020171 B1 020171 B1 (11) 020171

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
020171
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации и выдачи патента
2014.09.30
(21)
Номер заявки
(51) Int. Cl. C12N 15/62 (2006.01)
C12N 15/63 (2006.01)
A61K 38/18 (2006.01)
200901497
(22)
Дата подачи заявки
2009.11.09
(54)
СЛИТЫЙ БЕЛОК, СОДЕРЖАЩИЙ ФАКТОР РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ ИЛИ
ЕГО ФРАГМЕНТ И РЕЦЕПТОР ФАКТОРА РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ ИЛИ ЕГО
ФРАГМЕНТ, И ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ
ЗАБОЛЕВАНИЙ ИЛИ СОСТОЯНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ПАТОЛОГИЕЙ СОСУДОВ
B1
020171
Изобретение относится к медицине и включает композиции, способ лечения и профилактики
заболеваний сосудистого генеза через стимуляцию роста новых сосудов. Для этого в
фармацевтически приемлемой форме вводится композиция, главной составляющей которой
является принципиально новый белок или пептид, стимулирующий рост сосудов в ткани.
Данный белок не существует в природе и его невозможно классифицировать, так как
он имеет в структуре часть фактора роста и часть рецептора фактора роста и/или Fcфрагмент иммуноглобулина, например фактора роста фибробластов или фактора роста эндотелия
сосудов, или другие факторы. Это делает изобретение отличным от всех представленных.
Способ лечения заболеваний сосудистого генеза подобным высокофункциональным белком
представляется наиболее эффективным в связи с воздействием на несколько мишеней,
разрешением ишемии, недостаточного кровоснабжения (кровенаполнения). Также данная
композиция может использоваться в приготовлении вакцин и других препаратов для лечения
заболеваний, характеризующихся повышенным образованием сосудов, например опухолевых и
аутоиммунных.
B1
(57)
(56) NICHOLAS VAN BRUGGEN et al., "VEGF
antagonism reduces edema formation and tissue
damage after ischemia/reperfusion injury in the mouse
brain", The Journal of Clinical Investigation, 1999, v.
104, No. 11, p. 1613-1620
WO-A2-2000042179
YAN Jingliang et al., "Rap1a is a key regulator
of fibroblast growth factor 2-Induced angiogenesis and
together with rap1b controls human endothelial cell
functions", Molecular and Cellular Biology, 2008, v.
28, No. 18, p. 5803-5810
020171
(43) 2011.06.30
(96) 2009000104 (RU) 2009.11.09
(71)(72)(73) Заявитель, изобретатель и патентовладелец:
ТИМОФЕЕВ ИЛЬЯ ВАЛЕРЬЕВИЧ
(RU)
020171
Краткое описание изобретения
Изобретение относится к медицине и включает композиции, способ лечения и профилактики заболеваний сосудистого генеза через стимуляцию роста новых сосудов. Для этого в фармацевтически приемлемой форме вводится композиция, главной составляющей которой является принципиально новый
белок или пептид, стимулирующий рост сосудов в ткани. Данный белок не существует в природе и его
невозможно классифицировать, так как он имеет в структуре часть фактора роста и часть рецептора фактора роста и/или Fc-фрагмент иммуноглобулина, например, фактора роста фибробластов или фактора
роста эндотелия сосудов либо других факторов. Это делает настоящее изобретение отличным от всех
представленных. Способ лечения заболеваний сосудистого генеза подобным высокофункциональным
белком представляется наиболее эффективным в связи с воздействием на несколько мишеней, разрешением ишемии, недостаточного кровоснабжения (кровенаполнения). Также данная композиция может
использоваться в приготовлении вакцин и других препаратов для лечения заболеваний, характеризующихся повышенным образованием сосудов: опухолевых и других.
Полное описание изобретения
Известно, что в основе развития многих сердечно-сосудистых заболеваний лежит недостаточное
кровоснабжение ткани или органа, связанное с нарушением поступления крови по сосудам в силу разных
причин. В результате развивается ишемия ткани/органа и, в конечном итоге, происходит нарушение
функции. Примерами таких заболеваний могут быть ишемическая болезнь сердца, ишемический инсульт
мозга, ишемическая болезнь почек, эректильная дисфункция сосудистого генеза, осложнения тромбозов
сосудов конечностей и другие. Большинство современных методов терапии направлено на ликвидацию
осложнений ишемии и симптомов.
