Изобретение относится к биологии и медицины, а именно к

Изобретение относится к биологии и медицины, а именно к вирусологии.
Известны способы ингибирования инфекционного процесса, вызванного ортомиксо- (вирусы гриппа) и
парамикеовирусами, веществами, способными подавлять репродукцию указанных вирусов: амантадином [1],
рибавирином [2], интерфероном [3J.
Наиболее близким к заявляемому является способ воздействия на организм ингибиторами протеиназ
путем параентеральных инъекций препаратов амантадинового ряда, приготовленных в аэрозольной форме
[3]. Однако недостаток этой группы соединений и композиции состоит в избирательности противовирусного
действия. Соединения этого ряда активны лишь в отношении вирусов гриппа типа А и неактивны против
вирусов гриппа В, пара-миксовирусов и многих други х вирусов.
Для преодоления этого недостатка и создания средства против широкого спектра респираторных вирусов
разработана газо-водобелковая композиция (аэрозоль) с ингибиторами протеиназ. Технический уровень
достигается тем» что в составе предлагаемой трехфазной смеси активное белковое вещество - ингибиторы
протеиназ (апротинины) - приобретают новые полезные свойства. Такая газоводобелковая смесь оказывала
выраженное лечебное действие при поступлении на респираторный тракт животных, инфицированных
вирусами различных групп (вирусами гриппа типов А, В, парамикеовирусами). Активность смеси проявлялась
при незначительных концентрациях белкового компонента (активного вещества).
В качестве активного вещества в предлагаемой смеси использованы природные ингибиторы протеиназапротинины. Апротинины и апротинино-подобные ингибиторы - это природные белковые соединения,
ингибирующие широкий спектр протеиназ [4]. Имеются официальные препараты апротининов - Gordox
(Gedeon Richter), Contrycal (Germed), Trasyfol (Bayer AG), Aritagosan (Behring), Источником выделения
апротининовых ингибиторов служат органы различных животных [4,5]. Ранее делались попытки создать
противовирусные средства на основе этих соединений [6,7]. Для достижения противовирусного и лечебного
эффекта (подавление легочной патологии, защита животных от гибели и т.д.) применялись внутрибрюшинные
инъекции высоких доз ингибиторов протеиназ, 10000-15000 Калликреин ингибирующих единиц
(КИЕ)/особь/сутки либо 1000-1500 Трипсин ингибирующи х единиц (ТИЕ) /особь/сутки препаратов апротинина Contrycal, Antagosan или Gordox. При парентеральных инъекциях апротининовые полипептиды всасываются в
кровяное русло, где связываясь с различными белками крови, изменяют свои физико-химические
(заряд/степень ионизации, конформационную структуру и т.д.) и функциональные характеристики, Такое
белковое комплексирование может приводить к маскированию и ингибированию активности апротининов и к
блокированию прохождения комплексов из крови в респираторный тракт. В результате, трансформируется
механизм противовирусного действия и снижается лечебный эффект.
В предлагаемом способе посредством перевода ингибиторов протеиназ в трехфазную смесь и
воздействий этой смесью через респираторный тракт на организм получено усиление лечебного эффекта.
Аэрозоль апротининов оказывал более сильное лечебное и заметное профилактическое действие при дозах
в ~100 раз более низких, чем при парентеральных инъекциях. Усиление лечебной функции апротининов
вероятно обусловлено структурными превращениями молекулы активного вещества. При переходе в форму
газоводобелковой смеси меняются конформация и ионизация молекулы апротинина особенно на границе
раздела фаз (воздух-аэрозольная частица). Индуцированные аэрозолизацией структурные превращения по
свей вероятности ведут к появлению новых физиологических механизмов и качественному усилению
лечебного действия апротининов и апротинино-подобных ингибиторов.
Пример.
Вирусы и заражение животных. Патогенные для мышей вирусы гриппа A/Aichl/2/68[H3N2], B/Hong Kong/72
и парамиксовирус Сендай/960 размножали в 9-дневных куриных эмбрионах. При изучении
химиотерапевтического и профилактического эффекта аэрозоля апротинина использовали 1, 10 или 200 0%
мышиных летальных доз (МЛД50) вир уса, вводимого мышам интраназальными инъекциями, либо
ингаляциями вирусного аэрозоля.
