Исследование нитрат/нитрит-зависимых белков
реклама
МОСКОВСКИЙ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ (ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ) Факультет Общей и Прикладной Физики Кафедра Физики и Технологии Наноструктур Лаборатория Перспективных Исследований Мембранных Белков Магистерская диссертация Исследование нитрат/нитрит-зависимых белков-сенсоров Escherichia coli Мельников Игорь Александрович Научный руководитель: Георг Бюльдт Москва, 2014г. 2 Содержание 1. Список обозначений ...................................................................................................................5 2. Введение ......................................................................................................................................6 3. Обзор литературы .......................................................................................................................8 3.1. Двухкомпонентные системы ..............................................................................................8 3.1.1. Введение ........................................................................................................................8 3.1.2. Гистидин киназа катализирует АТФ-зависимое автофосфорилирование при детектировании сигнала .............................................................................................................9 3.1.3. Фосфорилированная гистидин киназа переносит свой фосфат на сопряженный регулятор ....................................................................................................................................10 3.1.4. Гистидин киназы избирательно фосфорилируют сопряженные им регуляторы, избегая кросс-фосфорилирования ...........................................................................................13 3.2. 3.2.1. HAMP играет важную роль в процессе передачи сигнала внутрь клетки ............15 3.2.2. Механизм передачи сигнала HAMP-доменом .........................................................17 3.3. Нитрат/нитрит-зависимые сенсоры NarX и NarQ ..........................................................24 3.3.1. Введение ......................................................................................................................24 3.3.2. Принципы работы и физиологическое значение ДКС: NarX-NarL и NarQ-NarP 25 3.3.3. Каталитические свойства гистидин киназ NarX и NarQ ........................................27 3.3.4. Структурные особенности сенсоров NarX и NarQ .................................................29 3.4. 4. HAMP-домен ......................................................................................................................15 Заключение .........................................................................................................................32 Материалы и методы ................................................................................................................33 4.1. Материалы ..........................................................................................................................33 4.1.1. Организмы...................................................................................................................33 4.1.2. Вектора ........................................................................................................................33 4.1.3. Синтетические олигонуклеотиды .............................................................................34 4.1.4. Химические вещества ................................................................................................34 4.1.5. Плашки для кристаллизации .....................................................................................35 4.2. Методы ...............................................................................................................................35 4.2.1. Агарозный ДНК-гель-электрофорез .........................................................................35 4.2.2. Полимеразная цепная реакция ..................................................................................36 4.2.3. Выделение геномной ДНК E.coli ..............................................................................38 4.2.4. Выделение ДНК из агарозного геля .........................................................................38 4.2.5. Рестрикция ДНК .........................................................................................................39 3 4.2.6. Лигирование ДНК ......................................................................................................40 4.2.7. Приготовление компетентных клеток ......................................................................40 4.2.8. Трансформация плазмиды в компетентные клетки ................................................41 4.2.9. Культивирование клеток и экспрессия белка ..........................................................42 4.2.10. Химический лизис ..................................................................................................42 4.2.11. Механическое разрушение клеток и осаждение мембран ..................................43 4.2.12. Солюбилизация .......................................................................................................44 4.2.13. Афинная хроматография ........................................................................................44 4.2.14. PAGE гель-электрофорез и Western Blotting........................................................44 4.2.15. Гель-фильтрация (Size-exclusion chromatography) ..............................................46 4.2.16. Концентрирование белка .......................................................................................46 4.2.17. Кристаллизация водорастворимых белков ..........................................................47 4.2.18. Thermal Shift Assay .................................................................................................48 4.2.19. Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей .....................................................49 4.2.19.1. Малоугловой рентгеновский спектрометр Rigaku SMAX-3000 .....................49 4.2.19.2. Обработка спектров малоуглового рассеяния ..................................................49 4.2.20. 5. Моделирование структуры белка с помощью ПО RaptorX ................................49 Результаты и обсуждения.........................................................................................................51 5.1. Создание генетических конструкций ..............................................................................51 5.2. Экспрессия и очистка белка .............................................................................................56 5.3. Кристаллизация NarQs ......................................................................................................61 5.4. Исследование белка NarQs ...............................................................................................63 5.4.1. Измерение термостабильности NarQs ......................................................................63 5.4.2. Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей ........................................................65 5.4.3. Моделирование структуры NarQs с помощью RaptorX .........................................66 6. Выводы.......................................................................................................................................68 7. Благодарности ...........................................................................................................................69 8. Список литературы ...................................................................................................................70 4 1. Список обозначений Da, kDa Дальтон, килодальтон bp kbp (base pair) Пара оснований нуклеотидов на комплементарных цепях нуклеиновых кислот (kilo base pair) Тысяча пар таких оснований а.о. Аминокислотный остаток ПЦР Полимеразная цепная реакция АТФ Аденозинтрифосфат АДФ Аденозиндифосфат ДКС, англ. TCS (Two-component regulatory system) Двухкомпонентная регуляторная система HAMP ХЭМП-домен (от англ. Histidine kinase, Adenylate cyclase, Methyl-accepting chemotaxis protein, Phosphotase) DHp Домен, отвечающий за димеризацию и трансфосфорилирование (от англ. Dimerization and Histidine phosphotransfer) CA домен, отвечающий за связывание с АТФ и последующее автофосфорилирование киназы (от англ. Catalytic and ATP-binding domain) HK Гистидин киназа RR Белок-регулятор, сопряженный с гистидин киназой CC Суперспираль (от англ. Coiled Coil) K-I-H Упаковка α-спиралей типа выступ-к-яме (от англ. Knobs-Into-Holes) K-I-K Упаковка α-спиралей типа выступ-к-выступу (от англ. Knobs-Into-Knobs) MBP Мальтоза-связывающий белок (от англ. Maltose binding protein) RT Комнатная температура (от англ. Room temperature) 5 2. Введение Микроорганизмы проводят свой жизненный цикл в постоянно изменяющихся физических и химических условиях. За долгие годы эволюции они выстроили ряд механизмов, которые позволяют им приспосабливаться даже к самым резким изменениям среды вокруг них. Эти механизмы действуют принципиально схожим образом: сначала клетка детектирует какой-либо сигнал снаружи, затем этот сигнал передается внутрь клетки через цитоплазматическую мембрану, где уже определенным образом влияет на экспрессию тех или иных генов, модулируя поведение клетки и ее ответ на изменение внешних условий. Среди основных внешних параметров, влияющих на гомеостаз бактериальной клетки, – уровень pH среды, осмотическое давление, концентрации ряда различных веществ, регулирующих энергетический метаболизм, хемотаксис а также чувство кворума. Наиболее яркими и относительно хорошо изученными примерами таких систем являются: сенсор осмотического давления EnvZ и сопряженный цитоплазматический регулятор OmpR[74]; хеморецепторы Tar&Tsr[75], фоторецепторы SRII-HtrII[48, 49], аэрорецепторы Aer[40, 41] вместе с регуляторной системой движения жгутиков Che; сенсоры нитратов-нитритов NarX&NarQ и сопряженные с ними регуляторы клеточного метаболизма NarL&NarP. Самым распространенным механизмом адаптации бактерий является так называемая двухкомпонентная регуляторная система (TCS, англ. Two-Component Regulatory System)[1]. ДКС состоит из пары белков, взаимодействующих посредством фосфорилирования определенных аминокислотных остатков. На сегодняшний день почти в любом бактериальном геноме можно найти закодированные двухкомпонентные системы, а в геномах некоторых видов число различных ДКС может достигать количества 200[5,6]. Такое преобладание двухкомпонентных систем по сравнению с другими механизмами в адаптационном аппарате клетки показывает, насколько важны и полезны для бактериальной клетки ДКС. Данные ДКС широко распространены лишь в бактериях и в некоторых археях и грибах, в то время как у высших животных встретить их довольно трудно. Такая особенность делает их отличным предметом для исследований в области разработки новых антибиотиков и других антибактериальных лекарств[15,16]. 6 На данный момент предметом нашего интереса являются две похожие ДКС микроорганизма E.coli (штамм K-12), роль рецепторов в которых выполняют гомологичные нитрат/нитрит-зависимые белкисенсоры NarX и NarQ, а цитоплазматических регуляторов метаболизма – белки NarL и NarP. NarX и NarQ – гомологи, находящиеся в цитоплазматической мембране – улавливают сигнал о нахождении нитрита либо нитрата в периплазматическом пространстве клетки и посредством структурных изменений передают этот сигнал в цитоплазму. В цитоплазме сигнал передается в виде фосфорилирования регуляторов метаболизма нитритов и нитратов NarL и NarP, катализируя их активность. При помощи этих двух ДКС бактериальная клетка регулирует свой метаболизм, используя нитриты и нитраты, как второстепенные (в отсутствие кислорода) акцепторы электронов в процессе энергетического обмена. Предметом интереса в данной работе является механизм передачи сигнала белками NarX и NarQ через цитоплазматическую мембрану клетки. В структурной организации этих сенсоров особое место занимает так называемый HAMP-домен, общий для широкого класса белков – гистидин киназ, аденилат циклаз, метилируемых белков хемотаксиса и фосфотаз (от англ. Histidine kinase, Adenylate cyclase, Methyl-accepting chemotaxis protein, Phosphotase)[28, 29]. HAMP-домен принимает входящий импульс от трансмембранной спирали и преобразует его, активируя каталитические свойства цитоплазматической части белка. Несмотря на широкую распространенность HAMP-домена, механизм его действия, суть структурные изменения при передаче сигнала, до конца не ясен. Также пока неизвестна полная трехмерная структура белков NarX и NarQ: по причине их амфифильной природы и достаточно крупной цитоплазматической части практически невозможно вырастить стабильные качественные кристаллы белка[76] для рентгеноструктурного анализа, а для ЯМР-спектроскопии белки слишком крупны. Разумным предложением для решения данной проблемы стало разделение этих белков на цитоплазматическую и трансмембранную части с помощью аппарата рекомбинантной генной инженерии и последующее выращивание отдельно кристаллов этих частей, что и было реализовано в данной работе. Цель данной работы заключалась в структурном исследовании рекомбинантных белков – частей NarX и NarQ, выявлении структурных изменений и закономерностей, определяющих передачу сигнала внутрь клетки, в частности для HAMP-домена этих белков. 7 3. Обзор литературы 3.1. Двухкомпонентные системы 3.1.1. Введение Двухкомпонентные системы играют важнейшую роль в адаптационном аппарате бактерий. Они позволяют ощущать и реагировать на различные изменения во внешнем окружении бактериальной клетки. Важность ДКС нельзя переоценить, почти в каждом изученном бактериальном геноме есть ДКС (в среднем по 20 ДКС на клетку), а в некоторых случаях их число достигает 200[5,6]. Важно заметить, что ДКС присущи преимущественно бактериям, в то время как в организмах архей и эукариот они играют довольно второстепенные роли[9]. Двухкомпонентная система состоит из сенсора (чаще всего закрепленного в цитоплазматической мембране) и регулятора, влияющего на экспрессию тех или иных генов[1]. Сенсорный белок принадлежит к классу гистидин киназ: при помощи различных конформаций, регулируемых сенсорным доменом, он способен проводить АТФзависимое автофосфорилирование, впоследствии фосфорилируя регулятор. Фосфорилирование катализирует активность регулятора, и он, в свою очередь, прикрепляясь к операторным участкам ДНК, взаимодествуя с сигма-фактором РНК-полимеразы, влияет на транскрипцию[11-14]. Как упоминалось ранее, ДКС широко распространены в бактериальных клетках, и, кроме того, ферментативным (т.е. отвечающим за реакции фосфорилирования) доменам и гистидин киназ, и регуляторов свойственна консервативность, т.