На правах рукописи Талицкий Константин Александрович Циркулирующие эндотелиальные клетки-предшественники и коллатеральный
реклама
На правах рукописи Талицкий Константин Александрович Циркулирующие эндотелиальные клетки-предшественники и коллатеральный ангиогенез при хронической ишемической болезни сердца и ишемии нижних конечностей. 14.01.05 – «Кардиология» 03.03.04 – «Клеточная биология, цитология, гистология» Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Москва 2012 г. Работа выполнена: в отделе ангиологии Института клинической кардиологии им. А.Л.Мясникова и в лаборатории ангиогенеза НИИ экспериментальной кардиологии ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ РФ. Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Карпов Юрий Александрович, доктор медицинских наук, профессор Парфенова Елена Викторовна. Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Сидоренко Борис Алексеевич, заведующий кафедрой кардиологии и общей терапии (с курсом нефрологии) ФГБУ «Учебно-научный медицинский центр» УД Президента РФ, доктор медицинских наук, профессор Тарарак Эдуард Михайлович, заведующий отделом клеточной биологии НИИ экспериментальной кардиологии ФГБУ РКНПК МЗ РФ. Ведущая организация: ГБОУ ВПО Первый Московский Государственный Медицинский Университет им. И.М.Сеченова МЗ и СР РФ Защита состоится «01» ноября 2012 г. на заседании диссертационного совета Д 208.073.04 по присуждению ученой степени кандидата медицинских наук в ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ РФ (121552 Москва, ул. 3-я Черепковская, д. 15а). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РНКПК» МЗ РФ. Автореферат разослан ______________________ к.м.н. Ученый секретарь диссертационного совета 2 Т.Ю. Полевая СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ CCS – Канадское кардиологическое общество CD – коллатеральный индекс CS – индекс коллатерального сопротивления G-CSF – гранулоцитарный колониестимулирующий фактор M – выборочное среднее p – уровень значимости SD – стандартное отклонение SE – стандартная ошибка NYHA – Нью-Йоркская Ассоциация сердца VEGF – фактор роста сосудистого эндотелия АГ – артериальная гипертония АД - артериальное давление АПС – аорто-подвздошный сегмент АПФ – ангиотензин-превращающий фермент БАБ – бета-адреноблокаторы БКК – блокаторы кальциевых каналов БРА – блокаторы рецепторов ангиотензина II ВПА – внутренняя подвздошная артерия вчСРБ – высокочувствительный С-реактивный белок ГБА – глубокая артерия бедра ДАД - диастолическое артериальное давление ДББХ – дистанция безболевой ходьбы ЗББА – задняя большеберцовая артерия ИБС – ишемическая болезнь сердца ИМ – инфаркт миокарда ИМТ - индекс массы тела КА – коронарные артерии КАГ - коронароангиография кДНК –кодирующая дезоксирибонуклеиновая кислота КШ – коронарное шунтирование 3 ЛДФ – лазерная допплеровская флоуметрия ЛПИ – лодыжечно-плечевой индекс МДХ – максимальная дистанция ходьбы МРТ – магнитно-резонансная томография НПА – наружная подвздошная артерия ПБА – поверхностная бедренная артерия ПББА – передняя большеберцовая артерия ПХ – перемежающаяся хромота САД - систолическое артериальное давление СКФ – скорость клубочковой фильтрации ССО - сердечно - сосудистые осложнения ТБКА – транслюминальная баллонная коронарная ангиопластика ТсрО2 – транскутанное напряжение кислорода УЗДГ – ультразвуковая допплерография УЗИ - ультразвуковое исследование ФК – функциональный класс ФР – факторы риска ХИНК – хроническая ишемия нижних конечностей ХПН – хроническая почечная недостаточность ХСН – хроническая сердечная недостаточность ЭКГ - электрокардиография ЭКП – эндотелиальные клетки-предшественники 4 Общая характеристика работы. Актуальность проблемы. Эндотелиальные клетки – предшественники (ЭКП) представляют собой популяцию прогениторных клеток, выделяемых из крови и костного мозга, которые экспрессируют поверхностные маркеры, специфичные как для незрелых гематопоэтических клеток, так и для эндотелия, и дифференцируются в клетки эндотелиальной линии. В многочисленных экспериментальных работах было показано активное участие ЭКП в процессах васкулогенеза, ангиогенеза и артериогенеза, а также в репарации эндотелия. Тем не менее, клиническое значение этих экспериментально выявленных механизмов остается во многом неизученным. При сердечно-сосудистых заболеваниях уменьшается количество ЭКП в крови, снижается их жизнеспособность и функциональная активность (Urbich, Dimmeler, 2005). Низкий уровень циркулирующих ЭКП является независимым фактором риска сердечно-сосудистых осложнений, что может отражать недостаточность репарации эндотелия (Schmidt-Lucke et al., 2005). В то же время, связь циркулирующих ЭКП и процессов ангиогенеза в клинических условиях изучена недостаточно. Снижение количества ЭКП в периферической крови и их функциональной активности в экспериментальных работах ассоциируется с ослаблением компенсаторного ангио-артериогенеза (коллатерального ангиогенеза) в ответ на ишемию (Urbich, Dimmeler, 2004), что может иметь определенное клиническое значение. Так, при ИБС коллатеральный ангиогенез оказывает влияние на прогноз, о чем свидетельствует обратная связь между развитием коронарных коллатералей и риском сердечно-сосудистых осложнений (Choi et al., 2005; Meier et al., 2007). Плохое развитие коронарных коллатералей наблюдается при повышенном уровне С-реактивного белка (Gulec et al., 2006), гомоцистеина (Yang et al., 2006), оксидативном стрессе (Demirbag et al., 2006), почечной недостаточности (Sezer et al., 2006); содержание ЭКП в крови при этих состояниях также снижено (Callaghan et al., 2005; Chen et al., 2004; van Grevenynghe et al., 2006; Verma et al., 2004). При ишемических