Получение газоводобелковой смеси (аэрозоля) и расчет доз. Источником создания смеси служил
ультразвуковой генератор типа Муесон-1 либо пневматический генератор эжекторного типа, снабженный
системой подачи воздуха. В последнем случае скорость принудительной подачи аэрозольной смеси в камеру
(Vc) составляла 9 л/мин, интенсивность распыления раствора апротинина (Qa)-0,1 мл/мин. Распыляемый
раствор (Са) содержал: 1000-10000 Калликреин Ингибирующих Единиц (КИЕ) в мл [Gordox] либо 100-1000
Трипсин Ингибирующи х Единиц (ТИΕ) на мл [Contrycal, Antagosan]. В ряде опытов для повышения
стабильности аэрозоля и улучшения его адсорбции в дыхательных путя х в раствор для распыления
добавляли NaCI, глицерин, неионный детергент (твин-80, тритон Х-100 и др.) до конечных концентраций 5-150
мкМ, 0,05-10%, 0,01-5,0%, соответственно.
Концентрация препарата в газо-водной смеси, поступающей в камеру, рассчитанная по формуле
Cc=Ca*Qa/Vc, составляла 0,09-0,9 КИЕ/мл и 0,009-0,09 ТИЕ/мл. Основная часть опытов выполнена с
концентрацией ~ 0,18 КИЕ/мл воздуха. Дозу, полученную каждой мышью, рассчитывали по формуле Guyton
D*Cc*Ct*P*V*t*R [3]. Сс - относительная кумулятивная концентрация препарата в камере за отрезок времени
t:P - масса мыши (6-10 г); V - удельный дыхательный объем мыши (1,2 мл /г/мин); R - коэффициент задержки
частиц аэрозоля в респираторном тракте мыши (0,75). Поскольку скорость принудительного оттока воздуха из
камеры равнялась со скорости подачи аэрозоля в камеру, коэффициент Ct принимали равным 1, в результате
проведенного расчета получили среднюю дозу апротинина 50-150 КИЕ/мышь/сутки (5-15 КИЕ на г веса мыши
в сутки). 1 КИЕ соответствует примерно 0,33 ТИЕ и адекватна 0,14 мкг белка [4,5].
В системе с ультразвуковым генератором определенные дозы аэрозоля естественным током воздуха (710 л/мин) направляли в камеру, создавая в ней газово добелковую атмосферу, которую вды хали мыши.
Мо щность распыления составляла около 0,5 мл/мин. Варьируя временем экспозиции мышей в.смеси
ингаляционные дозы ингибиторов подбирали близким к таковым в пневматической системе (см. выше). На
основании расчетов было установлено, в создаваемой газоводобелковой смеси состав ингредиентов
колебался в следующи х диапазонах: в 1 мл смеси белковый компонент содержался в количестве 0,01-0,9 КИЕ
Или 0,001-0,09 ТИЕ; вода 0,01-0,2 мг, а остальной объем газ.
Используемые аэрозоли имели дисперсность, необходимую для эффективного проникновения и
адсорбции в различных отделах респираторного тракта. При этом в пневматическом режиме распыления
~95% частиц имели диаметр до 1,9 мкм (см. фиг. 1), а при ультразвуковом - частицы имели размеры до 100
мкм, при этом частицы до 5 мкм составляли около 90% (заводская техническая характеристика генератора).
Следует отметить, что в пневматическом режиме, когда мелкодисперсный аэрозоль подается в камеру током
воздуха, основная часть (до 90%) частиц высыхает, уменьшая свои размеры [9]. В этом случае в аэрозольном
облаке доминировали сухие частицы (сухой аэрозоль), а концентрация воды в смеси составляла около 0,01
мг/мл. В ультразвуковом режиме имел место процесс частичной конденсации аэрозоля, а аэрозольное облако
имело свойства влажности аэрозоля. Положительный лечебный эффект удавалось получить при
использовании как сухого, так и влажного типов аэрозоля, однако сухой аэрозоль переносился более
благоприятно.
Эксперименты по оценке лечебного и профилактического эффекта газоводобелковой смеси ингибиторов
протеиназ.