е. они похожи для большого числа белков. Но, несмотря на это, ДКС работают в строго определенном режиме, когда каждая гистидин киназа фосфорилирует только свой, сопряженный регулятор, избегая перекрестного взаимодействия[4,5,8]. Кроме ДКС, широкое распространение в бактериальном мире и не только нашли так называемые фосфореле[3]. Механизм их работы – хотя и подразумевает в обоих случаях перенос фосфатной группы от одного белка другому – принципиально различный. В этой работе мы не будем останавливаться на фосфореле, а рассмотрим лишь подробно ДКС. 8 3.1.2. Гистидин киназа катализирует АТФ-зависимое автофосфорилирование при детектировании сигнала Типичная гистидин киназа, задействованная в аппарате ДКС, состоит из 4 доменов (см. рис. 1)[5]: - Сенсорный домен, детектирующий сигнал (либо связывающийся с лигандом чаще всего в периплазматическом пространстве). Сюда включены также трансмембранные α-спирали. - HAMP-домен, общий для широкого класса белков, принимающий непосредственное участие в передаче сигнала внутрь клетки (на рисунке не указан) - DHp (от англ. Dimerization and Histidine phosphotransfer) – домен, отвечающий за димеризацию гистидин киназы и за транс-фосфорилирование регулятора (находящийся здесь His – аминокислотный остаток гистидина является донором фосфатной группы при транс-фосфорилировании) - CA (от англ. Catalytic and ATP-binding domain) – домен, отвечающий за связывание с АТФ и последующее автофосфорилирование киназы. Рис. 1[5]. Структурная организация типичной гистидин киназы. N-конец гистидин киназы обычно находится вблизи сенсорного домена, а C-конец – вблизи каталитического домена. 𝐻𝐾-𝐻𝑖𝑠 + 𝐴𝑇𝑃 𝐻𝐾-𝐻𝑖𝑠~𝑃 + 𝐴𝐷𝑃 (1) Реакция автофосфорилирования гистидин киназы (1) подразумевает связывание АТФ со своим сайтом связывания на 9 поверхности белка и последующее перемещение γ-фосфата на гистидиновый аминокислотный остаток киназы. Гистидин киназы каталитически схожи с серин/треонин/тирозин киназами, но последние в комплексе с фосфатом образуют фосфодиэфирную связь, в то время как гистидин киназы образуют фосфорамидаты. Свободная энергия такой связи N~P намного больше, чем фосфодиэфирной, и, учитывая внутриклеточное соотношение ATP/ADP, очевидно, что только малая часть гистидин киназ фосфорилирована в равновесии (1)[2]. Не менее важной особенностью является наличие фосфатазной активности у подавляющего большинства гистидин киназ. Таким образом, комбинируя активность киназы и фосфатазы, гистидин киназа поддерживает уровень фосфорилированного регулятора на том или ином уровне в зависимости от наличия сигнала. Такие гистидин киназы (т.е. обладающие фосфатазной активностью) называют бифункциональными. 3.1.3. Фосфорилированная гистидин киназа переносит свой фосфат на сопряженный регулятор Регулятор, сопряженный с гистидин киназой, состоит из двух частей: из домена-приемника фосфата и из регуляторного домена (см. рис. 2) Рис. 2. Структура регулятора. 𝐻𝐾-𝐻𝑖𝑠~𝑃 + 𝑅𝑅-𝐴𝑠𝑝 𝐻𝐾-𝐻𝑖𝑠 + 𝑅𝑅-𝐴𝑠𝑝~𝑃 (2) При трансфосфорилировании (2) (при котором происходит перенос фосфата от одного белка другому в отличие от автофосфорилирования) фосфат переносится от гистидинового остатка киназы на аспартатный остаток домена-приемника регулятора. Химические свойства фосфо-аспартата (Asp~P) в полипептидной цепи отличаются от таковых в свободных молекулах ацил-фосфатов, прежде 10 всего свободной энергией гидролиза. Это привело к гипотезе, что энергия связи в ацил-фосфате может служить двигателем конформационных изменений в белке. Таким образом, фосфо-аспартат отличается от фосфосерина/тирозина, которые регулируют белковую конформацию лишь локальным электростатическим полем[2]. Свободные ацил-фосфаты обычно легко гидролизуются в течение нескольких часов и в кислотных и в щелочных растворах, в то время как белки способны катализировать гидролиз своего фосфо-аспартата либо, наоборот, стабилизировать фосфат, и таким образом их время жизни в фосфорилированном состоянии разнится очень сильно[2]. Рис. 3[14]. А, Б, Г – различные механизмы влияния регуляторов (красный цвет) на инициацию транскрипции РНК. В – сигма-фактор инициации транскрипции сам по себе не в состоянии связаться с ДНК. Он прочно связывается уже только с РНК-полимеразой, связанной с промотором. Будучи фосфорилированным, регулятор переходит в активное состояние и связывается со своим операторным участком на ДНК (некоторые белки-регуляторы связываются со своим операторным участком и без фосфорилирования, но именно при фосфорилировании 11 они обретают способность влиять на транскрипцию[4]). В зависимости от нуклеотидной последовательности оператора фосфорилированные регуляторные белки могут работать в мультимерах (палиндромная операторная последовательность) либо в виде цепочки связанных копий (повторяющаяся операторная последовательность)[17]. В целом, существует 3 типа механизмов, с помощью которых белки-регуляторы могут влиять на инициацию транскрипции[14] (см. рис. 3) В простейшем случае единственного операторного участка его положение относительно старта транскрипции (+1) по сути определяет направление регуляции. Так, положение оператора от -35 до +20 нуклеотида говорит о репрессии, так как регулятор будет состязаться с РНК-полимеразой за связывание с около-промоторным участком. Напротив, связывание регулятора между -65 и -30 нуклеотидами позволяет ему вербовать субъединицы РНК-полимеразы, усиливая белковые взаимодействия. Таким образом, место связывания регулятора скорее определяет его действия, чем различные конформации. Это позволяет одним и тем же белкам на одном промоторе активировать транскрипцию, а на другом репрессировать[17]. Особое место в регуляции транскрипции занимают сигмасубъединицы РНК-полимеразы (т.н. сигма-факторы инициации транскрипции). В большинстве случаев именно с сигма-фактором РНКполимеразы связывается белок-регулятор. Сигма-факторы не способны связаться напрямую с ДНК, они лишь связываются с остальными субъединицами РНК-полимеразы и при достаточно большом количестве (в 2-3 раза превышающем количество самой РНК-полимеразы) сигмафакторов в клетке они делают это конкурентно. В организме E.coli существует семь сигма-факторов инициации транскрипции: σ70(RpoD) – σA – основной фактор инициации транскрипции, транскрибирует большинство генов в клетке σ54 (RpoN) – фактор, транскрибирующий ряд генов, связанных с метаболизмом азота А так же σ19 (FecI) σ24 (RpoE) σ28 (RpoF) σ32 (RpoH) σ38 (RpoS) 12 3.1.4. Гистидин киназы сопряженные им фосфорилирования избирательно фосфорилируют регуляторы, избегая кросс- Среди огромного количества белков из класса гистидин киназ, работающих в двухкомпонентных системах, наблюдается ряд сходств и отличий. Наибольшее различие существует среди сенсорных доменов (находящихся вблизи N-конца аминокислотной последовательности) данных белков, что объясняется разнообразием принимаемых извне сигналов. Напротив, каталитические C-концевые домены гистидин киназ, как и домены-приемники регуляторов, сохраняют большую часть аминокислотной последовательности и претерпевают лишь незначительные изменения в ней для всего класса белков. Аминокислотные последовательности каталитических доменов гистидин киназ имеют общим 31% а.о., в то время как у регуляторов это число достигает 50%. На сегодняшний день известны некоторые трехмерные структуры регуляторов[21-24] и каталитических доменов гистидин киназ[1820] , что позволяет судить об их близком подобии (внутри семьи регуляторов и внутри семьи гистидин киназ отдельно). Таким образом, возникает вопрос, существует ли строгая специфичность между гистидин киназами и регуляторами, и, если существует, то каким образом обеспечивается отсутствие перекрестного фосфорилирования (т.е. фосфорилирования не сопряженными, не родственными киназами) при большой степени консервативности у каталитических доменов киназ и у доменов-приемников регуляторов. В поисках ответа на этот вопрос были реализованы различные методики. Например, в работе [4] были проанализированы in vitro все возможные кросс-фосфорилирования 21-ой различной гистидин киназой 34-х регуляторов E.coli. При этом только в 3% от всех проанализированных несопряженных 692 взаимодействий был замечен положительный исход кросс-фосфорилирования. Также гистидин киназы были разделены на группы по скорости авто- и дефосфорилирования, высказаны предположения о роли различных скоростей фосфорилирования в процессе передачи сигнала, а также о том, что эксперименты in vitro в некоторой степени отражают ситуацию in vivo. В другой работе[7] было исследовано транс-фосфорилирование гистидин киназами EnvZ, CheA и CpxA всех возможных регуляторов E.coli. В результате, через час реакции была обнаружена значительная доля кросс-фосфорилирования. С другой стороны, после 10 секунд 13 реакции каждый сопряженный регулятор был полностью фосфорилирован, в то время как остальные – не тронуты. Это указывает на значительное преимущество в кинетике реакции у сопряженной ДКС перед остальными взаимодействиями. Рассуждения относительно специфичности в ДКС проводились в рецензии [5]. Важным замечанием в этой работе было то, что в некоторых ДКС кросс-фосфорилирование существует и является неотъемлемой частью их работы, как например в системах NarX/NarL и NarQ/NarP[26,27]. Отдельно выделено соотношение в количествах между гистидин киназами и регуляторами – последних больше примерно на порядок. Кроме того, было отмечена важность фосфатазной активности у гистидин киназ, а также необходимость исследования структуры каталитических доменов на наличие критических аминокислотных остатков, влияющих на специфичность. Более полный анализ кинетики фосфорилирования в ДКС был проведен в работе [8] были исследованы взаимодействия между двумя двухкомпонетными системами E.coli – EnvZ/OmpR и CpxA/CpxR с помощью ультрабыстрого спектрометра и метода quenched(stopped)-flow. Это позволило определить константы скорости реакций фосфорилирования на миллисекундных временных отрезках. В результате была создана математическая модель реакций фосфорилирования между парами EnvZ/OmpR и CpxA/CpxR, которая была подтверждена in vivo при помощи мутаций выключения различных генов. Основными факторами отсутствия кросс-фосфорилирования in vivo были названы Колоссальное преимущество в кинетике фосфорилирования у сопряженной ДКС перед “чужими” киназами Наличие фосфатазной активности у гистидин киназ Конкуренция субстратов Таким образом, теория, описанная в [25], о решающем значении фосфатазной активности для отсутствия кросс-фосфорилирования частично была подтверждена. 14 3.2. HAMP-домен 3.2.1. HAMP играет важную роль в процессе передачи сигнала внутрь клетки HAMP-домен является неотъемлемым звеном в цепи передачи сигнала. Он был открыт, как отдельная единица в гистидин киназах и хеморецепторах, около 25 лет назад[28, 29] и впоследствии был найден также и в других белках, за что и получил название HAMP[30] (сокращение от гистидин киназ, аденилат циклаз, метилируемых белков хемотаксиса и фосфатаз). В настоящее время более одной пятой части всех гистидин киназ имеют HAMP-домен, а среди хеморецепторов эта доля увеличивается до двух третьих[31]. Ряд работ по генетическому анализу показал, что мутации HAMPдоменов различных сенсорных белков чаще всего приводят к серьезным изменениям в их работе. Таким образом, предполагается, что HAMPдомен является не просто соединительным элементом в полипептидной цепочке, но, скорее, принимает активное участие в процессе передачи сигнала[35]. Анализ аминокислотной последовательности ряда HAMPдоменов, несмотря на достаточно большое разнообразие в аминокислотном составе, выявил периодичность в свойствах у групп по 7 аминокислот – так называемую гептадную периодичность – введенную Ф. Криком и характерную для суперспиральной (здесь СС от англ. Coiled Coil) упаковки α-спиралей[32]. Было предположено, что мономеры HAMPдоменов образуют две α-спирали, связанные соединителем, а будучи димеризованными создают связку из четырех α-спиралей[33]. Многие попытки получить структуру HAMP-домена были безуспешными из-за его нестабильности отдельно от всего белка. Решение было найдено в [31], где методом ЯМР-спектроскопии была получена молекулярная структура HAMP-домена белка Af1503 организма Archaeoglobulus fulgidus (см. рис. 4). Archaeoglobulus fulgidus – экстремально термофильные археи, что, вероятно, позволило долгое время оставаться стабильным HAMP-домену в той работе. Что касается белка Af1503 – его функции неизвестны. Полученная в [31] структура подтвердила предположения о строении HAMP-домена: четыре спирали – по две от каждого мономера – были упакованы в связку. Две спирали каждого мономера смещены относительно друг друга примерно на один виток и скрещены под углом 15 3°-13° друг с другом и под углом 10°-15° относительно центральной оси связки. Соединитель связывает C-конец 1-й спирали (названной AS1) Nконцом 2-й спирали (названной AS2), обвивая связку снаружи (рис. 4). Важно также отметить, что все четыре α-спирали параллельны и составляют в димере параллельную связку[31]. Рис. 4[31]. Первая решенная структура HAMP-домена белка Af1503 организма Archaeoglobulus fulgidus. При всем многообразии сенсорных белков, содержащих HAMPдомен, многообразны и входящие в HAMP сигналы, генерируемые сенсорным доменом. Большинство трансмембранных сенсоров, связываясь с лигандом в периплазме, генерируют винтообразное смещение одной трансмембранной спирали относительно другой. Но это смещение может быть направлено как внутрь клетки и быть ассиметричным относительно димера (как, например, в метилируемом хемосенсоре Tar[38]), так и быть симметричным и направленным наружу (как в белке NarX[39]); кроме того, возможно вращение сигнальной спирали без смещения (как в трансдьюсере HtrII организма Natronomonas pharaonis[49]), а также непосредственное взаимодействие сенсорного домена и HAMP (как в сенсоре аэротаксиса Aer организма E.coli[40, 41]). 16 Но, несмотря на разнообразие принимаемых сигналов, оказалось возможным создавать химерные белки, состоящие из сенсорных, HAMP и каталитических доменов различных белков[34, 35, 42-45]. Так, NarX-Tar химера (состоящая из сенсорного, трансмембранного и HAMP доменов NarX и каталитического домена Tar) в бактериальной клетке приводит к репеллентному нитрат-нитриному хемотаксису[42]. А многочисленные эксперименты[34, 35] с химерным белком Tar-EnvZ (сенсорный, трансмембранный домен Tar, каталитический домен EnvZ, HAMPдомены от обоих белков) выявили активацию OmpB оперона регулятором OmpR из ДКС EnvZ-OmpR. Описанный же выше HAMP-домен белка Af1503 также нашел широкое применение в рекомбинантной генной инженерии в силу своей термодинамической стабильности. Принимая во внимание вышеописанные факты, можно заключить, что механизм передачи сигнала универсален для HAMP-доменов различных белков[31, 35]. Эту гипотезу подтверждает большое разнообразие химерных сенсорных белков, сохранивших свою функциональность. Также на это указывает универсальность структуры HAMP-доменов в виде связки четырех параллельных α-спиралей, несмотря на отличия в аминокислотной последовательности. 