В настоящем изобретении предлагается способ лекарственного лечения и профилактики ишемии,
основанный на стимуляции роста новых сосудов и возобновлении кровоснабжения ткани и органа с помощью фармацевтических композиций, которые содержат белок с активной частью "фактор N/рецептор
фактора N и/или Fc-фрагмент иммуноглобулина", где N - любой фактор, стимулирующий рост сосудов
или компонентов сосудистой стенки. Также данная композиция может использоваться в приготовлении
вакцин и других препаратов для лечения заболеваний, характеризующихся повышенным образованием
сосудов: опухолевых, аутоиммунных и т.п.
Одним из факторов, из которых будет составлена композиция, например, может быть фактор роста
фибробластов (ФРФ) и его рецептор.
Впервые ФРФ был обнаружен в экстрактах гипофиза в 1973 году (Н. Armelin, PNAS 70, 9 (1973)).
ФРФ относятся к семейству гепаринсвязывающих полипептидов, модулирующих функции различных клеток. ФРФ оказывает сильное влияние на пролиферацию и дифференцировку эндотелиальных
клеток. В настоящее время выделяют 23 члена семейства ФРФ (ФРФ 1-23). Каждый член семейства имеет свои функциональные особенности. По многочисленным данным пролиферация эндотелиальных и
гладкомышечных клеток сосудов может быть вызвана ФРФ 1 и 2 типов (кислый и основной). Для того
чтобы оказать воздействие на клетки, ФРФ должен связаться с рецептором на ее поверхности. Существуют 4 типа рецепторов ФРФ (ФРФР 1-4). С ФРФР1 связываются не только ФРФ 1 и 2, но и большинством других членов этого семейства, поэтому роль этого рецептора в проведении сигнала в клетку считается наиболее значимой.
В примере 1 показана выраженная экспрессия ФРФР1 на эндотелиальных клетках, подтверждающая значение данной мишени. Задачей настоящего исследования являлось изучение уровня экспрессии
рецептора-мишени ФРФР1 на эндотелиоцитах человека.
Эндотелиоциты формируют важнейший слой сосудистой стенки и соответственно являются мишенью терапии.
Экспрессия рецепторов на сосудах разных тканей человека (кожа, селезенка, миокард, кавернозные
тела, почка) изучалась путем иммуногистохимического анализа. Также была изучена экспрессия рецепторов для белка на стандартной модели HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены человека).
Во всех случаях (100%) была выявлена высокая экспрессия рецептора-мишени на эндотелиальных
клетках (3 креста). Окрашивание носило как мембранный, так и ядерный характер (100 и 82% соответственно), что характеризует значимость настоящего пути.
Данный рецептор на клетках сосудов может быть мишенью терапии.
ФРФР1 состоит из надмембранной, внутримембранной и внутриклеточной частей.
Надмембранная часть рецептора состоит из 3 доменов (Д I-III), подобных иммуноглобулину. ФРФ,
как правило, взаимодействуют с Д II и III; гепаран-сульфат, участвующий в формировании комплекса
ФРФ/ФРФР1, взаимодействует с Д3. Альтернативный мРНК сплайсинг способствует образованию на
поверхности клетки нескольких вариантов ФРФР1 (D. Johnson, L. Williams. J. Adv. Cancer Res., 60, 1
(1993); McKeehan et al. J. Prog Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 59, 135 (1998). Внутриклеточная часть рецептора представлена тирозинкиназой, при аутофосфорилировании которой происходит дальнейшее проведение сигнала в ядро и деление клетки.
Создание лекарственной композиции на основе слияния ФРФ и ФРФР в единый белок может значительно повлиять на ангиогенные свойства по сравнению с исходным ФРФ.
-1-
020171
В качестве примера 2 представлена аминокислотная последовательность такого белка (фиг. 1).
