Скачать: Методические рекомендации к контролю питательных
реклама
Утверждаю Начальник Главного управления карантинных инфекций МЗ СССР В.П.СЕРГИЕВ 19 февраля 1980 года МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ К КОНТРОЛЮ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ПО БИОЛОГИЧЕСКИМ ПОКАЗАТЕЛЯМ ВВЕДЕНИЕ Комплексная система стандартизации медицинских биологических препаратов, в том числе и бактериологических питательных сред, предусматривает применение унифицированных методов оценки качества готовых препаратов промышленного изготовления, а также экспериментальных образцов на различных этапах их конструирования и испытания. В настоящих "Методических рекомендациях" на основе обобщения опыта по контролю питательных сред промышленного изготовления предлагаются: условная классификация бактериологических питательных сред; биологические показатели, используемые для оценки сред; рекомендации для выбора той совокупности показателей, которые необходимы для оценки конкретной питательной среды в соответствии с ее назначением; описание методик оценки по всем показателям и необходимой подготовительной работы с тест-штаммами. Изложенными рекомендациями необходимо руководствоваться на этапе конструирования бактериологических питательных сред, при последующих их испытаниях (авторских, комиссионных), а также при серийном промышленном выпуске препаратов с внесением унифицированных методов на соответствующих этапах в программы испытания и в техническую документацию. Данные рекомендации могут быть использованы и для оценки качества питательных сред лабораторного изготовления. КЛАССИФИКАЦИЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД По своему целевому назначению питательные среды можно условно разделить на две основные группы: диагностические и производственные. I. Диагностические среды Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд. Эта группа сред, в свою очередь, включает следующие подгруппы: 1. Среды для выращивания широкого спектра микроорганизмов (жидкие, плотные) с целью одноразового посева или длительного культивирования. 2. Среды для выделения конкретного вида возбудителя (плотные элективные, селективные). 3. Среды дифференциальные, позволяющие различать отдельные виды (группы) микроорганизмов (плотные элективные, содержащие индикаторы, красители и т.д.). 4. Среды для идентификации, позволяющие по отдельным признакам (отношение к углеводам, мочевине и др.) проводить идентификацию микроорганизмов. 5. Среды накопительные - для обогащения конкретного вида микроорганизмов (жидкие, полужидкие элективные, селективные). II. Производственные среды К данной группе могут быть отнесены питательные среды, используемые в производственном процессе получения медицинских биологических препаратов (бактерийных вакцин, анатоксинов и др.) и контроле их качества. Поскольку для получения производственных питательных сред более целесообразным является использование не готовых сухих сред, а сухих компонентов коммерческого изготовления (белковые основы, стимуляторы роста и др.), в данное руководство включена именно эта группа препаратов: 1. Белковые основы (пептоны, гидролизаты и т.п.), стимуляторы роста (дрожжевые и другие экстракты). 2. Среды для контроля качества препаратов (стерильность). БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД Оценка питательных сред и их компонентов проводится с помощью совокупности показателей <*> из числа нижеперечисленных, выбираемых для контроля среды в соответствии с ее назначением: 1. Чувствительность определяется по максимальному разведению культуры, при котором рост. на всех засеянных чашках (пробирках) обнаруживается -1 -9 Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд. Результат ) для указывается по соответствующему разведению (10 - 10 всех групп питательных сред <*>. -------------------------------<*> Для каждого показателя указаны N (согласно N в разделе "Классификация") тех групп препаратов, для оценки которых данный показатель является обязательным. 2. Эффективность - по выходу микробных тел с 1 мл питательной среды (в млрд./мл) - для группы I/5 и II/1. 3. Показатель стабильности основных свойств микроорганизма - по отношению числа атипичных по морфологии, биохимическим, серологическим, фаголизабельным и др. свойствам колоний к общему числу колоний на чашках с испытуемой средой (в %) - для всех групп, кроме II/2. 4. Дифференцирующие свойства - по выраженности отличительных признаков патогенных микробов от непатогенных видов и естественных ассоциантов (по структурным особенностям колоний, их окраске, изменению цвета и др. признакам) - для групп I/3, I/4. 5. Показатель ингибиции - по степени подавляющего воздействия на постороннюю микрофлору. Выражается либо кратностью того минимального разведения, при котором полностью отсутствует рост посторонней микрофлоры, либо величиной отношения числа сформировавшихся клеток тест-штамма к расчетному количеству посеянных при соответствующем разведении клеток для всех сред I группы, кроме I/1, I/4. 