Утверждаю» Председатель Ученого совета биолого
реклама
«Утверждаю» Председатель Ученого совета биолого-почвенного факультета к.б.н., проф. И.А. Горлинский дата ________________ № протокола_________ Отчет старшего преподавателя кафедры генетики и селекции Богомаза Дениса Игоревича, работающего по программе поддержки молодых кандидатов наук СПбГУ. Тема исследования: «Сайленсинг генов стеринового метаболизма как метод увеличения устойчивости растений к фитостерин-зависимым патогенам и вредителям» Растения в природе тесно взаимодействуют с микроорганизмами и животными на разных уровнях организации, в том числе, метаболическом. Метаболиты растений играют определяющую роль в становлении и развитии их взаимоотношений с различными животными и микроорганизмами. Часто вещества растительного происхождения преобразуются в организме фитотрофа в вещества, необходимые для нормального развития и размножения. Лишение таких веществ может привести к нарушению нормального развития фитотрофа или его гибели. Наиболее ярким примером пищевой зависимости эволюционно неродственных друг другу фитотрофов является зависимость членистоногих, нематод и некоторых грибов от стеринов растения. Стерины являются полициклическими спиртами, выполняют в организме ряд важнейших функций: - структурную - входят в состав плазматических мембран эукариот наряду с фосфолипидами; - регуляторную - являются предшественниками целого ряда биологически активных соединений, в том числе стероидных гормонов (например, гормон линьки у насекомых, брассиностероиды растений). Однако существуют группы организмов – насекомые, нематоды и грибы, неспособные к самостоятельному синтезу стероидов. Для них единственным источником стероидных компонентов являются растения. Зависимость грибов от растительных стеринов была продемонстрирована в 1960х (Elliot et al., 1972). Добавление стеринов в среду для культивирования стимулировало вегетативный рост Phytophthora spp. и Pythium spp. и было абсолютно необходимо для полового размножения этих грибов. Гриб P. infestans неспособен самостоятельно синтезировать стерины, так как у него отсутствует фермент, ответственный за циклизацию сквалена. Тем не менее, гриб способен поглощать и трансформировать экзогенные стерины и их циклические предшественники, что говорит о существовании ферментов, участвующих в последующих реакциях синтеза стеринов. Абсолютно зависимыми от стеринов являются процессы бесполого и полового размножения. В отсутствии стеринов процессы размножения гриба подавлены полностью (Vauthrin et al., 1999; Kurzchalija and Ward, 2003; Marshall et al., 2001). По литературным данным все насекомые (и, по-видимому, беспозвоночные животные) не способны самостоятельно синтезировать стерины de novo. Насекомыефитофаги способны конвертировать большинство растительных стеринов в холестерин и другие стероиды, включая гормон линьки экдизон и экдистероиды. Более того, отдельные реакции этого превращения высоко специфичны для разных видов насекомых. Было показано, что изменения стеринового состава пищи оказывали негативное воздействие на развитие и размножение фитостерин-зависимых насекомых (Feldlaufer and Svoboda, 1991; Costet et al., 1987). Ауксотрофность по стеринам у нематод изучали на примере модельного объекта Caenorhabditis elegance. Подтверждено, что для развития личинок и размножения взрослых особей необходимо наличие в среде стеринов (Chitwood and Lusby, 1991). Можно предполагать, что и паразитические нематоды растений, в частности, картофеля, также зависят от стеринов хозяйских растений, но конкретные «предпочтения» неизвестны. Таким образом, можно сделать следующие выводы: 1. существует связь между эффективностью развития и размножения возбудителей фитофтороза и насекомых-фитофагов и составом стеринов; 2. для некоторых взаимодействий выявлено, что изменение, по сравнению с привычным рационом, качественного и