Инфицированных мышей экспонировали в камере с аэрозолем апротинина по 20-40 мин 3-4 раза вдень в
течение 5-7 дней. Патологические изменения в легких оценивали на 5-ый день инфекции, когда
интенсивность воспаления и титры вируса в легких близки к максимуму. С этой целью у 2 особей из каждой
группы извлекали легкие и проводили гистологическое и визуальное рассмотрение, На рис. 2А представлены
результаты эксперимента с вирусом гриппа A/Aichi/68. У контрольных мышей, получавши х ингаляции газоводной смеси без апротинина, обнаруживалось тотальное геморрагическое воспаление, которое поражало
практически полностью (100%) легочную ткань. У мышей, получавших газоводобелковую смесь с
апротинином, интенсивность воспаления была менее выраженной, а геморрагическое воспаление
захватывало 30-50% площади легкого. Сходное снижение легочных поражений отмечалось при
гистологическом и макроскопическом обследовании мышей, зараженных вирусом Сендай (фиг. 2Б) и В/НК/72
(фиг. 2D) и леченных по аналогичной схеме аэрозолем апротинина. При внутрибрюшинном введении
препарата Contrycal в дозе 1000-1500 THE /особь/ сутки либо 10000-15000 КИЕ /особь/ сутки препарата
Gordox мышам, заражённым ~ 200 МЛД50 вир уса A/Alcht/68 или Сендай/960, отмечалось более заметное
поражение легких, которое визуально оценивали в 40-60% (см. фиг. 2В, Г). Таким образом, аэрозольная доза
50-150 КИЕ апротинина в форме газоводобелковой смеси ингибировала развитие патологии в легких более
эффективно, чем парентеральные инъекции 10000-15000 КИЕ раствора апротинина.
Критерием лечебного эффекта служила также величина прибавки веса тела животных, которая, как
установлено, является показателем их выздоровления [8]. Как видно на фиг. 3, у здоровых
(неинфицированных) животных прибавка в весе составляла около 1 г/день. В группе мышей, заражённых
летательной дозой вируса гриппа A/Aichi/68 (около 200 МЛД50 /особь) регистрировалась задержка веса тела и
затем его падение, связанное с гибелью животных. В группе леченных животных в первые дни инфекции
отмечался лишь небольшой прирост в весе, а с 5 дня инфекции прибавка в весе составляла около 1 г/день,
что указывало на выздоровление животных. С ходное соотношение изменений веса контрольных и леченных
аэрозолем мышей наблюдалась при их заражении вирусом Сендай. Таким образом, применение газо-водной
смеси апротинина у животных, страдающи х инфекцией респираторного тракта, оказывает положительный
лечебный эффект, который проявляется в быстрой нормализации прибавки веса тела животных.
На заключительном этапе работы оценивали защитное действие аэрозольной смеси апротинина в опытах
со смертельной дозой вирусов гриппа A/Aichi/68, В/НК/72 или Сендай/960. Во-первых, следует иметь в виду,
что вирус гриппа В/НК/72 менее смертелен для мышей, чем два других вир уса. На фиг. 4 показано, что
аэрозоль апротинина спасал от гибели ~ 50% мышей при инфекции ~ 1МЛД50 вир уса В/НК/72. Во-вторых,
поскольку при заражающих дозах 1-10 МЛД50 вирусов гриппа А и Сендай оба способа лечения
(парентеральные инъекции и ингаляции газоводной смеси) давали защиту около 90-100%, для сравнения
указанных способов лечения применяли массивные дозы заражения около 200 МЛД50/мышь. Как видно на
фиг. 4 А, Б, в гр уппе нелеченных животных наблюдалась 100% гибель к 5-7 дню при гриппозной (панель А) и к
6-8 дню при парамиксовирусной (Б) инфекциях. У леченных животных, во-первых, отмечалась задержка
гибели на 1-4 дня в сравнении с контрольными мышами и, во-вторых, регистрировался защитный эффект на
уровне 40-50%. В параллельной группе мышей, леченных внутрибрюшинными инъекциями апротинина
(15000 КИЕ/мышь/сутки - дробно 5-6 инъекций в сутки в течение 7 суток), протективный эффект составил
~27% (см. фиг. 4В). Результаты этой серии экспериментов окончательно подтвердили вывод о высокой
лечебной эффективности аэрозольного применения низких доз газоводобелковой смеси апротинина.
Для оценки профилактического действия газоводобелковой смеси ставили эксперименты на
незараженных мышах (10 особей), к которым подсаживали две мыши, зараженные вирусом гриппа
A/Aichl/2/68 со множественностью около 0,1 МЛД50/мышь. Такие группы из 12 особей обрабатывали
газоводобелковой смесью с и без апротинина в течение 6-7 дней 3-4 экспозиции вдень по 30-40 мин. На 8-ой
день проводили исследование легких мышей. В контрольной группе, получавшей смесь без апротинина,
выявлялись очаги воспаления в легких и в ряде случаев удавалось обнаружить вирус в легких мышей. У
получавши х газо-водо-белковую смесь вирус и очаги легочного воспаления не обнаруживались. Таким
образом, в этой гр уппе наблюдалось профилактическое действие газоводобелковой смеси с ограничением
передачи вируса от больных мышей здоровым.