3.2.2. Механизм передачи сигнала HAMP-доменом На сегодняшний день механизм работы HAMP-домена остается в точности неясным. Представления о работе HAMP просуммированы в виде двух гипотез, каждая из которых имеет весомые аргументы в свою пользу. Чтобы понять суть каждой из гипотез, рассмотрим сначала упаковку α-спиралей в связке. В работе [31], в которой впервые была получена структура HAMPдомена, была исследована упаковка α-спиралей в связке (рис. 4). Благодаря анализу аминокислотной последовательности HAMP-домена (см. рис. 5) была выявлена гептадная периодичность гидрофобных аминокислотных остатков. Согласно этой модели, предложенной Ф. Криком в 1953 году[32], гидрофобные аминокислотные остатки, периодически повторяясь, принимают непосредственное участие во взаимодействиях между α-спиралями. Будучи распределенными, примерно, как один гидрофобный остаток на один виток спирали, боковые цепи этих остатков формируют гидрофобное ядро суперспирали. Остальные аминокислоты формируют внешнюю поверхность и взаимодействуют со средой. Согласно предложенной Криком 17 номенклатуре, периодически повторяющиеся в свойствах аминокислотные остатки названы буквами английского алфавита от a до g. При этом гидрофобные остатки занимают позиции a и d (см. рис. 5). Рис. 5[31]. Сравнение аминокислотных последовательностей и свойств HAMP-доменов различных белков и организмов. Гидрофобные аминокислотные остатки выделены желтым цветом, консервативные элементы – красным. Канонический способ упаковки α-спиралей в суперспираль был также назван knobs-into-holes, K-I-H (дословно с англ. выступ-к-яме). При такой упаковке в гидрофобном ядре связки каждая боковая цепь аминокислотного остатка (выступ) попадает в пространство, окруженное четырьмя другими боковыми цепями (яму). Таким образом, от слоя к слою возникают контакты между спиралями (см. рис. 6, правая часть). Однако, упаковка, наблюдаемая в работе [31] отличается от ожидаемой канонической K-I-H упаковки. Обнаруженный способ упаковки был назван knobs-into-knobs, K-I-K (дословно с англ. Выступ-квыступу). Как можно понять из названия, боковые цепи аминокислот в такой упаковке направлены друг на друга в гидрофобном ядре связки. А именно, пара боковых цепей (аминокислотных остатков x) устремлены по 18 направлению к центральной оси связки, в то время как остатки da слоя формируют кольцом центральную полость, направляя свои боковые цепи в боковые стороны. Такая расстановка аминокислотных остатков, получившая название x-da (см. рис. 6, левая часть), обычно характерна для спиралей, последовательности которых имеют отклонения от гептадной периодичности (при этом x – это обычно остаток a либо d, и необязательно, чтобы da-слой состоял только из остатков a и d). Кроме того, x-da – несимметричная упаковка, в отличие от канонической K-I-H, ведь в наблюдаемой структуре HAMP-домена α-спирали AS1 и AS2 вносят различные в смысле гептадной периодичности остатки во взаимодействие x-da (AS1 вносит a,d,e, в то время как AS2 вносит a,d,g). Рис. 6[31]. Взаимодействия в гидрофобном ядре HAMP-домена и переход от одной упаковки к другой; α-спирали расположены перпендикулярно плоскости рисунка, вид со стороны плазматической мембраны клетки. Слева – упаковка типа K-I-K, справа – K-I-H. A – схематичное представление взаимодействий в гидрофобном ядре; B – взаимодействие между аминокислотными остатками по слоям. 19 Далее, в работе [31] было замечено, что переход от K-I-K (или также называемой x-da) упаковки в наблюдаемой структуре HAMPдомена к канонической упаковке K-I-H может быть произведен вращением α-спиралей в разные стороны на 26° (что схематично показано на рис. 6 в виде шестеренок). Таким образом, на основе анализа похожих упаковок α-спиралей, было сделано предположение, что HAMP-домен модулирует проходящий сигнал с помощью этих двух конформаций, переключающихся с помощью вращения спиралей на 26°. Это послужило основой для первой гипотезы о механизме работы HAMP-домена (названной гипотезой коробки передач из-за аналогии с вращением шестеренок), согласно которой, HAMP-домен имеет две различных статических конформации (K-I-H и x-da) и переключается между ними в зависимости от сигнала с сенсорного домена, модулируя тем самым активность нижележащих каталитических единиц. Следует добавить, что в [31] были также опровергнуты более ранние представления о работе HAMP-домена, предполагающие вертикальное поступательное смещение α-спирали или ее ассоциацию с плазматической мембраной. В другой важной работе [37] были исследованы более или менее термостабильные мутанты HAMP-домена осмосенсора EnvZ. Оказалось, что при более стабильном HAMP-домене нижележащие каталитические домены теряют термодинамическую стабильность. Эта идея нашла продолжение в работах [50-52], где было исследовано и проанализировано влияние различных точечных мутаций HAMP-домена на его стабильность и на его работу в составе хемосенсоров. В результате была предложена иная гипотеза о механизме работы HAMP, названная гипотезой динамической связки. Суть ее заключается в том, что входящий сигнал модулирует стабильность и плотность упаковки αспиралей HAMP-домена – от более стабильного HAMP к менее стабильному и наоборот. Плотность упаковки спиралей HAMP в свою очередь влияет на конформацию нижележащих доменов, увеличивая и уменьшая их активность. Отдельно стоит рассмотреть место соединения последней спирали HAMP-домена AS2 с началом спирали нижележащего домена (см. рис. 7). Общей особенностью подавляющего большинства сенсорных белков, содержащих HAMP, является фазовая запинка (phase stutter) в гептадной периодичности α-спиралей в этом месте. Запинка образуется при смещении в гептадном регистре из 7 аминокислот на +4 или на -3 аминокислоты, что эквивалентно (см. рис. 7). Так как домены, идущие сразу за HAMP, всегда состоят из α-спиралей (параллельные димерные 20 спирали в EnvZ и NarX, антипараллельные суперспирали в Tar, Tsr, Aer и HtrII), то при наличии запинки плотно упакованные спирали HAMPдомена (x-da либо K-I-H) должны заставлять нижележащие спирали быть менее плотно упакованными. Рис. 7[52]. A – Сравнение последовательностей соединительного региона AS2-OH сенсорных белков. Гептадный регистр второй спирали HAMP-домена указан желтой стрелкой, а регистр нижележащей спирали – зеленой. Запинка выделена серым цветом. B – Схематическое изображение влияния упаковки HAMP на упаковку нижележащих доменов (OH – Output Helices) – следствие наличия запинки. Рис. 8[53]. Структура трех HAMP-доменов Aer2, полученная в работе [53]. Достаточно веский аргумент гипотеза динамической связки приобрела в работе [54], в которой была выявлена молекулярная структура (см. рис. 8) цепи из трех HAMP-доменов, принадлежащих рецептору аэротаксиса Aer2 (гомологичного рецептору Aer из E.coli) организма Pseudomonas aeruginosa. Это стало второй, третьей и четвертой решенными структурами HAMP-доменов. HAMP-1 и HAMP-3 21 из этой цепи демонстрируют конформацию, очень схожую с HAMPдоменом Af1503 с лишь незначительными изменениями. Конформация же HAMP-2, находящегося между HAMP-1 и HAMP-3, стала предметом огромного интереса, так как сильно отличалась от конформации соседей. Форма HAMP-2 была трапециевидной сбоку и ромбовидной в горизонтальном сечении (рис. 8). Вместо связки из четырех спиралей наблюдалась скорее суперспираль из двух спиралей AS2-AS2’ и примыкающие к ней AS1 и AS1’. Также было отмечено, что соединитель спиралей AS1 и AS2 играет важную роль в такой конформации, проникая ближе к центральной оси и образуя водородные связи. Одним из важных выводов той работы было предположение, что конформация, увиденная у HAMP-2, является именно той, менее плотно упакованной конформацией в гипотезе динамической связки, в отличие от более плотной упаковки вида HAMP-1, HAMP-3 и HAMP Af1503. Рис. 9[54]. Динамический ряд конформаций HAMP-домена и его влияние на активность каталитического домена. Первоначально[50], гипотеза динамической связки предполагала наличие двух конечных состояний HAMP-домена – более плотно и менее плотно упакованного – каждое из которых модулирует противоположные состояния сенсорного белка. Дальнейшие генетические эксперименты по мутациям HAMP-домена хемосенсоров[51] выявили отключение работы киназ (формируя так называемые CCW(A) и CCW(B) фенотипы, названные по направлению вращения жгутика при хемотаксисе) как при 22 очень плотной, так и при очень свободной упаковке спиралей HAMPдомена. В то же время, в промежуточном состоянии, между плотной и свободной упаковкой наблюдался CW-фенотип, т.е. наблюдалась работа киназ и прохождение сигнала. Это навело на мысль, что HAMP-домен может претерпевать непрерывный ряд различных динамических конформаций между плотной и свободной упаковкой связки (см. рис. 9), причем на концах этого ряда наблюдается отсутствие сигнала и активности каталитического домена. При наличии сигнала же, HAMPдомен принимает среднее положение в динамическом ряду и активирует нижележащий домен. Так модель динамической связки была доработана, с учетом ряда динамической стабильности HAMP. Таким образом, обе гипотезы достаточно привлекательны и имеют право на существование. Существенные аргументы в пользу как одной, так и другой гипотез пока не позволяют с уверенностью рассуждать о точном механизме работы HAMP-доменов и этот вопрос остается до сих пор открытым. 23 3.3. Нитрат/нитрит-зависимые сенсоры NarX и NarQ 3.3.1. Введение Энтеробактерии, такие как Escherichia coli, могут перестраивать свой метаболизм с аэробного на анаэробное дыхание и наоборот. Это происходит за счет сборки дыхательных цепей, состоящих из различных ферментов, в ответ на доступный в среде набор окислителей и восстановителей. Типичные электронные доноры – это формиаты (HCO2-), H2, NADH, лактаты; типичные электронные акцепторы включают кислород (O2), нитраты (NO3–), нитриты (NO2–), тетратионаты (S4O62–), фумараты, триметиламин N-оксид (TMAO) и [26] диметилсульфоксид (DMSO) . Приспосабливая свою дыхательную цепь к окружающим условиям, бактерия в первую очередь старается использовать самые энергетически выгодные пути, такие как кислородное дыхание. В анаэробных же условиях бактерии приходится выбирать из остальных электронных акцепторов. Следующим за кислородом по энергии восстановления идет нитрат (см. табл. 1), затем нитрит и все остальные. Электронный акцептор δG (кДж/моль) O2 O2 NO3– NO3– -233 -233 -144 -144 DMSO -92 TMAO Фумарат -87 -67 Конечный фермент дыхательной цепи Цитохром о-оксидаза Цитохром d-оксидаза Нитрат редуктаза Нитрат редуктаза DMSO/TMAO редуктаза TMAO редуктаза Фумарат редуктаза Оперон cyoABCD cydAB narGHJI narZYWV dmsABC torA frdABCD Табл. 1[55]. Сравнение энергии восстановления различных электронных акцепторов в дыхательной цепи E. coli. Указанные значения свободной энергии приведены из расчета, что донором электронов выступает NADH. Имея в своем распоряжении высокочувствительный аппарат обнаружения различных веществ в окружающей среде, бактерия регулирует транскрипцию ферментов дыхательной цепи, в зависимости от доступности каждого электронного акцептора. Данный принцип 24 регулирования очень удобен и позволяет бактерии более эффективно использовать ресурсы. Одним из центральных звеньев этой регулировочной цепи являются гомологичные сенсоры нитратов и нитритов NarX и NarQ, работающие в частности в организме E.coli. NarX и NarQ – трансмембранные белки из класса гистидин киназ, работающие в димерах, N-концевой сенсорный домен которых расположен в периплазматическом пространстве, а C-концевой – в цитоплазме. Улавливая присутствие нитратов или нитритов в периплазме, сенсор передает сигнал в цитоплазму, где вследствие этого происходит регуляция транскрипции генов дыхательной цепи, и клетка перестраивает свой метаболизм. Далее в этой главе рассматриваются более подробно свойства и механизм действия сенсоров NarX и NarQ. 3.3.2. Принципы работы и физиологическое значение ДКС: NarXNarL и NarQ-NarP Первоначально было установлено, что за обнаружение нитратов отвечает лишь одна ДКС E.coli – NarX-NarL[57]. Дальнейшие исследования установили, что в штаммах с удаленным геном белка NarX значительных изменений в сенсорных способностях к нитрату у E.coli не происходит. Так был обнаружен второй белок-сенсор нитратов – NarQ[58, 59]. Предположив, что NarQ представляет отдельную ДКС, был найден сопряженный NarQ регулятор NarP[60]. Более того, было обнаружено, что система NarQ-NarP также отвечает за чувствительность к нитритам, в отличие от NarX-NarL, которая специализируется лишь на нитратах[60]. Как типичные представители гистидин киназ, NarX и NarQ способны фосфорилировать и дефосфорилировать свои сопряженные регуляторы в составе ДКС. Исходя из основ ферментативного катализа, доля фосфорилированных регуляторов зависит от динамического равновесия между киназной и фосфатазной активностями гистидин киназы. В отсутствие сигнала одна из активностей превалирует над другой – обычно господствует фосфатазная активность дефосфорилирования. Напротив, при наличии сигнала ситуация меняется, и киназная активность увеличивается. При этом происходит смещение динамического равновесия и значительное увеличение доли фосфорилированных и активных регуляторов. Так происходит и для 25 белков данных двух ДКС. Будучи гомологами, NarX и NarQ имеют различной степени активность к несопряженным им регуляторам: так, NarQ способен фосфорилировать и дефосфорилировать NarL, в то время как NarX может вступать в реакции с NarP (хотя, активность NarX в отношении NarP едва уловима). Вопрос кросс-фосфорилирования между данными ДКС будет рассмотрен в следующем разделе. Рис. 10[56]. Схема работы гомологичных ДКС NarX-NarL и NarQ-NarP. Штрихованными стрелками указана слабая активность. Механизм регулирования метаболизма данными ДКС довольно сложен и включает в себя большое число взаимодействий. Прежде всего, в аэробных условиях синтез любых белков метаболизма нитратов и менее выгодных электронных акцепторов практически не идет из-за инактивации кислородом транскрипционного активатора генов анаэробного метаболизма Fnr (фумарат и нитрат редуктаза, от англ. Fumarate and nitrate reductase)[61]. В отсутствие кислорода Fnr активирует транскрипцию генов анаэробного метаболизма. В частности, Fnr активирует синтез белков NarQ и NarP, в то время как NarX и NarL уже присутствуют в клетке в достаточных количествах даже в аэробных условиях (воозможно, необходимость в этом связана с быстротой перестройки на анаэробное дыхание). Только после активации Fnr появляется возможность у регуляторов NarL и NarP проявить себя. В отсутствие нитратов и нитритов клетка выбирает следующие приемлемые акцепторы – DMSO, TMAO и фумараты – и активирует транскрипцию соответствующих ферментов (dmsABC, frdABCD). Напротив, когда нитраты и нитриты обнаружены в периплазме, все ферменты метаболизма энергетически менее выгодных акцепторов попадают под репрессию фосфорилированного NarL (см. рис. 10). Из двух родственных регуляторов в основном NarL производит активацию транскрипции генов нитрат редуктазы narGHJI, формиат дегидрогеназы fdnGHI, а также авторегуляцию генов narXL. NarP же, в свою очередь, больше отвечает за активацию транскрипции генов, связанных с метаболизмом нитритов и, 26 предположительно, малых концентраций нитратов: нитрит редуктаз nirBDC, nrfABCDEFG и периплазматической нитрат редуктазы napFDAGHBC[56, 63]. Следует отметить, что NarL выступает репрессором транскрипции этих генов, что, вероятно, связано с тем, что нитрит энергетически менее выгоден, чем нитрат. Также, в отличие от NarXL, NarQP не производит авторегуляции. Помимо всего прочего, было установлено, что NarQ также чувствителен к аэрации и фосфорилирует NarP в присутствии кислорода, но физиологического объяснения этому феномену не нашлось[64]. Как видно из описанных выше регуляторных взаимодействий, бактериальная клетка выстроила чрезвычайно сложную, но эффективную систему регуляции своего метаболизма в зависимости от внешних условий. ДКС NarX-NarL и NarQ-NarP играют одну из центральных ролей в этой системе, и выявление и описание их свойств, несомненно, может быть полезно для составления общей картины. 