количественного состава стеринов в пищевом субстрате приводит к полному или частичному подавлению нормального развития и размножения; 3. можно предположить, что растения с измененным, по сравнению с исходными формами, составом стеринов будут обладать большей устойчивостью к заболеваниям, которые вызывают фитостерин-зависимые вредители. Последнее предположение было проверено экспериментально в лаборатории генетики растений СПбГУ. С помощью метода опосредованной клеточной селекции на устойчивость клеточных линий к полиеновым антибиотикам или ингибиторам биосинтеза стеринов были получены растения картофеля, табака и томатов. Соответственно, было изучено 3 модели взаимодействий между растением и фитофагом: растения табака Nicotiana tabacum – плодовые мушки Drosophilla melanogaster, картофеля S. tuberosum – возбудитель поздней гнили P. infestans, растения томатов Lycopersicon esculentum – P. infestans. Для двух первых моделей подтверждено изменение состава стеринов по сравнению с исходными сортами. Во всех случаях было отмечено угнетение развития соответствующего вредителя на растении и подавление размножения (Левашина, 1994; Ходжайова и др., 1998; Khodjaiova et al., 2004). Полученные данные подтверждают возможность использования предложенного принципа для получения растений, устойчивых к фитостерин-зависимым возбудителям заболеваний растений. Однако, использованный метод опосредованной клеточной селекции на устойчивость к полиеновым антибиотикам и ингибиторам биосинтеза стеринов, несмотря на положительные результаты, имеет ряд недостатков. Исходя из этого, нами был предложен иной способ получения растений с измененным содержанием стеринов: он заключается в изменении в растении уровня экспрессии генов, ответственных за биосинтез стеринов, что позволит сместить соотношение между основными группами стеринов. Методология эксперимента основывается на явлении сайленсинга. Явление сайленсинга, приводящее фактически к выключению генов, распространено достаточно широко у растений в природе как механизм, позволяющий бороться с вирусными инфекциями и регулирующий уровень экспрессии генов. Кроме того, используется и его искусственное моделирование. Одной из точек приложения является получение растений с «выключенными» полностью или частично генами, определяющими синтез определенных веществ, с целью изменения метаболизма этого вещества. Изменение уровня экспрессии гена возможно с помощью трансформации растения вектором, содержащим антисмысловой ориентации. последовательность соответствующего гена в Проведение такой работы стало возможным, поскольку определены нуклеотидные последовательности многих генов синтеза стеринов у разных видов растений. Путь биосинтеза стеринов сложен, представляет собой многоступенчатый процесс, наиболее хорошо изучен у модельного объекта генетики растений арабидопсиса (Arabidopsis thaliana L.) (Benveniste, 2003). Для использования в работе выбраны несколько генов, участвующие в синтезе стеринов. Выбор основан на имеющихся литературных данных о пищевых стериновых предпочтениях упомянутых выше вредителях (Feldlaufer and Svoboda, 1991; Vauthrin et al., 1999; Kurzchalija and Ward, 2003; Marshall et al., 2001): ген DWF1, кодирующий фермент delta5-стерол-C24-редуктазу (изомеразу) (ответственен за конечный этап синтеза ситостерина); ген DWF5, гены SMT2 и SMT1, кодирующие ферменты стерол-С24метилтрансферазу 2 и 1 (изменение соотношения между С-24-метил- и С-24- этилстеринами в пользу последних) и ген картофеля HMGR (гидроксиметилглутарилкоацетилА редуктаза). Таким образом, в нашей работе предлагается получение трансгенных растений картофеля с отдельными генами биосинтеза стеринов в смысловой и анти-смысловой ориентациях (ген картофеля HMGR и арабидопсиса DWF1, SMT1 и SMT2). Результаты Получение агробактериальных штаммов с отдельными генами биосинтеза стеринов в смысловой и анти-смысловой ориентациях На первом этапе работы, совместно с к.