Подобные химерные белки можно создавать на основе других факторов роста (фактора роста эндотелия сосудов и прочих). При этом комбинация фактора роста может быть как со своим рецептором или
его частью, также и с рецептором для другого фактора, и/или с другим фактором, и/или с Fc-фрагментом
иммуноглобулина.
Пример 3 демонстрирует пролиферацию эндотелиальных клеток под действием белка, состоящего
из ФРФ и ФРФР, аминокислотная последовательность которого была приведена.
Задачей настоящего исследования являлось изучение влияния белка ФРФ-ФРФР на пролиферацию
эндотелиальных клеток. В качестве модели эндотелиоцитов использовались бычьи клетки капиллярного
эндотелия коры надпочечников (КЭКН) (N. Ferrara et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 5773 (1987).
В начале мы выявили высокую экспрессию ФРФР1 на КЭКН в стандартном анализе вестернблоттинг (фиг. 2).
Затем КЭКН были высеяны с плотностью 5×104 клеток/мл в 12-луночных пластинках. В каждую
лунку был добавлен белок ФРФ-ФРФР 1 в разных концентрациях, начиная с 10 нг/мл (20, 40, 60, 100). В
качестве контроля КЭКН выращивались в отсутствие белка.
После роста культуры в течение 5 дней клетки в каждой лунке были подсчитаны с помощью компьютерной программы на анализаторе Hewlett Packard Scanjet (США).
Как показано на фиг. 3, белок ФРФ-ФРФР1 стимулировал рост и выживание бычьих КЭКН. Роста
КЭКН в отсутствии белка не было.
Таким образом, пример 3 показал, что 1) выявлена высокая экспрессия рецептора-мишени на
КЭКН; 2) под действием химерного белка эндотелиальные клетки размножаются и приобретают митогенную активность, что может приводить к ангиогенезу (в сравнении с контролем); 3) повышение митогенной активности может зависеть от дозы белка, стимулирующего путь фактор/рецептор фактора (чем
выше доза, тем выше митогенная активность).
Пример 4 демонстрирует повышение активности рецептора-мишени ФРФР1 на эндотелиоцитах при
связывании с химерным белком ФРФ-ФРФР1.
Задачей настоящего исследования являлось изучение активности рецептора-мишени на эндотелиоцитах при добавлении белка ФРФ-ФРФР1.
Для этого к описанным клеткам КЭКН был добавлен белок ФРФ-ФРФР1 в концентрациях 1-40
нг/мл. Культивирование происходило в течение 5 мин при температуре 37°С. Затем клетки были промыты и лизированы в специальном буфере для лизиса (50 ммоль HEPES (рН 7,4), 150 ммоль NaCl, 10% глицерол, 1% Тритон Х-100, 1,5 ммоль MgCl2, ингибиторы протеазы и 2 ммоль натрия ванадат). Инкубация
лизата проводилась на льду в течение 30 мин, а затем он был центрифугирован (13000 об/мин, в течение
10 мин при температуре 4°С). Концентрация белка в лизате была измерена в анализе Кумасси Плюс
(Pierce). После этого проводились иммунопреципитация/вестерн-блоттинг. Эти методы выполнялись по
стандартному протоколу (Santa Cruz Biotechnology, США) с использованием анти-фосфотирозин (4G10)
антител. Полученные пробы использовали для электрофореза с последующим выявлением копреципитированных белков в вестерн-блоттинге. Часть клеток без добавления белка использовалась для контроля.
Результаты представлены на фиг. 4. Показано, что изучаемый белок вызывает фосфорилирование
ФРФР1, тогда как в контроле без добавления белка фосфорилирования рецептора не происходит. Концентрации стимулирующего белка влияют на фосфорилирование ФРФР1: чем выше концентрация, тем
больше эффект. Таким образом, пример 4 демонстрирует, что 1) белок ФРФ-ФРФР1 вызывал значимое
аутофосфорилирование рецептора-мишени ФРФР1 по сравнению с контролем; 2) концентрация белка
влияла на фосфорилирование рецептора: чем выше концентрация, тем больше эффект.
Пример 5 показывает, что химерный белок ФРФ-ФРФР индуцирует терапевтический ангиогенез in
vivo.