поражениях у человека компенсаторный коллатеральный ангиогенез обычно оказывается недостаточным для сохранения адекватной перфузии. Терапевтический ангиогенез - стимуляция роста новых сосудов в ишемизированных тканях с помощью ангиогенных факторов роста, их генов или стволовых и прогениторных 5 клеток - рассматривается как перспективный метод лечения пациентов с тяжелой ишемией нижних конечностей, который позволяет улучшить перфузию ткани, уменьшить ишемические симптомы и в ряде случаев предотвратить ампутацию. Несмотря на многочисленные завершенные исследования I-II фаз по терапевтическому ангиогенезу, факторы, определяющие эффективность терапевтического ангиогенеза у больного, остаются неясными. При ХИНК, так же как и при ИБС, отмечается существенное уменьшение количества циркулирующих ЭКП со снижением их жизнеспособности и функциональной активности (Yamamoto et al., 2004), что может оказывать влияние на эффективность терапевтического ангиогенеза у этой категории больных (De Vriese et al., 2008). Вместе с тем, на сегодняшний день остается неясным, какая из популяций прогениторных клеток вносит основной вклад в развитие лечебного эффекта при терапевтическом ангиогенезе (Sieveking, Ng, 2009; Ishida et al., 2005). Принимая во внимание активное участие ЭКП в компенсаторном ангиоартериогенезе, представляется актуальным исследовать связь циркулирующих ЭКП с состоянием коллатерального кровообращения, тяжестью заболевания и эффективностью ангиогенных вмешательств. Выяснение факторов, определяющих эффективность терапевтического ангиогенеза, важно для разработки дизайна клинических испытаний и определения подходов к повышению эффективности новых методов лечения больных с ишемическими заболеваниями, направленных на стимуляцию ангиогенеза. Цель исследования: исследовать связь уровня циркулирующих эндотелиальных клеток- предшественников с состоянием коллатерального кровообращения, клиническим течением заболевания и процедурами терапевтического ангиогенеза у больных с хронической ИБС и хронической ишемией нижних конечностей. Задачи исследования: 1. Оценить взаимосвязь содержания циркулирующих ЭКП с факторами сердечнососудистого риска, состоянием коллатерального кровоснабжения и клиническим течением заболевания в ходе проспективного наблюдения у больных со стабильной стенокардией напряжения и больных с ишемией нижних происхождения. 6 конечностей атеросклеротического 2. У части больных - исследовать динамику уровня ЭКП в крови до и после выполнения реваскуляризации, выяснить взаимосвязь выраженности ишемии и количества ангиографически визуализируемых коллатералей с уровнями циркулирующих ЭКП. 3. У больных с тяжелой ишемией нижних конечностей, которым не планируется выполнение процедур реваскуляризации, оценить эффект местного введения мононуклеарной фракции собственной крови больного, обогащенной эндотелиальными клетками- предшественниками, на функциональный статус, уровни циркулирующих ЭКП, маркеров ангиогенеза, и показатели кровоснабжения нижних конечностей. 4. Провести клиническое исследование безопасности и эффективности внутримышечного введения препарата «Корвиан» (плазмидной конструкции, содержащей ген VEGF), у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей (Fontaine IIб-III), которые не являются кандидатами для выполнения процедур реваскуляризации. 5. Изучить связь уровней циркулирующих ЭКП, клинических, лабораторных и инструментальных показателей с результатами терапевтического ангиогенеза. Научная новизна 1. Впервые установлено, что на фоне клеточной терапии с использованием стимулированной мононуклеарной фракции крови и генной терапии плазмидной конструкцией с кДНК сосудисто-эндотелиального фактора роста наблюдается значимое повышение циркулирующей популяции CD34+133+ ЭКП, а после эндоваскулярной реваскуляризации у больных ИБС и больных хронической ишемией нижних конечностей - значимое повышение циркулирующей популяции CD34+ kdr+ ЭКП. 2. Впервые выявлена связь уровня циркулирующих ЭКП с показателями коллатерального кровотока при хронической ИБС и хронической ишемии нижних конечностей: у больных с хорошо развитыми коллатералями количество циркулирующих ЭКП было в 1,5 - 5 раз выше, чем у больных с плохо развитыми коллатералями. 3. Впервые продемонстрировано, что добавление к стандартной консервативной терапии генной терапии препаратом Корвиан (плазмидной конструкцией с кДНК сосудистоэндотелиального фактора роста) дает более выраженный лечебный эффект у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей, чем стандартная консервативная терапия. 4. Впервые установлена связь уровня циркулирующих эндотелиальных клеток- предшественников с эффективностью генной терапии препаратом Корвиан, направленной на стимуляцию ангиогенеза у больных хронической ишемией нижних конечностей: у 7 5. Впервые установлены предикторы эффективности терапевтического ангиогенеза препаратом Корвиан у больных с хронической ишемией нижних конечностей: проходимый аортоподвздошный артериальный сегмент и меньшая длительность анамнеза перемежающейся хромоты. Практическая значимость В работе было установлены факторы, определяющие эффективность терапевтического ангиогенеза у больных с хронической ишемией нижних конечностей, и предложен подход к определению ожидаемой величины лечебного эффекта. Полученные в работе результаты важны для разработки дизайна клинических испытаний новых препаратов и технологий для терапевтического ангиогенеза, для определения подходов к повышению эффективности новых методов лечения тяжелой хронической ишемии, направленных на стимуляцию ангиогенеза. Апробация. Состоялась 25 июня 2012 г. на заседании межотделенческой конференции НИИ клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ РКНПК МЗ РФ. Основные положения работы доложены на российских и международных конференциях в гг. Москва (2009, 2011), Прага (2009), Лейпциг (2009), Гамбург (2010), Осло (2010), Милан (2009, 2011), Чикаго (2012). Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ. Объем и структура. Диссертация изложена на 174 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики методов исследования, результатов исследования, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Работа иллюстрирована 8 рисунками, 17 таблицами, 33 диаграммами. Библиографический указатель состоит из 14 отечественных и 133 иностранных источников. СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материал и структура исследования Работа проводилась в отделе ангиологии (руководитель отдела – проф. Ю.А.Карпов) НИИ клинической кардиологии им. А.Л.Мясникова ФГБУ РКНПК МЗ РФ. 8 Всего в работе было обследовано 117 человек: 30 пациентов со стабильной стенокардией, 67 пациентов с ишемией нижних конечностей и 20 добровольцев без клинических проявлений атеросклероза. Критерии включения В группу ИБС включались пациенты со стабильной стенокардией напряжения, направленные на коронарографию для решения вопроса о реваскуляризации миокарда. Показанием к включению была верифицированная ИБС: ИМ в анамнезе или положительная функциональная проба на ишемию. Больные ХИНК IIб-IV ст. по классификации Покровского-Фонтейна и ЛПИ менее 0,9. были консультированы сосудистым хирургом, 27 больным в дальнейшем была выполнена реваскуляризация нижних конечностей. Остальные 40 больных по заключению хирурга не являлись оптимальными кандидатами для реваскуляризации и были рандомизированы в группы стандартного лечения, либо терапевтического ангиогенеза. В группе терапевтического ангиогенеза больных рандомизировали в соотношении 1:4 в группы клеточной терапии, либо генной терапии. В качестве группы сравнения были привлечены 20 добровольцев без клинических проявлений атеросклероза, нарушений углеводного обмена, аутоиммунных и острых воспалительных заболеваний, не страдавших онкологическими и тяжелыми общими заболеваниями. Допускалось наличие гипертонической болезни I ст., умеренной гиперлипидемии, ожирения I-II ст. Критерии исключения: острый коронарный синдром или ОНМК в предшествующие 3 мес., КШ или ТБКА в предшествующие 12 мес., клинически выраженная недостаточность кровообращения, сложные нарушения ритма и проводимости сердца, пороки сердца, заболевания миокарда (миокардиты, кардиомиопатии), тяжелая ХПН (клиренс креатинина менее 30 мл/мин), печеночная недостаточность, декомпенсированная дыхательная недостаточность, онкологические или аутоиммунные заболевания (в т.ч. в анамнезе), декомпенсированный сахарный диабет, пролиферативная ретинопатия, острые воспалительные заболевания или хронические воспалительные заболевания в стадии обострения в течение предшествующего месяца, длительно сохраняющаяся анемия (Нb<100 г/л); тяжелые хронические заболевания. Для исключения латентных стадий онкопатологии у больных 9 ХИНК, которые не являлись кандидатами для выполнения реваскуляризации, перед рандомизацией проводился онкоскрининг, включая определение онкомаркеров крови. Клиническая характеристика обследованных лиц. Детальная характеристика обследованных пациентов и добровольцев дана в таблице 1. Таблица 1. Клинические характеристики сравниваемых групп при включении в исследование. ИБС ХИНК Добровольцы Р1-2 Р2-3 Р1-3 без ИБС и ХИНК 30 67 20 Женщины, n (%) 5 (16,7) 9 (13,4) 3 (15,0) 0,586 0,922 0,131 Возраст, годы, M±m 61,2±5,4 62,6±7,63 45,6±14,4 0,422 0,021 0,018 Анамнез курения, n (%) 17 (56,7%) 60 (89,6%) 11 (55%) 0,0004 0,001 0,317 Курение на момент 8 (26,7%) 45 (67,2) 12 (60,0) 0,002 0,571 0,378 Стаж курения, лет 29,9±14,1 39,5±9,4 13,3±10,5 0,004 0,033 0,027 АГ, n(%) 30 (100) 63 (94,0) 7 (35) 0,931 0,026 0,009 Гиперлипидемия, n(%) 19 (63,3) 52 (77,6) 10 (50) 0,882 0,047 0,212 Сахарный диабет, n (%) 13 (43,3) 23 (34,3) 0 0,446 0,007 0,006 ИМТ, кг/м2, M±m 29,95±4,32 27,43±3,42 25,61±3,70 0,009 0,032 0,029 ИБС, n (%) 30 (100) 35 (52,2) 0 0,003 0,026 0,011 Коронарный анамнез, 4,8±4,4 7,6±6,8 0 0,023 0,032 0,021 ИМ в анамнезе, n (%) 13 (43,3) 26 (38,8) 0 0,658 0,049 0,113 ОНМК/ТИА, n (%) 4 (13,3) 8 (11,9) 0 0,726 0,482 0,329 ХИНК, n (%) 4 (13,3) 67 (100) 0 0,007 0,011 0,481 Коронарная 4 (13,3) 19 (28,4) 0 0,003 0,226 0,364 1 (3,3) 26 (38,8) 0 0,001 0,542 0,209 n обследования,n (%) лет, M±m реваскуляризация в анамнезе, n (%) Реваскуляризация нижних конечностей в анамнезе, n (%) 10 1 (3,3) 22 (32,8%) 0 0,025 0,786 0,198 САД, мм рт.ст.,M±m 138,0±14,8 140,4±18,8 120,8±11,4 0,585 0,004 0,004 ОХС, ммоль/л,M±m 5,02±1,13 4,74±1,30 5,06±1,10 0.361 0.238 0,941 ХС-ЛПНП,ммоль/л, M±m 2,99±0,93 2,78±1,12 2,66±0,90 0.478 0.343 0,525 ХС-ЛПВП, ммоль/л,M±m 1,14±0,29 1,12±0,35 1,54±0,31 0,328 0,020 0,017 ТГ, ммоль/л,M±m 2,05±1,12 1,95±1,09 1,15±0,42 0,488 0,030 0,045 Глюкоза, ммоль/л,M±m 6,15±1,30 5,95±1,57 4,95±1,17 0,338 0,037 0,024 СКФ по Кокрофту- 95,98±33,21 84,85±22,4 98,33±23,13 0,101 0,336 0,034 13,81±6,22 15,78±7,17 11,23±1,26 0.338 0,495 0,283 Вч-СРБ, мг/дл,M±m 0,42±0,44 0,51±0,38 0,17±0,38 0.393 0,035 0,013 Мочевая кислота, 404,6±106,5 328,3±77,7 298±56,6 0.155 0,037 0,042 Аспирин 30 (100%) 50 (74,6%) 0 0,296 <0,001 <0,001 Клопидогрель 4 (13,3%) 13 (19,4%) 0 0,267 0,019 0,035 Статины 23 (76,7%) 46 (68,7%) 0 0,437 <0,001 <0,001 Бета-блокаторы 23 (76,7%) 22 (32,8%) 2 (10%) <0,001 <0,001 <0,001 Нитраты 11 (36,7%) 5 (7,5%) 0 0,005 0,032 0,003 Ингибиторы 20 (67%) 38(56,7%) 4 (20%) 0,672 0,002 0,006 БКК 11 (36,7%) 15 (22,4%) 2 (10%) 0,345 0,025 0,026 Мочегонные 6 (20%) 9 (13,4%) 0 0,535 0,104 0,227 