8.5. Внутрилабораторный контроль качества анализа мочи
реклама
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ГОСТ Р ………..— 200 Технологии лабораторные клинические. Технология клинического лабораторного анализа мочи. Анализ мочи общий Первая редакция Москва 2008 Предисловие Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации – ГОСТ Р 1.0—2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения» Сведения о стандарте 1 РАЗРАБОТАН Лабораторией проблем клинико-лабораторной диагностики, Межрегиональной общественной организацией содействия стандартизации и повышению качества медицинской помощи 2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 466 «Медицинские технологии» 3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от № 4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок – в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования – на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии Содержание 1.Область применения. .................................................................................................................7 2. Нормативные ссылки. ...............................................................................................................7 3.Общие положения. .....................................................................................................................7 4. Требования к обеспечению выполнения технологии ............................................................8 4.1. Требования к специалистам и вспомогательному персоналу. .......................................8 4.2.Требования к обеспечению безопасности труда медицинского персонала. .................9 4.3. Условия выполнения технологии клинического лабораторного анализа мочи и функциональное назначение ..................................................................................................10 4.4. Материальные ресурсы, необходимые для выполнения технологии: приборы, средства измерения, лабораторное оборудование. ..............................................................10 4.5. Реактивы. ...........................................................................................................................12 4.6. Прочий расходуемый материал.......................................................................................13 5. Характеристика методик выполнения технологии клинического лабораторного анализа мочи ..............................................................................................................................................13 5.1. Взятие образцов мочи ......................................................................................................13 5.2. Идентификация образца...................................................................................................13 5.3. Приемлемость образца .....................................................................................................13 Перед проведением анализа образцы должны быть доведены до комнатной температуры. ............................................................................................................................14 5.4. Оценка физических свойств мочи ..................................................................................14 5.5. Технологии выполнения химических исследований мочи с помощью диагностических тест-полосок ...............................................................................................14 5.6. Микроскопическое исследование мочи .........................................................................16 5.7. Автоматизированный анализ мочи .................................................................................22 6. Дополнительные сведения об особенностях выполнения технологии ..............................22 7. Регистрация результатов анализа мочи .................................................................................22 8. Обеспечение качества выполнения технологии анализа мочи ...........................................22 8.1. Программы обеспечения качества ..................................................................................22 8.2. Ведение регистрации контрольных мероприятий .........................................................23 8.3. Инструкции к используемым методикам лабораторных исследований ....................23 8.4. Контроль качества материалов и оборудования ...........................................................24 8.5. Внутрилабораторный контроль качества анализа мочи ...............................................24 8.6. Внешняя оценка качества ................................................................................................26 8.7. Непрерывное образование специалистов .......................................................................26 9. Требования к режиму труда и отдыха, диете и ограничениям при подготовке пациента к сбору мочи для проведения анализа мочи .............................................................................27 10. Стоимостные характеристики выполнения технологии клинического лабораторного анализа мочи ................................................................................................................................27 ПРИЛОЖЕНИЕ А .......................................................................................................................28 Сбор образцов мочи, условия хранения и доставки (преаналитический этап) .....................28 ПРИЛОЖЕНИЕ Б ........................................................................................................................31 Исследование мочи с помощью диагностических тест-полосок ............................................31 ПРИЛОЖЕНИЕ В .......................................................................................................................38 Подтверждение результатов, полученных с помощью тест -полосок, другими методами: определение относительной плотности урометром, белка и глюкозы -химическими методами .......................................................................................................................................38 Библиография...............................................................................................................................41 Проект НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ «Технологии лабораторные клинические. Технология клинического лабораторного анализа мочи. Анализ мочи общий». 1.Область применения. Настоящий стандарт устанавливает единые требования при выполнении технологии «Анализ мочи общий» в клинико-диагностических лабораториях (КДЛ) медицинских учреждений, в перечень исследований которых включен этот комплекс анализов. Соблюдение установленных настоящим стандартом требований обеспечивает надежность результатов исследования, необходимую для уверенного использования этих результатов при принятии клинических решений. Настоящий стандарт может использоваться всеми организациями, учреждениями и предприятиями, а также индивидуальными предпринимателями, деятельность которых связана с оказанием медицинской помощи гражданам Российской Федерации. 2. Нормативные ссылки. ГОСТ Р ИСО 15189 —2006 « Лаборатории медицинские – частные требования к качеству и компетентности». ГОСТ Р ИСО 15190 —2007 «Требования по безопасности». ГОСТ Р «Технологии медицинские лабораторные. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4 «Правила ведения преаналитического этапа клинических лабораторных исследований». 3.Общие положения. Технология «Анализ мочи общий» выполняется с целью диагностики болезней, при профилактических обследованиях, для мониторинга течения болезни и эффективности лечения. Исследование мочи имеет большое диагностическое значение не только при заболеваниях почек, но и многих других органов и систем организма. Комплекс методов общего анализа мочи обычно включает: - макроскопическую оценку с описанием общих физических свойств; - физические измерения (объем, относительная плотность); - химические исследования, которые проводятся с помощью диагностических тестполосок (качественный и полуколичественный анализ) : определение рН, белка, глюкозы, кетоновых тел, билирубина, уробилиноидов, крови, нитритов, аскорбиновой кислоты; или химическими методами для подтверждения результатов определения белка и глюкозы, полученных тест-полосками. - микроскопическое исследование осадка мочи.1 Традиционно сложившееся в нашей стране наименование «Анализ мочи общий» за рубежом обозначается термином «Уринализ». 1 4. Требования к обеспечению выполнения технологии 4.1. Требования к специалистам и вспомогательному персоналу. 4.1.1.Перечень специалистов с высшим и средним образованием, участвующих в выполнении данной технологии: - врач клинической лабораторной диагностики или биолог; - специалист со средним медицинским образованием (медицинский технолог, медицинский лабораторный техник, фельдшер-лаборант, лаборант). 4.1.2.Требования к образованию специалистов. Врачи клинической лабораторной диагностики или биологи должны иметь последипломное образование и периодически проходить повышение квалификации в установленном порядке. Врачи должны иметь сертификат специалиста. Врачи или биологи выполняют микроскопическое исследование мочи. Специалисты со средним образованием (медицинский технолог, медицинский лабораторный техник, фельдшер-лаборант, лаборант) должны иметь соответствующую квалификацию по диплому, сертификат специалиста и проходить в установленном порядке повышение квалификации. Они проводят макроскопическое исследование, физические измерения, химические исследования, подготовку препарата осадка мочи для микроскопического исследования. Квалифицированные специалисты со средним образованием могут проводить микроскопическое исследование осадка мочи при отсутствии патологических результатов химического исследования диагностическими тест-полосками. 4.1.3. Требования к знаниям и умениям специалистов, выполняющих данное исследование (требования образовательных стандартов) Врачи клинической лабораторной диагностики (биологи) должны знать [1]: - все признаки патологии, которые можно выявить на всех этапах исследования мочи; - строение, функции и основные болезни органов мочеобразовательной и мочевыделительной систем; клиническое значение протеинурии, глюкозурии, билирубинурии, кетонурии, уробилинодурии, гематурии (зритроцитурии, гемоглобинурии), лейкоцитурии.. - При проведении микроскопического исследования должны знать морфологию нормальных и патологических элементов: эпителия мочевыводящих путей, эритроцитов, лейкоцитов, цилиндров, строение кристаллов солей, встречающихся в кислой, щелочной и нейтральной моче, клинико-диагностическое значение лейкоцитурии, наличия почечного эпителия и его жировой дистрофии, переходного эпителия, солей. - Должны также знать все этапы подготовительной работы и проведения общего анализа мочи: правила сбора мочи, правила техники безопасности при работе с потенциально инфицированным биологическим материалом, требования к доставке и хранению материала, правила центрифугирования мочи для приготовления осадка, методики проведения физического, химического и микроскопического исследования мочи. Должны уметь: - описать физические свойства нормальной и патологической мочи, - определить относительную плотность, рН, - провести химические исследования мочи, - подготовить препарат для микроскопического исследования, провести микроскопию осадка мочи: дифференцировать клеточные элементы, цилиндры, соли, обнаружить наличие бактерий, спор и мицелия гриба, яиц или личинок гельминтов.. Специалисты со средним медицинским образованием (медицинский технолог, медицинский лабораторный техник, фельдшер-лаборант, лаборант) должны знать: - теорию образования мочи, функцию почек и причины ее нарушений, морфологию клеточных и других элементов мочи, мочевые синдромы и их значение в диагностике заболеваний органов мочевой системы, основные методы и диагностическое значение исследования физических и химических показателей мочи. Должны уметь: - описать физические свойства мочи, определить относительную плотность; - провести химическое исследование белка, глюкозы, кетоновых тел, билирубина, уробилиногена, нитритов; - приготовить препарат осадка мочи для микроскопического исследования. 4.2.Требования к обеспечению безопасности труда медицинского персонала. Лица, отвечающие за сбор, доставку и анализ образцов мочи, должны быть осведомлены о потенциальной биологической опасности, так как часто невозможно знать заранее, инфицирован ли образец, поэтому все образцы биологического материала считаются потенциально инфицированными. Персонал должен соблюдать общие правила техники безопасности, принятые для работы в клинико-диагностических лабораториях. Рекомендуется строго соблюдать общие предосторожности при ручной обработке образцов мочи пациентов и работе с другими материалами, используемыми при выполнении анализа. Это касается не только биологической опасности, но и работы с химическими реактивами и электроприборами. Для обеспечения безопасности работы в лаборатории необходимо следовать правилам стандарта ГОСТ Р ИСО 15190 —2007 «Требования по безопасности». 4.2.1.