Задачей исследования была оценка влияния белка ФРФ-ФРФР на развитие новых сосудов в зоне
ишемии у кроликов.
Белые новозеландские кролики были распределены в 2 группы в соотношении 2:1. Первая группа
(n=48) получила внутримышечные инъекции белка в дозе 25 мкг в зону ишемии. Вторая (контрольная)
группа кроликов (n=24) получила внутримышечные введения физиологического раствора с фосфатным
буфером в зону ишемии. В обеих группах применялась модель ишемии нижней конечности животных,
основанная на удалении поверхностной части бедренной артерии и лигировании возвратных ветвей для
блокирования образования коллатералей. Вводимый белок был хорошо очищен от токсинов и культуральной среды, а также от микроорганизмов. Физиологический раствор был стерилен. Оценка ишемии и
плотности сосудистого рисунка производилась по МРТ с контрастированием в динамике. Ангиография
выполнялась для изучения роста коллатералей. УЗИ с допплерографией использовалось для оценки кровотока в конечности. Окончательные результаты по развитию сосудов были сделаны на основании
вскрытия кроликов и проведения гистологического исследования. Также оценивалась концентрация белка ФРФ-ФРФР в плазме и эндогенное образование фактора роста.
-2-
020171
Результаты:
1) в группе, получающей белок ФРФ-ФРФР, через 3 недели наблюдалось статистически значимое
коллатеральное ремоделирование в зоне ишемии с образование новых сосудов;
2) при гистологическом и иммуногистохимическом исследованиях выявлены достоверные ангиогенные эффекты белка, заключающиеся в пролиферации эндотелиоцитов, образовании из них сосудистых трубочек с последующим формированием мелких сосудов по типу капилляров (выявлены различные стадии формирования сосуда). В контрольной группе подобных эффектов не наблюдалось. При введении физиологического раствора единственными изменениями были некроз и воспалительные реакции;
3) наибольший рост новых сосудов отмечен в месте введения белка. Плотность сосудистого рисунка уменьшалась при удалении от места введения препарата;
4) белок достоверно стимулировал образование эндогенного ФРФ-2 в крови кроликов (с 0,8 до 10,3
нг/л), что может приводить к кумулятивному длительному эффекту. Таким образом, белок ФРФ-ФРФР
оказывает ангио- и артериогенное действие, способствует восстановлению кровоснабжения в зоне ишемии in vivo.
Пример 6 показывает, что под действием химерного белка ФРФ-ФРФР происходит пролиферация
компонентов стенки кавернозных тел полового члена in vivo.
Задачей исследования была оценка формирования новых компонентов сосудистой стенки под действием химерного белка в кавернозных телах полового члена кроликов с нарушенным кровенаполнением, а также определение у животных эндотелиальной синтазы оксида азота.
Белые новозеландские кролики (вес 3,5 кг) были рандомизированы соотношении 1:1:1 получать белок ФРФ-ФРФР в разных дозах или физиологический раствор. Все кролики имели нарушение кровенаполнения кавернозных тел, которые были индуцированы по модели гиперхолестеролемии.
Первая группа кроликов (n=10) получала белок в дозе 25 мкг. Вторая группа (n=10) получала белок
в дозе 100 мкг. Третья (контрольная) группа (n=10) получала физиологический раствор. Все инъекции
совершались однократно интракавернозно. Белок был высоко очищен от токсинов и микроорганизмов,
физиологический раствор - стерильным.
Эффект оценивался по пролиферации эндотелиоцитов, гладкомышечных клеток, коллагеновых волокон (гистологическое и иммуногистохимическое исследования). Также оценивалось эндогенное образование ФРФ-2 в плазме через 24 ч после введения белка.
Эндотелиальная синтаза оксида азота (фермент, регулирующий уровень оксида азота (NO) - важнейшего медиатора эректильной функции, участвующий в нейтротрансмиссии и регулировке кровообращения) анализировалась в гистологическом материале кавернозных тел иммуногистохимическим методом.