Начальные клинические испытания, выполненные во время вспышки гриппа, вызванной вирусом гриппа
типа Η3Ν2, показали лечебную эффективность апротинина (препарат Gordox) при ингаляционном
применении газоводобелковой смеси и закапывании раствора в нос у больных гриппом детей. Отмечалось
сокращение антигеноносительства: у нелеченных больных вирусные антигены выявлялись в носоглотке в
среднем около 6 дней, а у леченных респираторными истилляциями апротинина оно сокращалось до 3 дней.
Это указывает на более раннее освобождение организма от вируса. Применение газо-водной смеси
апротинина на 2-3 дня укорачивало продолжительность симптомов заболевания (насморк, кашель, катар
верхних ды хательных путей и т.д.) и предотвращало возникновение вторичных осложнений.
Газо-водная смесь ингибиторов протеиназ может иметь широкое использование в медицине и
ветеринарии в качестве профилактического и лечебного средства против широкой группы вирусов (гриппа,
парагриппа, пневмовирусов, кори, паротита, респираторно-сцинтиального вируса, коронавирусов,
риновирусов, аденовирусов и др.) - возбудителей многих болезней респираторного тракта человека и
животных. Предлагаемый способ противовирусной защиты открывают новое направление в разработке
средств на основе газо-водо-белковых смесей, содержащих комбинации веществ с различным механизмом
антивирусного действия.
На фиг. 1 дан график дисперсионного профиля аэрозоля апротинина, поступающего в ингаляционную
камеру.
Диаметр частиц и их весовое содержание в аэрозоле регистрировалось лазерным контроллером (Malvern
Instruments LTD, England). Ордината - относительное весовое содержание частиц данного размера в
аэрозоле. Абсцисса - категории частиц: 1 (с диаметром от 1,2 до 2,3 мкМ), 2 (2,4-3,0), 3(3,0-4,0), 4(4,0-4,8), 5
(4.8-6,2), 6(6,2-7,9), 7(7,9-10,1), 8(10.1-13.0), 9(13,8-16.7). 10(16,7-25,0), 11(25,1-35.0), 12(35,1-42.0), 13(42.153,5). 14(53,6-90.5).
Как видно, аэрозоль содержал довольно гомогенную капельную суспензию с диаметром частиц 1,5-35,0
мкМ, в которой доминировали частицы с диаметром 1,2-4,0 мкМ (75% аэрозоля по массе). Частицы такого
размера, как известно, эффективно проникают в дистальные отделы органов дыхания и практически лишены
способности укрупняться от соодурений и оседать в респираторном тракте.
На фиг. 2 показана патология легких мышей, зараженных ортомиксо- или пара-миксовирусом и леченных
ингаляциями апротинина.
Мышей заражали вирусом A/Aichl/2/68 (А, В) или Сендай/960 (Б, Г) в дозе ~200 МЛД50/мышь и затем в
течение 6 дней проводили ингаляции (А,Б) - физиологического раствора (.1) или Gordox (2) по 40 мин - 4 раза
в день по стандартной схеме; либо внутрибрюшинно вводили физ. раствор (1) или Gordox (2) [~15000
ШЕ/мышь/сутки - 5-6 инъекций в сутки в течение 7 дней]. На 4-ый день инфекции у 2-ух мышей из каждой
группы легкие извлекали и фотографировали. 3 - легкие неинфицированных мышей.
На фиг. 3 представлена динамика изменений веса тела мышей, зараженных орто-миксо- или
парамиксовирусом и леченных ингаляциями апротинина. Мышей (по 20 особей в группе) заражали вирусом
/Aichl/2/68 и Сендай/960 дозой вируса ~200 МЛД50 на мышь и экспонировали в аэрозоле апротинина по
стандартной методике. В ходе инфекции проводили измерения веса тела и средние значения (г) откладывали
по оси ординат; по оси абсцисс -дни после заражения. 1 - вес неинфицированных мышей. 2 - вес зараженных
мышей, леченных апротинином, 3 - вес контрольных мышей (ингаляции физ. раствора).
На фиг 4 показан протективный эффект ингаляций апротинина у мышей, инфицированных ортомиксо- и
парамиксо-вирусами.
Мышей заражали вирусом /A/Alchl/2/68 (А, Б) и вирусом Сендай/960(Б) со множественностью около 200
МЛД50/особь и далее в течение 6,5 дней проводили курс имгаляций апротинина (А.Б) либо внутрибрюшинных
инъекций по стандартной схеме. В ходе инфекции регистрировали выживаемость животных. Ордината количество живых мышей (кумулятивный процент); абсцисса - дни после заражения. Кривая 1 - контрольные
(нелеченные мыши); 2 - мыши, леченные апротинином.