6. Скорость роста - по минимальному времени инкубации после посева культур, достаточному для их выявления (выражается в часах), - для всех групп питательных сред. ОЦЕНКА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ПО БИОЛОГИЧЕСКИМ ПОКАЗАТЕЛЯМ Тест-штаммы культур, порядок хранения и подготовка для контроля Набор тест-штаммов для оценки соответствующей питательной среды авторы определяют в процессе экспериментальной работы и рекомендуют их для контроля после проведения этапа испытания образцов питательной среды. Рекомендуемые для контроля свежевыделенные штаммы с момента выделения и получения их в виде чистых культур не должны проходить более 3 - 5-ти последовательных пересевов на питательных средах с последующим (обязательным) лиофильным высушиванием в большом количестве ампул и представлением в ГИСК для хранения в качестве производственных штаммов. Используемые для контроля музейные тест-штаммы получают в лиофилизированном состоянии из ГИСК им. Тарасевича. Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд. Лиофилизированные музейные и свежевыделенные культуры хранят при Т 4 - 6 °C. Восстановление культур из лиофилизированного состояния проводится с использованием жидкой <*> и плотной питательных сред, принятых для определенной группы микроорганизмов. -------------------------------<*> В случае отсутствия первичного роста культуры на плотной среде необходимые исследования проводят с бульонными культурами. Рекомендуемые для контроля штаммы должны проверяться на отсутствие диссоциации по соответствующим тестам (см. ниже). В случае необходимости проводят изучение культуральноморфологических и биохимических свойств. Тест-штаммы должны находиться в типичной для данного микроорганизма форме. В случае, если обнаруживается более 25% полиморфных колоний, культура не может быть использована для контроля питательных сред. Восстановленную культуру пересевают на соответствующую среду хранения, после чего пробирки запаивают. Полученные таким образом исходные культуры тест-штаммов хранят при Т 4 6 °C и используют по мере необходимости. Для получения рабочей культуры исходную культуру тест-штамма из запаянной пробирки высевают на такое количество пробирок с соответствующей средой для последующего хранения, которое позволит обеспечить необходимый контроль питательной среды. Рабочую культуру хранят при Т 4 - 6 °C не более 3 - 6 месяцев в условиях, предохраняющих культуру от высыхания. Для посева на испытуемые среды используют культуры тест-штаммов, прошедшие не более 2-х пассажей на питательных средах. Проверка тест-штаммов на диссоциацию а) Визуальный просмотр колоний на чашках и в микроскопе в "косонаправленном" свете. б) Проба кипячением 2-х млрд. взвеси микробных тел агаровой культуры в физиологическом растворе на водяной бане в течение 1 часа (учет результатов и агглютиноскопа). Взвесь культуры должна быть гомогенной. в) Эмульгирование агаровой культуры на стекле в 0,85% и в 4% растворах NaCl, а также в растворе трипофлавина 1:1000 (для культур, не содержащих поверхностных К-антигенов). Культура не должна хлопковаться. г) Специфическая реакция агглютинации на стекле с адсорбированными агглютинирующими специфическими сыворотками. Реакция агглютинации должна быть не менее чем на 3+. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И СКОРОСТИ РОСТА Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд. Культуры тест-штаммов, выращенные на скошенном агаре, смывают физиологическим раствором NaCl и подводят под оптический стандарт ГИСК им. Тарасевича, соответствующий 10 ед. мутности. В тех случаях, когда не определен коэффициент пересчета микробных клеток в единицы мутности, расчеты ведут от 10 ед. мутности по соответствующему разведению. Из исходной стандартной взвеси готовят 10-кратные разведения путем последовательного переноса не менее 0,5 мл культуры в 8 пробирок с 4,5 мл физиологического раствора, тщательно перемешивая и меняя стерильную пипетку после каждого "шага". -5 Из взвеси 4-х последних разведений (10 -6 , 10 -7 , 10 -8 , 10 ) по 0,1 мл из каждого вносят в 3 хорошо подсушенные чашки (пробирки) с плотной средой или 3 пробирки с 10 мл жидкой (полужидкой) питательной средой <*>. -------------------------------<*> При посеве обогащения в жидкие (полужидкие) -4 посевы производят взвеси из разведений 10 питательные -5 , 10 -6 , 10 среды -7 , 10 по 1 мл в каждую пробирку с 9 мл среды. При посевах на чашки и пробирки с плотной средой взвесь культуры распределяют по поверхности среды, используя для каждой чашки новый шпатель, а на пробирках со скошенным агаром взвесь культуры распределяют путем обкатывания. Метод обкатки можно использовать и для чашек. Посевы помещают в