Результаты:
1) пролиферация эндотелиоцитов и гладкомышечных клеток в группах 1 и 2 была достоверно выше,
чем в группе 3 (пролиферации не отмечено). Достоверных статистических различий между группами 1 и
2 не выявлено, однако пролиферация гладкомышечных клеток была несколько больше в группе 2
(р=0,06);
2) уровень эндогенного ФРФ-2 в плазме увеличился в 2,8 раз - в группе 1, в 3,5 раза - в группе 2 по
сравнению с исходным (отличия достоверны). В группе 3 изменений не выявлено;
3) в группах, получающих белок, уровень синтазы оксида азота был достоверно выше по сравнению
с контрольной группой. Различий по данному показателю между лечебными группами не было.
На основании полученных результатов был сделан вывод, что белок ФРФ-ФРФР оказывает пролиферирующее действие на эндотелиоциты и гладкомышечные клетки кавернозного тела полового члена
при дисфункции сосудистого генеза, а также способствует активации важнейшего медиатора - синтазы
оксида азота.
Пример 7 демонстрирует, что химерный белок ФРФ-ФРФР может использоваться как антиген для
приготовления противоопухолевой дивалентной вакцины. Ранее нами было показано, что ФРФР1 экспрессируется на клетках опухолей и является мишенью терапии, а повышенный уровень ФРФ-2 в крови
онкологических больных может обусловливать устойчивость к противоопухолевой терапии (I. Tsimafeyeu et al. EJC Vol. 7:2, 2009, 427-428; I. Tsimafeyeu 8th Kidney Cancer Symposium Materials (2009)).
Создание противоопухолевых вакцин считается одним из перспективных направлений биотерапии рака в
настоящее время. Для создания вакцины необходим антиген. Попытки создать вакцину с использованием
ФРФР1 в качестве антигена имели место (Zheng Shaojiang et al. J. Huazhong University of Science and
Technology 26 (4) 2006). Для создания вакцины использовался рекомбинантный ксеногенный (куриный)
ФРФР1. Авторы показали в исследовании in vivo, что данный антиген может использоваться для активной иммунотерапии, так как способствует образованию аутоантител против ФРФР1 у мышей. В примере
7 мы показываем, что рекомбинантный человеческий белок, состоящий, например, из ФРФ-2 и ФРФР,
может быть лучшим антигеном и использоваться для создания дивалентной вакцины, что, несомненно,
увеличит эффективность средства.
Химерный белок ФРФ-ФРФР, полученный нами, и рекомбинантный человеческий белок ФРФР1,
-3-
020171
приобретенный в R&D Systems, были очищены, лиофилизированы и добавлены к гидроксиду алюминия
(адъювант). Содержание обоих белков было 10 мкг, гидроксида алюминия - 4 мг/мл.
30 BALB/c мышей (самки) были распределены в 3 группы в соотношении 1:1:1. Первая группа получала подкожные инъекции вакцины на основе белка ФРФ-ФРФР 1 раз в неделю в течение 4 недель.
Вторая группа получала подкожные инъекции вакцины на основе белка ФРФР1 1 раз в неделю в течение
4 недель. Третья группа была контрольной и получала подкожные инъекции физиологического раствора
в том же режиме. Во всех группах до введения и через 4 недели после введения антигенов измерялся
титр аутоантител против белков ФРФР1 и ФРФ-2 (Santa Cruz Biotechnology, США). Также изучалось количество антигенпрезентирующих клеток в селезенке мышей (ELISPOT). Титр аутоантител против
ФРФР1 между лечебными группами достоверно не отличался (р>0,1), однако был достоверно выше по
сравнению с контролем (р<0,0001). Титр аутоантител против ФРФ-2 был достоверно выше в группе, получавшей химерный белок ФРФ-ФРФР (р<0,0001). Отличий по данному показателю между группами,
получавшими ФРФР1 и физиологический раствор, не выявлено (р=0,8). Суммарно общий титр образовавшихся аутоантител был достоверно выше в группе с химерным белком (р<0,05). Общее количество
антигенпрезентирующих клеток в селезенке было также достоверно выше в группе животных, которым
вводился химерный белок (р<0,03). Таким образом, был сделан вывод, что иммунизация in vivo химерным белком ФРФ-ФРФР в качестве антигена представляется более эффективной по количеству образованных аутоантител и антигенпрезентирующих клеток, что может использоваться в приготовлении противоопухолевых вакцин.