3.3.3. Каталитические свойства гистидин киназ NarX и NarQ Несмотря на гомологичность, гистидин киназы NarX и NarQ имеют серьезные отличия в каталитических способностях. В работе [65] исследовались способности цитоплазматических частей NarX и NarQ (для растворимости этих частей трансмембранные спирали белков были заменены MBP(Maltose binding protein)) к автофосфорилированию. В реакции автофосфорилирования гистидин киназы, рассмотренной выше в гл. 1, фосфорилирование гистидинового аминокислотного остатка происходит при связывании АТФ. Наличие же АДФ (в то же время продукта реакции фосфорилирования) катализирует обратную реакцию дефосфорилирования киназы. Доля фосфорилированных киназ, таким образом, находится в динамическом равновесии с остальными нефосфорилированными киназами и с соответствующими концентрациями АТФ/АДФ. При наличии сигнала гистидин киназа изменяет свои каталитические свойства и смещает динамическое равновесие в сторону более высокой доли фосфорилирования. В работе [65] было показано, что в растворе с АТФ-регенерационным аппаратом (преобразующим АДФ в АТФ) уровень фосфорилирования киназы неограниченно растет, в то время как в обычных условиях с АТФ, доля фосфорилированных киназ остается на одном достаточно низком уровне, 27 обусловленном динамическим равновесием. Также были выявлены различные сродства к АТФ и АДФ у исследованных белков (см. табл. 2). Автофосфорилирование Дефосфорилирование Белок -4 -1 KmATP, μM k, 10 с KmADP, μM –k, с-1 MBP-NarX185 2,4±0,7 0,5±0,2 2,3±0,6 0,029±0,01 MBP-NarQ182 22,8±9,3 2,2±1,1 1,8±0,7 0,013±0,003 CheA 300±75 260±40 42±8 0,028±0,003 NRII(NtrB) 31±1,4 118±2,5 40 – KinA 74±11 19±5 16±2,6 – EnvZ 218 0,81 – – PhoQ 20,1±13,1 – – – Табл. 2[65]. Параметры кинетики автофосфорилирования и дефосфорилирования различных киназ. Приведены значения Km – константы Михаэлиса и k – скорости реакции, экстраполированной до отсутствия субстрата. Указанные значения относятся к мономеру. Как видно из табл. 2, NarX и NarQ демонстрируют относительно высокое сродство как к АТФ, так и к АДФ среди белков данного класса, причем сродство NarX к АТФ на порядок выше, чем NarQ к АТФ. Хотя напротив, скорости связывания АТФ отличаются в четыре раза в обратную сторону. Нетрудно заметить и подавляющее преимущество скорости дефосфорилирования по сравнению со скоростью автофосфорилирования (отличие в 600 раз для NarX и в 60 раз для NarQ). Предположительно, исследованные химерные белки (MBP-NarX и MBPNarQ) оставались в конформации “отсутствия сигнала” во время эксперимента, что подтверждает превалирующая кинетика дефосфорилирования. В следующей работе тех же авторов [56] были исследованы кинетические параметры уже реакций трансфосфорилирования и дефосфорилирования регуляторов NarL и NarP киназами NarX и NarQ с учетом перекрестного взаимодействия. К уже фосфорилированным киназам в этой работе добавлялись регуляторы (по одному или вместе (см. рис. 11)) и система регенерации АТФ. Было выявлено, что скорость трансфосфорилирования NarX-NarL значительно больше скорости автофосфорилирования NarX, на что указывает стремительное дефосфорилирование киназы (рис. 11A). Накоплению фосфорилированного регулятора NarL препятствует, очевидно, фосфатазная активность NarX, превалирующая над киназной. В отношении NarP активность трансфосфорилирования со стороны NarX заметно слабее (рис. 11B), а фосфатазной активности почти нет, что позволяет фосфорилированному NarP неограниченно накапливаться. 28 Подавляющее преимущество NarL перед NarP относительно киназы NarX отчетливо видно на рис. 11C, где оба регулятора были добавлены в реакционную смесь, и присутствие фосфорилированного NarP едва уловимо. Рис. 11[56]. Реакции фосфорилирования между гистидин киназами NarX (X) и NarQ (Q) и регуляторами NarL (L) и NarP (P) в реальном времени. По оси ординат отложена степень фосфорилирования белка: NarX(○), NarQ(□), NarL(●), NarP(■). NarQ же не проявляет подобной NarX специфичности к одному регулятору и примерно одинаково взаимодействует с обоими регуляторами (рис. 11DE), имея склонность к усиленной фосфатазной активности к NarP (рис. 11F). Как видно из рис.10, кроссфосфорилирование в системах NarXNarL и NarQ-NarQ, скорее, имеет смысл не помех в работе двух ДКС, а, наоборот, кросс-регулирования. Таким образом, проявляя достаточно разные каталитические свойства, эти две ДКС кросс-регулируют дыхательную цепь бактерий, дополняя друг друга до более тонкой настройки. 3.3.4. Структурные особенности сенсоров NarX и NarQ Трансмембранные сенсорные белки NarX (598 а.о.) и NarQ (566 а.о.) состоят из трех основных доменов: сенсорного (~1-370 а.о.), центрального (~270-370 а.о.) и киназного (~370-570 а.о.). Сенсорный домен включает в себя четыре поддомена (см. рис. 12): периплазматический, трансмембранные спирали, HAMP-домен и так 29 называемую сигнальную S-спираль. Центральный домен находится сразу ниже сигнальной S-спирали и его функции на сегодняшний день остаются неизвестными, хотя, в работе [64] была установлена его значимость для чувствительности NarQ к кислороду. В то же время NarX не обладает такой чувствительностью, и, вообще, неясна физиологическая потребность в данном явлении. Следом за центральным идет каталитический домен, который состоит из двух поддоменов: DHp, предположительно, имеющего антипараллельную α-спиральную структуру, и CA, отвечающего за связывание с АТФ и, предположительно, состоящего из α/β-сэндвича[66]. Рис. 12. Структура сенсоров NarX и NarQ Центральный домен неизвестной функции не указан. В этом обзоре подробнее остановимся на поддоменах сенсорного домена, который и отвечает за передачу сигнала. Разобрав подробно свойства HAMP-домена в предыдущей главе, остаются к описанию периплазматический домен и сигнальная спираль, рассмотренные ниже. Структура периплазматического домена NarX (43-148 а.о.) в комплексе с нитратом (разрешения 2,0 Å) и без (разрешения 1,7 Å) была решена в работе [67]. Каждый из мономеров димерного периплазматического домена представлял связку из четырех α-спиралей (H1-H4), как показано на рис. 13. Два мономера почти не отличались строением и были симметричны (RMSD(Cα)=0,71Å). Единственный сайт связывания с нитратом был погребен в интерфейсе димеризационных взаимодействий в регионе так называемом P-box, расположенном на 30 спирали H1[67, 26]. Сам нитрат располагался в непосредственной близости к Arg54, образуя с ним водородные связи, и ван-дер-Ваальсово взаимодествие с Gly51. Также была обнаружена молекула воды около лиганд-связывающего сайта, располагаясь в потенциальной яме двух водородных взаимодействий с Ile47 и с кислородом нитрата. Вероятно, связывание молекулы воды имеет критическое значение для конформационных изменений при связывании лиганда. Как бы то ни было, в работе установлено, что связывание нитрата ведет к изменениям во взаимодействиях в P-box, что влечет за собой шарнирное движение спиралей H2 и H3, которые, в свою очередь, заставляют спираль H4 сместиться на 1Å относительно H1 в сторону мембраны. Таким образом, вследствие лишь частичной смысловой связи отдельно периплазматического домена с полным белком NarX, можно предполагать, что сигнал внутрь клетки (HAMP-домену) передается с помощью смещения трансмембранных спиралей TM2 относительно TM1 на 1Å перпендикулярно мембране[67]. Рис. 13[67]. А – структура димерного периплазматического домена NarX. Б – более подробное изображение сайта связывания с лигандом. Что касается сигнальной S-спирали, то ее важное значение для передачи сигнала было установлено в [66]. Сигнальные спирали представляют собой α-спирали, которые в димере образуют суперспираль в упаковке K-I-H и располагаются сразу за HAMP-доменом. Предположительно, S-спираль укрепляет свою стабильность с помощью солевых мостиков между остатками Arg и Glu. Общей особенностью большинства S-спиралей является сохраняющийся триплет аминокислот ERT в их последовательности, который создает отталкивающие 31 взаимодействия, вследствие чего структура S-спирали становится нестабильной и “растопыренной” в области ERT[66]. Это оказалось чрезвычайно важно в процессе передачи сигнала[66]. Данные факты хорошо согласуются с гипотезой динамической связки передачи сигнала через HAMP, рассмотренной в предыдущей главе. Таким образом, предположительный механизм передачи сигнала включает в себя взаимную стабилизацию/дестабилизацию HAMP-домена и S-спирали с помощью запинки[66]. 3.4. Заключение В данном обзоре были рассмотрены принципы работы гистидин киназ в составе ДКС, в частности NarX и NarQ. Понимание механизма их работы имеет немаловажное значение как для различных прикладных аспектов, так и для фундаментального знания о работе сенсорных белков. Хотя данная тема интенсивно изучается в течение более чем 30 лет, четкого ответа на вопрос о механизме действия сенсоров до сих пор не выявлено. Структурные методы кристаллографии выглядят очень многообещающе для решения этой проблемы, с учетом растущего количества решенных структур мембранных белков. Своей наглядностью структурные методы очень подкупают и позволяют с достаточной точностью подтверждать или опровергать те или иные гипотезы. Единственный их недостаток – сложность выращивания крупных качественных кристаллов, хотя за последнее время виден заметный прогресс в методологии. Таким образом, упор в данной работе делался на структурные исследования белков NarX и NarQ, как, безусловно, перспективное направление. 32 4. Материалы и методы 4.1. Материалы 4.1.1. Организмы В работе были использованы следующие штаммы E.coli (табл. 3): Штамм Описание генотипа F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 nupG recA1 Escherichia coli TOP10 araD139 Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 λfhuA2 [lon] ompT gal (λ DE3) [dcm] ∆hsdS Escherichia coli BL21 λ DE3 = λ sBamHIo ∆EcoRI-B (DE3) int::(lacI::PlacUV5::T7 gene1) i21 ∆nin5 F-, CmR, ompT, lon, hsdSB (restriction-, modification-), gal, dcm, Escherichia coli SE1 DE3 (lacI, T7polymerase under the control of the PlacUV5 promoter), ccdB+ Источник Invitrogen New England BioLabs Delphi genetics Табл. 3. Использованные в работе штаммы E.coli 4.1.2. Вектора В работе использовалась плазмида pStaby1.2 (T7 промотор, His C-концевой хвост, ccdA, устойчивость к ампициллину, lacI репрессор) производителя Delphi Genetics (см. рис. 14). Рис.14. Плазмидная карта вектора pStaby1.2 33 4.1.3. Синтетические олигонуклеотиды Клонирование генетических конструкций белков NarX и NarQ было выполнено посредством направленного сайт-специфичного мутагенеза. Исходные гены дикого типа белков NarX и NarQ были клонированы с генома E.coli BL21(DE3) в качестве матрицы. В работе были использованы следующие олигонуклеотиды (праймеры): Рабочее ПроизвоНуклеотидная последовательность название дитель NarXFwd1 GATAAGCTGTTTTACGCCAGTTCGCAGCATC Синтол GTATACTTCAGCCAATAGCCGAGAATACTGCCA NarXRev1 Синтол TT NarXFwd2 TGACCACATCTTCTTCATGGTTAGAGAC Синтол NarXRev2 CTCATAGACACCTCTGATACTCGTTTCG Синтол NarQFwd1 AGACATTGCTGACTGTTGGCCATAATAAAA Синтол NarQRev1 GGTGCCACTGCTCTGAGATGACATATAC Синтол NarQFwd2 CGCTATAAACTGTGGCAGATCAAATAATCC Eurofins NarQRev2 GAACCTTAAGTGCAAGTATTCTTTGGTCAG Eurofins NarXm_ins ATACATATGCTTAAACGTTGTCTCTCTCCGCTCA Синтол Fwd NarXm_ins GTGCTCGAGGGCATAACTTTCGGCC Синтол Rev NarXs_ins ATACATATGGCGCGACTGCTACAACCGTG Eurofins Fwd NarXs_ins GTGCTCGAGCTCATGGGTATCTCCTTG Eurofins Rev NarQs_ins ATACATATGGTGGTTGCCCCGCTGAATCAGCTG Eurofins Fwd GTTAC NarQs_ins GTGCTCGAGCATTAACTGACTTTCCTCACCCTCC Eurofins Rev GCA Табл. 4. Использованные в работе олигонуклеотиды 4.1.4. Химические вещества Неорганические соли и кислоты были приобретены у компаний Sigma-Aldrich, Applichem и Merck; детергент DDM – у Sigma-Aldrich; ферменты для работы с ДНК –Thermo; использовались киты для скрининговых кристаллизаций компаний Jena Bioscience, Rigaku reagents и Hampton Research. PEG400 (Полиэтилен гликоль 400) для кристаллизаций был приобретен у компании Sigma-Aldrich. 34 4.1.5. Плашки для кристаллизации В работе использовались 3 типа кристаллизационных плашек: CrystalQuick 96 Well Sitting Drop Plate (Greiner) компании Hampton Research, Greiner CrystalQuick™ Standard Profile Flat Bottom компании Jena Bioscience и Nanovolume Vapor Diffusion Plates собственного производства. Nanovolume Vapor Diffusion Plates были созданы Петром Утробиным и Михаилом Синцовым на основе стандартных плашек для кристаллизации мембранных белков LCP-Sandwich set. Круглое пространство, ограниченное спэйсером для LCP-капли было заменено овальным – для двух капель: капли преципитанта и капли кристаллизационной смеси белок-преципитант (см. рис. 15, красная капля – кристаллизационная смесь, синяя капля – преципитант). Рис. 15. Плашка для кристаллизации Nanovolume Vapor Diffusion 4.2. Методы 4.2.1. Агарозный ДНК-гель-электрофорез 35 Стандартный состав агарозного геля для гель-электрофореза (приведен состав 1% геля): 49 мл H2O (дистиллированной) 1 мл трис-ацетатного буферного раствора ТАЕ×50 0,5 г агарозы для получения 1% геля (варировалось в зависимости от размеров разделяемых отрезков ДНК от 0,8% до 1,2%) 2,5 мкл бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/мл или 5мкл GelRed. Напряженность электрического поля составляла 150В (~6В/см). Образцы ДНК для разделения окрашивались буфером 6хLD (дополнительно содержащим 5% SDS). Концентрация агарозы в геле варировалась в зависимости от необходимого отрезка разрешения (для разделения отрезков ДНК более 4000bp использовали 0,8% агарозный гель). 4.2.2. Полимеразная цепная реакция Состав смеси для проведения ПЦР (master-раствор): Название H2O (mQ, стерил.) 5xGC/HF Buffer dNTP HotStart II DNA Polymerase Σ Объем, мкл 138 40 8 2 188 Табл. 5. Стандартный состав «master»-раствора ПЦР Раствор делили на 4 пробирки по 47мкл. После добавляли в каждую из пробирок соответствущие недостающие компоненты – прямой праймер (Fwd), обратный праймер (Rev), ДНК матрицу, H2O (mQ, стерильную). В приведенной далее таблице для наглядности пробирки пронумерованы от 1 до 4, «+» или «-» означают наличие того или иного компонента: № пробирки H2O FW RW ДНК 1 – + + + 2 + – + + 36 3 + + – + 4 + + + – Табл. 6. Расшифровка контролей для ПЦР Такая организация проб для ПЦР позволяет определить в случае отрицательного результата, с каким из компонентов возникли проблемы. Стоит так же отметить, что в некоторых случаях в состав реакционной смеси добавляли DMSO 1-10% и MgCl2 0,5-5,0мМ (концентрации подбираются в каждом конкретном случае). Стандартный цикл реакции: Стадия Температура, °С Время Первичная 98 2 мин. денатурация Начало цикла (30-35 итераций) Денатурация 98 30 сек. Отжиг праймеров Tотжига 15-30 сек. Элонгация 72 tэлонгации Окончание цикла Деактивация 72 10 мин. Табл. 7. Стандартная программа температурного режима ПЦР полимеразы Для каждого из наборов праймеров использовалась соответствующая температура Tотжига. Время элонгации tэлонгации (варьируется в зависимости от длины амплифицируемой последовательности и сложности праймеров) вычислялось исходя из соотношения ʋэлонгации > 1000 bp/мин (заявленное производителем фермента значение ~5000 bp/мин, но не менее 1000 bp/мин). В некоторых случаях применялась двухстадийная ПЦР программа: Стадия Температура, °С Время Первичная 98 2 мин. денатурация Цикл 1 (5 итераций, для комплементарного участка праймера) Денатурация 1 98 30 сек Отжиг праймеров 1 Tотжига 1 15-30 Элонгация 1 72 tэлонгации Цикл 2 (30-35 итераций, для всего праймера) Денатурация 2 98 30 сек. Отжиг праймеров 2 Tотжига 2 15-30 сек. Элонгация 2 72 tэлонгации Окончание цикла Деактивация 72 10 мин. Табл. 8. Двухстадийная программа температурного режима ПЦР полимеразы Этот метод позволяет проводить ПЦР для праймеров, у которых длина участка, комплементарного матрице, сопоставима с длиной 37 некомплементарного участка (в таких случаях температура отжига всего праймера отличается от температуры отжига комплементарной части более чем на 5°С). 4.2.3. Выделение геномной ДНК E.coli Геномная ДНК выделялась по следующему протоколу: 1) 1мл бактериальной культуры, подращенной в течение 5-6 часов на 37°С, центрифугировался на rcf=4000g, 10мин в настольной центрифуге Eppendorf R4714 для осаждения клеток. 2) Надосадок сливался, а бактериальный осадок ресуспендировался в 0,2мл TritonX-100 буфера (10мМ Tris-HCl pH 8.0, 1мМ EDTA, 1% Triton X-100). 3) Полученная смесь инкубировалась 30 мин на 95°С при помешивании, затем охлаждалась до 4°С на льду. 4) Смесь центрифугировалась на rcf=12000g, 10мин и 10мкл надосадка, содержащие геномную ДНК, использовались для амплификации. 