БА Р А Н О В Александр Владимирович Р А З Р А БО ТК А М ЕТО Д О В СИ Н ТЕЗ А П СЕВД О П ЕП ТИ Д О В И М О Н О М ЕР О В П ЕП ТИ Д Н О - Н У К ЛЕИ Н О ВЫХ К И СЛО Т 02.00.10 Биоорганическая химия Псевдопептиды 1. Билдинг-блоки для создания различных структур. 2. Инструменты для исследования механизмов действия ферментов. Пептидно-нуклеиновые кислоты 1. НК-миметики. 2. Лиганды для аффинной хроматографии. 3. Потенциальные материалы для использования в нанобиотехнологии. 2 Цель настоящего исследования заключалась в синтезе псевдопептидов и их производных: COOtBu COOBzl Ns H N CbzHN COOMe H N BocHN COOAll N BocHN COOAll N NsN COOBzl B COOBzl O NR B O O N N H COOBzl R = Boc Cbz H BocHN N B = Thy CbzCyt COOH BocHN N B = Thy CbzCyt CbzAde COOH COOBzl 3 Основные задачи 1. Оптимизация подходов к созданию псевдопептидной (ψ) связи между остатками различных по строению аминокислот и синтез псевдопептида состава ProGly-ψ-Pro. 2. Разработка и препаративный синтез новых цитозинсодержащих мономеров ОЗ ПНК из псевдопептидов различного строения. 3. Подтверждение структуры тимин-, цитозини аденинсодержащих мономеров ОЗ ПНК на основе псевдопептидов Glu-ψ-Gly и Gly-ψ-Glu. 4 Основные положения, выносимые на защиту 1. Изучение восстановления производных дикарбоновых α-аминокислот. 2. Препаративный синтез псевдопептида ProGly-ψ-Pro. 3. Препаративный синтез двух новых цитозинсодержащих мономеров ОЗ ПНК на основе псевдопептидов Glu-ψ-Gly и Gly-ψ-Glu. 4. Оптимизация схемы синтеза двух тимин- и одного аденинсодержащего мономера ОЗ ПНК на основе псевдопептидов Glu-ψ-Gly и Gly-ψ-Glu. 5. Изучение региоселективности реакции алкилирования бромацилированными псевдопептидами Gly-ψ-Glu и Glu-ψ-Gly тимина и защищенных цитозина и аденина методами двумерной ЯМР-спектроскопии. 5 Способы создания восстановленной пептидной связи NO2 1. Реакция Мицунобу R1 ZHN O OH + S O O HN OY DEAD PPh3 THF R2 O R1 2. Восстановительное аминирование ZHN H + H2N O 3. Селективное восстановление уже имеющейся пептидной связи OY PhSH K2CO3 MeCN R1 STAB TEA DCM ZHN R2 O H N OY R2 R1 O H N ZHN O OY [H] R2 6 Изучение стадии восстановления защищенных дикарбоновых аминокислот поиск оптимального метода синтеза защищенных β-аминоспиртов O NMM R1HN 1a-c O OH IBCF NMM DME –20°C R2 4a-c O R1HN BH3 THF –78°C R1HN 3a-c OH R2 NaBH4 H2O/MeOH –10°C R2 O NH O O O R2 < 50% R1HN O 2a-c R1 a b c R2 1 3 Boc (CH2)2CO2Bzl 55% CH2CO2Bzl 33% Boc Cbz (CH2)2CO2tBu 40% 1 2 3 90% 71% 83% 7 Синтез защищенного псевдопептида Glu-ψ-Gly предшественника мономеров ОЗ ПНК NsGlyOAll (4) PPh3 DEAD THF COOBzl 3a BocHN OH COOBzl 65% BocHN Y N 5 Y = Ns COOAll 6Y=H PhSH K2CO3 CH3CN 67% 8 Синтез защищенного псевдопептида Gly-ψ-Glu предшественника мономеров ОЗ ПНК BocHN COOH AllBr Cs2CO3 DMF BocHN COOAll ∼100% 7 COOBzl BocHN PhSH K2CO3 CH3CN 62% 8 COOBzl Y N COOAll TFA DCM 72% 1a TFA H2N NsCl TEA DCM 75% Ns (10) COOAll BocHN(CH2)2OHPPh HN COOBzl COOAll 3 DEAD THF 11 Y = Ns 80% COOBzl 9 COOBzl 12 Y = H 9 Синтез полностью защищенного псевдопептида Glu-ψ-His HisOMe NsCl TEA DCM 0°C Ns HN COOMe 