Правила биологической безопасности: - прием присланного в лабораторию биологического материала (мочи) и работа с ним проводится в индивидуальных средствах защиты (халаты, резиновые перчатки); - после окончания работы проводят дезинфекцию лабораторного инструментария, стеклянных изделий, поверхности рабочих столов и помещений лаборатории. Все работы проводят в резиновых перчатках. Для обеззараживания используются средства, обеспечивающие уничтожение вирусов и бактерий, рекомендуемые для дезинфекции [2]. После окончания работы сотрудники снимают перчатки, обрабатывают руки дезинфицирующим раствором (70% раствором этилового спирта), а затем моют руки теплой водой с мылом. Потенциально опасные отходы, загрязненные остатками биологического материала, образующиеся в процессе выполнения технологии, дезинфицируют. После дезинфекции собирают в одноразовую твердую герметическую упаковку, маркируют надписью с указанием класса отходов, (например, «Опасные отходы, класс Б), кода подразделения, фамилии ответственного за сбор отходов лица, затем помещают в специальные контейнеры, установленные в определенных местах на территории лечебного учреждения [3]; 4.2.2. Правила работы со специальным оборудованием и соблюдение пожарной безопасности. Все сотрудники должны выполнять инструкции и правила техники безопасности, изложенные в технических паспортах к электрическим приборам, используемым в технологии (фотометры, микроскопы, центрифуги); персонал, работающий с реактивами, должен быть обучен обращению с ними, использовать средства персональной защиты, соблюдать правила личной гигиены. Для предупреждения пожаров необходимо соблюдать правила пожарной безопасности в соответствии с действующими нормативными документами. Таким образом, необходимо строгое следование всем инструкциям по технике безопасности, пожарной безопасности и биологической безопасности. 4.3. Условия выполнения технологии клинического лабораторного анализа мочи и функциональное назначение Комплекс исследований «Анализ мочи общий» выполняется в клиникодиагностических лабораториях амбулаторно-поликлинических и стационарных учреждений здравоохранения. Функциональное назначение услуги: проводится с целью диагностики болезней, профилактических обследований (скрининг при отсутствии симптомов болезней), наблюдения за течением и прогрессированием болезни и эффективностью лечения. 4.4. Материальные ресурсы, необходимые для выполнения технологии: приборы, средства измерения, лабораторное оборудование. 4.4.1. Микроскоп бинокулярный с иммерсией и встроенным осветителем. Микроскопы, использующиеся для исследования осадка мочи должны иметь бинокулярную насадку, встроенный источник света, стандартные установки объективов и окуляров на определенное увеличение. 4.4.2. Центрифуга лабораторная. Для приготовления осадка мочи должны использоваться центрифуги, обеспечивающие не менее 1500 оборотов в мин., имеющие самозакрывающиеся крышки, когда ротор запущен. При использовании центрифуги необходимо строго следовать инструкции производителя. 4.4.3. Приборы для считывания результатов диагностических тест-полосок. . Приборы для считывания интенсивности цвета тест-полосок представляют собой отражательные фотометры или рефлектометры, которые представляют собой фотометрические устройства для количественного измерения потоков света, отраженного поверхностью реакционной зоны. Лучи света, отраженные и рассеянные в разных направлениях, многократно отражаются от внутренней стенки сферы прибора, внутри которого создается равномерная освещенность, интенсивность которой определяется суммой всего отраженного исследуемой поверхностью света. Поскольку окраска различных реакционных зон неодинакова, может потребоваться измерение на разных длинах волн, что предусмотрено устройством прибора. При использовании отражательных фотометров необходимо строго следовать инструкции по применению прибора. Допускается применение в КДЛ только тех приборов, которые зарегистрированы в соответствии с установленным порядком. 4.4.4. Фотометр (фотоэлектроколориметр) (при необходимости химическими методами результатов определения на тест-полосках). 4.4.5.Урометр плотности). (при необходимости дополнительного измерения подтверждения относительной 4.4.6.Секундомер (при использовании визуального способа считывания результатов). 4.4.7. Штатив для пробирок. 4.4.8. Стеклянные (пластиковые) изделия. 4.4.8.1. Сосуд с крышкой для сбора мочи (50 – 100 мл). Сосуд для сбора мочи должен быть емкостью не менее 100 мл с широким горлом (не менее 4 см в диаметре) с устойчивым основанием, чтобы избежать случайного разливания. Посуда для сбора должна быть сухой, чистой, но не стерильной, желательно из прозрачного материала, инертного к составным частям мочи. Если посуда используется для транспортировки, она обязательно должна иметь плотно закрывающуюся крышку, чтобы избежать вытекания содержимого, при этом крышка должна легко открываться. Сосуд и крышка не должны содержать химических веществ, например, детергентов, которые могут мешать при определении некоторых химических составляющих мочи. Сосуд для сбора мочи не используется повторно без специальной обработки. 4.4.8.2. Центрифужные пробирки (10 мл). Центрифужные пробирки из стекла или пластика должны быть прозрачными для обеспечения макроскопического изучения мочи и достаточно прочными, чтобы не разбивались при центрифугировании. Должны закрываться крышками для уменьшения опасности разбрызгивания. Они должны иметь коническую форму для концентрирования осадка, быть градуированными для стандартизации объема центрифугируемой мочи. Пробирки должны быть химически чистыми и маркированными для правильной идентификации пациента. 4.4.8.3. Цилиндры мерные (50, 100 мл). Используются при определении относительной плотности мочи урометром. 4.4.8.4. Стекла предметные и стекла покровные для микроскопии. Вместо стеклянных предметных и покровных стекол могут быть использованы пластиковые слайд-планшеты для исследования осадка мочи, что создает более стандартные условия и облегчает микроскопию. Это изделия разового использования, совпадающие по размеру с предметным стеклом (80 х 30 х 1,7 мм), имеющие 10 камер, каждая из которых имеет покрытие из тонкой пластиковой пластинки, соответствующее покровному стеклу (размером 19 х 17 мм). 10 камер позволяют проводить микроскопическое исследование 10 образцов мочи (нативного или суправитально окрашенного осадка). Устройство позволяет также проводить подсчет форменных элементов без применения счетной камеры. 4.4.8.5. Пипетки для переноса осадка мочи: обычно используют пастеровские пипетки с тонко оттянутым концом и баллончиком; предназначены для стандартизации объема капли осадка и уменьшения риска биологической опасности, связанной с ресуспендированием или переносом осадка. Они должны быть сухими и химически чистыми. 4.5. Реактивы. 4.5.1.реактивы для суправитальной окраски осадка мочи. Краска Штернгеймера. Используется готовая коммерческая краска Штернгеймера, состоящая из двух реактивов, из которых перед употреблением готовится рабочий раствор. Реактив применяется для суправитальной (без фиксации препарата) окраски осадка мочи для более надежной идентификации элементов организованного осадка мочи, включая клетки новообразований.. Описание применения реактива дано в разделе «Микроскопические исследования мочи» (см. п. 5.6.5.). 4.5.2. Диагностические тест-полоски. Диагностическая тест-полоска представляет собой изделие для диагностики in vitro, предназначенное для одноразового применения, Она состоит из реакционной зоны, отражательной части и подложки. Реакционная зона содержит высушенный и импрегнированный в волокна пористой матрицы (например, альфа-целлюлозы) комплекс химических реагентов в необходимых количествах, предусмотренных методикой исследования. Тест-полоска может содержать одну или несколько реакционных зон, расположенных на единой подложке, каждая из которых предназначена для обнаружения или измерения содержания определенного аналита. В основе методов, используемых в тест-полосках для анализа мочи, лежат цветные реакции, приводящие к изменению окраски тестовой зоны полоски. В зависимости от химических свойств определяемого аналита используются разные химические методы, в том числе ферментативные (например, глюкозооксидазный метод для анализа глюкозы в моче, или оценка количества лейкоцитов в моче на основе исследования активности их собственной эстеразы). Диагностически значимые изменения показателей мочи должны вызывать визуально заметные изменения окраски. Концентрация реактивов в тестовых зонах должна быть подобрана таким образом, чтобы быстро получить результат (в пределах нескольких десятков секунд). П р и м е ч а н и е 1 - При обнаружении патологического результата повторяют исследование химическими методами (подтверждающие тесты). Например, обязательно проводят количественное определение белка в моче с пирогаллоловым красным, сульфосалициловой кислотой или другим химическим методом, глюкозы – гексокиназным или глюкозооксидазным методом на анализаторе глюкозы, а также микроскопическое исследование осадка мочи. В зависимости от типа полоски оценка результатов исследования мочи может быть произведена и зарегистрирована: - визуально, путем субъективного сравнения оператором с прилагаемой к изделию цветной шкалой; - оптическим способом. 4.5.3. Готовые наборы химических реактивов для определения белка или глюкозы (при необходимости использования химических методов, например, в качестве подтверждающих тестов или при отсутствии диагностических тест-полосок). 4.6. Прочий расходуемый материал. 4.6.1. Перчатки резиновые. 4.6.2. Дезинфицирующие средства. 5. Характеристика методик выполнения технологии клинического лабораторного анализа мочи 5.1. Взятие образцов мочи Для правильного ведения преаналитического этапа необходимо соблюдать требования стандарта ГОСТ Р «Технологии медицинские лабораторные. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4 «Правила ведения преаналитического этапа клинических лабораторных исследований». Правила взятия различных образцов мочи, хранения и транспортировки изложены в приложении А. 5.2. Идентификация образца В направлении на исследование должна быть включена следующая информация: фамилия и инициалы пациента, возраст или дата рождения, пол, отделение медицинского учреждения и палата (в стационаре), номер медицинской карты (идентификационный номер), диагноз дата и время сбора образца мочи (с указанием порции – утренняя, случайная и т.д.), время доставки образца в лаборатории. Должны быть перечислены все показатели, которые требуется исследовать. При необходимости указать принимаемые пациентом лекарства. Немаркированные или неправильно маркированные образцы не пригодны для исследования, о чем необходимо уведомить клинициста, назначившего анализ. 5.3. Приемлемость образца Так как точность результатов исследования мочи во многом зависит от качества доставленного образца мочи, необходимо неукоснительно следовать правилам сбора и транспортировки мочи (приложение А). Рекомендуется сразу после сбора доставлять образцы утренней мочи в лабораторию и исследовать как можно скорее. После доставки образца мочи в лабораторию сотрудник лаборатории, принимающий материал, должен проверить правильность оформления направления на анализ, маркировку посуды (код или фамилия больного и другие данные должны быть идентичны данным, указанным в бланке-направлении) и зарегистрировать поступивший материал. Моча, температуре замерзания элементов, урометром, собранная для общего анализа, может храниться при комнатной не более 4-х часов. Можно сохранять в холодильнике, не допуская (от 2°С до 8°С), но охлаждение, предотвращая разрушение форменных может влиять на результаты определения относительной плотности затруднять микроскопию из-за преципитации уратов, а также не рекомендуется для некоторых химических компонентов, например, билирубина и уробилиногена, окисление которых (с образованием биливердина или уробилина) может привести к ложно-отрицательным результатам. Отсрочка анализа и использование охлаждения образца отмечаются в бланке ответа. Перед проведением анализа образцы должны быть доведены до комнатной температуры. 5.4. Оценка физических свойств мочи 5.4.1.Количество мочи для общего анализа. Для общего анализа собирается вся порция мочи. В лабораторию доставляется не менее 70-100 мл. Образец не должен содержать примесей и чужеродных материалов (например, фекалий, частиц тканей, используемых в ванной комнате и др.). Если правильность сбора мочи не соблюдается, клиницисту сообщают о непригодности собранного образца и необходимости прислать повторно правильно собранную мочу. В некоторых случаях цвет, прозрачность и запах мочи имеют клиническое значение. 5.4.2. Цвет мочи. Цвет мочи в норме – от светло-желтого до насыщенного желтого. Красная мутная моча характерна для макрогематурии (цвет «мясных помоев»), красная и прозрачная моча наблюдается при наличии гемоглобина, миоглобина, порфиринов, некоторых лекарств или пищевых красителей. При билирубинурии моча приобретает желто-коричневый цвет. 5.4.3. Запах мочи. Аммиачный запах отмечается обычно вследствие бактериального разложения, что может наблюдаться при длительном хранении мочи или инфекции мочевыводящих путей. При появлении кетоновых тел в моче больных диабетом отмечается «плодовый» или «яблочный» запах. 