Трентал 0 5 (7,5%) 0 0,092 0,335 - Реваскуляризации других сосудистых бассейнов в анамнезе, n (%) Гаулту, мл/мин,M±m Гомоцистеин, мкмоль/л,M±m мкмоль/л, M±m Прием препаратов: АПФ/БРА По сравнению с больными ИБС и ХИНК, добровольцы были достоверно моложе, имели менее длительный анамнез курения, меньшие средние значения ИМТ, более низкий средний уровень САД; кроме того, уровень глюкозы, триглицеридов и мочевой кислоты сыворотки крови у добровольцев также были достоверно ниже, а уровень холестерина 11 ЛПВП – достоверно выше. У добровольцев реже регистрировалась АГ, не было случаев сахарного диабета, достоверно меньше была доля постоянно получающих лекарственные препараты кардиологического и эндокринологического профиля. При этом доля лиц с гиперлипидемией и процент курящих достоверно не отличались от пациентов с ИБС и ХИНК. По сравнению с больными ИБС, в группе ХИНК было достоверно больше курящих, анамнез курения был в среднем более длительным, а индекс массы тела – ниже. У больных ХИНК в анамнезе чаще встречалась реваскуляризация нижних конечностей и реже – коронарная реваскуляризация. 52,2% больных в группе ХИНК также страдали ИБС, а в группе ИБС в 13,3% случаев диагностировали сопутствующую ХИНК. В группе ХИНК больные достоверно реже принимали БАБ и нитраты, при этом различий по частоте приема антиагрегантов и статинов не было. Группы ИБС и ХИНК также не отличались по возрасту, уровню АД, липидов крови, мочевой кислоты, глюкозы, С-реактивного белка и гомоцистеина. Доля больных с АГ, СД, гиперлипидемией также значимо не различалась между группами. Методы исследования Процедуры и ход исследования. В группе ИБС всем больным выполняли стандартное обследование. Образцы крови для определения уровня циркулирующих прогениторных клеток получали перед КАГ и через 6 мес. после реваскуляризации миокарда. У 27 больных с ХИНК, которым была запланирована хирургическая или эндоваскулярная обследования, реваскуляризация проводилось нижних дуплексное конечностей, сканирование и помимо стандартного сцинтиграфия нижних конечностей, определение ДББХ и МДХ по данным тредмил-теста, а также исследование уровня циркулирующих прогениторных клеток. Обследование повторяли через 6-9 мес. после реваскуляризации. Все больные ХИНК, рандомизированные в группы генной терапии, клеточной терапии и стандартного лечения, получали базисную терапию (статины, ацетилсалициловая кислота, трентал, ингибиторы АПФ или блокаторы рецепторов ангиотензина II), всем больным при отсутствии противопоказаний проводились сеансы 12 тренировочной ходьбы на тредмиле. В группах генной и клеточной терапии дополнительно к стандартной терапии больные получали лечение, направленное на стимуляцию ангиогенеза в ишемизированных конечностях. Больным группы генной терапии в ишемизированные мышцы путем обкалывания вводили Корвиан - стерильный апирогенный препарат плазмидной ДНК, включающей кодирующую часть (кДНК) гена фактора роста эндотелия сосудов (VEGF-165), в дозе 28,6 мкг/кг. Введение препарата проводили дважды с промежутком одна неделя (у 10 больных) и трижды с промежутком 1 неделя между первым и вторым введениями и 2 недели – между 2-м и 3-м введениями. Клиническое исследование препарата Корвиан было одобрено МЗ РФ, этическим комитетом РФ и локальным этическим комитетом РКНПК. Все больные подписывали информированное согласие. Больным группы клеточной терапии в ишемизированные мышцы вводили суспензию мононуклерных клеток, выделенную из собственной крови больного методом афереза на сепараторе MCS+ (т.н. мононуклеарная фракция). Для мобилизации прогениторных клеток перед проведением процедуры афереза больным назначался курс инъекций гранулоцитарного колониестимулирующего фактора роста (G-CSF; филграстим) в дозе 5 мкг/кг/сут в течение 5 дней. Полученная в ходе афереза клеточная суспензия вводилась в ишемизированные мышцы путем обкалывания в асептических условиях. Для оценки эффективности терапевтического ангиогенеза, помимо стандартного клинического обследования, был использован комплекс современных лабораторных и клинико-инструментальных методов. ДББХ оценивали с помощью тредмил-теста по протоколу Гарднера-Скиннера. Проводили дуплексное сканирование и ангиографию нижних конечностей, сцинтиграфию нижних конечностей с 99mTc-MIBI, МРТ нижних конечностей с контрастированием, транскутанную оксиметрию. ДББХ оценивалась исходно, через 2 недели и 1, 3, 6 месяцев после начала лечения. Повторная ангиография, сцинтиграфия и МРТ нижних конечностей проводились через 3 месяца после начала лечения. Пробы для определения циркулирующих ЭКП брали исходно, на фоне терапии, через 1, 3 и 6 мес. после лечения. Стандартное обследование. Всем больным проводили подробные опрос и физикальное обследование пациента; общий клинический, биохимический анализы крови (включая липидный спектр, вч-СРБ и гомоцистеин), коагулограмму и уровень фибриногена крови; анализы мочи; ЭКГ в 12 отведениях, суточное мониторирование ЭКГ 13 по Холтеру, трансторакальную двухмерную эхокардиографию, по показаниям – нагрузочную пробу, тест толерантности к глюкозе; гликемический профиль, определение гормонов, характеризующих функцию щитовидной железы. Определение уровня циркулирующих ЭКП. Содержание циркулирующих ЭКП оценивали в образцах мононуклеарной фракции крови, полученной путем центрифугирования на градиенте плотности 1,077 г/л. Визуализацию поверхностных маркеров клеток осуществляли методом прямой иммунофлуоресценции. Содержание ЭКП оценивалось методом поточной цитометрии на приборе «FACSСalibur» (Becton Dickinson, США) на основании фенотипа CD45-CD34+kdr+. Анализировали 0,8-1 млн событий (клеток) для каждого образца. Лейкоциты выделяли по параметрам прямого и бокового светорассеяния. Далее из популяции СD45low/- клеток по экспрессии CD34 и kdr выделяли популяции CD34+kdr– и CD34+kdr+ клеток и для каждого пациента рассчитывали их число в пересчете на 1 миллион мононуклеаров (см. рис.1). У больных ХИНК дополнительно визуализировали маркер CD133. На основании фенотипа CD45-CD34+CD133+ и CD45-CD34-CD133+, а также CD45-CD34+kdr+ идентифицировали фракции прогениторных клеток, которые, по данным литературы, содержат популяцию циркулирующих ЭКП (Rustemeyer et al., 2006). При этом CD133позитивные ЭКП считаются более «ранними» эндотелиальными предшественниками, недавно покинувшими костный мозг. Также определяли популяцию CD34-негативных CD133-позитивных предшественников, которые, как считается, обладают более высокой ангиогенной и репаративной активностью (Friedrich et al., 2006). 