5) При необходимости геномная ДНК разрезалась ферментами рестрикции. 4.2.4. Выделение ДНК из агарозного геля Для выделения ДНК из агарозного геля использовался набор QIAquick Gel Extraction Kit компании Qiagen. ДНК выделялась по следующему протоколу: 1) Вырезанный из геля фрагмент растворялся в ~1ml раствора QX1 при 50°С в течение короткого промежутка времени. При этом было необходимо убедиться, что цвет раствора желтый, что указывало на pH<7.5. Если цвет был оранжевым или фиолетовым, то необходимо было добавить 10мкл 3М ацетата натрия, pH5.0. 2) Полученный раствор наносился на силиконовую мембрану колонки – центрифугированием в настольной центрифуге Eppendorf R4714 – 2 раза тем же раствором по 3 мин, 5-6 тыс. об/мин. 3) Далее колонка была промыта 500мкл высокосолевого буфера PB – 2 раза новым раствором по 3 мин, 5-6 тыс. об/мин. 38 4) Промывка 500мкл буфера PE, содержащего этанол – 5 мин, 5-6 тыс. об/мин. 5) Чтобы смыть остатки PE-буфера, пустая колонка с резервуаром центрифугировались 10 мин на 10 тыс. об/мин. При наличии запаха спирта, центрифугировались еще 1 мин. 6) Капля 30-50мкл буфера AE/5, либо воды (mQ H2O) помещалась на центр мембраны колонки. ДНК элюировалась в воду (либо AE/5) в течение 10 мин. 7) Затем раствор ДНК снимался с колонки центрифугированием в два этапа: 3 мин, 4-6 тыс. об/мин и 3 мин, 10 тыс. об/мин. 8) Полученный образец использовался по назначению, либо хранился при -20°С. 4.2.5. Рестрикция ДНК Стандартный состав реакционной смеси: Название H2O (mQ, стерил.) 10xFastDigest Buffer ДНК Рестриктаза Σ Объем, мкл 12 2 5 1 20 Табл. 9. Стандартный состав рестрикционной смеси Объем рестрикционной смеси варьируется в зависимости от концентрации ДНК; количество фермента не должно превышать 1/10 объема рестрикционной смеси. Количество ДНК (нг) лимитируется объемом лунок агарозного геля (стандартно – 30мкл для «тонких» гребенок и 50мкл для «толстых» гребенок). Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 60-90 минут (термостат или водяная баня). Реакция терминировалась подогревом реакционной смеси. Температура и длительность терминации подбирались для каждой конкретной реакции в зависимости от того, какая рестриктаза использовалась в реакционной смеси (таблица температур и времен приведена на сайте производителя). После реакции рестрикции следовало разделение рестриктов ДНК на агарозном геле. Необходимые участки геля (соответствующие 39 требуемому размеру рестрикта) вырезались из геля, и производилось выделение ДНК из геля (п. 4.2.4). 4.2.6. Лигирование ДНК Лигирование проводили в течение 60 мин. при комнатной температуре или в течение ночи (~10 часов) при 20°С (термостат). Необходимые для реакции лигирования количества ДНК (донора и акцептора) рассчитывалось по уравнению: 𝑀𝑣𝑒𝑐 [𝑛𝑔] × 𝐿𝐷𝑁𝐴 [𝑘𝑏𝑝] 3 × = 𝑀𝐷𝑁𝐴 [𝑛𝑔] 𝐿𝑣𝑒𝑐 [𝑘𝑏𝑝] 1 Формула для расчета состава лигазной смеси Состав смеси для лигазной реакции: Название H2O (mQ, стерил.) 10xLig.Buffer ДНК (донор) ДНК (акцептор) ATP (50мМ) T4 ДНК лигаза Σ Объем, мкл 12 2 2 1 1 0,5 20 Табл. 10. Стандартный состав лигазной смеси Стоит отметить, несмотря на то, что АТФ присутствует в лигазном буфере, при многократном использовании буфера (в циклах разморозки и заморозки) АТФ в буфере деградирует, в связи с чем возникает необходимость либо разделять буфер из набора сразу на порции по 2-10 мкл (для избежания повторного размораживания), либо искуственно вводить АТФ в лигазную смесь до 5-10мМ. При лигировании по «тупым концам» в смесь добавлялась дополнительно PNK (полинуклеотид 5’-гидроксил-киназа) для довешивания на 5’-концы цепей ДНК фосфатных групп. 4.2.7. Приготовление компетентных клеток 40 В данной работе применялся протокол Hiroaki[68] приготовления компетентных клеток: Буферные растворы: TB (10мМ Pepes/Hepes, 55мМ MnCl2, 15мМ CaCl2, 250мМ KCl, pH=6.7) – pH бы доведен до 6.7 перед добавлением MnCl2, после чего раствор стерилизовался фильтрованием через 0,45мкм фильтр, хранился при 4°С. 1. Клетки со стока (-80°С) рассеяли на чашку Петри, содержащую штамм-специфичные антибиотики, подращивали в течение ночи при 37°С. 2. С ночной чашки культуру (несколько колоний) переносили в жидкую среду 50мл SOC (так же содержащей необходимые антибиотики), подращивали до OD600=0,6 при непрерывном перемешивании на 150-180 об/мин в бактериальном шейкере, 18°С. 3. Переносили культуру в 50мл пробирку и охлаждали на льду 10 мин. 4. Осаждение культуры центрифугированием: 10 мин, 3000 об/мин в предварительно охлажденной центрифуге. После тщательно отбирался надосадок. 5. Осажденную культуру ресуспендировали в 20мл охлажденного буфера TB, давали отстояться в о льду 10 мин., после чего повторно осаждали клетки 10 мин при 3000 об/мин в охлажденной центрифуге с повторным отбором надосадка. 6. Клетки повторно ресуспендировали в 5мл TB с добавлением DMSO до конечной концентрации 7% и давали настояться во льду. После чего раскапывали в охлажденные 1,5мл пробирки и замораживали в жидком азоте. 4.2.8. Трансформация плазмиды в компетентные клетки Трансформация в компетентные клетки, приготовленных по протоколу, указанному выше, проходила следующим образом: 1. Клетки со стока (-80°С) размораживались 30 мин во льду 2. К аликвоте компетентных клеток добавлялась охлажденная во льду ДНК (не более 5мкл), после чего клетки еще охлаждались на протяжении 30 мин. 3. Термошок – клетки на 1 мин ставили в термостат 42°С, после чего сразу же возвращали в лед на 5-15 мин. 41 4. К клеткам добавляли 900мкл LB и инкубировали при 37°С и интенсивном помешивании на протяжении 40-60 мин с последующим растиранием на чашку с LB агаром и соответствующими антибиотиками. В случае трансформации штамма SE1 вместо LB добавляли 900 мкл специальной среды, идущей в комплекте и инкубировали при той же температуре в течение 50 минут (критично). 4.2.9. Культивирование клеток и экспрессия белка Культивирование E. coli производилось по стандартному протоколу. Необходимые клетки пересаживались с чашки в жидкую среду (LB, SOB) с добавлением соответствующих антибиотиков (стандартные концентрации антибиотиков: Amp 100мкг/мл, Kan 50мкг/мл) и инкубировались в течение ночи при интенсивном перемешивании (150-180 об/мин, 37°C). Стандартная экспрессия ставилась в 3-6 л питательной среды (LB, ZYP-5052). Ночная культура по достижении необходимой плотности (OD600 ~ 0,6-0,8), пересеивалась (без осаждения) в двухлитровые колбы Эрленмейера (LB, ZYP-5052, по 0,4 л среды в колбе, 6-12 колб) и инкубировалась при 37°C, 150об./мин. в течение 8-10 часов. Выход клеточной массы составлял около 7г клеток на литр культуры. При автоиндуцируемой экспрессии после пересева в свежую ZYP5052 среду каждый час производились измерения концентрации глюкозы одноразовыми тестерами. Когда концентрация глюкозы в среде опускалась до 0% (через 3-5 часов после пересаживания), температуру инкубации снижали до 20°C, после чего инкубировали в течение ночи. Состав автоиндуцируемой среды (на 1л): 930 мл ZY среды (1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта), 1мл 1M MgSO4, 20мл 50×5052 (25% глицерина, 2.5% глюкозы, 10% -лактозы), 50мл 20×NPS (0,5M (NH4)2SO4, 1M KH2PO4, 1M Na2HPO4). ZY среда и NPS стерилизовались автоклавированием; растворы MgSO4 и 5052 стерилизовались фильтрованием через 0,45мкм стерилизационный фильтр. 4.2.10. Химический лизис Для выделения плазмидной ДНК отдельную колонию клеток с чашки пересаживали в жидкую селективную питательную среду 42 (10-25 мл LB с добавлением необходимых антибиотиков) и инкубировали при 37°C, 180об./мин. в течение ночи. Ночную культуру перемещали в 50мл пробирку и осаждали центрифугированием при 4°C, 5000 об/мин, 10 мин. После тщательного отбора надосадка, осажденные клетки ресуспендировали в 0,5мл буфера А1 (входящего в состав коммерческого набора NucleoSpin® Plasmid purification kit, Macherey-Nagel, Dueren, Germany). Далее проходил SDS/щелочной лизис клеток (добавление 0,5мл буфера А2). Реакция лизиса прекращалась посредством добавления нейтрализующего высокосолевого буфера А3. Так же, буфер А3 создает необходимые для связывания ДНК силиконовым фильтром условия (pH раствора). После центрифугирования (10000 об/мин, 4°C, 10 мин) надосадок переносили на специальную силиконовую колонку (NucleoSpin® Plasmid spin column из набора для выделения ДНК) с последующим пропусканием надосадка для связывания с колонкой. Различные примеси были смыты с колонки 0,6 мл высокосолевого буфера AW с последующей промывкой 0,6 мл этанолсодержащего буфера A4. Плазмидная ДНК с колонки элюировалась 50мкл буферного раствора AE (5 mM Tris-HCl, pH 8.5) и замораживалась (-20°C). 4.2.11. Механическое разрушение клеток и осаждение мембран Клетки ресуспендировали в предварительно охлажденном буферном растворе (150мМ NaCl, 25 мМ NaPi pH 8.0) в соотношении 1:5 (5мл раствора на 1г клеток). Для разрушения ДНК в раствор добавляли ДНКазу I в (Sigma-Aldrich, Germany) в расчете 5мг на 30г клеток. Разрыв мембраны клеток происходил при достижении высоких скоростей движения по микроканальцам с покрытием алмазной крошкой и при резком изменении давления с 2000 атм. до 1 атм., создаваемого с помощью установки высокого давления Microfluidics M-110P (с внутернней камерой на 2069 атм.). Дальнейшее разделение клеточного лизата на водорастворимую и мембранную фракции происходило посредством центрифугирования в ультрацентрифуге Beckman-Coulter Optima L-100 XP с использованием роторов SW40-Ti и SW70-Ti (Beckman-Coulter) при rcf=220000g, 1час, 4°C в вакууме. 43 4.2.12. Солюбилизация Осажденную мембранную фракцию ресуспендировали в буферном растворе 300мМ NaCl, 20 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 2%DDM. Раствор гомогенизировался и инкубировался в течение ночи при постоянном помешивании при 4ºC. Солюбилизат откручивали в ультрацентрифуге в течение 1 часа при 220000g, 4ºC. Надосадок тщательно собирали для дальнейшей очистки. 4.2.13. Афинная хроматография Ni2+-NTA смола (Qiagen, Германия) была вначале помыта водой (mQ H2O) в размере 3-5 объемов колонки (CV), после чего уравновешена буфером (300мМ NaCl, 20мМ Tris-HCl pH 8.0, 30мМ Имидазола для водорастворимых белков и 300мМ NaCl, 20мМ Tris-HCl pH 8.0, 30мМ Имидазола + 2%DDM для солюбилизированных мембранных белков). Далее к смоле добавляли раствор белка и инкубировали в течение ночи при 4ºC с постоянным перемешиванием. Смолу с нанесенным образцом переносили обратно в колонку. Смолу промывали 3CV буфера для промывки (300мМ NaCl, 20мМ Tris-HCl pH 8.0, 30мМ Имидазола ± 2%DDM), после чего элюировали белок со смолы 1CV буфера для элюирования (300мМ NaCl, 20мМ Tris-HCl pH 8.0, 200мМ Имидазола ± 2%DDM). 4.2.14. PAGE гель-электрофорез и Western Blotting Разделение денатурированных посредством SDS белков производилось при помощи градиентного PAGE-электрофореза. Такие гели, в отличие от гелей с постоянной концентрацией акриламида, позволяют разделить белки в большем отрезке весов, а также существенно сжимают фронт движения белков одинакового молекулярного веса в электрическом поле [69]. Состав растворов для приготовления градиентных гелей (градиент концентрации акриламида в разделяющем геле от 7.8% до 16,2%) указан в таблице 11. Разделяющий гель заливался с помощью перистальтического насоса, соединенного с одной стороны к камере для заливки гелей (Hoefer 44 Германия), с другой стороны к U-образной камере с выходом из одной из трубок (Bio-Rad, Германия). Раствор с меньшей концентрацией акриламида постоянно перемешивался. Насос был подсоединен непосредственно к трубке с раствором 7,8%АА. После начала заливки клапан между трубками открывался, позволяя растворам постепенно перемешиваться в трубке с раствором меньшей концентрации АА (поскольку поток раствора между трубками был направлен от 16,2%АА). После, поверх каждого геля добавляли 100мкл этанола для удаления контакта раствора геля с воздухом. Гель застывал в течение ночи, после чего этанол с камеры геля смывали водой. Далее заливали концентрирующий гель, который застывал в течение 3 часов при комнатной температуре. 16.2% “heavy” гель, мл Сахароза 6g AA/BAA 30%/0,8%, мл 16 H2O, мл 4 3M Tris pH 8.8, мл 3,125 1M Tris pH 6.8, мл SDS 10%, мл 0,250 Σ, мл 26 TEMED 100% 4 мкл APS 20% 8 мкл Компонент 7.8% “light” гель, мл 6.5 15 3,125 0,250 25 8 мкл 16 мкл 4% “concentr.” 3 14.5 2.5 0,200 20 20 мкл 40 мкл Табл. 11. Состав растворов для заливки 11 градиентных АА гелей Разделение производилось в электрофоретической камере производства Hoefer (Германия). Состав катодного и анодного буферов (одинаковые): 25 мM Tris-base, 200 мM Глицина, 0.1% SDS. Для анализа белковых образцов методом western blot (иммуноблот) белки, разделенные на акриламидном геле, переносились на нитроцеллюлозную мембрану. Для этих целей использовался буфер для переноса (на 1л: 200мл MetOH, 5,8г Tris-base, 2,9г Глицина, 3,85мл 10%SDS, H2O (mQ) до 1л). Мембрана и гель смачивались в буфере для переноса и плотно прижимались (без пузырей воздуха). Затем так же плотно они обжимались смоченными в буфере бумажными прокладками. Такой “сэндвич” помещался в камеру для переноса Bio-Rad, заполненную буфером для переноса, где создавалось напряжение на обкладках “сэндвича”. Параметры тока пропорционально зависели от площади геля. 45 Так, для стандартного геля процесс переноса проходил при 25В, 50мА, в течение 45 мин. После переноса белков на мембрану, она помещалась в раствор 3% молока и TBST (TBST: 20мМ Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl, 0,1% Tween20) и инкубировалась в течение ночи при температуре 4ºC для полного заполнения молоком. После этого, мембрана в молоке и TBST инкубировалась с первичными антителами (penta-His mouse IgG1, monoclonal, 500x, Life technologies) в течение 2 часов. Затем следовала промывка 2 раза по 15 мин молоком и TBST. Следом мембрана инкубировалась со вторичными антителами (Goat anti-Mouse IgG (gamma), Alkaline phosphatase conjugate, 1000x, Invitrogen) в течение часа. Затем следовала промывка 2 раза по 15 мин в молоке и TBST и 2 раза по 15 мин в TBST без молока. После этого мембрана проявлялась с помощью ~1мл субстрата. В качестве субстрата для окрашивания блота использовалась щелочная фосфатаза. 4.2.15. Гель-фильтрация (Size-exclusion chromatography) Для очистки белкового образца от примесей, полученных, вероятно, в процессе неизбежного протеолиза, применялась гельфильтрация. Объединенные и сконцентрированные до необходимого объема (половина объема петли) фракции белка после аффинной хроматографии разделялись на колонке, содержащей 24мл смолы Superdex® 200 HR (GE Healthcare) и предварительно уравновешенной 30мл буфера для гель-фильтрации (300мМ NaCl, 20мМ Tris-HCl pH 8.0). Скорость потока буфера через колонку составляла обычно 1 мл/мин. Эффективность колонки проверялась прохождением ацетона 10мг/мг. Калибровка колонки проводилась при помощи стандартов компании Bio-Rad (Германия) по протоколам [70]. 4.2.16. Концентрирование белка Белки концентрировались в центриконах компании Millipore (США). Центриконы подбирались в зависимости от молекулярного веса белка. Вначале мембрана центрикона промывалась водой, чтобы смыть остатки глицерина, в настольной центрифуге Eppendorf 5810R при условиях rcf=2000g, 10 мин, 4ºC. Затем следовала еще одна промывка 46 буфером (300мМ NaCl, 20мМ Tris-HCl pH 8.0), rcf=2000g, 10 мин, 4ºC. После этого в резервуар центрикона заливался образец с белком и откручивался в той же центрифуге при rcf=2000g, 4ºC пока не будет достигнута определенная концентрация (определялась по объему образца). Концентрация белка определялась спектрофотометрически по коэффициенту поглощения (триптофана) на длине волны 280нм. Использовались спектрофотометр SHIMADZU-UV2450 и нанофотометр IMPLEN P-330. 