5.4.4. Прозрачность мочи. Свежевыпущенная моча прозрачна. Мутность может быть обусловлена клетками, солями, слизью и бактериями. Точная оценка прозрачности по шкале: «полная – неполная», предполагает чтение газетного шрифта через пробирку с мочой. В практической работе обычно в бланке указывают: «прозрачная, мутноватая или мутная» в соответствии с визуальной оценкой. 5.5. Технологии выполнения химических исследований мочи с помощью диагностических тест-полосок Химический анализ мочи может быть выполнен с использованием различных тестполосок, выпускаемых разными производителями (см. п. 4.5.2.). Эти диагностические полоски можно использовать для качественного или полуколичественного исследования мочи (см. приложение Б). С помощью тест-полосок могут быть определены следующие аналиты, входящие в состав общего анализа мочи: - относительная плотность - рН - белок (альбумин), - глюкоза, - кетоновые тела, - билирубин, - уробилиноген, - эритроциты / гемоглобин, - нитриты - лейкоциты (эстераза нейтрофилов). -аскорбиновая кислота (вспомогательный параметр) П р и м е ч а н и е 1 – производятся тест-полоски, содержащие дополнительную тестовую зону для определения аскорбиновой кислоты, что используется как контрольный параметр, позволяющий учесть риск получения неправильных результатов таких важных показателей, как гемоглобин, белок, глюкоза, билирубин. При отсутствии зоны для оценки содержания аскорбиновой кислоты необходимо обратить внимание на перечень лекарственных препаратов, принимаемых пациентом. Для исследования используется свежесобранная моча, хранившаяся до анализа не более четырех часов. При отсроченном анализе мочу следует хранить в холодильнике. Использование консервантов нежелательно, так как они могут ингибировать некоторые тесты. Перед исследованием мочу тщательно перемешивают. Методика проведения исследования: необходимое для анализа количество полосок изъять из пенала, не прикасаясь руками к тестовым зонам. Пенал следует быстро закрыть крышкой для предотвращения поступления влаги из воздуха. П р и м е ч а н и е 2 – В крышке или внутри пенала находится осушитель, поглощающий влагу при открывании пенала. Это обеспечивает длительный срок хранения полосок даже после вскрытия пенала. После удаления избытка мочи полоску следует держать горизонтально для исключения перекрестного загрязнения реактивами из прилегающих зон. При определении результата анализа мочи на отражательном фотометре диагностическую полоску после удаления избытка мочи помещают в специальный держатель, транспортер или на место считывания результата (в зависимости от конструкции прибора). Анализатор мочи (отражательный фотометр) проводит измерение параметров в стандартном режиме. П р и м е ч а н и е 4 – При работе на некоторых анализаторах нет необходимости предварительного удаления избытка мочи, так как он удаляется в процессе движения полоски на транспортере к фотометру, в котором происходит детекция результата. Иногда для удаления избытка мочи в анализаторе предусмотрена отдельная функция. После помещения полоски в анализатор происходит измерение и распечатывание результата. На отражательных фотометрах возможна качественная и полуколичественная оценка результатов. Патологические результаты отмечаются особыми пометками (флагами). В тест-полосках для исследования мочи на отражательных фотометрах с полуколичественным определением предусмотрены так называемые компенсационные зоны. Эти зоны, как правило, белого цвета, не импрегнированны реактивами. Они представляют собой своего рода «холостые пробы», постановка которых необходима для приборной компенсации окрашивания реакционных зон нативной мочой при определении химических компонентов. В некоторых случаях (экстренный анализ мочи при отсутствии фотометра, измерение параметров на приеме у врача общей практики, при наличии интенсивной окраски мочи, которая меняет цвет фона) результаты могут быть оценены визуально через промежуток времени, который указан в инструкции. Время экспозиции должно быть точно соблюдено для получения надежных результатов. После погружения полоски в мочу сравнивают окраску тестовых зон с окраской соответствующих зон цветной шкалы на пенале и регистрируют результат. Временной интервал между нанесением мочи на полоску и моментом чтения результата критически важен для точности определения: слишком короткий интервал может вызвать занижение результата из-за незавершенности цветной реакции, а слишком длинный интервал - из-за нестабильности окрашенного продукта. Визуальная оценка результатов по цветным шкалам, нанесенным на контейнеры для хранения полосок, может быть выражена как в единицах концентрации, так и в виде полуколичественной (порядковой) оценки результатов: «отрицательные» (-), «сомнительные» (+-), «положительные» (+, ++, +++ или ++++). Для подтверждения результатов исследований, полученных с помощью диагностических тест-полосок, могут быть использованы химические методы. Например, для обнаружения белка используют: - реакцию с 20% сульфосалициловой кислотой (качественная проба), основанную на коагуляции белка, или - количественный метод с красителем пирогаллоловым красным (приложение В). Для определения глюкозы используют глюкозооксидазный метод (приложение В).Имеются готовые наборы реактивов для выполнения химических методов, необходимо тщательно изучать инструкцию и точно ей следовать. 5.6. Микроскопическое исследование мочи 5.6.1. Требования к образцу осадка мочи для микроскопического исследования. Исследование проводят в первой утренней порции мочи, которая является наиболее концентрированной, что способствует увеличению количества элементов осадка, или в случайной (рандомизированной) порции. Перед проведением исследования врач должен иметь информацию о времени сбора мочи и результатах физико-химических исследований. Необходимо строго соблюдать условия хранения образца мочи. Исследование осадка необходимо выполнять в течение 4-х часов после сбора мочи, при более позднем исследовании образец мочи нужно хранить в холодильнике, не замораживая. Большинство консервантов влияют на результаты тестов диагностических полосок, поэтому их применение нежелательно, но при необходимости можно использовать тимол (несколько кристаллов на образец мочи). В настоящее время для исследования мочи выпускаются вакуумные пробирки, содержащие стабилизатор для клеточных элементов, который не влияет на результаты диагностических полосок. 5.6.2. Виды микроскопических исследований. Микроскопическое исследование при общем анализе мочи проводится в нативном препарате на предметных стеклах в затемненном поле микроскопа или с опущенным конденсором. При наличии трудно дифференцируемых клеток (зпителия, макрофагов, клеток сперматогенеза и др.) могут применяться суправитальные окраски (без фиксации препарата) на предметных стеклах или в пробирке с мочой, приготовленной для микроскопии осадка, с использованием разных красителей (например, краски Штернгеймера, см. п.4.5.1.). Кроме визуального микроскопического исследования применяется исследование с помощью автоматических и полуавтоматических анализаторов.в. 5.6.3.Подготовка осадка мочи и приготовление препаратов для микроскопического исследования: В лаборатории должна быть утверждена процедура подготовки осадка мочи и приготовления препарата для микроскопического исследования и процедура проведения самого микроскопического исследования. Каждый сотрудник должен выполнять все этапы анализа одинаковым способом и оценивать микроскопические элементы осадка, используя одни и те же критерии для идентификации. Объем мочи, используемый для центрифугирования, должен быть выбран в каждой лаборатории и использоваться постоянно, например, 10 мл; если в каких-либо случаях будут использоваться меньшие объемы (например, в педиатрии, неонаталогии), это отмечается в заключении. В центрифужную пробирку помещают 10 мл из утренней порции мочи после тщательного ее перемешивания. Центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин. Затем быстрым наклоном пробирки сливают прозрачный верхний слой, оставляя примерно 1 мл осадка, после чего 1 каплю (приблизительно 40 мкл) переносят пастеровской пипеткой с баллончиком и тонко оттянутым концом на середину предметного стекла и покрывают покровным. Покровное стекло должно покрывать осадок полностью. При избытке жидкости препарат становится многослойным и это затрудняет микроскопические исследования. При малом объеме мочи, например, у грудных детей, центрифугируют весь объем мочи, оставшийся после анализа на диагностических полосках, после сливания надосадочной жидкости оставляют примерно 1/10 часть. Использование слайд-планшетов вместо предметных и покровных стекол создает более стандартизованные условия для микроскопии. Стандартизация приготовления препаратов осадка мочи позволяет получить сравнимые результаты микроскопического исследования в разных лабораториях. 5.6.4.Микроскопическое исследование нативного препарата осадка мочи. Изучение препарата начинают с малого увеличения (ок. х 8, об. х 10) для общего обзора, а более детальное изучение препарата с количественной оценкой элементов организованного и неорганизованного осадка производят при большом увеличении (ок. х10, об. х 40). Если элементы осадка встречаются в каждом просмотренном поле зрения, то количественную оценку выражают их числом в поле зрения, при небольшом количестве элементов, когда их встречают далеко не в каждом поле зрения, — числом в препарате (число в препарате оценивается при малом увеличении). Различают организованный и неорганизованный осадок. Организованный осадок мочи состоит из клеток крови (эритроцитов, лейкоцитов), эпителиальных клеток (многослойного плоского, переходного, почечного эпителия), цилиндров (белкового и клеточного происхождения, а также состоящих из продуктов распада клеток). При наличии клеток злокачественных образований их также относят к организованному осадку. Неорганизованный осадок мочи представлен различными кристаллическими образованиями. 5.6.4.1. Организованный осадок мочи. В организованном осадке мочи различают клетки 3-х видов эпителия - плоского, переходного и почечного, эритроциты, лейкоциты, цилиндры, грибы и бактерии. Клетки опухолей также относятся к организованному осадку мочи. Плоский эпителий. У мужчин плоский эпителий попадает в мочу только из нижней трети мочеиспускательного канала, и в моче здоровых мужчин он практически не встречается. У женщин плоский эпителий попадает в мочу из мочеиспускательного канала и влагалища, поэтому в женской моче он практически всегда присутствует. При плохом туалете наружных половых органов количество плоского эпителия может быть столь значительным, что другие элементы осадка различить не удается. В этом случае анализ необходимо повторить. Плоский эпителий представляет собой крупные полигональные или округлые клетки с небольшим ядром, не окрашенные и не содержащие зернистости или включений. У девочек до пубертатного периода и у женщин в менопаузе плоский эпителий, попавший со стенок влагалища, более мелкий, ядро у него более крупное, что иногда приводит к ошибкам микроскопии, так как плоский эпителий принимают за переходный. Плоский эпителий располагается в виде отдельных клеток или пластами. П р и м е ч а н и е 1 - В мочевом осадке практически всегда встречают клетки плоского эпителия от единичных в препарате до единичных в поле зрения. Особого диагностического значения клетки плоского эпителия не имеют. Пласты плоского эпителия у женщин могут быть косвенным признаком плоскоклеточной метаплазии. Повышение содержания переходного эпителия наблюдается при воспалительных заболеваниях мочевыводящих путей, предстательной железы, при интоксикации или после наркоза. При обнаружении большого количества переходного эпителия, не подтвержденного диагнозом, рекомендуется проводить цитологическое исследование на наличие атипичных клеток. Переходный эпителий попадает в мочу у мужчин из почечных лоханок, мочеточников, мочевого пузыря, мочеиспускательного канала и протоков предстательной железы. У женщин – из почечных лоханок, мочеточников и мочевого пузыря. Эпителий по размеру в 3-6 раз больше лейкоцита и отличается выраженным полиморфизмом. В разных отделах мочевыводящих путей он отличается по размеру, форме клетки, количеству ядер. Так, пузырный эпителий - это крупные округлые клетки, содержащие от 1 до 3-х ядер. Общими признаками является легкое окрашивание цитоплазмы в желтоватый цвет в результате контакта с урохромами мочи и наличие мелкой зернистости. Возможно появление вакуолей и капель жира. П р и м е ч а н и е 2 - У здорового человека встречаются единичные клетки в препарате. Повышение содержания переходного эпителия наблюдается при воспалительных заболеваниях мочевыводящих путей, предстательной железы, при интоксикации или после наркоза. При обнаружении большого количества переходного эпителия, не подтвержденного диагнозом, рекомендуется проводить цитологическое исследование на наличие атипичных клеток. Почечный эпителий. Почечный эпителий попадает в мочу из нефронов. Морфологически он представляет небольшие