Образование персистеров у штамма Escherichia coli 4S Мелешенко А. А., Рюмина Е. Д. Научный руководитель: к. б. н. Летаров А. В. Персистеры: Сохраняют жизнеспособность при обработке антибактериальными препаратами. Метаболически не активны. Обеспечивают выживание культуры при обработке антибиотиком. Цели: Определить факторы, способствующие появлению персистеров в культуре E. coli 4S. Определить факторы, влияющие на выход клеток из состояния персистентности. Задачи: Экспериментально подтвердить наличие персистеров в культуре E.coli 4S. Установить время, за которое под воздействием ампицилина гибнут все клетки, кроме персистеров. Определить, зависит ли образование персистеров от фазы роста культуры. Мы использовали: Ампициллин – антибиотик β-лактамного ряда. Он препятствует образованию клеточной стенки и, следовательно, делению клеток. Поэтому нам важно, чтобы в момент добавления антибиотика клетки находились в состоянии активного деления. Мы выбрали его, потому что он обладает бактерицидным действием, легко отмывается, не вызывает мутаций и лизирует клетки, что облегчает выделение персистеров из культуры. Концентрация, которую мы использовали -100мг/л. Культура E. сoli (штамм 4S). Чашки Петри с питательной средой (агар-агар). Питательный бульон, физ. раствор. Прибор, для измерения оптической плотности. Методы. Серийное разведение: Какое-то количество изначальной культуры разводят в физ. растворе, то же самое делают с получившимся раствором. И так нужное кол-во раз. Посев шпателем: Эксперимент 1 Кривая гибели Схема эксперимента: Подготавливают ночную культуру (культуры сеют в пробирки с бульоном и ставят в качалку на ночь (250 об/мин, 37 градусов)). В пробирки с бульоном добавляют ночную культуру, ставят в качалку на 1-2ч (чтобы культура начала расти). Высевают соответствующее разведение культуры на чашку (точка "0") и добавляют ампициллин. Высевают культуры на чашки через определенные промежутки времени. Считают колонии. Результаты: кривая гибели состоит из двух ярко выраженных фаз: фазы быстрой гибели и плато, где скорость гибели гораздо меньше. Вторая фаза наступает через 3-4 часа после добавления антибиотика (при условии, что культура находилась в стадии активного деления). Предположительно, это плато образуют персистеры. Выводы: в культуре есть клетки, которые толерантны к антибиотику. При этом они не могут расти в присутствии антибиотика. Гипотеза Это медленно растущие клетки. Эксперимент 2 Кривая роста. Сравнение скорости роста исходной культуры и культуры, полученной из предпологаемых персистеров. Схема эксперимента: Изначальную культуру и культуру с точки 3ч кривой гибели посеяли в пробирку с бульоном, поставили на ночь в качалку. Утром развели. Через некоторые промежутки времени измеряли оптическую плотность. Результаты: культуры растут одинаково. Гипотеза: Это резистентные клетки. Эксперимент 3 Кривая гибели Схема эксперимента: Колонии с чашек из точки 0 (исходная культура) и точки 3 ч (предположительно персистеры) посеяли в бульон. Когда они выросли, добавили ампицилин. Построили кривую гибели. Результаты: клетки культур гибнут одинаково. Вывод: толерантные к ампициллину клетки, полученные в результате первого эксперимента, растут и умирают также, как и обычные клетки => это не резистентные клетки и не медленно растущие мутанты=> это персистеры. Гипотеза: образование персистеров связано с фазой роста культуры. Допустим, они образуются на стационарной фазе (что было бы логично, т. к. на этой фазе замедляется рост культуры). Эксперимент 4 Схема эксперимента: Посадили ночную культуру. Утром развели ее в 20 и 1000 раз (по 2 повторности). Поставили кривую гибели. Результаты: клеток в культуре 1:20 примерно в 35 раз больше, чем в культуре 1:1000, что не соответствует разнице разведений (в одной культуре клеток в 50 раз больше, чем в другой). Эксперимент 5 Log фаза Схема эксперимента: Ставим культуру расти на ночь Разводим в 100 раз и оставляем расти на 3 ч Повторяем то же самое N раз После N-ого раза добавляем антибиотик Строим кривую гибели Результаты: клеток в культуре 1:20 примерно в 40 раз больше, чем в пересеваемой (1 раз) культуре. Что опять больше, чем предположительное кол-во персистеров, если бы они не образовывались бы на логорифмической фазе. Вывод: видимо, существуют два типа персистеров (образующиеся на стационарной и логорифмической фазах) с разной скоростью активации. Персистеров, образующихся на логарифмической фазе, меньше, и они активируются быстрее. Планы Изучить зависимость образования персистеров от антибиотика. Изучить взаимодействие персистеров и фага. Исследовать воздействие различных факторов на активацию персистеров (t0 и др.)