Терапевтическое использование
Для использования в терапевтической практике способа, описанного в настоящем изобретении,
фармацевтические композиции на основе указанных химерных белков вводятся млекопитающему, предпочтительно человеку, в фармацевтически приемлемой форме, включая введение внутривенно, а также
следующими путями: внутримышечным, интраперитонеальным, интрацереброспинальным, подкожным,
внутрикавернозным, внутрисуставным, внуртисиновиальным, внутриоболочечным, оральным, локальным или ингаляционным.
Композиции также могут вводиться непосредственно в зону ишемии или около зоны ишемии для
обеспечения локального действия наряду с системным терапевтическим действием. Подобные формы
введения включают фармацевтически приемлемые носители, которые по своей природе не обладают ни
токсическим, ни терапевтическим действием. Примерами таких носителей являются ионообменные вещества, квасцы, стеарат алюминия, лецитин, белки плазмы (такие как белок плазмы человека), буферные
вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, частичные глицеридные смеси
насыщенных овощных жирных кислот, вода, соли или электролиты, такие как сульфат протамина, гидрофосфат натрия, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидная окись кремния, трисиликат
магния, поливинилпирролидон, вещества с целлюлозной основой и полиэтиленгликоль.
Носители для локальной или основанной на геле форм включают полисахариды, такие как натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы или метилцеллюлозы, поливинилпирролидон, полиакрилаты, полимеры полиоксиэтиленполиоксипропиленового блока, полиэтиленгликоль и спирты. Для введения во всех
случаях используются обычные лекарственные формы, получаемые со складов. К таким формам относятся, например, микрокапсулы, нанокапсулы, липосомы, пластыри, ингаляционные препараты, аэрозоли, подъязычные таблетки и препараты с постоянным высвобождением вещества. Белок в таких препаратах может содержаться в концентрации примерно от 0,01 мкг/мл до 100 мг/мл.
Подходящие примеры препаратов с постоянным высвобождением вещества включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих композицию; подобные матрицы имеют
определенную форму, например это могут быть пленки или микрокапсулы. К примерам матриц с постоянным высвобождением относятся полиэфиры, гидрогели [например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат)],
описанные Лангером и др. (J. Biomed. Mater. Res. 15, 167 (1981) и Лангером (Chem. Tech. 12 (1982), или
поли(винилалкоголь), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и
гаммаэтил-L-глутамата, описанные Сидман и др. (Biopolymers 22, 547 (1983), недеградируемый этиленвинилацетат (Лангер и др. см. выше), деградируемые сополимеры молочной и гликолевой кислот, такие
как Lupron Depot™ (инъецируемые микросферы, состоящие из полимеров молочной и гликолевой кислот и ацетата лейпролида), и поли-D-(-)-3-гидроксибутировой кислоты. В то время как такие полимеры,
как этиленвинилацетат и сополимер молочной и гликолевой кислот, способны к постоянному высвобождению молекул в течение более 100 дней, определенные гидрогели высвобождают белки за более короткие периоды времени. Когда инкапсулированные полипептидные белковые субстанции остаются в организме на долгое время, они могут денатурировать или агрегироваться в результате воздействия влаги при
температуре 37°С, что ведет к потере биологической активности и возможным изменениям в иммуногенности. С целью стабилизации могут быть разработаны разумные стратегии в зависимости от действующего механизма. Например, если обнаружен механизм агрегации, выражающийся в формировании
межмолекулярной S-S-связи посредством тиодисульфидного обмена, стабилизация может быть достигнута путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации с целью удаления кислых раство-4-
020171
ров, контролирования влажности, использования соответствующих добавок и разработки специфических
полимерных матричных составов.
Композиции с постоянным высвобождением белкового агента включают также субстанции, заключенные в липосомах. Липосомы, содержащие эти субстанции, могут быть получены известными в данной области методами, например, описанными Эпстейном и др. (Proc. Nat. Acad. Sci. 82, 3688 (1985); Хуанг и др. (Proc. Nat. Acad. Sci. 77, 4030 (1980); патент США № 4485045 и патент США № 4544545. Липосомы, как правило, имеют небольшую величину (величиной около 200-800 ангстрем) и принадлежат к
однослойному типу, в котором содержание липидов выше чем 30 мол.% холестерина; выбранное соотношение может изменяться для подбора оптимальных условий терапии.