клетки в 1,5-2 раза больше лейкоцита, неправильной округлой, четырехугольной или овальной формы с достаточно крупным ядром. Так как эпителий имеет длительный контакт с урохромами мочи, он окрашен в различные оттенки желтого цвета. В клетках почечного эпителия выражены элементы дистрофии, которые проявляются крупной зернистостью, часто закрывающей ядро, наличием вакуолей и капель жира. Клетки почечного эпителия располагаются в виде групп, цепочек или комплексов. В моче, содержащей билирубин, клетки почечного эпителия набухают и выглядят более крупными, округлыми и пигментированными. Наиболее частые лабораторные ошибки связаны с идентификацией почечного эпителия. Для уверенности в результатах анализа необходимо обнаружение почечного эпителия сопоставить с другими параметрами, такими как белок в моче и наличие цилиндров, а также с данными анамнеза или диагнозом. При сложностях в дифференциальной диагностике клеток осадка мочи рекомендуется использовать суправитальную окраску, которая позволяет дифференцировать клетки осадка мочи. П р и м е ч а н и е 3 – Почечный эпителий появляется в результате поражения почечной паренхимы при заболеваниях почек, при различных видах интоксикации, в том числе лекарствами и токсинами, а также после наркоза. У новорожденных иногда присутствуют единичные клетки почечного эпителия. Жировое перерождение почечного эпителия свидетельствует о тяжести поражения. Лейкоциты. В моче здоровых людей лейкоциты встречаются практически всегда. Это небольшие круглые бесцветные или сероватые клетки, в 1,5-2 раза больше эритроцитов. Как правило, лейкоциты в моче представлены сегментно-ядерными нейтрофилами (95%), реже - лимфоцитами или эозинофилами. Выявление высокого содержания лейкоцитов на фоне бактериурии свидетельствует о пиурии (гной в моче). В препарате лейкоциты могут быть расположены отдельно или в виде скоплений. Присутствие скоплений необходимо отмечать в бланке исследований. П р и м е ч а н и е 4. Количество лейкоцитов зависит от пола и возраста: у мальчиков до пубертатного периода они могут не встречаться, у мужчин обнаруживается 0-3 лейкоцита в поле зрения, у женщин - 0-5 в поле зрения. П р и м е ч а н и е 5. Содержание лейкоцитов в моче повышаются при заболеваниях почек и мочевыводящих путей инфекционно-воспалительного характера. П р и м е ч а н и е 6. В моче с низкой плотностью лейкоциты могут набухать, а в условиях щелочной мочи - разрушаться. Эритроциты по форме похожи на диски желтовато-зеленоватого цвета, содержат гемоглобин. Эритроциты, утратившие гемоглобин, по форме похожи на кольца. Эритроциты попадают в мочу из почек, мочевыводящих путей и половых органов. Почечное происхождение эритроцитов подтверждает наличие эритроцитарных цилиндров. П р и м е ч а н и е 7 – В моче здоровых людей допускается присутствие единичных эритроцитов в поле зрения. Эритроциты встречаются в виде неизмененных и измененных. Неизмененные эритроциты по форме похожи на диски желтовато-зеленоватого цвета, содержат гемоглобин, в препарате опалесцируют. Измененные эритроциты - это эритроциты, утратившие гемоглобин, по форме похожие на кольца. Измененные эритроциты встречаются в кислой моче. Деление эритроцитов на измененные и неизмененные не имеет первостепенного значения для решения вопроса об источнике гематурии. В щелочной моче эритроциты разрушаются. При большом количестве измененных эритроцитов в моче может обнаруживаться свободный гемоглобин. П р и м е ч а н и е 8 - Форма эритроцитов зависит от осмоляльности мочи. В моче с низкой плотностью эритроциты увеличиваются в диаметре, в ряде случаев может наступить гемолиз. В моче с высокой плотностью эритроциты уменьшаются в размере, мембрана имеет складчатую структуру («съеживаются»). П р и м е ч а н и е 9 - Дифференцировать эритроциты мочи надо от дрожжевых грибов и кристаллов оксалатов округлой формы. Споры грибов в отличие от эритроцитов чаще овальной формы, более резко преломляют свет, имеют голубоватый оттенок и почкуются. Овоидные оксалаты обычно, хотя и не всегда, имеют различную величину и резко преломляют свет. Прибавление к препарату осадка капли 5% уксусной кислоты приводит к гемолизу эритроцитов, оставляя грибы и кристаллы оксалата кальция без изменения. П р и м е ч а н и е 10 - Гематурия может быть обнаружена при поражении паренхимы почки, при тяжелой физической нагрузке, при поражениях мочевыводящих путей, при почечно-каменной болезни, при неопластических процессах, при дисметаболической нефропатии и при передозировке антикоагулянтов непрямого действия. Цилиндры. Цилиндры представляют собой белковые и клеточные слепки почечных канальцев. В основе любого цилиндра находится белок, который выполняет функцию склеивающего материала. Белок в цилиндрах изменен и представлен гиалиноподобной массой. Различают следующие виды цилиндров: гиалиновые, зернистые, восковидные, эпителиальные, эритроцитарные, пигментные, лейкоцитарные. П р и м е ч а н и е 11. Для образования цилиндров необходимо соблюдение следующих условий: наличие белка в моче, кислая реакция мочи, нарушение оттока или застой мочи. Цилиндры обнаруживаются в кислой моче. В щелочной моче цилиндры растворяются. Гиалиновые цилиндры имеют нежные контуры, прозрачны, при ярком освещении плохо заметны. На поверхности может быть легкая зернистость за счет аморфных солей или клеточного детрита. Образуются из свернувшегося белка. П р и м е ч а н и е 12 - Появление гиалиновых цилиндров свидетельствует о развитии протеинурии, что чаще всего является следствием повышенной проницаемости клубочковых капилляров. В моче здорового человека встречаются единичные цилиндры в препарате. Зернистые цилиндры имеют более резкие контуры и состоят из плотной зернистой массы желтоватого цвета. Восковидные цилиндры имеют резко очерченные контуры и гомогенную с блеском, слегка желтоватую структуру. Образуются из уплотненных гиалиновых и зернистых цилиндров при задержке их в канальцах. Наличие восковидных цилиндров свидетельствует о тяжелом поражении почек. Эпителиальные цилиндры имеют четкие контуры и состоят из клеток почечного эпителия. Пигментные цилиндры могут быть обнаружены при гемоглобинурии и миоглобинурии; коричневого цвета, имеют сходство с зернистыми . Эритроцитарные цилиндры желтоватого цвета состоят из массы эритроцитов, образуются при почечной гематурии . Лейкоцитарные цилиндры образуются из массы лейкоцитов, обнаруживаются при гнойных процессах в почках, пиелонефритах. П р и м е ч а н и е 13 - Кроме цилиндров, образованных из белка и клеток, в мочевом осадке иногда встречаются образования цилиндрической формы из аморфных солей, не имеющие практического значения. Эти образования растворяются при подогревании препарата или прибавлении к препарату капли щелочи или кислоты. П р и м е ч а н и е 14 - Цилиндрурия является симптомом поражения паренхимы почки: гиалиновые цилиндры подтверждают ренальную протеинурию, а лейкоцитарные и эритроцитарные почечное происхождение лейкоцитурии и гематурии. 5.6.4.2. В осадке мочи могут быть обнаружены бластоспоры грибов рода Candida, которые имеют сходство с эритроцитами. В отличие от эритроцитов споры гриба почкуются, имеют голубоватый оттенок и более резко преломляют свет. Добавление капли 30% уксусной кислоты лизирует эритроциты, оставляя неизмененными споры гриба. В осадке мочи также могут быть выявлены бактерии, патогенные простейшие (например, трихомонады), некоторые гельминты и яйца гельминтов, что требует дальнейшего обследования пациентов и дополнительных исследований (микробиологических, паразитологических). 5.6.4.3. Неорганизованный осадок мочи. Неорганизованный осадок мочи – это соли, выпавшие в осадок в виде кристаллов или аморфных масс. Характер солей зависит от коллоидного состояния мочи, значения рН и некоторых других факторов. В кислой моче встречаются: мочевая кислота, ураты, кислый мочекислый натрий сульфат кальция, гиппуровая кислота. В кислой, нейтральной и щелочной моче встречаются: кислый мочекислый аммоний, оксалат кальция, В нейтральной и щелочной моче встречаются аморфные фосфаты. В щелочной моче встречаются: карбонат кальция, фосфат магния, В слабокислой, нейтральной и щелочной моче встречаются: магния аммония фосфат, фосфат кальция. Кристаллы аминокислот и других соединений, обнаруживаемые при патологии: Кристаллы аминокислот и других соединений, обнаруживаемые при патологии: - цистин, П р и м е ч а н и е 15 – Встречается при цистинозе (наследственное заболевание). - лейцин, - тирозин, П р и м е ч а н и е 16 – Лейцин и тирозин указывают на нарушение обмена при отравлениях фосфором, тяжелых заболеваниях печени, В12-дефицитной анемии, лейкозах, новообразованиях. - холестерин, П р и м е ч а н и е 17 – Наблюдается при амилоидозе, липоидном нефрозе, туберкулезе почек, холестериновых камнях. - билирубин, П р и м е ч а н и е 18 – Встречается при билирубинуриях. - гемосидерин, П р и м е ч а н и е 19 – Встречается при гемолитических анемиях. - гематоидин, П р и м е ч а н и е 20 – Образуется в глубоких гематомах и очагах распада опухоли без доступа воздуха, встречается при вскрытии гематом паренхимы почек, распаде опухоли. - кристаллы лекарственных препаратов. П р и м е ч а н и е 21 – Могут быть обнаружены в моче при длительном применении некоторых лекарств (сульфаниламидные препараты, некоторые антибиотики, такие как полин, ампициллин).). 5.6.5. Микроскопическое исследование осадка мочи, окрашенного суправитально. Суправитальная окраска применяется в сомнительных случаях, она увеличивает точность результатов микроскопического исследования, позволяет наиболее четко выявлять все элементы организованного осадка, дифференцировать клетки плоского и переходного эпителия, различать нейтрофилы и лимфоциты, отличать почечный эпителий от лейкоцитов. Для суправитальной окраски используют краску Штернгеймера. В продаже имеется готовый набор реактивов для окраски осадка мочи по Штернгеймеру, состоящий из двух красителей красного исинего цвета. Рабочий раствор готовят смешиванием двух равных частей. Ход определения. Центрифугируют свежую утреннюю мочу. К 0.5 мл осадка прибавляют 1 каплю реактива, перемешивают и инкубируют 5 мин. Затем каплю окрашенного осадка помещают на стекло, покрывают покровным (или заполняют камеру слайд-планшета) и исследуют под микроскопом. Ядра клеток окрашиваются в синий цвет, цитоплазма – в розовый, гиалиновые цилиндры – в голубой, восковидные – в яркокрасный, зернистые - в бурый. 5.7. Автоматизированный анализ мочи Выпускаются приборы, пригодные для выполнения микроскопического исследования мочи, наряду с полуколичественными химическими исследованиями и измерением относительной плотности. Эти приборы могут количественно анализировать осадок мочи. Принцип действия прибора основан на тонкослойной проточной микроскопии, просмотр окрашенной мочи осуществляется видеосистемой и высокоскоростной имиджпроцессорной системой. Система автоматически классифицирует найденные элементы и обеспечивает высокую воспроизводимость и легкость использования. Имеются также приборы, которые центрифугируют образец в пробирках, специально приспособленных для просмотра с использованием микроскопа. Существуют системы, которые упрощают приготовление образца или снижают требуемый объем. Все эти приборы используют разные методологии, но все они сортируют образцы, помогают снизить использование стекол, центрифужных пробирок и ручное манипулирование с образцами мочи. Полуавтоматические и полностью автоматические устройства для считывания реагентных полосок описаны в п.4.4.3. 6. Дополнительные сведения об особенностях выполнения технологии Дополнительных сведений о выполнении данной технологии нет. 7. Регистрация результатов анализа мочи Каждый сотрудник лаборатории должен использовать одни и те же формы (бланки результатов анализов) для сообщения полученных результатов. Форма бланка должна содержать название лаборатории и медицинский организации; информацию о пациенте, достаточную для его идентификации; название биологического материала и всех исследуемых показателей; дату получения пробы и, если это необходимо, время получения; результаты исследования; референтные интервалы; фамилию и подпись сотрудника, выполнившего исследование. Порядок выдачи результатов должен быть определен инструкцией, утвержденной руководителем медицинской организации. 8. Обеспечение качества выполнения технологии анализа мочи 8.1. Программы обеспечения качества Программы обеспечения качества включают последовательный мониторинг каждого аспекта процедуры для обеспечения гарантии достаточно высоких возможностей диагностики и наблюдения состояния пациента. Программы обеспечения качества должны включать все этапы работы и устанавливать связи между всеми составляющими процесса (пациент, лаборатория, клиницист). Проведение контроля качества лабораторных исследований, заключающегося в тестировании контрольных материалов (внутрилабораторный контроль качества и участие во внешней оценке) является только одним из аспектов обеспечения качества. Контроль необходим и на этапах сбора образца, хранения, доставки, ручной обработки, ведения регистрации, выдачи документов. Нуждается в контроле также и техническая компетентность персонала, непрерывное продолжение образования. Для успешного осуществления всех контрольных мероприятий необходимо следовать правилам, изложенным в стандарте ГОСТ Р ИСО 15189 —2006 «Медицинские лаборатории – частные требования к качеству и компетентности». 