92% CbzGlu(OtBu)-ol (3c) PPh3 DEAD THF COOtBu Ns N 30% 13 N 14 NsN CbzHN COOMe 15 N NsN 10 Синтез защищенного псевдопептида ProGly-ψ-Pro H2N OH 16 Boc2O H 2O BocHN 81% 17 OH N OH BocHN 21 BocHN COOBzl 59% (23a) 54% (23b) 20 COOBzl 18 ProOBzl (19) STAB TEA, DCM 75% N NR N N O O RPro 22a R = Boc 22b R = Cbz PivCl, TEA, CH3CN TEA 78% TFA DCM ∼100% × 2TFA H2N OH KIO4 H2O N H 23a R = Boc 23b R = Cbz COOBzl 24a R = H (× 2TFA) (R = Boc) TFA DCM ∼100% – BzlOH O N H 25 11 Два метода получения мономеров ПНК первоначально разработаны для синтеза незаряженных ПНК B O B OH Hal Hal O R1 ZHN R1 H N X COOY ZHN R2 ZHN Nielsen, 1991 N COOY R2 B R1 O O N COOY R2 Meltzer, 1995 12 Синтез производных нуклеиновых оснований A Thy ClCH2COOH KOH H2O 40°C O NH Cyt 70% 27a NHCbz BrCH2COOEt NHCbz B N CbzCl Py N O H 27b OH NH2 2 N 73% N DCM/DMF 0°C 37 N 35 Y = Et OY 28b Y = H N 38 O NHCbz NaOH H 2O 66% N N O O NHCbz CbzOIm+EtBF4– 35% N O N NaOH (aq.) 87% C BrCH COOEt N 75% 28a O NaH DMF N 34 O NaH DMF 40% N N N N 28c O N Ade OEt 36 CbzCl NaH DMF 26% NHCbz N N N H 27c OEt OH N a b c Base 27 28 Thy Cyt Ade — 75% 26% 70% 26% 17% 13 Синтез мономеров ОЗ ПНК на основе псевдопептида Glu-ψ-Gly COOBzl BocHN COOBzl H N COOAll O BrCH2COBr TEA DCM 78% Br BocHN 6 N COOAll 26 BCH2CO2H (28a,b) IBCF NMM, TEA DMF –20°C O a b Thy CbzCyt 6 29 26 29 6 26 29 56% — 56% 39% 43% 30% K2CO3 DMF N BocHN B B (27a,b) B COOBzl COOY 30 29a,b Y = All 99% 92% 30a,b Y = H [Pd(PPh3)4] morpholine THF 14 Синтез мономеров ОЗ ПНК на основе псевдопептида Gly-ψ-Glu Br H N BocHN COOAll O BrCH2COBr TEA DCM 86% BocHN 12 BCH2CO2H (28a-c) COOBzl N BocHN a b c COOBzl B O 12 32 Thy CbzCyt CbzAde 64% 10% 26% COOAll 31 IBCF NMM, TEA DMF –20°C B N COOY B (27a-c) K2CO3 (27a) NaH (27b) K2CO3/Cs2CO3 (27c) DMF 31 32 12 31 32 33 91% 60% 41% 78% 52% 35% 45% 47% 53% 32a-c Y = All COOBzl 33a-c Y = H [Pd(PPh3)4] morpholine THF 15 Конкурирующие процессы в ходе реакции алкилирования O проблема идентификации изомеров NH O O O O O O O O O NH N N H N H O O O O O HN N O N-1 vs. N-3 Cyt O N N N H N O O O HN O N N H O N-1 vs. N-3 Thy N H O Br O O N N H O O O NH O O O O N N N-9 vs. N-7 Ade 16 Ключевые корреляции для тиминсодержащего мономера ОЗ ПНК на основе псевдопептида Gly-ψ-Glu O 28 H3C 29 27 28 NH N O 25 24 6 HN 7 8 N 26 N 31 O O O 13 9 10 O 11 12 + C25–H26 C26–H25 C31–H25 – C29–H25 19 16 3 24 15 4 1 30 N H O 14 O 29 27 5 O 25 H3C 30 31 26 O O O 17 18 20 2 23 21 22 17 26 25 25 26 Thy[Gly-ψ-Glu] COSY-спектр 18 25 26 25 26 Thy[Gly-ψ-Glu] HSQC-спектр 19 26 25 25 27 26 31 29 Thy[Gly-ψ-Glu] HMBC-спектр 20 26 25 25 27 26 31 29 Thy[Gly-ψ-Glu] HMBC-спектр 20 Ключевые корреляции для цитозинсодержащего мономера ОЗ ПНК на основе псевдопептида Gly-ψ-Glu O 30 HN O 34 34 31 O 32 33 35 28 N 27 N O 25 24 HN 7 8 37 N 25 38 27 37 24 N 29 N O O O 10 O 11 12 + C25–H26 C26–H25 C29–H25 – C28–H25 15 19 16 3 NH 28 36 O 13 9 30 14 O 4 1 O 31 26 5 O 32 29 26 6 36 38 33 35 O O 17 18 20 2 23 21 22 21 25 26 27 25 27 26 29 28 Cyt[Gly-ψ-Glu] HMBC-спектр 22 25 26 27 25 27 26 29 28 Cyt[Gly-ψ-Glu] HMBC-спектр 22 Ключевые