14 В качестве контроля использовались образцы мононуклеарной фракции крови от 20 добровольцев без клинических проявлений атеросклероза. Коронароангиография. Селективную КАГ проводили у больных ИБС по стандартной методике в соответствии с рекомендациями ACC/AHA. При определении степени стенозирования КА руководствовались заключением рентгенохирурга. Для оценки развития коронарных коллатералей для бассейна каждой КА (ПНА, ОА, ПКА) применяли шкалу Рентропа (Rentrop et al., 1985), для последующего анализа использовали наилучший показатель. При 0-1 ст. развитие коллатералей считали слабым, при 2-3 ст. – хорошим. Также использовали модифицированный коронарный коллатеральный индекс (CD), предложенный Choi и соавт. (2006). Индекс определяется как частное от суммы баллов по Рентропу (Ren) для каждой эпикардиальной КА и суммы т.н. индексов коллатерального сопротивления (CS), представляющих собой произведение максимального стеноза эпикардиальной КА (maxSt) и скорости контрастирования данной артерии по TIMI (CTFC). Для каждой КА скорость контрастирования определяли как число кадров от момента начала заполнения контрастом проксимального сегмента артерии до достижения контрастом характерных ориентиров в наиболее дистальном сегменте данной КА (Gibson et al., 1996). Общая формула расчета коллатерального индекса: 1000*(Ren ПНА+Ren ОА+Ren ПКА+1)/(CS ПНА+CS ОА+CS ПКА), где CD = CS = maxSt КА*CTFC КА. Относительную и абсолютную дистанцию безболевой ходьбы оценивали по стандартной методике в ходе тредмил-теста по протоколу Гарднера-Скиннера. Сцинтиграфия нижних конечностей с 99mTc-MIBI проводилась для оценки перфузии конечностей у больных с ХИНК на аппарате Siemens SkyLight. Радиофармпрепарат вводили внутривенно в дозе 370МБк, через 1 час выполняли планарное сканирование всего тела во фронтальной плоскости со скоростью 12 см/мин. Для каждого сегмента конечности (бедро, голень, стопа) определяли показатель перфузии, который выражался как доля накопленной радиоактивности данного сегмента по отношению к общей накопленной радиоактивности всего тела. Дуплексное сканирование и ультразвуковую допплерографию артерий нижних конечностей проводили на аппаратах VIVID 7 (GeneralElectric, США), ACUSON 128 XP 10 и HDI 5000 SonoCT (Philips, США), в покое, по стандартной методике. 15 Ангиографию нижних конечностей проводили у больных с ХИНК по стандартной методике феморальным или радиальным доступом. Для оценки эффективности коллатерального кровотока применяли коллатеральный индекс Choi и соавт. (2006), модифицированный нами для нижних конечностей (Талицкий и соавт., 2011). При наличии окклюзирующих поражений также использовали метод Vajanto и соавт. (2009): подсчитывали все видимые коллатерали, пересекающие прямую, перпендикулярную длиннику окклюзированного сегмента артерии на границе его средней и дистальной трети. Магнитно-резонансная томография. Обследование пациентов выполнялось на МР-томографе «Magnetom Avanto», 1.5 Тл (Siemens AG, ФРГ). Контрастный препарат («Омнискан», GE Healthcare, США) вводился внутривенно болюсно в покое и на высоте нагрузки - максимального тыльного сгибания и разгибания стоп обеих ног. Перфузию мышц характеризовали как изменение максимальной интенсивности сигнала, а артериальный кровоток – как максимальную интенсивность контрастирования артерии. Транскутанная оксиметрия. Исследование проводили на приборе ТСМ 400 (RadiometerCopenhagen). Электрод располагали на коже тыльной поверхности стопы в I межпальцевом промежутке. TcpO2 определяли в положении лежа, сидя и во время позиционной пробы с пассивным подъемом конечности на угол 45° в течение 3 мин. и последующим восстановлением. Статистический анализ. Количественные характеристики выражены как среднее±стандартное отклонение, качественные показатели – в абсолютных величинах и процентах. Для соответствие распределения непрерывных нормальному изучаемых показателей (тест анализировали распределение Комогорова-Смирнова). параметров нормальному, для При на его несоответствии анализа применяли непараметрические методы расчета. Межрупповые различия оценивались с помощью критерия Манна-Уитни, для повторных измерений использовали критерий Вилкоксона. Для оценки корреляций использовали ранговый тест Спирмена. Для нормально распределенных показателей межгрупповые различия оценивали с помощью t-теста для количественных показателей (с поправкой Бонферрони в случае множественных сравнений) и критерия χ2 для качественных показателей. Для оценки влияния клинических, лабораторных и инструментальных показателей (в качестве независимых величин) на клиническую эффективность лечения ишемии нижних конечностей использовали простую 16 модель линейной регрессии. Критерий значимости приняли 0,05. Обработку данных проводили с помощью пакета программ Statistica 6.0. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Циркулирующие ЭКП у больных хронической ИБС. Уровень циркулирующих CD34+kdr+ ЭКП у больных ИБС был достоверно ниже, чем у лиц контрольной группы, в среднем в 2,16 раза. После реваскуляризации отмечался достоверный прирост уровня ЭКП, в среднем в 1,99 раза, при этом исчезало достоверное различие между больными и добровольцами контрольной группы (рис. 2). Уровень ЭКП обратно коррелировал с функциональным классом стенокардии (r=0.66; p=0,003) и числом пораженных коронарных артерий (r=-0.659, p=0,004). У больных с трехсосудистым поражением уровень ЭКП был в 2 раза ниже (10,9±6,70), чем у больных с однососудистым поражением (20,69±10,43) (р<0,05). Отрицательная корреляция также была обнаружена с такими ФР ССО, как стаж курения (r=-0.22, p=0,046), уровень СРБ (тенденция: r=-0.29, p=0,060) и фибриногена (r=-0.46, p=0,011). Уровень ЭКП у больных с хорошо развитыми коллатералями (2-3ст. по Рентропу) был на 47% выше, чем у больных с малоразвитыми коллатералями (0-1 ст), (р=0,0047) 17 (рис. 3). Вместе с тем, линейной корреляции уровня ЭКП с индексом Рентропа обнаружено не было (r=0,22; p=0,112). В то же время, для коллатерального индекса CD отмечалась достоверная положительная корреляция с уровнем циркулирующих ЭКП (r=0.73; p=0,008), что может быть связано с большей чувствительностью этого показателя по сравнению с индексом Рентропа (рис. 4). 18 Таким образом, было установлено, что уровень циркулирующих ЭКП у больных ИБС достоверно снижен по сравнению с лицами без клинических проявлений атеросклероза. Степень этого снижения прямо пропорциональна тяжести заболевания и обратно пропорциональна степени развития коронарных коллатералей. Коронарная или периферическая реваскуляризация приводит к значимому повышению уровня циркулирующих ЭКП. 2. Циркулирующие ЭКП у больных ХИНК. Уровни циркулирующих CD34+133+ и CD34+kdr+ ЭКП были в равной степени снижены у больных с ХИНК по сравнению с добровольцами, в среднем на 38,7% (р<0,05). CD34+133- и CD34-CD133+ популяции не демонстрировали значимых различий между больными ХИНК и здоровыми добровольцами. После выполненной реваскуляризации уровни CD34+133+ и CD34+kdr+ ЭКП повышались на 35-36%, при этом оставаясь достоверно ниже значений контрольной группы. Уровни CD34-негативных клеток не демонстрировали достоверной динамики. Наблюдалась тенденция к снижению уровня CD34+133- клеток на 20% (рис. 5). 19 Была обнаружена прямая корреляция между уровнем CD34+133+ ЭКП и ДББХ (r= 0.31; р= 0,02); и обратная корреляция с возрастом (r= -0.317; р= 0,02) и стадией ХИНК (r =0.316; р = 0,02). При межквартильном анализе уровень CD34+kdr+ ЭКП при высоких значениях коллатерального индекса был в 3,74 раза выше, чем при низких значениях (рис. 6). Уровни же «молодой», более проангиогенной CD34-CD133+ популяции ЭКП при межквартильном анализе различались в 5,16 раз. Была обнаружена прямая корреляция между уровнем CD34-CD133+ ЭКП и коллатеральным индексом (r = 0,62, p = 0,0059). 20 Таким образом, уровень циркулирующих ЭКП у больных ХИНК достоверно снижен по сравнению с добровольцами. Степень этого снижения, как и у больных ИБС, прямо пропорциональна тяжести заболевания и обратно пропорциональна степени развития коллатералей. Реваскуляризация также приводит к значимому повышению уровня циркулирующих ЭКП. 3. Влияние терапевтического ангиогенеза на уровни циркулирующих ЭКП и коллатеральное кровообращение у больных ХИНК. Клинический эффект лечения. Диагностические и лечебные процедуры в рамках протокола протекали без серьезных осложнений. В группе генной терапии в течение 6 мес. у 20% больных не наблюдалось существенных изменений в клиническом статусе конечности, у 30% пациентов – минимальное улучшение (+1 по Рутерфорду), у 50% умеренное улучшение (+2 по Рутерфорду). В группе стандартной терапии у 13% больных наблюдали минимальное улучшение, у 60% больных – без существенных изменений, у четверти больных - минимальное ухудшение (-1 по Рутерфорду). В группе клеточной терапии у двух больных наблюдали минимальное улучшение, у трех – умеренное улучшение. В связи с недостаточным количеством наблюдений в группе клеточной терапии данные приводятся без статистического сравнения с контрольной группой. 21 Функциональные показатели. У больных, получавших Корвиан, уже через 1 мес. наблюдали достоверное увеличение ДББХ и МДХ и прирост ЛПИ, достигавшие максимума к 3 мес. и сохранявшиеся более 6 мес. В среднем, дистанция ходьбы возрастала в 2,75 раза, прирост ЛПИ достигал 18%. В группе стандартной терапии достоверного прироста функциональных показателей не наблюдалось, хотя имелась тенденция к увеличению на сроке 1 мес. (рис. 7) В группе клеточной терапии через 3 мес. после лечения ДББХ увеличивалась более чем в 2 раза, а ЛПИ - в 1,5 раза; изменения были статистически значимыми, однако малое число больных не позволяет проводить сравнение с контрольной группой (рис. 8). 