8.2. Ведение регистрации контрольных мероприятий Регистрация проведения контроля должна осуществляться на всех уровнях: преаналитическом, аналитическом и постаналитическом, для каждого этапа должны быть разработаны и документированы правила проведения всех процедур. Для клиницистов должна быть разработана форма запроса на исследование, включающая дату назначения и взятия пробы, информацию для идентификации пациента, диагноз, сведения о приеме лекарств или диагностических процедурах, если они могут влиять на результаты исследования. Для персонала, осуществляющего взятие материала, должна быть разработана инструкция, содержащая условия подготовки пациента и процедуру взятия биоматериала. Для пациентов, собирающих материал самостоятельно, составляются памятки. В инструкцию по доставке пробы должны быть включены условия и сроки хранения проб и правила безопасной транспортировки. Для персонала лаборатории должны быть определены критерии для приема и отказа в приеме проб, требования по регистрации пробы, обработке, маркировке и хранению пробы до анализа. Аналитический этап проводится в соответствии с методиками исследований (см. п.8.3.). На постаналитическом этапе необходимо разработать правила оценки приемлемости результатов анализа, которые должны включать аналитическую достоверность по данным внутрилабораторного контроля качества, оценку возможной интерференции лекарственных препаратов, сравнение результатов с референтным интервалом, проверку правильности регистрации. Форма выдачи результатов должна быть утверждена в учреждении и согласована с лечебными отделениями. Регистрация должна также охватывать контрольные материалы и оценку приборов. Необходимо иметь в каждой лаборатории разработанные и отпечатанные процедуры для обнаружения и коррекции ошибок, результатов, выходящих за контрольные пределы. Регистрация, касающаяся реагентных полосок, в журнале или компьютере должна быть доступной на рабочем месте и должна включать: - номер набора реагентных полосок и срок годности; - дату открывания контейнера с полосками (эти сведения должны быть также записаны на контейнере); - все результаты пациентов и контроля качества: - дату и время сбора образцов и поступления в лабораторию: -идентификационные данные сотрудника, который выполняет исследование. 8.3. Инструкции к используемым методикам лабораторных исследований Методика процесса выполнения лабораторных исследований должна быть оформлена в виде документа и быть доступна на рабочем месте. Методика должна быть основана на инструкции к используемому оборудованию и/или к наборам реактивов, методических указаниях или других документах, утвержденных в установленном порядке. Описание методики должно включать: принцип метода, используемые реактивы и приборы, ход исследования, аналитические характеристики метода, калибровочные процедуры. Кроме этого описание должно включать следующую информацию: - процедуру сбора образца и транспортировки; критерии приемлемости или отбрасывания образцов мочи (учитываются продолжительность срока хранения образца после взятия, использование консервантов, достаточное количество мочи для исследования); - информацию о контрольных материалах; процедуры контроля качества; - референтные интервалы; - выходящие за пределы референтных интервалов величины (настораживающие); - подтверждающее исследование; - способ регистрации результатов; - предосторожности, связанные с биологической опасностью исследуемого материала. - причины получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов. 8.4. Контроль качества материалов и оборудования Контроль за качеством материалов и оборудования включает: -правильное хранение реактивов и диагностических полосок, - постоянное тщательное соблюдение сроков годности реактивов и диагностических тест-полосок, что предотвращает использования испорченных или просроченных реактивов и является важной составляющей обеспечения качества; -наличие на рабочем месте инструкции по эксплуатации прибора; - наличие журналав регистрации сервисного обслуживания и ремонта оборудования. 8.5. Внутрилабораторный контроль качества анализа мочи Существует два основных вида контроля качества лабораторных исследований: внутрилабораторный контроль и внешняя оценка качества. Для проведения каждого из них имеется несколько способов. Внутрилабораторный контроль представляет собой систему повседневного слежения за точностью получаемых в лаборатории результатов. 8.5.1.Контроль качества химических исследований. Для химического анализа с использованием реагентных тест-полосок необходим мультикомпонентный контроль на двух различных уровнях для уверенности в надежности результатов. Контроль качества следует проводить каждый день в каждой серии анализов, а также при открывании новой упаковки с реагентными полосками. При смене тест-полосок необходимо тщательно изучать инструкции производителей, так как методики могут варьировать у разных производителей, что может отражаться на времени развития цветовой реакции и интнрпретации полученных результатов. Полоски от разных производителей Гн должны перемешиваться. Рекомендуется параллельное тестирование со старыми и новыми партиями полосок на контрольных материалах и образцах мочи пациентов. Для этих целей используют главным образом коммерческие контрольные материалы. Для контроля воспроизводимости могут быть использованы образцы мочи здоровых людей. П р и м е ч а н и е 1. Полоски от разных производителей используются только при визуальной оценке результатов. При работе на мочевых анализаторах необходимо работать на полосках конкретного производителя или адаптированных к данному анализатору ролосках. Если результаты тест-полосок отличаются от ожидаемых значений, необходимы подтверждающие тесты, которые определяют те же самые вещества с большей чувствительностью или специфичностью, но используют другие реакции, так как повторные реакции с реагентными полосками не являются подтверждающим тестом. Например, при определении белка используется подтверждающий тест с пирогаллоловым красным или сульфосалициловой кислотой. 8.5.1.1. Правила оценки аналитической надежности полуколичественных методов клинических лабораторных исследований мочи. Для полуколичественных методов исследований, при которых результаты выражаются в ординальной шкале, оценка прецизионности может быть выражена как пропорция ожидаемых результатов по принятой их классификации: «отрицательные», «1+», «2+», «3+». Эти пропорции имеют 95% доверительный интервал, рассчитываемый на основе статистических таблиц. При сопоставлении групп с низкой («1+») или среднеповышенной («2+») концентрацией аналитов могут быть получены более точные результаты, чем при сопоставлении с группой с высокой концентрацией («3+»), которая не имеет четко ограниченного верхнего предела. Оценка правильности исследований может быть основана на градациях отрицательных и положительных результатов с установлением порога обнаружения и порога подтверждения (на основе сравнения с результатами, полученными при параллельных исследованиях количественным методом). Приемлемая правильность определений с помощью полуколичественных тест-полосок характеризуется долей ложноположительных результатов на уровне менее 10% при пороге обнаружения и долей ложноотрицательных результатов также на уровне менее 10% при пороге подтверждения. В серой зоне (между порогами обнаружения и подтверждения) доля ложноотрицательных результатов должна сохраняться на уровне меньше 30%. 8.5.2. Контроль качества микроскопических исследований. Контроль качества правильности микроскопических исследований должен выполняться каждый день, когда проводятся исследования. Имеются доступные коммерческие контрольные материалы, содержащие эритроциты и лейкоциты. В качестве контроля воспроизводимости может быть использовано исследование параллельных образцов мочи (дубликатов), что рекомендуется использовать при идентификации цилиндров, почечного эпителия и других форменных элементов. 8.5.2.1. Правила оценки аналитической надежности неколичественных методов клинических лабораторных исследований Требования к аналитической надежности неколичественных методов клинических лабораторных исследований (например, микроскопических исследований мочи) должны разрабатываться с учетом специфики их аналитических принципов, биологических и морфологических характеристик (особенностей) изучаемых компонентов биологических материалов. В отношении визуальных неколичественных методов применяется оценка по частоте обнаружения с их помощью искомых компонентов биоматериалов, включая компоненты, характерные (по своей морфологии, химическому или биологическому сродству с определенными хромофорами, флюорофорами, антителами) для специфических форм патологии, соответствующий вид исследования. задаче диагностики которых предназначен П р и м е ч а н и е 1 – В последнем случае могут применяться критерии диагностической чувствительности и специфичности, применяемые при оценке клинической информативности. При разработке требований к аналитической надежности визуального метода должны использоваться в качестве ориентира результаты исследования образцов биоматериалов, произведенного исследователем, имеющим большой опыт визуального изучения изображений, подтвержденного правильного обнаружения и классификации исследуемых компонентов биоматериалов. 8.6. Внешняя оценка качества Внешняя оценка качества необходима для оценки правильности результатов лабораторных исследований и сопоставимости результатов, полученных в разных лабораториях. Каждая лаборатория должна обязательно участвовать во внешней оценке качества. Специальными организациями, имеющими лицензию на проведение межлабораторной оценки качества выполнения лабораторных исследований, в том числе общего анализа мочи, между лабораториями периодически (несколько раз в год) распределяются контрольные образцы с установленным содержанием химических компонентов для контроля правильности или микрофотографии нативных препаратов осадка мочи. Полученные лабораториями результаты регистрируются и заключения рассылаются участвующим лабораториям для сравнительной оценки правильности выполнения исследования. В случае неудовлетворительной оценки результатов лаборатория должна принимать соответствующие меры для исправления своих ошибок. 8.7. Непрерывное образование специалистов Для обеспечения качества анализа квалификация персонала должна соответствовать сложности выполняемого исследования. Весь персонал лаборатории должен периодически (раз в пять лет) проходить обучение на циклах усовершенствования, которые проводятся медицинскими образовательными учреждениями, имеющими соответствующую лицензию. Еаждый специалист должен заниматься самообразованием. Лаборатория должна иметь доступную для пользования современную литературу, включая периодические издания по лабораторной диагностике и атласы. Специалистам лаборатории необходимо участвовать в конференциях и семинарах. Персонал, выполняющий визуальную оценку реагентных тест-полосок, должен пройти тестирование на различение цветов. Полное микроскопическое исследование должен выполнять только специально обученный персонал, при отсутствии таких специалистов лаборатория может использовать реагентные тест-полоски для получения полуколичественной информации о гематурии, пиурии и бактериурии. 9. Требования к режиму труда и отдыха, диете и ограничениям при подготовке пациента к сбору мочи для проведения анализа мочи На результаты анализа мочи, включающего определение целого ряда химических аналитов, могут влиять разнообразные факторы: физическая нагрузка, прием лекарств и т.д., поэтому условия подготовки пациента к сбору образца мочи должны быть стандартизованы и подробно описаны в соответствующей инструкции для пациента. См. приложение А. 10. Стоимостные характеристики выполнения технологии клинического лабораторного анализа мочи Таблица А1 - Трудозатраты в УЕТ на выполнение сложной медицинской услуги «Анализ мочи общий» . Код Вид исследования Трудозатраты в УЕТ услуги Специалиста со Врача средним клинической образованием лабораторной диагностики, биолога 03.016.06. Анализ мочи общий Регистрация (предварительная и 0,45 окончательная: поступившего материала, паспортных данных пациентов, результатов исследований и т.