соответствующие условия выращивания. После инкубации производят учет результатов, чувствительность среды определяют по наибольшему разведению, обеспечивающему формирование колоний или визуально видимый рост на всех засеянных чашках (пробирках) с питательной средой <*>. -------------------------------<*> При определении показателя чувствительности в жидких средах обогащения в случае отсутствия визуально обнаруживаемого роста после соответствующей инкубации посевов из каждой пробирки производят высев на чашки с питательным агаром, разделенным на 4 - 8 секторов, на каждый из которых засевают по одной петле культуры из каждой пробирки с жидкой средой. Учет результатов скорости роста культуры в каждом взятом в опыт разведении микробной взвеси производят для плотных сред через 12 - 24 - 48 часов инкубации, для жидких (обогащения) через 3 - 6 и далее часов. Показатель скорости роста определяют по минимальному времени инкубации посевов, за которое при соответствующем разведении обеспечен отчетливый видимый невооруженным глазом рост культуры (помутнение, наличие пленки, осадка, роста по уклону и др.) во всех засеянных пробирках с жидкими (полужидкими) питательными средами или формирование Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд. типичных, легко дифференцируемых колоний на чашках (пробирках) с плотной средой. Определение стабильности биологических свойств культур Определение этого показателя проводят на чашках, где выросло не менее 25 и не более 100 - 150 колоний. Изучают свойства культур, выращенных на питательных средах, по культуральноморфологическим, биохимическим, серологическим, фаголизабельным и другим признакам. При этом оцениваются: а) характер роста культур (равномерное помутнение среды, формирование пленки на поверхности среды, придонно-пристеночный рост, рост в виде осадка и др. в жидких средах. Равномерное, зональное помутнение среды, рост по уколу, сталактитовый рост, в виде елочки в др. в полужидких средах; форма, структура, характер роста колоний, диаметр (измеряется с помощью микрометра или циркуля-измерителя, средний диаметр вычисляется из 5-ти измерений на каждой чашке. Диаметр колоний в популяции не должен отличаться более чем в 2 раза) - на плотных средах); б) морфология микробов - форма (кокки, палочки, отсутствие полиморфизма в размерах, окраске и др.): - расположение (одиночное, парное, гроздевидное, цепочки и др.); - строение (наличие капсулы, жгутиков, спор, включений и др.); - подвижность; в) серологические признаки изучают в реакции агглютинации на стекле с видовыми (рецепторными) агглютинирующими сыворотками, с антительными диагностикумами или с люминесцирующими сыворотками, с антительными диагностикумами или с люминесцирующими адсорбированными сыворотками. Проверяют физико-химическое состояние клеток - стабильность взвеси микробов (отсутствие спонтанной агглютинации) в растворе трипофлавина, в 0,85% и 4% растворах NaCl; г) H S и биохимические свойства (ферментация углеводов, образование 2 индола и др.), пигментообразование; д) фаголизабельность; е) биологические свойства (гемолиз и др.). Названные свойства определяют по общепринятым методикам. По п. п. "в", "г", "д" изучают не менее чем 3 колонии с каждой чашки. Определение дифференцирующих свойств Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд. Дифференцирующие свойства среды определяют по следующим тестам: а) выраженности дифференцирующего признака - структура колоний, изменение цвета колоний или цвета среды под колониями, ореол вокруг них, диаметр последнего, появление диффузного изменения цвета среды; б) четкости дифференциации колоний группы патогенных микроорганизмов от микробов непатогенных видов, входящих в тот же систематический таксон, и от естественных ассоциантов при посеве смесей. Для оценки дифференцирующих свойств среды готовят смесь из штамма каждого возбудителя и одного из штаммов непатогенных микробов. Испытывают два варианта смесей патогенного и непатогенного микробов в отношении 1:1 и 1:10. Высев из каждой смеси производят по 0,1 мл на 3 чашки с опытной средой. Первая смесь необходима для учета четкости дифференциации, вторая - для оценки возможности выделения единичных патогенных возбудителей из смеси с другими микроорганизмами. Дифференцирующие свойства сред, используемых для идентификации чистых культур, определяют качественно набором штаммов с положительными и отрицательными признаками по соответствующим тестам. Определение показателя ингибиции Ингибирующие свойства среды определяются как по отношению к патогенной флоре, так и по отношению к микробам-ассоциантам. При определении показателя ингибиции в отношении микробов-ассоциантов посевная доза этих микробов должна превышать посевную дозу патогенной флоры в 10 раз для слабо элективных и в 100 раз (и более) для селективных сред. Смесь готовится путем соединения 1 мл взвеси, содержащей в посевной дозе 100 микробных клеток возбудителя, и 1 мл взвеси одного из микробовассоциантов, содержащего 1000 и 10000 м.