б.н., асс. Андреевой Е.А., на основе нуклеотидных последовательностей генов биосинтеза стеринов арабидопсиса (в случае генов SMT1, SMT2, DWF1) и картофеля (ген HMGR1), содержащихся в базе данных нуклеотидных последовательностей GenBank, были сконструированы специфические праймеры для наработки в процессе полимеразной цепной реакции соответствующих последовательностей. В праймеры были внесены сайты для эндонуклеаз рестрикции (не встречающиеся в нуклеотидных последовательностях самих генов) для оптимизации процесса клонирования фрагментов ПЦР в целевой ориентации. В ходе полимеразной цепной реакции на матрице ДНК картофеля и арабидопсиса были получены ПЦР-продукты ожидаемого размера. Они были очищены от агарозы путем фильтрации через стекловату, обработаны соответствующими рестриктазами и клонированы в полилинкер вектора pART7 под промотор 35S и терминатор октопинсинтазы. Скрининг рекомбинантных плазмид был проведен методом ПЦР со специфическими праймерами, рестрикционным анализом и подтверждены секвенированием. Затем последовательности генов синтеза стеринов с привнесенными регуляторными последовательностями были вырезаны по сайтам эндонуклеазы рестрикции Not1 и переклонированы в вектор pART27, содержащий структурные элементы, необходимые для поддержания в клетках E.coli и Agrobacterium tumefaciens, в последних данный вектор ведет себя как Ti-плазмида (Gleave, 1992). Рекомбинатные плазмиды были отобраны методами ПЦР со специфическими праймерами и рестрикционным анализом. Полученные плазмиды с с генами стеринового синтеза были перенесены в агробактериальный штамм EHA105 методом электропорации или трёх-родительского скрещивания (с использованием хелперного штамма E. coli pRK2013) (Дрейпер и др., 1991). Кроме того, для контроля был получен штамм Agrobacterium tumefaciens с плазмидой pART27 без стериновых генов. Наличие последовательностей, соответствующих клонированным, было подтверждено методом ПЦР. Таким образом, нами получены агробактериальные штаммы, содержащие плазмиды с отдельными генами синтеза стеринов в смысловой и анти-смысловой ориентациях. Перечень плазмид с отдельными генами синтеза стеринов и их условные обозначения представлены ниже в смысловой ориентации: ген SMT2 – плазмида sm2s; SMT1 – smt1s, DWF1 – d1s; HMGR1 – hm1s; в анти-смысловой ориентации: ген SMT2 – плазмида sm2as; SMT1- smt1as, DWF1 – d1as; HMGR1 – hm1as; контрольный штамм с немодифицированной плазмидой – pART27. Результаты экспериментов по трансформации растительных объектов полученными агробактериальными штаммами Трансформация эксплантов табака Для проверки способности полученных штаммов к переносу целевых генов проводили трансформацию растений табака N. tabacum, так как данный вид является модельным объектом для агробактериальной трансформации. Трансформацию проводили в условиях in vitro с использованием в качестве эксплантов листовых дисков. Регенерацию проводили на среде с добавлением синтетических аналогов гормонов – нафтилуксусной кислоты (НУК) – 0,1 мг/л (аналог ИУК) и бензиламинопурина (БАП) – 1 мг/л (аналог зеатина) (Дрейпер и др., 1991). Отбор трансгенных растений проводили на среде с добавлением селективной концентрации канамицина (100 мг/л). В результате проведенных экспериментов по трансформации штаммами с геном HMGR (штаммы с плазмидами hm1s и hm1as) получены трансгенные растения табака, устойчивые к селективной концентрации антибиотика канамицина, содержащие последовательности соответствующих генов синтеза стеринов. Трансгенная природа полученных растений подтверждена ПЦР с праймерами к гену nptII и целевым генам. Кроме того, проверен штамм с контрольной плазмидой без вставки pART27. В результате трансформации получены трансгенные, канамицин-устойчивые и ПЦР-позитивные растения. Трансформация эксплантов картофеля Полученные и апробированные агробактериальные штаммы