д.), ручная или на компьютере. Оценка физических свойств мочи 0,15 Химическое исследование с помощью 0,5 реагентных тест-полосок Подготовка препарата для 0,05 провендения микроскопического исследования Микроскопическое исследование 0,5 осадка мочи ПРИЛОЖЕНИЕ А Сбор образцов мочи, условия хранения и доставки (преаналитический этап) А.1 Введение Преаналитический этап проводится в лечебном отделении и после доставки биоматериала в лабораторию – в самой лаборатории. Врачами-клиницистами составляются заявки на исследования. В заявке должны быть указаны ФИО пациента, пол, возраст или год рождения, отмечен способ получения биоматериала (например, взятие мочи катетером), время сбора мочи, порция образца мочи (утренняя, случайная), консерванты (если используются), обязательно должен быть указан клинический диагноз, хотя бы на уровне диагностического предположения и влияющие на анализ лекарственные препараты. Отсутствие в заказе диагноза или принимаемых пациентом лекарств, влияющих на результаты,может привести к неправильной трактовке полученных результатов и ошибке в постановке диагноза. Средний медицинский персонал отделения отвечает за подготовку пациента, правильный сбор материала самим пациентом (при необходимости проводится взятие материала катетером), хранение образца в течение строго определенного времени после сбора и доставку образца мочи в лабораторию. В амбулаторных условиях больной сам собирает мочу дома без наблюдения медицинского персонала, поэтому в каждой лаборатории должны быть составлены специальные инструкции (памятки) для больных, которые пациент обязан неукоснительно соблюдать для обеспечения унифицированных условий сбора материала. Рекомендуется снабжать пациента специальной посудой для сбора образца. Продолжение преаналитического этапа в лаборатории заключается в приеме и регистрации поступившего биоматериала, хранении его при необходимости до исследования, обработке и подготовке к исследованию. Составление клиницистами заявки на анализы является очень важным моментом, так как правильность диагноза во многом зависит от правильно составленной заявки. А.2 Подготовка пациента Подготовка пациента к сбору мочи должна быть стандартизована, для чего необходимо учитывать: время принятия пищи; продолжительность отдыха, положение тела, а также физическую нагрузку перед взятием (предупреждение ортостатической и связанной с физической нагрузкой протеинурии); для некоторых показателей – суточные биоритмы; влияние лекарственных препаратов и токсических факторов. Сбор мочи для общего анализа проводят при обычном пищевом режиме, натощак. Лекарства, мешающие определению тех или иных компонентов (см. приложение Б), должны быть отменены; если это сделать невозможно, врач-клиницист должен отмечать прием этих препаратов в заявке на исследование. В заявке, кроме паспортных данных пациента, должны быть отмечены способ получения (сбора) и порция образца мочи, используемые консерванты, обязательно указывается клинический диагноз, хотя бы на уровне диагностического предположения. Для персонала клинических отделений и пациентов сотрудниками лаборатории должны быть составлены подробные письменные инструкции по сбору образцов мочи, так как не только персонал, но и больные должны понимать и выполнять требования, необходимые для стандартизации взятия образцов мочи и получения правильных результатов. А.3 Виды образцов мочи: - случайный (рандомизированный) образец; - первый утренний образец; - образец суточной мочи (за время, равное 24 часам); - образец, полученный за другое время (например, 10-12 часов, 2-3 часа). Для общего анализа мочи обычно используют утренний или случайный образец. А.4 Сбор образцов мочи для технологии анализа мочи А.4.1 Сбор случайного образца мочи Случайный (рандомизированный) образец может быть собран в любое неустановленное время (используется, например, для химического исследования с помощью диагностических тест-полосок). Рандомизированные образцы обычно собирают для анализа мочи грудных детей, так как невозможно собрать образец за длительный или строго определенный промежуток времени, а также экстренных пациентов. А.4.2 Сбор утреннего образца мочи Для общего анализа обычно собирают утреннюю порцию мочи. Собирают всю порцию мочи натощак сразу после сна (желательно, чтобы предыдущее мочеиспускание было не позже, чем в 2 ч ночи) в сухую, чистую, но не стерильную посуду, при свободном мочеиспускании. Перед сбором мочи проводят тщательный туалет наружных половых органов. Лежачих больных предварительно подмывают слабым раствором марганцевокислого калия, затем промежность вытирают сухим стерильным ватным тампоном в направлении от половых органов к заднему проходу. Собирая мочу у лежачих больных, необходимо следить, чтобы сосуд был расположен выше промежности во избежание загрязнения из области анального отверстия. П р и м е ч а н и е 1 - Катетер или пункция мочевого пузыря могут быть использованы только в крайних случаях — у новорожденных, грудных детей, пациентов с заболеваниями простаты, неврологических больных, которые не контролируют мочеиспускание, иногда — для микробиологических исследований. Из длительно стоящего катетера мочу для исслиседования брать нельзя! П р и м е ч а н и е 2 - При сборе мочи для исследования у грудных и маленьких детей используют специальные мешки с гипоаллергенным кожным адгезивным средством, благодаря которому мешок для сбора мочи плотно прикрепляется к коже, контейнер проверяется каждые 15 мин., собранный образец переливают в сосуд для сбора мочи, маркируют и транспортируют. По возможности надо собирать мочу сразу в посуду, в которой она будет доставлена в лабораторию. Желательно использовать широкогорлый сосуд (размер диаметра горла сосуда - не менее 4 см) вместимостью 50 – 100 мл с крышкой. Сосуд должен иметь широкое основание, чтобы избежать случайного разбрызгивания. Мочу из судна, утки, горшка брать нельзя, так как даже после прополаскивания этих сосудов на стенках может сохраняться осадок фосфатов, способствующих разложению свежей мочи. П р и м е ч а н и е 3 - Если в лабораторию доставляют не всю собранную мочу (например, если количество мочи больше 100 мл), то ее необходимо собирать в сухую чистую посуду и перелить в сосуд, в котором она будет доставлена в лабораторию, тщательно перемешав перед отделением части, чтобы форменные элементы и кристаллы, были равномерно распределены по всему объему. В настоящее время выпускаются специальные разовые контейнеры для сбора мочи объемом 100 мл из небьющегося материала (пластика), инертного по отношению к составным частям мочи, градуированные, с плотно закрывающейся крышкой. Контейнер и крышка не должны содержать веществ, мешающих при химическом определении. Такие контейнеры могут быть частью вакуумной системы для сбора мочи (при необходимости соблюдения стерильности при сборе мочи). Контейнер должен иметь соответствующую маркировку, после сбора на сосуд приклеивается этикетка, которая должна вмещать все необходимые данные о пациенте (полное имя, идентификационный номер, дату и время сбора образца, применение охлаждения или консерванта). Этикетку располагают на контейнере, а не на крышке, чтобы избежать ошибок в идентификации. Собранную мочу как можно быстрее доставляют в лабораторию. Если необходимо транспортировать образцы мочи, используют специальные контейнеры для транспортирования, которые должны быть хорошо закрыты, чтобы избежать вытекания содержимого при транспортировке. Крышка должна легко открываться. П р и м е ч а н и е 4 – после проведения цистоскопии анализ мочи можно назначать не ранее, чем через 5—7 дней. А.5 Хранение образца мочи Длительное хранение мочи при комнатной температуре до исследования приводит к изменению физических свойств, разрушению клеток и размножению бактерий. Моча, собранная для общего анализа, может храниться при комнатной температуре не более 4-х часов, использование охлаждения предотвращает разрушение форменных элементов, но, возможно, влияет на результаты определения относительной плотности. Применение консервантов нежелательно, но допускается, если между мочеиспусканием и исследованием проходит более 4-х часов (несколько кристаллов тимола на 100 мл мочи хорошо сохраняют форменные элементы и не мешает химическим исследованиям). П р и м е ч а н и е 5 – Мешающими факторами при исследовании многих химических компонентов мочи могут оказаться различные посторонние примеси (загрязнение) — бактериальные или химические. Эти примеси могут появляться на разных этапах: — в организме — интерференция лекарств (попадающие в мочу лекарства или их метаболиты могут мешать при химическом определении тех или иных компонентов в моче); — во время мочеиспускания — возможно загрязнение мочи от гениталий (при неправильном сборе мочи), нельзя исследовать мочу во время менструации; – после взятия мочи (недостаточно чистая посуда, неправильное хранение, приводящее к размножению бактерий и распаду структурных элементов) ПРИЛОЖЕНИЕ Б Исследование мочи с помощью диагностических тест-полосок Диагностические тест-полоски для определения в моче одного или нескольких аналитов предназначены для одноразового использования (см. п. 5.5 «Технология выполнения химических исследований мочи, входящих в состав общего анализа мочи, с помощью диагностических тест-полосок»). Лаборатории должны использовать только тест-полоски, разрешенные к применению в установленном порядке и ждо срока годности, указанного на упаковке. Для общего анализа мочи используются полоски, включающие 10 или 11 показателей (п. 4.5.3.), аскорбиновая кислота является 11-тым вспомогательным показателем, так как она влияет на результаты других тестов. Выпускаются также полоски с комбинацией тестов для специальных целей, например, для мониторинга терапии сахарного диабета (глюкоза и кетоновые тела), заболеваний почек и мочевого тракта (лейкоциты, нитриты, pH, глюкоза, белок и кровь), для заболеваний органов гепатобилиарной системы (уробилиноген и билирубин). Эти полоски оцениваются только визуально. Химические методы, используемые в тест-полосках, основаны на цветных реакциях, дающих изменение цвета тестовой зоны полоски. Визуальную оценку проводят по цветной шкале.Результаты тест-полосок, предназначенных для общего анализа мочи, оцениваюся качественно или полуколичественно с помощью отражательного фотометра (см. п. 4.4.3.). Принцип и чувствительность метода, влияние различных факторов, состав реакционной среды, последовательность расположения аналитов у разных производителей полосок могут отличаться. Поэтому перед работой с полосками необходимо внимательно ознакомиться с инструкцией, обращая внимание на каждый определяемый параметр. При проведении исследований необходимо соблюдение указаний инструкции производителя. Перед работой с полосками мочу следует тщательно перемешать. П р и м е ч а н и е 1 - В описании тестов указываются только те влияющие факторы, которые являются общими для большинства полосок. Факторы, влияющие на развитие окраски тестовой зоны, получение ложноположительных или ложноотрицательных результатов при использовании полосок конкретного производителя, подробно указаны в инструкции. Б.1 Относительная плотность Принцип теста. Тест отражает концентрацию ионов в моче. В присутствии катионов протоны освобождаются комплексным реагентом, что приводит к изменению окраски индикатора бромтимолового синего от синей через сине-зеленую к желтой. Тест не учитывает содержание мочевины и глюкозы. Шкала окраски позволяет получить результаты относительной плотности в пределах 1,000—1,030 с интервалом 0,005. Результаты измерения хорошо коррелируют с данными плотности мочи, полученными с помощью рефрактометра. В щелочной моче (при рН 7 и более) показатели плотности бывают заниженны. В этом случае значения плотности, измеренной с помощью полосок, необходимо корректировать в соответствии с рекомендациями, указанными в инструкции (как првило, прибавлять 0,005). Ряд анализаторов коррекцию плотности при высоком рН мочи проводит автоматически. Аскорбиновая кислота также занижает значение плотности. Возможное влияние на плотность белка, кетокислот и глюкозы указано в прилагаемой методике, которую необходимо перед работой внимательно изучить. П р и м е ч а н и е 1 Ограничение интервала измерения плотности 1,000—1,030 не всегда позволяет пользоваться данным методом.. При необходимости плотность может быть измерена урометром. Б.2 pH Принцип теста: реакция мочи определяется с помощью универсального индикатора или смеси индикаторов. В зоне измерения рН наблюдается серия ясных изменений окраски при значениях pH 5-9. Свежевыпущенная моча здоровых людей имеет pH 5—6. Источники ошибок. При длительном хранении образца значение pH мочи увеличивается, моча становится более щелочной из-за контакта с воздухом и увеличения числа бактерий. На результаты реакции влияют дезинфицирующие и моющие средства. Б.3 Белок Принцип теста. Тестовая зона для определения белка на мультитестовой полоске содержит буфер и индикатор, изменяющий окраску в присутствии белка. В качестве индикатора чаще всего используется органический краситель бромфеноловый синий, но могут применяться и другие вещества, например, 3,3,5,5-тетрахлорфенол-3,4,5,6тетрабромсульфофталеин. От индикатора зависит цвет тестовой зоны. Границы чувствительности. Полоски разных производителей имеют разную чувствительность на белок. Стандартная чувствительность для белка составляет 0,15 г/л или 0,3 г/л. Некоторые производители выпускают полоски с высокой чувствительностью для белка - 0,1 г/л. Несмотря на то, что изменение окраски может наступить при концентрации белка в моче 0,06-0,08 г/л, оно расценивается как наличие белка не меньшее, чем чувствительность полоски. Чувствительность не зависит от способа регистрации – приборного или визуального. Содержание белка меньшее, чем чувствительность полоски, не может быть определено, так как отсутствует шкала сравнения. Специфичность. Индикатор особенно чувствителен к альбумину. Концентрация, полученная анализатором или