4.2.17. Кристаллизация водорастворимых белков При кристаллизации белка вручную были использованы плашки Corning® Costar® 24-well plates и микромостики компании Hampton Research. Раствор белка смешивался с раствором преципитанта в количествах 1мкл:1мкл в мостике, в основной резервуар было помещено 100 мкл раствора преципитанта. Затем резервуары закрывались круглыми стеклянными пластинками и герметизировались полимерной смазкой. Все процедуры проходили при поддержании высокой влажности. Заполненные плашки помещались в термошкаф на 22ºC и наблюдались спустя определенное время. В основном же для кристаллизации белка использовался робот Formulatrix NT8. В кристаллизациях на роботе использовалось 3 вида плашек: CrystalQuick 96 Well Sitting Drop Plate (Greiner) Greiner CrystalQuick™ Standard Profile Flat Bottom Nanovolume vapour diffusion plates В экспериментах с первым типом плашек первоначально робот разливал по 50мкл раствора преципитанта в 96 основных резервуаров. Затем по 200нл растворов белка и преципитанта смешивались в малом резервуаре. Плашки запечатывались герметичной пленкой и помещались в Rock Imager 1000 (Formulatrix), где автоматически инспектировались по расписанию. Второй тип плашек был таким же, как первый, за исключением того, что на один основной резервуар приходилось три малых, в отличие от плашек первого типа (где на один основной резервуар был один малый резервуар). Протокол кристаллизации был таким же, как для плашек первого типа, в основной резервуар разливалось по 100мкл раствора 47 преципитанта, а в трех малых резервуарах были реализованы три различных соотношения белок:преципитант (1:2, 1:1, 2:1 по объему). Плашки третьего типа широко использовались в данной работе. Достоинствами этих плашек являются высокая скорость диффузии паров за счет малого доступного объема, а также хорошие возможности для наблюдения кристаллизации. Для кристаллизации в таких плашках робот раскапывал в одну половину резервуара 800нл раствора преципитанта, а в другую – по 50-100нл раствора белка из LCP-шприца и раствора преципитанта (обычно в соотношении 1:1). Далее плашка быстро запечатывалась специальной пленкой COC или покрывным стеклом и отправлялась в Rock Imager 1000 для инспектирования по расписанию. Недостатком этих плашек оказалось пропускание водяных паров, как PMMA-пластинкой, так и пленкой. Впоследствии, пленки стали покрываться слоем лака для того, чтобы предотвратить испарение. Покрывные стекла, не пропускавшие водяные пары, в силу своей дороговизны, использовались лишь в отдельных экспериментах. В работе были использованы следующие киты для скриннинга Crystal Screen I&II (Hamton research) JBScreen JCSG ++ HTS L (Jena Bioscience) JBScreen PACT ++ HTS L (Jena Bioscience) Emerald Wizard Classic I&II (Rigaku Reagents) После выявления различных кристаллизационных условий были приготовлены киты для оптимизации, содержащие PEG400 с добавками различных концентраций и уровней pH. 4.2.18. Thermal Shift Assay Для определения термостабильности белков использовался метод TSA, реализованный на приборе Rotor-Gene Q (Qiagen). Образцы для TSA готовились в 200-микролитровых ПЦР-пробирках, раствор для TSA был приготовлен из буфера (SEC, либо 300мМ NaCl, 20мМ Tris-HCl pH 8.0) и флюоресцентного красителя 5-15мМ CPM (7-diethylamino-3-(4'maleimidylphenyl)-4-methylcoumarin, Sigma), активирующегося при взаимодействии с тиолами в составе цистеинов в процессе денатурации. Буфер с красителем разливался по 50мкл в ПЦР-пробирки, в первую пробирку наливалось 100мкл. Затем в первую пробирку добавлялось от 2 до 4 мкг белка, и производилась серия разбавлений (перенос лишних 50мкл из первой пробирки по остальным, разбавляя в 2 раза содержание 48 белка при каждом следующем шаге) от пробирки к пробирке. В последней пробирке просто оставляли 100мкл. Также была одна пробирка с раствором без белка для контроля (референс). После загрузки образцов составлялась программа нагревания от 28 до 98ºC, с шагом в 1ºC в течение 30 секунд. Детектор работал в режиме Blue Gain 1 (460нм). 4.2.19. Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей 4.2.19.1. Малоугловой рентгеновский спектрометр Rigaku SMAX-3000 Полное подробное описание спектрометра можно найти на сайте производителя (http://www.rigaku.com/products/saxs/smax3000). Во время накопления спектров пробы, прикрепленные к штативу, автоматически перемещаемом электроникой, находились в боксе в высоком вакууме. Источник с коллимационной системой создает узкоколлимированный пучок рентгеновского излучения (длина волны 1,54Å) размером порядка 1мм. Измерения проводились в двух камерах (SC1 – дальняя и SC2 – ближняя к детектору) в интервале векторов рассеяния (Q-диапазон) 0,008–0,24Å-1. Время накопления рассеяния от одного образца было равно 300с. В качестве калибровки использовался спектр порошка AgBh. 4.2.19.2. Обработка спектров малоуглового рассеяния Первичная обработка картины рассеяния с получением спектра рассеяния проводилась программой Saxsgui v2.08.03 при использовании спектра AgBh для калибровки. Затем дальнейшая обработка осуществлялась при помощи программного пакета ATSAS[72, 73]: программа PRIMUS для первичной обработки спектра и DAMMIN для последующего ab initio моделирования формы (метод заполнения шариками). 4.2.20. Моделирование структуры белка с помощью ПО RaptorX RaptorX[71] – это сервер, разрабатывающий предсказание молекулярной структуры белка. Получив входные данные в качестве 49 аминокислотной последовательности белка, RaptorX производит предсказание вторичной и третичной структур белка, а также контакты с растворителем, неупорядоченные регионы, сайты связывания лигандов. Принцип работы RaptorX состоит в сравнении аминокислотной последовательности белка с последовательностями белков известной структуры, последующим делении белка на известные домены и дальнейшем более точном анализе последовательности этих доменов. После процедуры предсказания структуры сервер выдает ряд чисел, по которым так или иначе можно судить о качестве предоставленной модели. Среди таких параметров: P-value для общей относительной оценки модели, GDT (global distance test) и uGDT (un-normalized GDT) для общей абсолютной оценки качества. P-value – это вероятность данной модели быть хуже самой лучшей из набора случайно сгенерированных моделей данного белка (или домена). Таким образом, P-value показывает относительное качество данной модели: чем меньше P-value, тем качественнее модель. Для αспиральных белков значение P-value меньше 10-3 – это хороший показатель, в то время как для β-листовых белков удовлетворительное значение – 10-4. uGDT – это ненормированный GDT (Global Distance Test), определенный, как 1 ∙ 𝑁 1 + 0,75 ∙ 𝑁 2 + 0,5 ∙ 𝑁 4 + 0,25 ∙ 𝑁(8), где N(x) – это число аминокислотных остатков с оценкой ошибки моделирования (в Å) меньше x. GDT рассчитывается, как uGDT, деленный на длину аминокислотной последовательности белка (либо домена) и умноженный на 100. uGDT, GDT определяют общее абсолютное качество модели. Для белка с длиной последовательности меньше 100 а.о. значение uGDT>50 – хороший показатель. Для белка с длиной последовательности больше 100 а.о. значение GDT>50 – хороший показатель. Если у модели хороший uGDT (>50), но плохой GDT (<50), то это указывает на то, что модель может быть достаточно качественной лишь местами. 50 5. Результаты и обсуждения 5.1. Создание генетических конструкций Первоначально были получены гены белков NarX и NarQ при помощи ПЦР на матрице-геноме E.coli с использованием праймеров NarX_Fwd1, NarX_Fwd2, NarX_Rev1, NarX_Rev2, NarQ_Fwd1, NarQ_Fwd2, NarQ_Rev1, NarQ_Rev2 (см. рис. 16). Рис. 16. Агарозные гели-электрофорезы продуктов ПЦР на матрице-геноме E.coli. Слева – ПЦР для получения гена NarX (праймеры NarX_Fwd1 и NarX_Rev1), справа – ПЦР для получения гена NarQ (праймеры NarQ_Fwd2 и NarQ_Rev2). Обозначения дорожек: 1 – продукт реакции, 2 – контроль без прямого праймера, 3 – контроль без обратного праймера, 4 – контроль без матрицы, lad – маркер веса ДНК (расшифрован рядом (в единицах bp)). Красным кружком выделен полученный продукт реакции. Полученные фрагменты ДНК (narX и narQ) были выделены из агарозного геля и в дальнейшем использовались в качестве матрицы для дальнейших ПЦР. Подтверждение в правильности генов narX и narQ было получено рестрикционным анализом (см. рис. 18). Ген narX был порезан эндонуклеазами рестрикции (рестриктазами) EcoRV и NsiI, ожидаемые продукты реакции имели размеры 196, 566, 467 и 1192bp, что и было обнаружено на геле (рис. 18, слева). Ген narQ был порезан рестриктазой AgeI, предполагаемые продукты имели размеры 335, 681 и 819bp, что подтвердилось на геле (рис. 18, справа). Как упоминалось ранее, предложением для данной работы послужила идея создания конструкций мембранной и цитоплазматической частей данных белков (NarX и NarQ), 51 перекрывающиеся в области HAMP. Эти конструкции были названы NarXm, NarQm для мембранных частей и NarXs, NarQs для цитоплазматических (см. рис. 17). Таким образом, на начальном этапе в работе требовалось собрать генетические векторные конструкции рекомбинантных белков NarXm, NarXs, NarQs, белком же NarQm уже занимался Андрей Ищенко в Исследовательском центре г. Юлих. Рис. 17. Главная идея эксперимента, состоявшая в разделении крупных амфифильных белков на мембранную и цитоплазматическую (растворимую) части. Рис. 18. Агарозные гели-электрофорезы продуктов рестрикционного анализа. Слева – рестрикция гена narX ферментами EcoRV и NsiI (первые две дорожки). Справа – рестрикция гена narQ ферментом AgeI (последние две дорожки). Используя в качестве матрицы гены narX и narQ, методом ПЦР были получены отрезки ДНК narXm, narXs и narQs (с сайтами рестрикции 52 NdeI и XhoI на разных концах), соответствующие необходимым рекомбинантным белкам (рис. 19). Эти отрезки были выделены из агарозных гелей и впоследствии проверялись рестрикционным анализом. Рис. 19. Агарозные гели-электрофорезы продуктов ПЦР на матрицах narX, narQ. Слева – ПЦР для получения narXm (праймеры NarXm_insFwd и NarXm_insRev), по центру – ПЦР для получения narQs (праймеры NarQs_insFwd и NarQs_insRev), справа – ПЦР для получения narXs (праймеры NarXs_insFwd и NarXs_insRev). Обозначения дорожек: 1 – продукт реакции, 2 – контроль без прямого праймера, 3 – контроль без обратного праймера, 4 – контроль без матрицы, lad – маркер веса ДНК (расшифрован рядом (в единицах bp)). Красным кружком выделен полученный продукт реакции. Рис. 20. Карта собранных генетических конструкций. Нуклеотидная последовательность гена белка встраивалась в плазмиду по сайтам рестрикции NdeI и XhoI. В качестве вектора была выбрана плазмида pStaby1.2 с геном устойчивости к ампициллину, геном антидота ccdA и lacI репрессором. Гены мембранных и цитоплазматических частей белков NarX и NarQ лигировались в плазмиду по липким концам, полученным после рестрикции ферментами NdeI и XhoI (см. рис. 20). Рестрикции подвергались как отрезки ДНК narXs, narQs, narXm, так и плазмида pStaby1.2. Как отмечено выше, для встраивания полученных отрезков (narXm, narXs и narQs) в векторную конструкцию было необходимо провести их рестрикцию на концах. При рестрикции на концах отрезков narXs и narQs не возникло проблем (см. рис. 21, слева) – полученные рестрикты были выделены из геля. В середине же отрезка narXm был сайт рестрикции XhoI (как и на конце), потому сначала два продукта рестрикции narXm (см. рис. 21, по центру) (ферментами NdeI и XhoI) 53 были выделены из геля, а затем сшиты вместе лигированием. При таком лигировании образовывалось множество сшитых друг с другом цепочкой по сайту XhoI отрезков (ведь у одного из рестриктов narXm был сайт XhoI на обоих концах), что видно при анализе лигирования на агарозном геле (см. рис. 21, справа). Из всех полосок на геле после лигирования была выбрана полоска с молекулярным весом narXm, примерно равным 680bp, (рис. 21, справа, красный кружок) и выделена из этого геля. Таким образом, все три отрезка ДНК были готовы для встраивания в плазмиду. Рис. 21. Агарозные гели-электрофорезы. Слева – продукты рестрикции (по две одинаковых дорожки) генов narXs, narQs и плазмиды pStaby1.2 ферментами NdeI и XhoI. По центру – продукты рестрикции (три одинаковых дорожки) гена narXm ферментами NdeI и XhoI. Справа – лигирование двух порезанных (выделенных из геля по центру) фрагментов narXm (две одинаковых дорожки), красным кружком обведены сшитые фрагменты правильного веса, остальные полоски указывают на многократно сшитые отрезки с сайтом XhoI на обоих концах. Порезанные на концах отрезки narXm, narXs и narQs были залигированы с плазмидой pStaby1.2, также заранее порезанной рестриктазами NdeI и XhoI. Лигазная смесь сразу же использовалась для трансформации компетентных клеток E.coli штамма TOP10, которые затем высевались на селективную чашку с LB-агаром и ампициллином (200мг/л). После первичной селекции на чашке с антибиотиком (ампициллин) отбирались 4 клона для дальнейшего анализа. Клоны подращивались в течение ночи в селективной среде LB с ампициллином (100мг/л) а затем производилось выделение из них плазмидной ДНК. 4 клона плазмидной ДНК подвергались рестрикционной селекции (см. рис. 22). При выявлении правильных клонов на агарозном геле после рестрикции, образцы плазмидной ДНК отправлялись на секвенирование с помощью праймеров T7 promotor и T7 terminator в компанию Синтол. 54 Рис. 22. Агарозные гели-электрофорезы. Рестрикционная селекция. Дорожки клонов 1-4 обозначены цифрами 1-4. Слева – рестрикционная селекция 4 клонов narXm сначала ферментами NdeI и PvuII (левая часть геля), затем NdeI и XhoI (правая часть геля); клоны 1 и 2 удовлетворительны. По центру – рестрикционная селекция 4 клонов narQs ферментами NdeI и XhoI; клоны 2 и 4 удовлетворительны. Справа – рестрикционная селекция 4 клонов narXs ферментами NdeI и XhoI; все 4 клона удовлетворительны. После подтверждения последовательности клона секвенированием плазмида трансформировалась в экспрессионные штаммы E.coli: плазмида, содержащая ген narXm – в штамм SE1, а содержащие narXs и NarQs плазмиды – в штамм BL21(DE3). Культура экспрессионных штаммов с соответствующим вектором подращивалась в течение ночи, а наутро была помещена в музей на -80ºC для сохранения. В течение работы в гене narQs (вероятно при разморозке холодильника) были получены мутации, и стало необходимо создавать эту генетическую конструкцию заново. Этапы повторной работы можно видеть на рис. 23. Рис. 23. Агарозные гели-электрофорезы. Слева – продукты ПЦР, 1 – продукт, 2 – контроль без прямого праймера, 3 – контроль без обратного праймера, 4 – контроль без матрицы. Красными кружками обведены полученные продукты реакций (слева на геле – narQs на матрице narQ, праймеры NarQs_insFwd и NarQs_insRev; справа на геле – narQ на матрице-геноме E.coli, праймеры NarQ_Fwd2 и NarQ_Rev2). Справа – рестрикционная селекция 4 клонов narQs ферментами NdeI и XhoI, клоны 1-3 удовлетворительны. 55 5.2. Экспрессия и очистка белка Белки экспрессировались в среде ZYP-5052 для автоиндукции в шейкере в два этапа – около 4 часа на 37ºC, затем по истощению глюкозы температуру понижали до 20ºC. Подготовка к экспрессии (выращивание предкультуры) происходило путем посева одной колонии с селективной чашки с необходимым штаммом в 20-30мл среды LB в присутствии ампициллина 100мг/мл. Предкультура подращивалась в течение ночи, затем была инокулирована в основную среду. Клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в буфере для последующего разрушения. К ресуспендированным в буфере клеткам добавлялись ДНКаза, PMSF до 1мМ, коктейль ингибиторов протеаз Complete®. Клетки разрушались при давлениях 18000psi-25000psi. Затем мембраны осаждались на центрифуге. В случае NarXm осадок солюбилизировался в буфере с 2% DDM и наносился на Ni2+-NTA смолу. После элюирования белковых фракций все элементы процесса первичной очистки анализировались на акриламидном геле и блоте. Первоначальная экспрессия дала чрезвычайно мало белка из-за того, что по ошибке вместо экспрессионного штамма SE1 был использован штамм TOP10 (см. рис. 24). Рис. 24. Акриламидный гель и соответствующий блот для анализа фракций первичной очистки NarXm, экспрессированного в E.coli TOP10. 