к. Из указанных смесей производят высев по 0,1 мл на 3 чашки (каждый штамм смешивается с патогенным возбудителем отдельно). Ингибирующее действие жидких селективных (элективных) питательных сред обогащения определяют по отношению к патогенной и к соответствующей непатогенной микрофлоре с использованием монокультур и их смеси. С этой целью по 1 мл взвеси, содержащей 10, 100 и 1000 м.к. чистой культуры патогенного, 1000, 10000 м.к. (и более) чистой культуры непатогенного микробов, вносят в три параллельные пробирки (с 10 мл среды) каждого разведения. Одновременно в 3 пробирки с 10 мл испытуемой среды вносят это же количество микробных клеток патогенного возбудителя в смеси с 1000, 10000 и 100000 м.к. непатогенного микроба. Через 3 - 6 и более часов инкубации производят высев из каждой пробирки с посевами чистых культур и из смесей по 0,1 мл на чашки с соответствующей средой для последующей идентификации и через оптимальный срок инкубации учитывают результат (аналогично тому, как для плотных сред). Определение показателя эффективности Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд. а) Оценку качества белковых основ по показателю эффективности на моделях жидкой питательной среды производят путем определения концентрации микробной взвеси в среде через соответствующий срок инкубации по изменению показателя оптической плотности (на спектрофотометре или ФЭКе). б) На модели плотной питательной среды эффективность определяют по следующей методике: 18 - 20-часовую культуру смывают с плотной среды физиологическим раствором хлористого натрия и взвесь доводят до 10 ед. оптического стандарта мутности ГИСК им. Тарасевича. Полученную взвесь разводят физиологическим раствором в 2 раза, что соответствует приблизительно 500 млн. микробных тел в 1 мл (5 ед. стандарта). 0,1 мл этого разведения засевают на 2 пробирки со скошенным испытуемым агаром (скашивают таким образом, чтобы в нижней части пробирки не было столбика). Через 20 часов роста при 37 °C культуры смывают с поверхности агара 2,5 мл физиологического раствора. Добавление физиологического раствора, которое пошло на это разведение, плюс 0,5 мл взвеси культуры в физиологическом растворе и составят выход микробных тел (в млрд.) с 1 мл среды. Пример: 2,5 мл физиологического раствора смывают культуры с 5 мл питательного агара. Следовательно, на 1 мл питательного агара приходится 0,5 мл взвеси культуры. Для разведения 0,5 мл взвеси культуры до содержания 1 млрд. микробных тел (10 ед. стандарта) пошло 3,2 мл физиологического раствора. Следовательно, в пробирке будет содержаться 3,2 мл физиологического раствора плюс 0,5 взвеси культуры, т.е. всего 3,7 мл. Выход микробных тел с 1 мл среды составит соответственно 3,7 млрд. м.к. в) В жидких (полужидких) средах обогащения определение накопительного эффекта проводят по следующей методике: Разведение соответствующих тест-штаммов проводят по методике, описанной -4 5 - -6 для определения чувствительности. Из разведений культур в 10 10 , , 10 , -7 10 до жидкой 1 (полужидкой) разведения мл взвеси испытуемой производят высев питательным агаром для посевной из по 0,1 определения дозе, необходимого возбудителя в для каждого вносят в 3 - 5 пробирок с 10 мл средой. Параллельно из каждого мл взвеси культуры на 3 - 5 чашек с числа жизнеспособных микробных клеток в последующего вычисления прироста средах обогащения. После соответствующей инкубации посевов в среде обогащения (3 - 6 и более часов), Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд. независимо от видимых ее изменений, из каждой пробирки производят высев на чашки с питательным агаром (по 0,1 мл на чашку). В случае обильного роста культуры в жидкой среде ее перед посевом на чашки необходимо развести. Степень разведения учитывают при обсчете результатов. Через 18 - 20 и более часов инкубации производят подсчет сформировавшихся колоний на чашках, засеянных из исходных взвесей культур и из жидких сред обогащения. Прирост числа микроорганизмов при размножении в среде обогащения в процессе инкубации посевов в течение соответствующего времени (t) определяют по формуле (в %): n - n t o J = ------- x 100, n t где: n - число колоний на чашках, засеянных из жидких сред после инкубации; t n - число колоний при высевах исходных взвесей культур. o В процессе отработки методов контроля следует шире использовать методы статистической обработки данных при определении количественных величин для показателей (определение средних величин, средних квадратичных отклонений, вычисление коэффициента вариации, определение доверительных интервалов и статистической значимости разницы средних величин на контрольной и опытных средах). Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
