птиц в птицеводческом хозяйстве ФГУП ППЗ «Птичное» Россельхозакадемии, учитывая первичные данные ветеринарной отчетности за период
2010-2013 гг., установлено, что смертность птиц составила 2,4-3,4 %; в
2010 г. - 2,7 %, в том числе молодняка до 105 суток - 1,2 %; 2011 г. - 2,8 %
и 0,8 %; 2012 г. - 2,4 % и 0,9 %; 2013 г. - 3,4 % и 0,9 %, соответственно.
Летальность птиц колебалась в пределах от 1,5 до 2,7 %; 2010 г. - 2,2 %;
2011 г. - 2,4 %; 2012 г. - 1,5 %; 2013 г. - 2,7 %. В общей структуре патологии птиц доля болезней органов пищеварения составляла 21,0 - 25,0 %, в
частности, в 2010 г. было зарегистрировано 3787 больных птиц, что составляло 25,0 % от общего числа болезней, в том числе молодняка до 105
суток - 2425 (64,0 %), в 2011 г. - 2919 (21,0 %) и 897 (30,72 %); в 2012 г.
- 2304 (24,0 %) и 1529
(66,36 %); в 2013 г. - 3011 (22,0 %) и 1115 (37,03
%), соответственно. Таким образом, проведенные исследования показали,
что удельный вес болезней органов пищеварения доминировал у молодняка в возрасте до 105 суток.
Затем, в соответствии с планом работы и внутренней логикой исследования, диссертант изучает видовой состав энтеробактерий, доминирующих в микробиоценозах кишечника птиц при болезнях органов пищеварения, учитывая количество микроорганизмов (КОЕ) в 1,0 г исследуемого
материала цыплят 5-,10-,15-сут. возраста, для чего выполняет работу по
определению наиболее эффективных дифференциально-диагностических
сред в опытах с чистыми и смешанными культурами энтеробактерий.
В результате проведенных автором бактериологических исследований, с использованием селективных и хромогенных сред, в том числе
«ТВХ agar» и «Chrom agar», из репрезентативной выборки птицеводческих
объектов, было выделено и идентифицировано 129 культур микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, в том числе Е. coli (51,1 %); K.pneumonia
(22,5 %); P.vulgaris (24,0 %); E. aerogenes (1,3 %). При серологической
идентификации, идентифицировано 38 (73,0 %) культур микроорганизмов
E.coli, серогруппа 0 1 - 12 (31,5 %), 0 2 - 8 (23,0 %), 078 - 7 (18,4 %), 015
- 7 (18,4 %), 0111 - 2 (5,2 %), 26,9 % типировать не удалось. Из 52 культур
микроорганизмов
15 (28,8 %) продуцировали адгезивные
антигены:
01:К99; 01:F41; 01:K99:F41; 02:К88; 02:K99:F41; 078:К88; 078:К99;
015:K88:F41.
Следующий этап исследований автор посвятил изучению факторов
вирулентности выделенных изолятов, были получены результаты изучения
патогенных, вирулентных, адгезивных, инвазивных, токсигенных свойств,
фенотипических признаков энтеробактерий, связанных с плазмидами вирулентности. При изучении патогенных свойств из 129 изученных культур
микроорганизмов 33,3 % энтеробактерий, выделенных при болезнях органов пищеварения птиц, являлись патогенными, в том числе E.coli 28 (65,0
%), K.pneumonia 7 (16,2 %), P.vulgaris 8 (18,6 %), 66,6 % - непатогенными. При определении вирулентности, беспородных белых мышей, согласно
общепринятой методике, заражали внутрибрюшинно в дозах от 2-х млрд.
до 3,2-х млн. бактериальных клеток, выражая степень вирулентности в
LD50. Таким образом, при изучении вирулентных свойств, средняя величина LD 5 O S.enteritidis - 154,0; E.coli - 398,0; K.pneumoniae - 698,0; P.vulgaris
- 457,5 млн. бактериальных клеток.