1 – лизат/100, 2 – супернатант лизата/20, 3 – солюбилизированный осадок лизата/20, 4 – супернатант после осаждения солюбилизата/20, 5 – маркер молекулярного веса, 6-10 – пять фракций элюции Ni-NTA, 11 – проскок Ni-NTA колонки, 12 – промывка Ni-NTA колонки, 13 – образец Ni-NTA смолы после элюции. После трансформации в штамм SE1, наконец, был получен и очищен солюбилизированный белок NarXm (молекулярный вес 26,2кДа) (рис. 25). На полученном акриламидном геле четко видны две основные полосы белка, отвечающие за мономер и димер (вероятно, димеризационный контакт настолько силен, что не разрушается в присутствии SDS, также возможен дисульфидный мостик между 56 цистеинами мономеров). Также, на геле и блоте видны посторонние полосы, образованные протеолитическими фрагментами белка (очистка производилась без ингибиторов протеаз). Выход белка составил ~3мг с литра экспрессионной культуры. Рис. 25. Акриламидный гель и соответствующий блот для анализа фракций первичной очистки NarXm, экспрессированного в E.coli SE1. 1 – супернатант лизата, 2 – солюбилизированный осадок лизата, 3 – осадок после осаждения солюбилизата, 4 – супернатант после осаждения солюбилизата, 5 – проскок Ni-NTA колонки, 6 – маркер молекулярного веса, 7-12 – шесть фракций элюции с Ni-NTA. Дальнейшая экспрессия и очистка NarXm производилась вместе с экспрессией и очисткой NarXs (молекулярный вес 49,0кДа) с использованием ингибиторов протеаз (см. рис. 26). Рис. 26. Слева – анализ на геле фракций первичной очистки NarXm (мономер и димер белка в составе фракций выделены красным). 1 – супернатант лизата/20, 2 – солюбилизированный осадок лизата, 3 – промывка Ni-NTA колонки, 4 – проскок Ni-NTA колонки, 5 – образец смолы Ni-NTA после элюции, 6 – маркер молекулярного веса, 7-12 – шесть фракций элюции с Ni-NTA. Справа – анализ на геле фракций очистки NarXs. Белок NarXs оказался нерастворимым в воде (при первичной очистке он выпал в мембранный осадок и указан в красной рамке на геле в мембранной фракции). 1 – супернатант лизата/20, 2 – солюбилизированный осадок лизата, 3 – промывка Ni-NTA колонки, 4 – проскок NiNTA колонки, 5 – образец смолы Ni-NTA после элюции, 6 – маркер молекулярного веса, 7-12 – шесть фракций элюции (белка в них не обнаружено). Как видно из рис. 26, был получен достаточно чистый образец NarXm. В то же время, возникли проблемы с NarXs – белок оказался нерастворимым в воде, вероятно в силу нестабильного HAMP-домена. Была произведена попытка солюбилизировать осадок после экспрессии NarXs, чтобы подтвердить именно это. На рис. 27 можно увидеть экспрессионные полосы NarXs (49кДа) в мембранной фракции лизата и 57 отсутствие белка во фракциях очистки. Таким образом, NarXs был, действительно, плохо растворим в воде. Рис. 27. Акриламидный гель (плохо отмытый). Подтверждение наличия NarXs в мембранной фракции и анализ чистых образцов NarXm и NarQs. 1 – осадок после центрифугирования солюбилизированной мембранной фракции после экспрессии NarXs, 2 – супернатант после центрифугирования солюбилизированной мембранной фракции после экспрессии NarXs, 3 – концентрированная фракция элюции NarXs, 4 – маркер молекулярного веса, 5 – чистый образец NarXm, 6 – чистый образец NarQs. После этого было решено отказаться от работы с NarX и сконцентрироваться на NarQ, а точнее, на его растворимой части NarQs, тем более что Андреем Ищенко и Иваном Гущиным были получены кристаллы мембранной части NarQm. Для получения растворимого белка NarQs (молекулярный вес 45,4кДа), также проводилась автоиндукционная экспрессия в среде ZYP5052 штамма BL21(DE3). Клетки осаждались, ресуспендировались в буфере с ДНКазой, PMSF и Complete® и разрушались при давлениях 18000psi-25000psi. Клеточный лизат центрифугировался, и супернатант наносился на Ni2+-NTA смолу. Фракции очистки, включая элюированные фракции, анализировались на акриламидном геле (рис. 28, слева). Выход белка составлял 5-6мг с литра культуры. Рис. 28. Анализ первичной очистки NarQs. Слева – анализ очистки NarQs после свежей трансформации после секвенирования. 1 – супернатант лизата/20, 2 – солюбилизированный осадок лизата, 3 – промывка Ni-NTA колонки, 4 – проскок Ni-NTA колонки, 5 – образец смолы NiNTA после элюции, 6 – маркер молекулярного веса, 7-12 – шесть фракций элюции с Ni-NTA. Справа – анализ очистки NarQs спустя 5 месяцев. 1 – супернатант лизата/20, 2 – проскок Ni-NTA колонки/20, 3 – промывка Ni-NTA колонки, 4 – маркер молекулярного веса, 5-10 – шесть фракций элюции с Ni-NTA, 11 – маркер молекулярного веса. 58 Спустя полгода после первой очистки NarQs белок перестал экспрессироваться совсем. По всей видимости, во время хранения музея холодильник был разморожен. Вследствие этого было проведено секвенирование используемых клонов, которое выявило многочисленные мутации в плазмидной ДНК. Генетические конструкции NarQs были созданы заново и секвенированы. После проверки подлинности нуклеотидной последовательности, обновленные векторы были вновь трансформированы в экспрессионный штамм BL21. Резервная копия правильного клона плазмиды хранилась в надежном месте (-20°C). Рис. 28. Акриламидный гель и блот для анализа фракций первичной очистки NarQs, экспрессированного в E.coli BL21(DE3). Красным выделен белок NarQs. Для геля: 1 – проскок Ni-NTA колонки/10, 2 – промывка Ni-NTA колонки, 3 – образец колонки после элюции, 4,5 – маркер молекулярного веса, 6-11 – шесть фракций элюции с Ni-NTA. Для блота: 1 – проскок Ni-NTA колонки/10, 2 – промывка Ni-NTA колонки, 3 – образец колонки после элюции, 4 – маркер молекулярного веса, 5-10 – шесть фракций элюции с Ni-NTA. NarQs был вновь экспрессирован и прошел первичную очистку (рис. 28). Анализ фракций на геле выявил большое количество примесей, и образцы фракций Ni-NTA элюции разделялись с помощью гельфильтрации. В частности, выше молекулярного веса NarQs располагался димер (при высоких концентрациях – видно, что полосы NarQs перегружены). Для гель-фильтрации образцов NarQs была использована колонка GE HR 10/30 со средой Superdex 200 (General Electric). Для калибровки колонки, на нее был нанесен раствор для калибровки компании Bio-Rad (см. рис. 29). Образец после элюции с Ni-NTA прогонялся через колонку для гель-фильтрации и собирался в различные фракции (рис. 30). Белок сходил двумя пиками – димером и мономером (как подтвердил дальнейший PAGE анализ). На малых молекулярных весах (около 59 1000Да) двумя неразличимыми пиками сходили имидазол (оставшийся после Ni-NTA элюции) и, как выяснилось позднее добавлением нитрата серебра, АДФ. Необходимые (достаточно чистые от примесей) после гель-фильтрации фракции сливались вместе и концентрировались. Рис. 29. Калибровка колонки для гель-фильтрации. Рис. 30. Гель-фильтрация образцов NarQs после Ni-NTA очистки. Рис. 31. Акриламидный гель и соответствующий блот для анализа фракций гель-фильтрации. 1 – денатурированный кипячением образец NarQs, 2 – NarQs после элюции с Ni-NTA, 3 – проскок с центрикона при концентрировании белка NarQs, 4 – образец NarQs после концентрирования перед гель-фильтрацией, 5 – маркер молекулярного веса, 6-11 – фракции 2-7 гель-фильтрации (см. рис. 30), 12 – 12-я фракция гель-фильтрации (см. рис. 30). На рис. 30-31 видно, что 12-я фракция гель-фильтрации не содержит белка, но, в то же время, поглощает ультрафиолет на 280нм. Из всех веществ, это может быть либо имидазол, оставшийся после элюции, либо АТФ, либо АДФ. Сравнение реакций с нитратом серебра указало на 60 наличие именно АДФ. Значит АДФ, связанный с белком, проходит вместе с ним все стадии очистки. Таким образом, был получен чистый образец растворимого белка NarQs, который был сконцентрирован для последующей кристаллизации. 5.3. Кристаллизация NarQs Для кристаллизационного скрининга были использованы киты Hampton Crystal Screen I&II, Emerald Wizard Classic I&II, JBScreen PACT и JBScreen JCSG. Начальная концентрация белка была 10мг/мл. Скрининговые кристаллизации вначале были выполнены в плашках Greiner CrystalQuick™ Standard Profile Flat Bottom с тремя лунками для белка. В трех лунках испытывались различные соотношения белок:преципитант (2:1, 1:1, 1:2). Начальный скрининг не дал результатов, потому было решено увеличить концентрацию белка. Белок был сконцентрирован до 80мг/мл, при этом он оставался растворимым, не выпало агрегатов. Скрининг снова был проведен на этот раз в плашках Nanovolume Vapor Diffusion Plates, где нуклеацию и кристаллизацию можно было наблюдать гораздо четче. Скрининг выявил некоторые условия, при которых появлялись микрокристаллы, похожие на белковые. Все эти условия объединяло наличие PEG400. Для PEG400 были созданы оптимизационные киты, для более тщательного скрининга условий. На основе PEG400 был создан оптимизационный кит, названный PEG400opt (см. рис. 23). Рис. 32. Схема созданного кристаллизационного кита PEG400opt, всего 48 различных условий – по два повторения. Были поставлены кристаллизации при разных концентрациях NarQs с китом PEG400opt. Наилучшие кристаллы (длиной около 60 мкм) были выращены в условиях B5, F5 (30% PEG400, 0,1M Tris-HCl, 0,2M дигидрат цитрата натрия) и A4, E4 (15% PEG400, 0,1М Карбонатный 61 буфер, 0,2М дигидрат цитрата натрия). Рис. 33 подтверждает, что в этих условиях выросли белковые кристаллы: при концентрации белка 80мг/мл кристаллизация идет, хотя при 40мг/мл уже нет. Рис. 33. Сравнение кристаллизаций с различными концентрациями NarQs: левая половина – 80мг/мл, правая половина – 40 мг/мл. Использованные изображения: на белом фоне – изображение в проходящем свете, на синем фоне – кросс-поляризованный свет. Левая половина была получена с помощью кита PEG400opt на 12 день. Правая половина – те же условия (кроме концентрации NarQs), изображения справа получены на 21 день. На рис. 34 можно наблюдать процесс нуклеации и кристаллизации белка NarQs. Кристаллы появляются на 8-й день. 1 2 3 5 6 7 4 Рис.34. Нуклеация и кристаллизация от времени в лунке F5 кита PEG400opt при концентрации NarQs 80мг/мл. 1 – 0 часов, 2 – 12 часов, 3 – 1,5 суток, 4 – 2,5 суток, 5 – 3,5 суток, 6 – 5,5 суток, 7 – 8,5 суток. 62 Также были проведены кристаллизации с AMPPNP в качестве лиганда в плашках CrystalQuick 96 Well Sitting Drop Plate и Nanovolume Vapor Diffusion Plate. AMPPNP использовался в концентрации 4мМ вместе с белком и 4мМ MgCl2. При этом были поставлены контрольные кристаллизации без MgCl2, которые ничем не отличались от кристаллизаций без лиганда вообще. Рис. 35. Верхний ряд – кристаллизации чистого NarQs, без лиганда, 4 одинаковых условия. Нижний ряд – 4 одинаковых условия кристаллизации NarQs в присутствии 4мМ AMPPNP и 4мМ MgCl2. Кристаллизационные условия: NarQs 80мг/мл, 0,1М Tris-HCl pH8.5, 30%PEG400, 0,2М NaCl. Как можно видеть из рис. 35, наличие AMPPNP способствует росту кристаллов (верхний ряд без лиганда и без кристаллов). Вероятно, это происходит вследствие стабилизации CA-домена киназы негидролизуемым нуклеотидом AMPPNP. 5.4. Исследование белка NarQs 5.4.1. Измерение термостабильности NarQs Измерения термостабильности NarQs проводились методом TSA на приборе Rotor Gene Q. NarQs, как известно, связывается с АТФ при автофосфорилировании. В качестве лиганда для NarQs использовался негидролизуемый аналог АТФ – AMPPNP. Для связывания с АТФ белку NarQs необходимы двухвалентные ионы металлов, для этих целей использовалась соль 4мМ MgCl2. На рис. 36 приведен график TSA, измеренного для трех случаев: чистый белок NarQs, белок с 4мМ AMPPNP и 4мМ MgCl2, а также белок с 4мМ AMPPNP без MgCl2. 63 CPM fluorescence 25 20 NarQs 15 10 NarQs+AMPPNP +MgCl2 5 NarQs+AMPPNP 0 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94 97 Temperature, ºC Рис. 36. TSA для белка NarQs. Использованный для измерений буфер – родной для белка (300мМ NaCl, 20мМ Tris-HCl pH8.0) Как видно из графика на рис. 36, белок NarQs обладает достаточно слабой термостабильностью, демонстрируя температуру плавления Tm=48°C. Скорее всего, это связано опять же с нестабильностью HAMPдомена белков E.coli. В то же время, наличие AMPPNP, связанного с белком, никак не меняет его термостабильности, на что указывают все кривые. Также, термостабильность не зависит от концентрации соли в буфере, как показано на рис. 37, где изображен график TSA для NarQs в буфере с разной концентрацией NaCl от 300мМ до 1М. Для всех кривых плавления Tm=48°C. 60 50 40 1M 800mM 30 650mM 20 500mM 300mM 10 0 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94 97 Рис. 37. TSA для белка NarQs в буферах с разной концентрацией соли NaCl от 300мМ до 1М. 64 5.4.2. Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей Спектр малоуглового рассеяния снимался на рентгеновском спектрометре Rigaku S3000 (МФТИ, Долгопрудный). Раствор белка в стандартном буфере (300мМ NaCl, 20мМ Tris-HCl pH8.0) концентрации 10мг/мл помещался в капилляр и запаивался там. Спектр снимался в вакууме в течение 5 мин в каждой из камер (SC1 и SC2). После получения спектра он обрабатывался программой PRIMUS из пакета ATSAS – выбирался отрезок, соответствующий аппроксимации Гинье, затем из кривой вычиталось рассеяние от буфера (рис. 38). Рис. 38. Обработка спектра рассеяния: аппроксимация Гинье. Рис. 39. Обработка спектра рассеяния: построение функции Паттерсона 65 Далее строилась функция Паттерсона распределения расстояний в макромолекуле (Рис. 39). Моделирование формы белка производилось программой DAMMIN из того же пакета ATSAS методом ab initio, предполагающем заполнение объема макромолекулы малыми шариками. Результаты моделирования формы можно увидеть на рис. 40. Рис. 40. Модель белка NarQs, полученная в результате анализа спектра малоуглового рассеяния. 5.4.3. Моделирование структуры NarQs с помощью RaptorX RaptorX – сервер, сравнивающий последовательности неизвестных белков с элементами последовательностей белков известной структуры. На сервер RaptorX была послана задача прогнозировать третичную структуру белка NarQs. В результате белок NarQs был разбит на три домена: первый включал в себя HAMP-домен и S-спираль, второй включал в себя часть центрального домена неизвестной функции и третий представлял собой каталитический домен гистидин киназы. 66 Рис. 41. Модели мономеров каталитического домена (слева) и HAMP-домена вместе с Sспиралью (справа). Для модели каталитического домена было получено более чем приемлемое значение P-value=6,12∙10-5. Значения uGDT(GDT)=162(69) были хорошими. Это позволяет считать модель каталитического домена очень правдоподобной – наличие антипараллельной связки α-спиралей, а также α/β-сэндвича для связывания АТФ действительно отражает реальную ситуацию. Для модели HAMP+S-спираль значение P-value=5,93∙10-3 – удовлетворительно, но не позволяет всерьез рассчитывать на этот прогноз, к тому же uGDT(GDT)=60(51) для этой модели, поэтому более чем схематичной эту модель считать не стоит. Хотя с другой стороны, в ней есть связка двух параллельных α-спиралей HAMP-домена, а также следом идет еще длинная α-спираль. Во всяком случае, с помощью метода моделирования невозможно судить о каких-либо структурных особенностях в модели белка, так как эта модель носит всего лишь предсказательный характер. 