Липосомы с продолжительным сроком циркуляции покрываются патентом США № 5013556.
Еще одним путем использования данного изобретения является инкорпорирование препарата
внутрь изделий, имеющих определенную форму. Такие изделия могут быть использованы для модулирования противоопухолевых механизмов, в том числе иммунных.
Кроме того, такие изделия могут быть использованы для модулирования инвазии опухолей и метастазов.
Возможна конъюгация настоящего химерного белка и другого лечебного средства.
Возможно приготовление вакцины, в качестве антигена которой может быть ФРФ и ФРФР. Вакцины могут быть приготовлены различным способом, на различных носителях, с использованием различных адъювантов.
При профилактике или лечении заболевания необходимая доза белка будет зависеть от типа заболевания, от его степени серьезности и протекания, от того, вводятся ли белки с профилактической или
терапевтической целью, от предыдущей терапии, от истории болезни пациента и его реакции на белок и
от указаний лечащего врача. Белок может вводиться пациенту различными способами, единовременно
или в качестве серии назначений.
Белки или пептиды, состоящие из "фактора N/рецептора фактора N/Fc-фрагмента иммуноглобулина", могут быть использованы для лечения различных сосудистых, неопластических и ненеопластических заболеваний и нарушений.
Сосудистые заболевания, которые поддаются такому лечению, включают ишемическую болезнь
сердца, ишемический инсульт мозга, ишемическую болезнь почек, эректильную дисфункцию любой
природы с сосудистым компонентом, осложнения тромбозов сосудов конечностей, некроз тканей, вызванный внешним воздействием (химическим, физическим, биологическим), а также любые другие состояния, сопровождающиеся ишемией, нарушением кровенаполнения и кровоснабжения.
Опухоли и близкие состояния, которые поддаются такому лечению, включают почечно-клеточный
рак, рак легких, рак желудка, рак пищевода, колоректальный рак, рак печени, рак яичников, рак шейки
матки, рак эндометрия, гиперплазию эндометрия, эндометриоз, фибросаркомы, хориосаркомы, опухоли
головы и шеи, гепатобластому, саркому Капоши, меланому, рак кожи, гемангиому, кавернозную гемангиому, гемангиобластому, рак поджелудочной железы, ретинобластомы, астроцитому, глиобластому,
шванному, олигодендроглиому, медуллобластому, нейробластому, рабдомиосаркому, остеогенную саркому, лейомиосаркому, рак мочевого пузыря и другие уротелиальные опухоли, опухоль Вильмса, рак
предстательной железы, аномальную пролиферацию сосудов, связанную с факоматозами.
Возможно применение способа при неонкологических заболеваниях, которые поддаются лечению,
включая такие, как ревматоидный артрит, псориаз, атеросклероз, диабетические и другие ретинопатии,
фиброплазии, неоваскулярную глаукому, тироидные гиперплазии (в том числе болезнь Граве), трансплантацию роговицы и других тканей, хронические воспаления, воспаление легких, нефротический синдром, асцит, преэклампсию, перикардиальный выпот (например, связанный с перикардитом) и плевральный выпот. В зависимости от типа заболевания и от степени его серьезности первоначальная доза для
введения пациенту будет составлять от 1 мкг/кг до 15 мг/кг и может вводиться путем одного или многих
отдельных введений или путем постоянного вливания. Обычная дневная доза может варьировать примерно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг и более в зависимости от вышеупомянутых факторов. Для повторного
введения в течение нескольких дней и более в зависимости от условий лечение повторяется, пока не достигается желаемое подавление симптомов болезни. Однако могут использоваться и другие режимы дозировки. Успех лечения легко определяется обычными методами и анализами (лабораторными и инструментальными).