с геном синтеза стеринов HMGR и контрольный штамм pART27 были использованы для трансформации растений картофеля. Трансформацию проводили в условиях in vitro, с использованием в междоузлий качестве эксплантов. Регенерацию проводили на среде с добавлением БАП – 3 мг/л. Отбор трансгенных растений проводили на среде с добавлением селективной концентрации канамицина (100 мг/л). В результате были получены растения-регенеранты, устойчивые к селективному антибиотику канамицину. Наличие последовательностей Т-ДНК в полученных растениях подтверждено методом ПЦР с праймерами к генам nptII и smt2. Из литературных данных известно, что уменьшение продукции стеринов у растений в подавляющем большинстве случаев сопровождается карликовостью. Среди полученных трансгенных растений картофеля и табака все имели нормальный фенотип, как в условиях культивирования in vitro, так и при перенесении в условия теплицы, индукция сайленсинга отмечена не была. Причинами этого могут быть: - для эффективного развития сайленсинга необходим достаточно высокий процент гомологии между эндогенной и экзогенной копией гена. Поскольку для трансформации в случае генов DWF1 и SMT2 были использованы последовательности арабидопсиса, то, по-видимому, введение в геном картофеля последовательностей генов синтеза стеринов арабидопсиса не позволяет запустить процесс замолкания эндогенной копии гена; - возможно, использованный принцип индуцирования сайленсинга недостаточно эффективен (по литературным данным в зависимости от гена-мишени и вида растения составляет 0-20%). Ключевым моментом запуска процесса пост-транскрипционного сайленсинга является образование двунитевой структуры между РНК с эндогенной и экзогенной копий гена. Таким образом, необходим эффективный синтез РНК с внесенной копии гена, поиск в цитоплазме гомологичной РНК и образование двунитевой структуры. По литературным данным, гораздо более эффективным вариантом искусственного запуска сайленсинга является следующая схема: в плазмиду под контроль одного промотора клонируют последовательность гена-мишени как в анти-смысловой, так и в смысловой ориентациях. В растении, трансформированном такой конструкцией, образование двунитевой РНК происходит сразу же после процесса транскрипции, что позволяет добиться большого выхода трансформантов с «умолкнувшими» генамимишенями. Примером такой конструкции является плазмида pKannibal (Wesley, 2001). Применение конструкций такого типа позволяет добиваться 70-100% выхода трансформантов с «умолкнувшими» генами-мишенями. Учитывая это, нами предложен альтернативный путь получения трансгенных растений картофеля с измененным метаболизмом стеринов за счет «умолкания» отдельных генов синтеза стеринов, который реализуется в работе Андреевой Е.А. Несмотря на то, что картофель – культура, достаточно легко поддающаяся агробактериальной трансформации, объектом на котором можно в большом количестве получать трансгенные растения является арабидопсис. Для арабидопсиса также описан возбудитель фитофтороза – Phytophthora porri. Соответственно, на этом объекте с помощью плазмид на основе pKannibal можно получать растения с индуцированным сайленсингом, тестировать на устойчивость к фитофторозу, а полученные результаты возможно применять для корректировки схемы эксперимента на растениях картофеля. Соответственно, для работы на растениях арабидопсиса выбраны гены синтеза стеринов – SMT1, SMT2, Hydra (дельта7,8-стеролизомераза). На основе плазмиды pKannibal сконструированы агробактериальные штаммы, содержащие последовательности этих генов, проводится трансформация растений методом floral spray (Chung et al., 2000). Полученные результаты позволят проводить дальнейшие исследования по разработке метода получения растений, с измененным спектром стеринов для проверки роли последних в морфогенезе растения и получения форм, устойчивых к фитостеринзависимым вредителям и патогенам. Список процитированной литературы: 1. Камилова Т.