Адгезивные, инвазивные, цитотоксические свойства, устойчивость
микроорганизмов к фагоцитозу изучали при взаимодействии с клетками
крови птиц, культурой клеток «Уего», при этом 38 (88,3 %) культур микроорганизмов являлись адгезивными, в том числе, высокоадгезивные 15 (39,4
%), среднеадгезивные - 23 (60,5 %). Автором определен коэффициент корреляции между показателями адгезии на эритроцитах птиц и клетках
«Уего» г=0,4, что свидетельствует о корреляционной зависимости между
количеством адгезивных культур, выявленных с применением данных моделей. Фагоцитарный индекс, составил от 12,3±0,39 до 42,0±1,8, фагоцитарное число - от 1,2±0,12 до 6,3±0,12. Установлено, что Y.enterocolitica Sформа, обладали способностью к инвазии. Для определения цитотоксичности диссертант исследовал надосадочную жидкость. Цитопатическое действие веротоксинов (цитотоксинов) характеризовалось вакуолизацией цитоплазмы и кариопикнозом 85,6±2,2 % пораженных клеток.
При дальнейших исследованиях были получены результаты изучения
токсигенных свойств энтеробактерий. Для изучения продукции LT/ST токсинов на лабораторной модели «эдематозный тест», диссертант оценивал
в реакции клеточного иммунитета в виде гиперчувствительности замедленного типа и установил, что 40 (93,0 %) культур микроорганизмов продуцировали токсины. При изучении продукции термолабильных токсинов
(LT) на лабораторной модели «тест дилатации кишечника», диссертант
учитывал отношение массы тонкого кишечника с содержимым к массе
остального тела. При витальном исследовании продукции термостабильных токсинов (ST) и веротоксинов (VT) на лабораторной модели «легочный тест» учитывали проницаемость сосудов легких (величину отека
определяли по разности массы легких в контроле и опыте) по степени экстравазации витального красителя «синего Эванса», вводимого через хвостовую или подкрыльцовую вену. Через 24-48 ч диссертант наблюдал
пропитывание тканей легкого красителем, что свидетельствовало о нарушении сосудистой проницаемости при действии токсиов. При использовании диссертантом метода пассивной латексной агглютинации, из числа
изученных E.coli 19 (44,7 %) культур микроорганизмов продуцировали
термолабильные токсины.
Эмпирическим
путем
было
определено,
что
микроорганизмы
S.enteritidis продуцировали термостабильные токсины; E.coli - термолабильные и термостабильные токсины 28 (65,0 %); K.pneumonia - термостабильные токсины 6 (85,7 %); P.vulgaris - термолабильные токсины 5
(62,5%). Умереннотоксигенными являлись 18 (41,8 %) бактерий, слаботоксигенными - 25 (58,1 %), коэффициент проницаемости кровеносных сосудов составил 1,02±0,09-1,37±0,17, термостабильные токсины продуцировали 32 (75,0 %) культуры микроорганизмов, выделенных из репрезентативной выборки птицеводческих объектов.
Затем были изучены фенотипические признаки энтеробактерий, связанные с плазмидами вирулентности, показатели гемолитической активности микроорганизмов, колициногенные свойства, чувствительность микроорганизмов к антибиотикам. Таким образом, проведенные исследования
показали, что при изучении этиологической значимости факторов вирулентности изолятов, установлено, что патогенные энтеробактерии выделенные из репрезентативной выборки птицеводческих объектов, обладали
адгезивной активностью, способностью к инвазии, устойчивостью к фагоцитозу, продуцировали термолабильные, термостабильные токсины, гемолизины, бактериоцины.
Дальнейшие исследования были посвящены изучению дифференциально-диагностических признаков патогенных энтеробактерий при диссеминации в ткани и органы птиц и средствам их детекции с применением
эффективных питательных сред и молекулярно-генетических экспрессметодов индикации ДНК. Для первого этапа работы было произведено моделирование инфекционного процесса на 12-ти суточных эмбрионах птиц
и цыплят 5-,10-,15-суточного постинкубационного онтогенеза - интра3
3
назально культурами микроорганизмов в дозе 0,2 см и 1,0 см . Далее
была изучена возможность применения молекулярно-генетических экспресс-методов идентификации ДНК патогенных бактерий, с целью повышения эффективности бактериологического исследования на эшерихиоз
птиц. Летальность эмбрионов составляла до 100,0 %, цыплят - 20,0-60,0
%. За животными вели клинические наблюдения в течение 25 суток, выявили острое и подострое течение болезни. Для изучения диссеминациии
энтеробактерий в ткани и органы птиц из исследуемого материала выделяли чистые культуры микроорганизмов, для дифференциации патогенных
штаммов -
идентифицировали
ДНК бактерий методом полимеразной
цепной реакции в реальном времени. Таким образом, проведенные автором
исследования показали эффективность применения тест-системы «АмплиСенс Эшерихиозы-FL», основанной на методе полимеразной цепной реакции в реальном времени, что позволило идентифицировать ДНК патоген-
ных E.coli в течение З ч , с чувствительностью 250 бактериальных клеток в
исследуемом образце, корреляцией результатов исследований с применением лабораторных моделей (г=0,89). В результате подбора дифференциально-диагностических сред для видовой идентификации сальмонелл
установлена эффективность среды «XLD agar», клебсиелл
- «Brilliant
agar», иерсиний - «YS agar», для дифференциации патогенных штаммов
эшерихий - среды «Smac agar», «Chrom agar».