В соответствии с другим применением изобретения эффективность пути фактор роста/рецептор
фактора роста и/или Fc-фрагмент иммуноглобулина в предотвращении или лечении болезней может
быть улучшена путем введения белков серийно или же в комбинации с другим веществом, эффективным
для данной цели, таким как фактор некроза опухоли, интерфероны, интерлейкины; антитела и ингибиторы, способные нейтрализовать или ингибировать ангиогенную активность фактора роста эндотелиальных клеток кровеносных сосудов и его рецепторов и/или фактора роста гепатоцитов и/или эпидермального фактора роста и его рецепторов и/или фактора роста плаценты и/или mTOR и/или других внутриклеточных киназ или одно или более обычных терапевтических веществ, таких как, например, алкилирующие соединения, антагонисты фолиевой кислоты, антиметаболиты метаболизма нуклеиновых ки-5-
020171
слот, антибиотики, аналоги пиримидинов, 5-флюороурацил, пуриновые нуклеозиды, амины, аминокислоты, триазольные нуклеозиды или кортикостероиды, лекарственные средства, преимущественно влияющие на функциональную активность сердечной мышцы, лекарственные средства, преимущественно влияющие на тонус сосудистой стенки, лекарственные средства, улучшающие кровоснабжение тканей мозга, лекарственные средства, влияющие на водно-солевой обмен, гиполипидемические (антисклеротические) лекарственные средства, лекарственные средства, улучшающие реологические свойства крови. Подобные вещества могут присутствовать во вводимом составе или могут вводиться отдельно. Кроме того,
химерные белки могут вводиться серийно или же в комбинации с другими видами лечения (например,
радиологическим, хирургическим лечением, физиотерапией, гомеопатией и проч.), которое может включать введение сопутствующих веществ (например, анестетиков и др.).
В соответствии с одним из применений изобретения при комбинированной терапии подвергается
атаке васкуляризация опухоли. Один или более химерных белков, описанных в изобретении, вводятся
пациенту с опухолью в терапевтически эффективных дозах, определенных, например, при наблюдении
некроза опухоли или ее метастатических очагов, если они имеются. Такая терапия продолжается до тех
пор, пока перестает наблюдаться дальнейшее улучшение или клиническое обследование показывает, что
опухоль или ее метастазы исчезли.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Слитый белок, содержащий фактор роста фибробластов или его фрагмент и рецептор фактора роста фибробластов или его фрагмент, для лечения или профилактики заболеваний или состояний, связанных с патологией сосудов.
2. Белок по п.1, который является модифицированным путем гликозилирования, добавления и/или
замены аминокислот и/или слияния с Fc-фрагментом Ig или терапевтически активными средствами.
3. Изолированная молекула ДНК, кодирующая слитый белок по любому из пп.1, 2.
4. Культивируемая клетка-хозяин, включающая молекулу ДНК по п.3 и экспрессирующая слитый
белок.
5. Способ получения слитого белка по любому из пп.1, 2, включающий культивирование клеткихозяина по п.4 и выделение слитого белка.
6. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики заболеваний или состояний, связанных с патологией сосудов, содержащая фармацевтически эффективное количество белка по любому
из пп.1, 2 вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.
7. Фармацевтическая композиция по п.6, где заболевание выбрано из группы, включающей сердечно-сосудистые заболевания, эректильную дисфункцию и рак.
8. Применение белка по любому из пп.1, 2 для получения лекарственного средства для лечения или
профилактики заболеваний или состояний, связанных с патологией сосудов.
9. Применение по п.8, где заболевание выбрано из группы, включающей сердечно-сосудистые заболевания, эректильную дисфункцию и рак.
10. Способ лечения и профилактики заболеваний или состояний, связанных с патологией сосудов,
включающий введение фармацевтически эффективного количества белка по любому из пп.1, 2 или фармацевтической композиции по любому из пп.6, 7.
Пример аминокислотной последовательности белка, входящего в фармацевтическую композицию
Фиг. 1
Гиперэкспрессия ФРФР1 на бычьих эндотелиальных клетках
Фиг. 2
-6-
020171
Стимулирование роста колоний клеток под действием белка, состоящего из ФРФ-2 и ФРФР1
Фиг. 3
Стимуляция аутофосфорилирования ФРФР1
Фиг. 4
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
-7-