корреляции для цитозинсодержащего мономера ОЗ ПНК на основе псевдопептида Glu-ψ-Gly O 30 HN 34 34 31 O 32 33 35 28 20 21 19 27 22 18 26 23 O O O N N O 15 14 6 HN 7 5 O O O O N 9 10 31 30 NH 25 28 36 38 24 N 27 37 29 26 O 25 24 8 37 32 29 16 17 36 38 33 35 N O O 13 O 11 12 + C25–H26 C26–H25 C29–H25 – C28–H25 4 3 1 2 23 26 27 25 25 27 26 29 28 Cyt[Glu-ψ-Gly] HMBC-спектр 24 26 27 25 25 27 26 29 28 Cyt[Glu-ψ-Gly] HMBC-спектр 24 Ключевые корреляции для аденинсодержащего мономера ОЗ ПНК на основе псевдопептида Gly-ψ-Glu O 31 HN N 26 25 HN 7 8 N 32 O 27 N 31 O N 37 26 32 O 33 34 36 39 37 28 N 27 38 30 N 29 HN 25 35 N 29 O 10 O 11 12 + C25–H26 C26–H25 C30–H25 – C27–H25 15 19 16 3 24 14 O 4 1 36 38 13 9 34 39 N 5 O 33 30 24 6 35 28 N O O O O 17 18 20 2 23 21 22 25 26 25 25 27 26 30 Ade[Gly-ψ-Glu] HMBC-спектр 26 26 25 25 27 26 30 Ade[Gly-ψ-Glu] HMBC-спектр 26 Выводы 1. Разработан новый метод восстановления дикарбоновых α-аминокислот. 2. Впервые синтезированы два защищенных производных псевдопептида ProGly-ψ-Pro. 3. Впервые осуществлен синтез двух цитозинсодержащих мономеров ОЗ ПНК на основе псевдопептидов Glu-ψ-Gly и Gly-ψ-Glu. 4. Проведена оптимизация схемы синтеза полученных ранее двух тиминсодержащих мономеров ОЗ ПНК на основе псевдопептидов Glu-ψ-Gly и Gly-ψ-Glu и одного аденинсодержащего мономера ОЗ ПНК на основе псевдопептида Gly-ψ-Glu. 5. Проведен анализ структуры полученных по разработанной в ходе настоящей работы схеме тимин-, цитозинсодержащих мономеров ОЗ ПНК на основе псевдопептидов Gly-ψ-Glu и Glu-ψ-Gly, а также аденинсодержащего мономера ОЗ ПНК на основе псевдопептида Gly-ψ-Glu с помощью методов двумерной ЯМРспектроскопии, который показал однозначность структуры выделенных продуктов реакции алкилирования гетероциклических нуклеиновых оснований бромацильными производными защищенных псевдопептидов Glu-ψ-Gly и Gly-ψ-Glu. 27 Публикации 1. Баранов А. В., Прохоров Д. И., Боярская Н. П., Кириллова Ю. Г. Синтез нового аналога пептида ProGlyPro. Вестник МИТХТ. — 2006. — Том 1, № 6. — с. 77–80. 2. Баранов А. В., Цвид Н. С., Лукьянченко В. И., Прохоров Д. И., Кириллова Ю. Г., Швец В. И. Исследование путей синтеза цитозинового мономера отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот. Вестник МИТХТ. — 2007. — Том 2, № 5. — с. 28–32. 3. Боярская Н. П., Прохоров Д. И., Баранов А. В. Разработка универсального подхода к синтезу мономеров отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот. III Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. — 2005. — Ч. 1. — С. 142–143. 4. Баранов А. В., Льянов М. А., Лукьянченко В. И., Прохоров Д. И. Синтез хиральных мономеров пептидно-нуклеиновых кислот. II Молодежная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии». Москва. — 2007. — Т. 1. — С. 34. 5. Баранов А. В., Кириллова Ю. Г. Синтез псевдопептидных фрагментов для получения негидролизуемых аналогов физиологически активного пептида СЕМАКС. Третий съезд общества биотехнологов России им. Ю. А. Овчинникова. Москва. — 2005. — С. 31–32. 28 СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!