22 Ангиография нижних конечностей. У больных в группах терапевтического ангиогенеза через 3 мес. наблюдалось снижение индекса коллатерального сопротивления на 17%. Средний балл, характеризующий развитие коллатералей, вырос на 38%, с 1,12 до 1,55. Среднее число видимых коллатералей также увеличилось - на 35%, до 15,1±1,4 (рис. 9). Следует отметить наличие достоверной обратной корреляции между величиной коллатерального индекса после лечения и такими показателями, как число выкуриваемых 23 сигарет (r=-0.635, p<0,05) и наличием проходимого подвздошного сегмента (r=0.536, p<0,05). Сцинтиграфия нижних конечностей. Показатели перфузии голени и бедра в группе пациентов были достоверно ниже, чем среди здоровых добровольцев, в среднем, на 25%. Через 3 месяца перфузия достоверно возрастала только у больных, получавших Корвиан: в среднем на 7,3% для бедра и на 7,8% для голени. МРТ нижних конечностей. В ответ на нагрузку в условиях хронической ишемии достоверного прироста перфузии не происходило, наблюдалась даже тенденция к снижению уровня перфузии на 5,3%. При этом артериальный кровоток при нагрузке достоверно возрастал на 14%. У больных, получавших Корвиан, через 3 месяца после лечения перфузия мышц и кровоток в покое остались прежними, в то же время показатель перфузии мышц при нагрузке достоверно вырос на 21% по сравнению с аналогичным показателем до лечения, и наблюдалась явная тенденция к увеличению кровотока при нагрузке на 14% (р=0,07) (рис. 10). Прирост кровотока в ответ на нагрузку увеличился с 14% до 43%, однако эта тенденция не достигла уровня статистической значимости. В контралатеральной конечности, куда не проводилось инъекций Корвиана, через 3 месяца после лечения показатели перфузии мышц и кровотока, как покое, так и при нагрузке, не продемонстрировали значимой динамики. 24 Транскутанная оксиметрия. Исходно напряжение кислорода было снижено в среднем в 2 раза по сравнению с нормой. На фоне лечения наблюдался достоверный прирост показателя как в положении лежа, так и в положении сидя, и только у больных в группах терапевтического ангиогенеза (рис. 11). Циркулирующие ЭКП. Через 1 и 3 мес. после введения Корвиана наблюдалось увеличение уровня циркулирующих CD34+CD133+ ЭКП, но не CD34+kdr+ ЭКП. Содержание других фракций прогениторных клеток не претерпело достоверных изменений. На фоне клеточной терапии значительно повышался уровень незрелых гематопоэтических предшественников, что вероятнее всего являлось следствием введения G-CSF. Количество циркулирующих CD34+CD133+ЭКП возрастало в 30 раз. Достоверного прироста уровня CD34+kdr+ЭКП не отмечалось. В группе стандартной терапии значимых изменений уровня циркулирующих прогениторных клеток отмечено не было. Отмечалась тенденция к росту количества CD34CD133+ ЭКП к 3 мес. после лечения на 20%, не достигавшая статистической значимости. У больных с хорошим ответом на терапию Корвианом исходный уровень CD34+CD133+ЭКП был в 2,12 раза выше, чем у пациентов, не ответивших на терапию (рис. 12). При этом прирост ЛПИ через 3 мес. от начала терапии коррелирует с исходным уровнем CD34+CD133+ЭКП как в группе генной терапии (r = 0,68, p<0,05), так и в группе клеточной терапии (r = 0.97, p = 0,008). 25 Предикторы однофакторного эффективности анализа, хороший терапевтического эффект терапии ангиогенеза. Корвианом По данным ассоциирован с проходимым аортоподвздошным сегментом, меньшей длительностью курения, более высоким исходным лодыжечно-плечевым индексом и меньшей давностью симптомов (табл. 2). Таблица 2. Показатели, определяющие эффективность терапевтического ангиогенеза, по данным однофакторного анализа. r p Проходимый подвздошный сегмент 0,505 0,02 Стаж курения -0,485 0,037 ЛПИ до лечения 0,477 0,033 Давность анамнеза ПХ -0,579 0,007 По данным многофакторного логистического регрессионного анализа и построения простой модели линейной регрессии, независимыми предикторами эффективности терапии по шкале Рутерфорда оказались наличие проходимого подвздошного сегмента (β=0,418; р=0,038) и меньшая давность анамнеза ПХ (β=-0,426; р=0,035). 26 Выводы 1. Содержание циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников в крови больных ИБС и больных ХИНК достоверно снижено по сравнению с лицами без клинических проявлений атеросклероза, величина этого снижения прямо пропорциональна степени тяжести заболевания. 2. У больных ИБС и больных ХИНК имеется прямая зависимость между уровнем циркулирующих ЭКП и степенью развития коронарных и периферических коллатералей по данным ангиографии. 3. Через 6 мес. после выполненной коронарной реваскуляризации содержание ЭКП в крови больных ИБС возрастает на 99%, в аналогичные сроки после реваскуляризации нижних конечностей у больных ХИНК наблюдается рост уровня ЭКП на 35%. Степень прироста уровня ЭКП после реваскуляризации зависит от отягощенности пациента по факторам риска сердечно-сосудистых осложнений, а у больных ХИНК – также от стадии заболевания и объема реваскуляризации. 4. Уровень циркулирующих ЭКП у больных ХИНК значимо повышается на фоне терапевтического ангиогенеза с помощью генной и клеточной терапии и возвращается к исходному уровню в течение 6 мес. Стандартная консервативная терапия при ишемии нижних конечностей не вызывает прироста уровня циркулирующих ЭКП. 5. Использование генной терапии препаратом Корвиан (плазмидной конструкции, содержащей ген VEGF) у больных с ХИНК безопасно и приводит к значимому улучшению клинического статуса по шкале Рутерфорда, дистанции ходьбы и показателей перфузии конечностей, а также показателей коллатерального кровообращения. Применение генной терапии дает более выраженный лечебный эффект, чем стандартная консервативная терапия. 6. Наилучший эффект терапевтического ангиогенеза препаратом Корвиан наблюдается у пациентов с менее длительным анамнезом перемежающейся хромоты, с проходимым подвздошно-бедренным сегментом, имеющих более высокий исходный ЛПИ и меньший стаж курения. Больные с хорошим эффектом ангиогенной терапии имеют более высокий исходный уровень циркулирующих ЭКП по сравнению с больными, не ответившими на терапию. 27 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Определение уровня циркулирующих ЭКП наряду с оценкой проходимости подвздошно-бедренного сегмента, ЛПИ и данных анамнеза (длительности перемежающейся хромоты и стажа курения) рекомендуется проводить при отборе больных ХИНК для участия в клинических испытаниях терапевтического ангиогенеза с помощью генной терапии и прогнозирования эффективности данного метода лечения. 