На основе результатов исследований разработаны «Методические рекомендации по индикации энтеробактерий, циркулирующих в птицеводческих хозяйствах».
Завершающим этапом работы стало изучение влияния токсигенных
энтеробактерий на динамику развития патологических процессов в тканях
и органах птиц. При заражении бактериями S.enteritidis,
K.pneumonia,
P.vulgaris, E.coli установлена коррелятивная зависимость изменений, развивающихся в сердечно-сосудистой и иммунной системе 12-ти суточных
эмбрионов, цыплят 5-, 10-, 15-суточного постинкубационного онтогенеза,
обусловленных застойной гиперемией сосудов, токсической дистрофией
кардиомиоцитов, массовым распадом лимфоцитов, макрофагальной реакцией, периваскулярным отеком тканей, образовавшимся вследствие выхода плазмы и форменных элементов крови, инфильтрацией рыхлой волокнистой
соединительной ткани мононуклеарными лейкоцитами и псев-
доэозинофилами. Динамика патологических процессов при диссеминации
E.coli 0157:Н7 в ткани и органы 12-ти суточных эмбрионов, цыплят 5-, 10,15-суточного постинкубационного онтогенеза в результате действия
цитотоксинов
характеризовалась
дифференциально-диагностическими
признаками, обусловленными дистрофическими и некротическими процессами гепатобиллиарной системы и нефротоксическим синдромом, проявляющимся застойным геморрагическим инфарктом, некрозом эпителия
канальцев нефронов почек птиц.
Таким образом, полученные автором экспериментальные данные указывают, что на развитие патологических процессов в тканях и органах
птиц влияет этиологическая структура и факторы вирулентности микроорганизмов; так же, на основе апробации и подборе эффективных дифференциально-диагностических сред, лабораторных моделей и молекулярногенетических экспресс-методов идентификации ДНК, в составе комплекса
дифференциальной диагностики эшерихиоза птиц, оптимизирована схема
видовой
идентификации и дифференциации штаммов, продуцирующих
адгезивные антигены, бактериоцины, гемолизины, термолабильные, термостабильные токсины.
Анализируя результаты исследований, полученные автором, можно
утверждать, что поставленная цель была достигнута. Содержание автореферата диссертации соответствует содержанию диссертации. Выводы согласуются с результатами диссертационных исследований.
В рецензируемой работе не установлено замечаний, которые бы исключали положительную оценку.
Несмотря на положительную оценку работы, следует отметить некоторые ее недостатки:
1. В тексте встречаются ошибки, опечатки и неудачные выражения.
2. Полученные автором результаты научных исследований по частоте
выявления ассоциированных форм эшерихиоза птиц, особенно с заболеваниями вирусной этиологии, которые имеют большое практическое значение при диагностике и дальнейшей специфической профилактики ассоциированных инфекций у птиц, что скромно отмечено диссертантом.
3. Не все результаты исследований, представленные в диссертационной работе автора, имеют отражения в выводах и практических предложениях.
Отмеченные недостатки не являются принципиальными и не снижают
научную и практическую значимость работы.
Несмотря на отмеченные недостатки, диссертацию Плотниковой Елены Михайловны «Индикация факторов вирулентности энтеробактерий,
дифференциальная диагностика эшерихиоза птиц» следует считать завершенной научно-исследовательской работой, выполненной на актуальную
тему. По наличию элементов новизны и практической значимости работа
отвечает требованиям ВАК РФ, предъявляемым к кандидатским диссертациям, а её автор достоин
присуждения ему ученой степени кандидата
биологических наук по специальности 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология.
Официальный оппонент
доктор ветеринарных наук,
зав. лабораторией качества и стандартизации
бактерийных лекарственных средств
ФГБУ «Всероссийский государственный центр
качества и стандартизации лекарственных
средств для животных и кормов»
123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д. 5
тел./факс: (495) 982-50-84, (499) 253-14-68,
(499)253-14-91
E-mail: kanc@vgnki.ru
Подпись Склярова О.Д. заверяю:
ог
О.Д. Скляров