по шкале сравнительной окраски, хорошо коррелирует с концентрацией альбумина в моче, полученной химическими методами. Для глобулинов, миеломного белка Бенс-Джонса и некоторых других белков чувствительность полоски значительно ниже, поэтому эти белки определяются менее эффективно. Результаты анализов пациентов, содержащих белок в концентрации ниже чувствительности полоски, или белок, отличный от альбумина, могут быть оценены либо как отрицательные, либо концентрация белка будет значительно занижена. Поэтому при использовании диагностических полосок при анализе мочи больных с миеломной болезнью, с почечной патологией, а также у беременных женщин рекомендуется проводить качественное определение белка с 20% сульфосалициловой кислотой, а в положительных пробах количественное одним из химических методов. Источники ошибок. Влияющие факторы указаны в инструкции к полоскам. В некоторых пробах ложноположительные результаты могут быть получены во время или после вливания кровезаменителя поливинилпирролидона, при приеме лекарств, содержащих хинины или хинолины; при наличии остатков дезинфицирующих средств. Красноватая окраска тестовой области может наблюдаться после лечения феназопиридином. Оценка результатов зависит от чувствительности полоски и используемого индикатора, поэтому может отличаться у разных производителей. Первая положительная окраска на белок соответствует чувствительности полоски, то есть первому окну с положительным результатом на цветной шкале или первому определяемому значению на анализаторе мочи. Более низкие концентрации тест не улавливает. Считывание результата анализатором проходит в стандартном режиме. Время экспозиции при визуальной оценке указано в методике анализа, обычно оно соответствует 60 сек. Окраска, не достигающая уровня чувствительности, и анализатором, и визуально оценивается как “отрицательный результат”, даже если он не соответствует строго “отрицательному” значению. Небольшое количество белка может выявляться у здоровых людей как вариант физиологических значений. Белок может появляться в небольшом количестве у пациентов на белковой диете, после парной и у женщин в предменструальном периоде. Б.4 Лейкоциты Принцип. Тест-зона для определения лейкоцитов содержит индоксилэфир, который выявляет эстеразу гранулоцитов. Индоксил запускает реакцию с солью диазония, при этом тест-зона меняет бежевую окраску на фиолетовую. Специфичность. Тест обнаруживает эстеразную активность в гранулоцитах и макрофагах, которые появляются при хронических воспалениях. Этим тестом могут быть обнаружены как целые, так и разрушенные лейкоциты, которые не могут быть идентифицированы при микроскопическом исследовании. Особенно актуальна оценка разрушенных лейкоцитов в щелочной моче, где разрушаются эритроциты, лейкоциты и растворяются цилиндры. Источники ошибок. Влияющие факторы указаны в методике анализа. В образцах мочи с интенсивной окраской за счет билирубина или нитрофуранов, может быть неспецифическое изменение окраски в тест-зоне. Консерванты могут влиять на результаты теста (например, формалин и формальдегид дают ложноположительные результаты). Оценка. Первый положительный результат, полученный на анализаторе или цветной шкале, показывает концентрацию приблизительно 10—25 лейкоцитов в мкл (10000 – 25000 лейкоцитов в мл). Далее результаты распределяются в соответствии с особенностями полосок. Результаты анализатора или цветной шкалы представляют собой средние величины, полученные в счетной камере при проведении калибровки метода. При наличии сомнительных значений, которые не могут быть четко классифицированы как “негативный” или первый позитивный результат при проведении анализа в стандартном режиме, необходимо провести повторную оценку зоны теста в более поздние сроки, которые указаны в методике анализа (обычно 90 или 120 сек). Какие-либо последующие изменения окраски не учитываются. При высоких концентрациях лейкоцитов (более 500 лейкоцитов в мкл) количество лейкоцитов не может быть идентифицировано. Если при первичном исследовании в моче пациента находят 10—25 лейкоцитов в мкл, то есть первый положительный результат, тест должен быть повторен в свежесобранном образце мочи. П р и м е ч а н и е 1. Эстераза, как и другие протеиназы, разрушает белки соединительной ткани, поэтому организм продуцирует большое количество различных ингибиторов протеиназ. Выраженная экскреция ингибиторов с мочой может быть причиной отрицательного результата теста на лейкоциты. Ингибиторы мочи могут быть как эндогенного (образуются в организме), так и экзогенного (например, лекарства) происхождения. Б.5 Нитриты. Определение нитритов - скрининговый тест на скрытую бактериурию, так как большинство бактерий восстанавливают нитраты в нитриты. Положительная реакция диагностических полосок обнаружена в 90% случаев всех инфекционных заболеваний мочевых путей. Нитрат-восстанавливающей способностью обладает большинство бактерий, вызывающих воспалительные процессы в почках и мочевыводящих путях (кишечная палочка, протей, сальмонеллы и др.). Принцип. Ароматические амины сульфаниламидов реагируют с нитритами в кислой среде с образованием соли диазония, которая при взаимодействии с индикатором изменяет цвет тестовой зоны полоски. Чувствительность теста соответствует содержанию около 105 бактерий/мл, что соответствует 0,8 мг/л нитритов. Положительная реакция приводит к изменению окраски тестовой зоны от белой через слабо розовую до ярко розовой или красной. Специфичность. Тест специфичен для нитритов. Источники ошибок. Влияющие факторы указаны в методике анализа. Ложноположительные результаты могут быть получены при длительном хранении мочи в теплом месте из-за экзогенного размножения бактерий. Для протекания реакции восстановления нитратов в нитриты необходимо наличие нитратов в моче, бактерий, восстанавливающих нитраты, и промежутка времени, достаточного для протекания реакции превращения нитратов в нитриты. Поэтому при наличии нитрит-образующих бактерий ложноотрицательные результаты могут быть получены при малом сроке нахождения мочи в мочевом пузыре, при отсутствии или низком содержании нитратов в моче на фоне голодания, при отсутствии овощей в диете или при парентеральном питании. Ложноотрицательные результаты также могут быть связаны с присутствием нитрит-превращающих микроорганизмов в моче. При ложноотрицательном результате подтверждением бактериального поражения может служить тест на лейкоциты. Для получения достоверных результатов используют либо утреннюю порцию мочи, либо мочу, собранную после 4-х часового перерыва. Исследование должно проводиться в течение 4-х часов. За 3 дня до анализа необходимо отменить антибиотики и препараты аскорбиновой кислоты. Оценка. Любая степень изменения окраски на розовую расценивается как положительная. Отсутствие изменения окраски при однократном тестировании не исключает наличия инфекции из-за колебания содержания нитритов в моче. В этих случаях необходим повторный анализ. П р и м е ч а н и е 3 –Некоторые виды бактерий (стрептококки, псевдомонады, нейсерии и др.) не обладают способностью восстанавливать нитраты и нитритов не образуют. Б.6 Кровь Принцип метода. Гемоглобин и миоглобин, обладая пероксидазными свойствами, расщепляют импрегнированный в тестовую зону субстрат с образованием перекиси водорода, которая распадается на воду и атомарный кислород. Последний окисляет индикатор (производное соединение бензидина либо какой-то другой) с образованием окрашенного вещества. Интенсивность окраски зависит от количества пигмента, а цвет реакционной зоны - от используемого индикатора. Тест позволяет выявить эритроциты, гемоглобин и миоглобин. Неповрежденные эритроциты лизируются, освобожденный гемоглобин вступает в реакцию, вызывая точечное изменение окраски. Гемоглобин и миоглобин равномерно меняют окраску всей тестовой зоны. Реакция более чувствительна к гемоглобину и миоглобину, чем к эритроцитам. Чувствительность тестовой зоны мультитестовых полосок к присутствию крови в моче зависит от типа полосок и составляет от 5 до 20 эритроцитов/мкл. Предел чувствительности — 5 эритроцитов в мкл (5000/мл). Для высокочувствительных тестов чувствительность теста близка к пределу физиологической гематурии. Подробнее чувствительность и пределы обнаружения указаны в инструкции. Специфичность. Тест специфичен к гемоглобину и миоглобину. На результат не влияют другие клеточные составляющие. Источники ошибок. К ложноотрицательным или заниженным результатам может привести высокое содержание аскорбиновой кислоты, высокое содержание белка и полное отсутствие гемолиза эритроцитов. В последнем случае проба может быть отрицательной при наличии эритроцитов в осадке мочи. В некоторых видах полосок реагентная область импрегнирована йодатной смесью, которая окисляет аскорбиновую кислоту, так что даже ее высокие концентрации в моче не отражаются на результате. К ложноположительным результатам могут приводить остатки окислителей, содержащих хлор. Более подробно влияющие факторы указаны в инструкции к полоскам. Оценка. На цветной шкале имеются отдельные зоны оценки для гемоглобина и эритроцитов. Эритроциты: точечная или компактная окраска на тест-полоске указывает на неизмененные эритроциты. Интервалы концентраций, необходимые для интерпретации результатов, полученных при использовании данного вида полосок, указаны в инструкции. При высокой концентрации эритроцитов область теста может иметь однородный темный цвет, окраска которого выходит за пределы определяемых значений. В этом случае требуется разведение образца в 10 или 100 раз 0,9% раствором хлорида натрия и последующее повторения теста. Гемоглобин. Гомогенная окраска тестовой зоны указывает на наличие свободного гемоглобина, гемоглобина из лизированных или измененных эритроцитов и миоглобина. Различить гемоглобин и миоглобин данным методом невозможно. Интервалы концентраций, необходимые для интерпретации результатов, полученных при использовании данного вида полосок, указаны в инструкции. Более слабая окраска, чем первый положительный результат, свидетельствует о необходимости повторного анализа и может быть связана с отсутствием гемолиза эритроцитов. Гемолиз эритроцитов является необходимым условием для протекания цветной реакции, так как гемоглобин, который находится внутри эритроцита, в химическую реакцию не вступает. При частичном гемолизе эритроцитов одновременно появляется диффузное и точечное окрашивание. П р и м е ч а н и е 1. Неизмененные эритроциты – это обычные эритроциты, содержащие гемоглобин. Измененные эритроциты – это эритроциты, утратившие гемоголобин, которые встречаются, как правило, в кислой моче. Лизированные эритроциты – это разрушенные эритроциты. Гемолиз процесс разрушения эритроцитов. Сравнение с микроскопическим исследованием осадка. При сравнении результатов теста с микроскопическим исследованием осадка необходимо обратить внимание на следующие моменты: 1. Полоска определяет неизмененные, а по гемоглобину измененные и разрушенные эритроциты. Поэтому при анализе щелочной мочи, в которой эритроциты разрушаются и не могут быть выявлены при микроскопии, по гемоглобину можно выявить присутствие эритроцитов. 2. При наличии измененных эритроцитов тестовая зона полоски покажет гемоглобин. 3. Данным методом выявляются только эритроциты, которые при микроскопии необходимо дифференцировать с бластоспорами и оксалатами овоидной формы. Некоторое несоответствие результатов, полученных при использовании полосок и при микроскопии, может быть связано с невыполнением стандартных условий получения осадка мочи (режим центрифугирования, объем мочи для осадка) и приготовлением препарата для микроскопии. Б.7 Глюкоза Принцип теста. Определение глюкозы основано на глюкозооксидазной реакции. D-глюкоза при участии фермента специфической глюкозоксидазы превращается в глюконовую кислоту с образованием перекиси водорода, которая в присутствии пероксидазы окисляет индикатор с образованием окрашенного соединения. Цвет реакционной полоски зависит от используемого индикатора. Чувствительность метода. Как правило, чувствительность полосок соответствует 23 ммоль/л и превышает границы физиологической концентрации, которая составляет от 0,12 до 1,8 ммоль/л. Высокая чувствительность полосок, с одной стороны, позволяет определить даже небольшую глюкозурию с большой степенью надежности, с другой стороны, при физиологической концентрации глюкозы будет получен отрицательный результат. Полуколичественное измерение концентрации находится в пределах от 2-3-х до 55-60 ммоль/л в зависимости от используемых полосок. Таким образом, концентрация глюкозы может быть измерена в широком диапазоне. Точные значения чувствительности полосок и границы измерения указаны в инструкции. Источники ошибок. Регистрация пониженных или отрицательных результатов может наблюдаться при высоком содержании аскорбиновой кислоты. Ложноположительные результаты могут быть вызваны остатками в посуде для сбора мочи перекиси водорода или окислителей, содержащих хлор. Оценка. Концентрация, соответствующая первому положительному результату, и интервалы для определяемых концентраций зависят от вида полосок и указаны в инструкции. Б.8 Кетоновые тела Принцип. Определение кетоновых тел основано на реакции