2. Выявленные в работе взаимосвязи позволяют определять больных ХИНК, у которых ожидается низкая эффективность терапевтического ангиогенеза, что следует учитывать при разработке дизайна клинических испытаний новых препаратов и технологий, направленных на стимуляцию ангиогенеза. 28 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Талицкий К.А., Карпов Ю.А., Парфенова Е.В.Терапевтический ангиогенез в лечении ишемии нижних конечностей. //Кардиология 2007, №12, c.81-84. 2. Талицкий К.А., Булкина О.С., Арефьева Т.И., Воробьева О.Н., Балахонова Т.В., Самко А.Н., Левицкий И.В., Филатов Д.Н., Сергиенко В.Б., Стукалова О.В., Елисеев А.О., Кухарчук В.В., Парфенова Е.В., Карпов Ю.А.Циркулирующие прогениторные клетки в условиях стимуляции ангиогенеза у больных с хронической ишемией нижних конечностей.//Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные исследования и перспективы клинического применения. Под ред. В.А.Ткачука. М., Литтерра, 2009. С. 163-175. 3. К.А. Талицкий, О.С. Булкина, Т.И. Арефьева, О.Н. Воробьева, И.В. Левицкий, А.А. Федорович, П.И. Макаревич, Е.В. Парфенова, Ю.А. Карпов. Эффективность терапевтического ангиогенеза у больных с хронической ишемией нижних конечностей. //Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2011; т.VI, № 3, с. 1-10. 4. Шевченко Е.К., Талицкий А.К., Парфенова Е.В.Перспективы повышения эффективности генной и клеточной терапии сердечно-сосудистых заболеваний: генетически модифицированные клетки. //Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2010: 5(2): 19-28. 5. Traktuev DO, Tsokolaeva ZI, Shevelev AA, Talitskiy KA, Stepanova VV, Johnstone BH, Rahmat-Zade TM, Kapustin AN, Tkachuk VA, March KL, Parfyonova YV. Urokinase gene transfer augments angiogenesis in ischemic skeletal and myocardial muscle. Mol Ther. 2007; 15(11):1939-46. 6. Talitskiy K., Arefieva T., Samko A., Parfyonova Ye., Karpov Yu. Decreased level of circulating endothelial progenitor cells in patients with stable angina is partially restored after coronary revascularization. //New approaches In coronary Artery disease. Proceedings of the 8th international congress on Coronary artery disease Prague (Czech Republic), October 1114, 2009. MEDIMOND S.r.l. Bologna, 2009. p. 39-43. 7. Талицкий К.А., Булкина О.С., Арефьева Т.И., Воробьева О.Н., Балахонова Т.В., Самко А.Н., Филатов Д.Н., Елисеев А.О., Кухарчук В.В., Парфенова Е.В., Карпов Ю.А. Применение терапевтического ангиогенеза у больных с хронической ишемией нижних 29 8. Талицкий К.А., Булкина О.С., Арефьева Т.И., Воробьева О.Н., Балахонова Т.В., Самко А.Н., Филатов Д.Н., Елисеев А.О., Кухарчук В.В., Парфенова Е.В., Карпов Ю.А. Циркулирующие прогениторные клетки в условиях стимуляции ангиогенеза у больных с хронической ишемией нижних конечностей. //Всероссийская научная школаконференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (МГУ им. М.В.Ломоносова) 21-23.09.2009. Сборник тезисов. – Москва, 2009. с. 12. 9. К. А. Талицкий, О. С. Булкина, О. Н. Воробьева, И. В. Левицкий, Е. В. Парфенова, Ю. А. Карпов. Применение стимулятора ангиогенеза Корвиана у больных с хронической ишемией нижних конечностей. //Всероссийская конференция «Фундаментальные и клинические аспекты изучения ангиогенеза. Подходы регенеративной медицины», Сборник тезисов. М., 2011. с. 21 10. Talitskiy K.A, Bulkina O.S, Arefieva T.I., Vorobieva O.N., Balakhonova T.V., Samko A.N., Filatov D.N., Zotikov A.E., Pokrovskiy A.V., Eliseev A.O., Kuharchuk V.V., ParfyonovaYe.V., KarpovYu.A. Decreased level of circulating endothelial progenitor cells in patients with hypertension and chronic limb ischemia can be restored after stem cell therapy or vascular surgery. 19th European Meeting on Hypertension. Milan, June 12 - 16, 2009. //Journal of Hypertension. 2009; 27(Suppl. 4): S91. 11. Talitskiy K.A, Bulkina O.S, Arefieva T.I., Vorobieva O.N., Balakhonova T.V., Samko A.N., Filatov D.N., Eliseev A.O., Kuharchuk V.V., Parfyonova Ye.V., KarpovYu.A. Circulating progenitor cells after angiogenic gene therapy or stem cell therapy in patients with chronic limb ischemia. //Regenerative Medicine. 2009; 4(6): Suppl. 2, p. S293. 12. Talitskiy K.A, Bulkina O.S, Arefieva T.I., Vorobieva O.N., Balakhonova T.V., Samko A.N., Filatov D.N., ParfyonovaYe.V., KarpovYu.A. Direct comparison of angiogenic gene therapy and stem cell therapy in patients with chronic limb ischemia. //Atherosclerosis Supplements. 2010; 11 (2): 179. 13. K. Talitskiy, O. Bulkina, T. Arefieva, O. Vorobieva, T. Balakhonova, A. Samko, I. Levitskiy, D. Filatov, O. Stukalova, Y. Parfyonova, Y. Karpov. Blood pressure response and higher count of circulating endothelial progenitors predict angiogenic gene therapy effectiveness in 30 14. K. Talitskiy, O. Bulkina, T. Arefieva, A. Samko, Y. Parfyonova, Y. Karpov. Predictors of angiogenic therapy effectiveness in hypertensive patients with chronic limb ischemia. //J. Hypertens. 2011; Vol. 29, e-Supplement A, p. e277. 15. K. Talitskiy, O. Bulkina, A. Fedorovich, A. Samko, Y. Parfyonova, Y. Karpov. Angiogenic therapy in hypertensive patients with chronic limb ischemia improves microcirculation and promotes collateral formation. //J. Hypertens. 2011; Vol. 29, e-Supplement A, p. e201. 16. K. Talitskiy, O. Stukalova, O. Bulkina, Y. Parfyonova, Y. Karpov. Magnetic resonance imaging is useful for the estimation of therapeutic angiogenesis effect in patients with chronic limb ischemia. //J. Am. Coll. Cardiol. 2012; 59; E2069. 17. K. Talitskiy, O. Bulkina, T. Arefieva, Y. Parfyonova, Y. Karpov. Predictors of angiogenic therapy effectiveness in patients with chronic limb ischemia. //J. Am. Coll. Cardiol. 2012; 59; E2062. 31