67 6. Выводы Задуманные генетические конструкции были созданы и трансформированы в экспрессионные штаммы E.coli. Необходимые белки были экспрессированы в организме E.coli. Рекомбинантный белок NarXs, вопреки ожиданиям, оказался нерастворимым. Было принято решение оставить конструкции, связанные с NarX и сконцентрироваться на NarQ. Рекомбинантный растворимый белок NarQs был экспрессирован, очищен и сконцентрирован до необходимой концентрации. Измерена термостабильность белка NarQs, выявлено, что связывание лиганда (AMPPNP) не влияет на нее. Проведены предварительные структурные эксперименты: компьютерное моделирование структуры и малоугловое рассеивание рентгеновских лучей. Определены кристаллизационные условия и получены микрокристаллы растворимого рекомбинантного белка NarQs. 68 7. Благодарности Я хотел бы поблагодарить Георга Бюлдта и Валентина Ивановича Горделия за создание прекрасных условий для этой научной работы. Хочу выразить благодарность Андрею Ищенко и Ивану Гущину за руководство этим проектом и ценные приобретенные знания. Отдельную благодарность хочу выразить Михаилу Синцову, Валентину Борщевскому и Виталию Половинкину за неоценимую помощь в кристаллизационных экспериментах. Я благодарю Александра Ивановича Куклина, Алексея Мишина, Александру Криволапову, Нелли Хабибуллину, Михаила Николаева, Андрея Богородского и Дмитрия Волкова за ценные советы и полезные навыки. 69 8. Список литературы 1. Parkinson JS, Kofoid EC. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu Rev Genet. 1992;26:71-112 2. Stock AM, Robinson VL, Goudreau PN. Two-component signal transduction. Annu Rev Biochem. 2000;69:183-215 3. Hoch JA. Two-component and phosphorelay signal transduction. Curr Opin Microbiol. 2000 Apr;3(2):165-70 4. Kaneyoshi Yamamoto, Kiyo Hirao, Taku Oshima, Hirofumi Aiba, Ryutaro Utsumi and Akira Ishihama. Functional Characterization in Vitro of All Twocomponent Signal Transduction Systems from Escherichia coli. J Biol Chem. 2005 Jan 14;280(2):1448-56. Epub 2004 Nov 2 5. Laub MT, Goulian M. Specificity in two-component signal transduction pathways. Annu Rev Genet. 2007;41:121-45 6. Kiil K, Ferchaud JB, David C, Binnewies TT, Wu H, Sicheritz-Pontén T, Willenbrock H, Ussery DW. Genome update: distribution of two-component transduction systems in 250 bacterial genomes. Microbiology. 2005 Nov;151(Pt 11):3447-52 7. Jeffrey M Skerker, Melanie S Prasol, Barrett S Perchuk, Emanuele G Biondi and Michael T Laub. Two-Component Signal Transduction Pathways Regulating Growth and Cell Cycle Progression in a Bacterium: A SystemLevel Analysis. PLoS Biol. Oct 2005; 3(10): e334 8. Groban ES, Clarke EJ, Salis HM, Miller SM, Voigt CA. Kinetic buffering of cross talk between bacterial two-component sensors. J Mol Biol. 2009 Jul 17;390(3):380-93. doi: 10.1016/j.jmb.2009.05.007. Epub 2009 May 13 9. Egger LA, Park H, Inouye M. Signal transduction via the histidyl-aspartyl phosphorelay. Genes Cells. 1997 Mar;2(3):167-84 10. Mizuno T. Compilation of all genes encoding two-component phosphotransfer signal transducers in the genome of Escherichia coli. DNA research 4, 161-168 (1997) 11. M Jishage, A Iwata, S Ueda and A Ishihama. Regulation of RNA polymerase sigma subunit synthesis in Escherichia coli: intracellular levels of four species of sigma subunit under various growth conditions. J. Bacteriol. 1996, 178(18):5447 12. Maeda H, Fujita N, Ishihama A. Competition among seven Escherichia coli sigma subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase. Nucleic Acids Res. 2000 Sep 15;28(18):3497-503 13. Akira Ishihama. Functional modulation of Escherichia coli RNA polymerase. Annu. Rev. Microbiol. 2000. 54:499–518 14. Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. New York: Garland Science; 2002 15. Barrett JF, Hoch JA. Two-component signal transduction as a target for microbial anti-infective therapy. Antimicrob Agents Chemother. 1998 Jul;42(7):1529-36 70 16. Stephenson K, Hoch JA. Two-component and phosphorelay signaltransduction systems as therapeutic targets. Curr Opin Pharmacol. 2002 Oct;2(5):507-12 17. Salis H, Tamsir A, Voigt C. Engineering bacterial signals and sensors. Contrib Microbiol. 2009;16:194-225. doi: 10.1159/000219381. Epub 2009 Jun 2 18. Ferris HU, Coles M, Lupas AN, Hartmann MD. Crystallographic snapshot of the Escherichia coli EnvZ histidine kinase in an active conformation. J Struct Biol. 2014 Mar 26 19. Xie W, Dickson C, Kwiatkowski W, Choe S. Structure of the cytoplasmic segment of histidine kinase receptor QseC, a key player in bacterial virulence. Protein Pept Lett. 2010 Nov;17(11):1383-91 20. Song Y, Peisach D, Pioszak AA, Xu Z, Ninfa AJ. Crystal structure of the Cterminal domain of the two-component system transmitter protein nitrogen regulator II (NRII; NtrB), regulator of nitrogen assimilation in Escherichia coli. Biochemistry. 2004 Jun 1;43(21):6670-8 21. Buckler DR, Zhou Y, Stock AM. Evidence of intradomain and interdomain flexibility in an OmpR/PhoB homolog from Thermotoga maritima. Structure. 2002 Feb;10(2):153-64 22. Gouet P, Fabry B, Guillet V, Birck C, Mourey L, Kahn D, Samama JP. Structural transitions in the FixJ receiver domain. Structure. 1999 Dec 15;7(12):1517-26 23. Solá M, Gomis-Rüth FX, Serrano L, González A, Coll M. Three-dimensional crystal structure of the transcription factor PhoB receiver domain. J Mol Biol. 1999 Jan 15;285(2):675-87 24. Volz K, Matsumura P. Crystal structure of Escherichia coli CheY refined at 1.7-A resolution. J Biol Chem. 1991 Aug 15;266(23):15511-9. 25. Alves R, Savageau MA. Comparative analysis of prototype two-component systems with either bifunctional or monofunctional sensors: differences in molecular structure and physiological function. Mol Microbiol. 2003 Apr;48(1):25-51 26. Stewart V. Biochemical Society Special Lecture. Nitrate- and nitriteresponsive sensors NarX and NarQ of proteobacteria. Biochem Soc Trans. 2003 Feb;31(Pt 1):1-10 27. Stewart V, Bledsoe PJ. Synthetic lac operator substitutions for studying the nitrate- and nitrite-responsive NarX-NarL and NarQ-NarP two-component regulatory systems of Escherichia coli K-12. J Bacteriol. 2003 Apr;185(7):2104-11 28. Ames P, Parkinson JS. Transmembrane signaling by bacterial chemoreceptors: E. coli transducers with locked signal output. Cell. 1988 Dec 2;55(5):817-26 29. Jin T, Inouye M. Transmembrane signaling. Mutational analysis of the cytoplasmic linker region of Taz1-1, a Tar-EnvZ chimeric receptor in Escherichia coli. J Mol Biol. 1994 Dec 16;244(5):477-81 71 30. Aravind L, Ponting CP. The cytoplasmic helical linker domain of receptor histidine kinase and methyl-accepting proteins is common to many prokaryotic signalling proteins. FEMS Microbiol Lett. 1999 Jul 1;176(1):111-6 31. Hulko M, Berndt F, Gruber M, Linder JU, Truffault V, Schultz A, Martin J, Schultz JE, Lupas AN, Coles M. The HAMP domain structure implies helix rotation in transmembrane signaling. Cell. 2006 Sep 8;126(5):929-40 32. Crick F. The packing of α-helices: simple coiled coils. Acta crystallogr (1953) 6: 689-697 33. Butler SL, Falke JJ. Cysteine and disulfide scanning reveals two amphiphilic helices in the linker region of the aspartate chemoreceptor. Biochemistry. 1998 Jul 28;37(30):10746-56 34. Zhu Y, Inouye M. Analysis of the role of the EnvZ linker region in signal transduction using a chimeric Tar/EnvZ receptor protein, Tez1. J Biol Chem. 2003 Jun 20;278(25):22812-9. Epub 2003 Apr 2 35. Zhu Y, Inouye M. The HAMP linker in histidine kinase dimeric receptors is critical for symmetric transmembrane signal transduction. J Biol Chem. 2004 Nov 12;279(46):48152-8. Epub 2004 Aug 16 36. Inouye M. Signaling by transmembrane proteins shifts gears. Cell. 2006 Sep 8;126(5):829-31 37. Kishii R, Falzon L, Yoshida T, Kobayashi H, Inouye M. Structural and functional studies of the HAMP domain of EnvZ, an osmosensing transmembrane histidine kinase in Escherichia coli. J Biol Chem. 2007 Sep 7;282(36):26401-8. Epub 2007 Jul 16 38. Falke JJ, Hazelbauer GL. Transmembrane signaling in bacterial chemoreceptors. Trends Biochem Sci. 2001 Apr;26(4):257-65 39. Cheung J, Le-Khac M, Hendrickson WA. Crystal structure of a histidine kinase sensor domain with similarity to periplasmic binding proteins. Proteins. 2009 Oct;77(1):235-41. doi: 10.1002/prot.22485 40. Watts KJ, Ma Q, Johnson MS, Taylor BL. Interactions between the PAS and HAMP domains of the Escherichia coli aerotaxis receptor Aer. J Bacteriol. 2004 Nov;186(21):7440-9 41. Watts KJ, Johnson MS, Taylor BL. Structure-function relationships in the HAMP and proximal signaling domains of the aerotaxis receptor Aer. J Bacteriol. 2008 Mar;190(6):2118-27. doi: 10.1128/JB.01858-07. Epub 2008 Jan 18 42. Ward SM, Delgado A, Gunsalus RP, Manson MD. A NarX-Tar chimera mediates repellent chemotaxis to nitrate and nitrite. Mol Microbiol. 2002 May;44(3):709-19 43. Ward SM, Bormans AF, Manson MD. Mutationally altered signal output in the Nart (NarX-Tar) hybrid chemoreceptor. J Bacteriol. 2006 Jun;188(11):3944-51 44. Ferris HU, Dunin-Horkawicz S, Mondéjar LG, Hulko M, Hantke K, Martin J, Schultz JE, Zeth K, Lupas AN, Coles M. The mechanisms of HAMP-mediated signaling in transmembrane receptors. Structure. 2011 Mar 9;19(3):378-85. doi: 10.1016/j.str.2011.01.006 72 45. Ferris HU, Dunin-Horkawicz S, Hornig N, Hulko M, Martin J, Schultz JE, Zeth K, Lupas AN, Coles M. Mechanism of regulation of receptor histidine kinases. Structure. 2012 Jan 11;20(1):56-66. doi: 10.1016/j.str.2011.11.014 46. Ferris HU, Coles M, Lupas AN, Hartmann MD. Crystallographic snapshot of the Escherichia coli EnvZ histidine kinase in an active conformation. J Struct Biol. 2014 Jun;186(3):376-9. doi: 10.1016/j.jsb.2014.03.014. Epub 2014 Mar 26 47. Ferris HU, Zeth K, Hulko M, Dunin-Horkawicz S, Lupas AN. Axial helix rotation as a mechanism for signal regulation inferred from the crystallographic analysis of the E. coli serine chemoreceptor. J Struct Biol. 2014 Jun;186(3):349-56. doi: 10.1016/j.jsb.2014.03.015. Epub 2014 Mar 27 48. Gordeliy VI, Labahn J, Moukhametzianov R, Efremov R, Granzin J, Schlesinger R, Büldt G, Savopol T, Scheidig AJ, Klare JP, Engelhard M. Molecular basis of transmembrane signalling by sensory rhodopsin IItransducer complex. Nature. 2002 Oct 3;419(6906):484-7 49. Moukhametzianov R, Klare JP, Efremov R, Baeken C, Göppner A, Labahn J, Engelhard M, Büldt G, Gordeliy VI. Development of the signal in sensory rhodopsin and its transfer to the cognate transducer. Nature. 2006 Mar 2;440(7080):115-9. Epub 2006 Feb 1 50. Zhou Q, Ames P, Parkinson JS. Mutational analyses of HAMP helices suggest a dynamic bundle model of input-output signalling in chemoreceptors. Mol Microbiol. 2009 Sep;73(5):801-14. doi: 10.1111/j.1365-2958.2009.06819.x. Epub 2009 Jul 28 51. Zhou Q, Ames P, Parkinson JS. Biphasic control logic of HAMP domain signalling in the Escherichia coli serine chemoreceptor. Mol Microbiol. 2011 May;80(3):596-611. doi: 10.1111/j.1365-2958.2011.07577.x. Epub 2011 Feb 24 52. Parkinson JS. Signaling mechanisms of HAMP domains in chemoreceptors and sensor kinases. Annu Rev Microbiol. 2010;64:101-22. doi: 10.1146/annurev.micro.112408.134215 53. Airola MV, Watts KJ, Bilwes AM, Crane BR. Structure of concatenated HAMP domains provides a mechanism for signal transduction. Structure. 2010 Mar 14;18(4):436-48. doi: 10.1016/j.str.2010.01.013 54. Stewart V. The HAMP signal-conversion domain: static two-state or dynamic three-state? Mol Microbiol. 2014 Mar;91(5):853-7. doi: 10.1111/mmi.12516. Epub 2014 Jan 27 55. Gunsalus RP. Control of electron flow in Escherichia coli: coordinated transcription of respiratory pathway genes. J Bacteriol. 1992 Nov;174(22):7069-74 56. Noriega CE, Lin HY, Chen LL, Williams SB, Stewart V. Asymmetric crossregulation between the nitrate-responsive NarX-NarL and NarQ-NarP twocomponent regulatory systems from Escherichia coli K-12. Mol Microbiol. 2010 Jan;75(2):394-412. doi: 10.1111/j.1365-2958.2009.06987.x. Epub 2009 Dec 4 73 57. Stewart V, Parales J Jr. Identification and expression of genes narL and narX of the nar (nitrate reductase) locus in Escherichia coli K-12. J Bacteriol. 1988 Apr;170(4):1589-97 58. Chiang RC, Cavicchioli R, Gunsalus RP. Identification and characterization of narQ, a second nitrate sensor for nitrate-dependent gene regulation in Escherichia coli. Mol Microbiol. 1992 Jul;6(14):1913-23 59. Rabin RS, Stewart V. Either of two functionally redundant sensor proteins, NarX and NarQ, is sufficient for nitrate regulation in Escherichia coli K-12. Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Sep 15;89(18):8419-23 60. Rabin RS, Stewart V. Dual response regulators (NarL and NarP) interact with dual sensors (NarX and NarQ) to control nitrate- and nitrite-regulated gene expression in Escherichia coli K-12. J Bacteriol. 1993 Jun;175(11):325968 61. Stewart V. Nitrate respiration in relation to facultative metabolism in enterobacteria. Microbiol Rev. 1988 Jun;52(2):190-232 62. Cavicchioli R, Schröder I, Constanti M, Gunsalus RP. The NarX and NarQ sensor-transmitter proteins of Escherichia coli each require two conserved histidines for nitrate-dependent signal transduction to NarL. J Bacteriol. 1995 May;177(9):2416-24 63. Stewart V, Lu Y, Darwin AJ. Periplasmic nitrate reductase (NapABC enzyme) supports anaerobic respiration by Escherichia coli K-12. J Bacteriol. 2002 Mar;184(5):1314-23 64. Stewart V, Chen LL, Wu HC. Response to culture aeration mediated by the nitrate and nitrite sensor NarQ of Escherichia coli K-12. Mol Microbiol. 2003 Nov;50(4):1391-9 65. Noriega CE, Schmidt R, Gray MJ, Chen LL, Stewart V. Autophosphorylation and dephosphorylation by soluble forms of the nitrate-responsive sensors NarX and NarQ from Escherichia coli K-12. J Bacteriol. 2008 Jun;190(11):3869-76. doi: 10.1128/JB.00092-08. Epub 2008 Mar 28 66. Stewart V, Chen LL. The S helix mediates signal transmission as a HAMP domain coiled-coil extension in the NarX nitrate sensor from Escherichia coli K-12. J Bacteriol. 2010 Feb;192(3):734-45. doi: 10.1128/JB.00172-09. Epub 2009 Dec 4 67. Cheung J, Hendrickson WA. Structural analysis of ligand stimulation of the histidine kinase NarX. Structure. 2009 Feb 13;17(2):190-201. doi: 10.1016/j.str.2008.12.013 68. Inoue H, Nojima H, Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 1990 Nov 30;96(1):23-8 69. Gradient SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. The Protein Protocols Handbook Part II 2002, pp 69-72, 10.1385/1-59259-169-8:69, print ISBN 978-0-89603-940-7, Humana Press 70. Gel filtration principles and methods. Amersham Biosciences. 18-1022-12 Edition al. 71. Jian Peng and Jinbo Xu. RaptorX: exploiting structure information for protein alignment by statistical inference. PROTEINS, 2011 74 72. P.V.Konarev, V.V.Volkov, A.V.Sokolova, M.H.J.Koch and D. I. Svergun (2003). PRIMUS - a Windows-PC based system for small-angle scattering data analysis. J Appl Cryst. 36, 1277-1282 73. D. I. Svergun (1999). Restoring low resolution structure of biological macromolecules from solution scattering using simulated annealing. Biophys J. 2879-2886 74. STEVEN FORST, JORGE DELGADO, AND MASAYORI INOUYE. Phosphorylation of OmpR by the osmosensor EnvZ modulates expression of the ompF and ompC genes in Escherichia coli. Proc. Nati. Acad. Sci. USA Vol. 86, pp. 6052-6056, August 1989 Biochemistry 75. Antommattei FM, Munzner JB, Weis RM. Ligand-specific activation of Escherichia coli chemoreceptor transmethylation. J Bacteriol. 2004 Nov;186(22):7556-63 76. Cherezov V, Clogston J, Papiz MZ, Caffrey M. Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases. J Mol Biol. 2006 Apr 14;357(5):1605-18. Epub 2006 Feb 2 75