Легаля. Ацетоуксусная кислота и ацетон реагируют с нитропруссидом натрия в щелочной среде с образованием комплекса, окрашенного в фиолетовый цвет. -оксимасляная кислота с нитропруссидом натрия не реагирует. Чувствительность. Тест в 10 раз чувствительнее к ацетоуксусной кислоте, чем к ацетону. Границы чувствительности для ацетоуксусной кислоты обычно составляют 0,5 ммоль/л (5 мг/100 мл). Источники ошибок. Каптоприл (2-меркаптоэтансульфонат натрия) и другие вещества, содержащие свободные сульфгидрильные группы, могут давать ложноположительные результаты. Перечень влияющих факторов указан в инструкции к полоскам. Некоторые соединения, например, фенилкетоны и фталеины, вызывают развитие красной окраски, которая отличается от фиолетового цвета, характерного для ацетона и ацетоуксусной кислоты. Оценка. У здоровых людей концентрация кетоновых тел, выявленных реакцией Легаля, не превышает 0,5 ммоль/л. Повышение уровня кетоновых тел приводит к появлению фиолетовой окраски. Интенсивность цвета увеличивается с увеличением концентрации. Пределы измерений и интерпретация результатов в соответствии с цветной шкалой приводятся в инструкции к полоскам. Б.9 Билирубин Принцип. Тест основан диазореакции. При взаимодействии билирубина с солью диазония в кислой среде образуется окрашенный комплекс, интенсивность цвета которого увеличивается с увеличением концентрации билирубина. Цвет окрашенного соединения зависит от используемого индикатора. Чувствительность. Практически чувствительность составляет около 9 мкмоль/л (0,5 мг/100 мл) билирубина. Более низкая концентрация билирубина может быть выявлена с относительно низкой вероятностью. Источники ошибок. Проба может быть ложноотрицательная при наличии в моче больших количеств аскорбиновой кислоты, нитритов или мочевой кислоты, при длительном хранении мочи на свету, так свет вызывает разрушение билирубина. Ложноположительные результаты могут быть вызваны лекарственными препаратами, окрашивающими мочу в красный цвет или дающими красную окраску в кислой среде (феназопиридин), а также при высоком содержании уробилиногена. Оценка. Пределы измерений и интерпретация результатов в соответствии с цветной шкалой приводятся в инструкции к полоскам. Даже легкое окрашивание является положительным результатом. Компоненты мочи, вызывающие интенсивную желтую окраску, могут изменить оттенок окрашивания. Б.10 Уробилиноген Принцип. Определение уробилиногена мультитестовых полосок основано на диазореакции со стабильной солью диазония в кислой среде. Цвет окрашенного соединения зависит от используемого индикатора. Интенсивность окраски соответствует концентрации уробилиногена. П р и м е ч а н и е 1.В моче человека могут присутствовать два производных билирубина (уробилиноида): стеркобилиноген и уробилиноген. У здорового человека содержится стеркобилиноген. При заболеваниях печени нарушается превращение уробилиногена в пирролы, и он появляется в моче. По химической структуре оба соединения очень близки, их невозможно дифференцировать с помощью обычных химических методов, поэтому цветная реакция выявляет оба соединения, но по традиции в диагностических полосках они называются уробилиногеном. Чувствительность зависит от используемых полосок и указана в инструкции, также как и пределы измерений. Физиологический предел концентраций составляет от 5 до 17 мкмоль/л (1 мг/100 мл). Сравнение цветов позволяет различить норму и патологию. Специфичность. Тест основан на реакции, специфичной для уробилиногена. На нее не влияют другие вещества, которые реагируют с диазосоединениями, а также факторы, интерферирующие в реакции Эрлиха. Тест позволяет дифференцировать физиологическую и патологическую уробилиногенурию, но не может быть применен для доказательства полного отсутствия уробилиногена. Источники ошибок. Ложноотрицательные результаты могут быть получены при длительном хранении мочи, особенно при действии солнечного света. Реакция замедляется в присутствии больших количеств формальдегида. Ложноположительные результаты могут быть получены при использовании некоторых лекарств, например, феназопиридина. Более подробно влияющие факторы указаны в инструкции к полоскам. Большое количество билирубина может вызвать появление сине-зеленой окраски вследствие образования биливердина. Оценка. Пределы измерений и интерпретация результатов в соответствии с цветной шкалой приводятся в инструкции к полоскам. Более высокие уровни уробилиногена наблюдаются после приема богатой углеводами пищи. ПРИЛОЖЕНИЕ В Подтверждение результатов, полученных с помощью тест -полосок, другими методами: определение относительной плотности урометром, белка и глюкозы -химическими методами В.1 Измерение относительной плотности мочи с помощью урометра. Относительная плотность есть отношение массы образца мочи к массе равного объема дистиллированной воды при той же температуре. Отношение выражается числовыми значениями; нормальные значения: 1.003 – 1.035. Относительная плотность мочи зависит от концентрации растворенных в ней веществ (мочевины, солей натрия, белка, глюкозы и др.). П р и м е ч а н и е 1. При измерении тест-полосками неионизированные вещества (глюкоза, рентгеноконтрастные вещества) не влияют на результаты, тат как принцип измерения основан на зависимости относительной плотности от ионной концентрации. Для определения относительной плотности используют урометры (комбинированные ареометры) с диапазоном шкалы от 0.001 до 1.050. При использовании урометра необходимо, чтобы он плавал в контейнере (цилиндре) и при этом не касался стенок, что требует достаточно широкого контейнера и относительно большого количества мочи. На определение относительной плотности урометром влияет температура, при которой производится измерение. Урометры градуированы для измерения при строго определенной температуре (15°, 20°, 22°С), обозначенной на приборе. Любое отклонение от этой температуры приводит к изменению объема и, следовательно, концентрации растворенных веществ и относительной плотности. При температуре, выше указанной, объем мочи увеличивается, концентрация и относительная плотность снижается, падение температуры приводит к обратному эффекту. При перемене температуры на три градуса относительная плотность изменяется на 0,001. Присутствие белка и глюкозы повышает относительную плотность: каждые 3 г/л белка дает повышение на 0.001, каждые 10 г/л глюкозы – на 0.004. В.2 Измерение концентрации белка в моче химическими методами. Измерение концентрации белка в моче химическими методами проводится в надосадочной жидкости (супернатанте) после центрифугирования мочи в стандартном режиме (1500 об/мин 10 мин). В.2.1.Референтным методом измерения концентрации белка в моче является биуретовый метод, который выявляет полипептидные связи и не зависит от аминокислотного состава белка. Он с одинаковой эффективностью определяет альбумины, глобулины и другие белки. В связи с низкой чувствительностью метода определение белка в моче требует проведения осаждения и концентрирования белка, поэтому из-за большой трудоемкости метод в лаборатории практически не используется. В качестве химических методов рекомендуется исследование белка в моче с сульфосалициловой кислотой (ССК) и пирогаллоловым красным (ПГК). В.2.2.Измерение концентрации белка в моче с сульфосалициловой кислотой. Принцип метода: при взаимодействии белка мочи с ССК происходит денатурация белка и образование преципитатов, которое приводит к помутнению раствора. Степень помутнения условно пропорциональна содержанию белка в растворе. Качественное исследование белка с ССК. Реактивы: 20% раствор сульфосалициловой кислоты. Ход определения: в 2 пробирки наливают около 3-х мл супернатанта мочи. В опытную пробирку добавляют 6-8 капель реактива. На темном фоне сравнивают опытную пробирку с пробиркой, содержащей интактную мочу (бланком). Помутнение в опытной пробирке указывает на наличие белка, проба считается положительной. П р и м е ч а н и е 1: При щелочной реакции порцию мочи для исследования подкисляют 2-3 каплями слабой уксусной кислоты. Количественное исследование белка с ССК. Реактивы: 3% раствор ССК, 0,9% раствор хлорида натрия (физраствор), 1% раствор стандарта белка. Оборудование: фотометр, автоматические пипетки, пробирки. Ход определения: к 1 мл мочи добавляют 3 мл 3% ССК, перемешивают и инкубируют 10 мин. Время инкубации отмечают по первой пробе. В качестве бланка используется проба мочи с физиологическим раствором. Бланк ставится отдельно для каждого пациента (бланк образца). По окончании срока инкубации измеряют абсорбцию опытной пробы против бланка при длине волны 590-650 нм. Определение концентрации проводят по калибровочному графику или по таблице, составленной в соответствии с графиком. Калибровочный график. Для построения графика готовят разведения 1% стандартного раствора белка физиологическим раствором до конечной концентрации 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 и 1 г/л. Каждое из разведений проводят через методику анализа аналогично пробе мочи. По результатам анализа чертят калибровочный график в координатах абсорбция (ось ординат) – концентрация (ось абсцисс). Линейность метода сохраняется до 1 г/л. При концентрациях белка выше предела линейности пробу мочи разводят физраствором в 5-10 раз и результат измерения умножают на разведение. Референтные пределы 0,01-0,140 г/л (по Н.У. Тицу, 1997). П р и м е ч а н и е 2: В качестве стандарта может быть использован альбумин и белок, состоящий из смеси альбумина и глобулина. Использование смешанного белка в качестве стандарта повышает надежность результатов. П р и м е ч а н и е 3. В России производятся готовые наборы для определения концентрации белка с ССК. Источники ошибок. Ложноположительные результаты могут быть получены при наличии в моче йод-контрастных веществ, большого количества пенициллина и сульфаниламидов, высокой концентрации мочевой кислоты. К недостаткам метода относится низкая устойчивость преципитата, сложная нелинейная зависимость абсорбции от концентрации белка, существенные различия в белковом составе калибратора и пробы мочи, неполная преципитация ряда белков анализируемой пробы, что приводит к получению заниженных результатов. Проба с ССК привлекательна исключительно по своей простоте и низкой себестоимости. В.2.3 Количественное определение белка с пирогаллоловым красным (ПГК) Принцип метода: при связывании белка с органическим красителем пирогаллоловым красным в кислой среде образуется окрашенный комплекс, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию белка в пробе. Комплекс устойчив к воздействию многих соединений, в том числе лекарственных препаратов, солей, оснований, кислот. Реактивы. Для определения белка используют готовые наборы реактивов, которые выпускаются различными производителями. Стандартный раствор белка входит в состав набора. Ход определения указан в методике анализа. Измерение абсорбции проводится при длине волны 600 нм. Абсорбция остается стабильной при температуре измерения от 25 до 370С как минимум в течение 30 мин после окончания химической реакции. Линейность метода достигает 4-х г/л белка, а чувствительность составляет 0,03-0,04 г/л. Метод отличает хорошая воспроизводимость результатов, простота и удобство исполнения. Оборудование: фотометр, автоматические пипетки. П р и м е ч а н и е 4. Краситель ПГК не сорбируется на стенках кювет до концентрации белка 5 г/л, поэтому метод используется для измерения концентрации белка на автоматических биохимических анализаторах. Референтные пределы 0, 024 -0,141 г/сутки (по Н.У. Тицу, 1997). Специфичность. Метод наиболее чувствителен к альбумину, однако его чувствительность к глобулину и миеломному белку находится в пределах 70% по сравнению с альбумином. Использование в качестве стандарта смешанного белка снижает возможную погрешность в определении. Источники ошибок. Возможные источники ошибок и влияющие факторы указаны в методике анализа. Вещества, присутствующие в моче, дают суммарную ошибку определения около 2%. В..3 Определение глюкозы химическими методами Для определения глюкозы используют глюкозооксидазный метод, основанный на окислении глюкозы глюкозооксидазой с образованием перекиси водорода, которая под действием пероксидазы окисляет ортотолидин или другое вещество, например, фенолфталеин, с образованием окраски, интенсивность которой измеряется фотометрически. Имеются готовые наборы реактивов для выполнения химических методов, необходимо тщательно изучать инструкцию и точно ей следовать. Концентрацию глюкозы в моче можно определять также гексокиназным методом с использованием готовых наборов реактивов и на анализаторе глюкозы, пригодном для определения концентрациинлюкозы в моче. Библиография 1.Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации № 380 от 25 декабря 1997 г. «О состоянии и мерах по совершенствованию лабораторного обеспечения диагностики и лечения пациентов в учреждениях здравоохранения Российской Федерации». 2.«Инструкция по мерам профилактики распространения инфекционных заболеваний при работе в клинико-диагностических лабораториях лечебнопрофилактических учреждений». Москва, 1991. 3.«Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений». СанПиН 2.1.1.728-99., Москва, 1999 г.