А., Лучникова Е.М., Инге-Вечтомов С.Г. Влияние метаболизма стеринов на кроссинговер у дрозофилы в модельной экологической системе «дрозофиладрожжи»//Генетика.-1990.-26.-стр. 249-256. 2. Левашина Е.А. Клеточная селекция in vitro как способ получения растений, ограничивающих развитие стерин-зависимых насекомых. //Диссер. канд. биол. наук.СПб.-1994.-120 с. 3. Метлицкий Л.В., Озерецковская О.Л., Васюкова Н.И. Фитостерины и их роль во взаимоотношениях растений с паразитарными грибами (на примере грибов семейства Pythiaceae).//Успехи совр. биол.-1980.-89.-стр. 28-41. 4. Ходжайова Л.Т., Левашина Е.А., Усольцева М.Ю., Бондаренко Л.В., Лутова Л.А. Изменение содержания растительных стеринов как способ биологической борьбы с фитостерин-зависимыми организмами/В сб.: Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку.-Москва.-2000.стр.124-128. 5. Benveniste P. Sterol metabolism//in The Arabidopsis book. Edit. by Somerville C. and Meyerowitz E.-2003.- www.arabidopsis.org 6. Brigneti G, Martin-Hernandez AM, Jin H. et al. Virus-induced gene silencing in Solanum species.//Plant J..- 2004.- Jul;39(2).-pp.264-272. 7. Chitwood D.J. and Lusby W.R. Metabolism of plant sterols by nematodes.//Lipids.-1991.V.26(8).-pp.619-627. 8. Choi,D., Ward,B.L. and Bostock,R.M. Differential induction and suppression of potato 3hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase genes in response to Phytophthora infestans and to its elicitor arachidonic acid.//Plant Cell.-1992.-V.4 (10).-pp.1333-1344. 9. Dotson WD, Tove SR, Parks LW. Biochemical modifications and transcriptional alterations attendant to sterol feeding in Phytophthora parasitica//Lipids.-2000.-V. 35(3).- pp. 243-247. 10. Elliot C.G. Sterols and production of oospores by Phytophthora cactorum. //J.Gen.Microbiol.-1972.-72.-P.321-327. 11. Feldlaufer M.F. and Svoboda J.A. Sterol utilization and ecdisteroid content in the house fly, Musca domestica (L.)//Insect.Biochem.-1991.-21.-pp.53-56. 12. Heyer J, Parker B, Becker D, Ruffino J, Fordyce A, Witt MD, Bedard M,Grebenok R.Steroid profiles of transgenic tobacco expressing an Actinomyces 3-hydroxysteroid oxidase gene.//Phytochemistry.-2004.- V.65(22).-pp. 2967-76. 13. Hiriart JB, Lehto K, Tyystjarvi E, Junttila T, Aro EM. Suppression of a key gene involved in chlorophyll biosynthesis by means of virus-inducing gene silencing.//Plant Mol Biol.- 2002.Sep;50(2).-pp.213-224. 14. Marshall JA, Dennis AL., Kumazawa T, Haynes AM, Nes WD. Soybean sterol composition and utilization by Phytophthora sojae//Phytochemistry.- 2001.-V. 58(3).- pp. 423-428. 15. Ming-HsanChung, Ming-KungChen &Shu-Mei Pan. Floral spray transformation can efficiently generate Arabidopsis transgenic plants// Transgenic Research.–V.- 2000.-p. 471–476. 16. Schaller H, Grausem B, Benveniste P, Chye ML, Tan CT, Song YH, Chua NH. Expression of the Hevea brasiliensis (H.B.K.) Mull. Arg. 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzyme A reductase 1 in tobacco results in sterol overproduction.//Plant Physiol.- 1995.- V.109(3).-pp. 761770. 17. Yoshioka,H., Yamada,N. and Doke,N. cDNA cloning of sesquiterpene cyclase and squalene synthase, and expression of the genes in potato tuber infected with Phytophthora infestans.//Plant Cell Physiol.- 1999.-V.40 (9).-pp. 993-998. Педнагрузка: Практикум по молекулярно-биологическим методам -16 ч. Научное руководство магистрантом – 30 ч. Учебная практика – 48 ч. Рецензирование – 5 ч. Публикации: First report of leaf spot caused by Periconia igniaria on yellow starthistle in Russia /Tamara Kolomiets, Lubov Pankratova, Zhanna Mukhina, Domenique Kassanelly, Tatiana Matveeva, Denis Bogomaz, Dana Berner// Plant Disease (в печати). Отчет заслушан и утвержден на заседании кафедры генетики и селекции. к.б.н., ст. преп. акад. РАН, проф. Д.И. Богомаз С. Г. Инге-Вечтомов
