УДК 579.61; 579.62 1 Уткина Т.М. 1, Попова Л.П. 1, Акжигитов А.С.2 Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, Оренбург 2 Оренбургский государственный аграрный университет Email: labpersist@mail.ru МОДИФИКАЦИЯ ФАКТОРОВ ПЕРСИСТЕНЦИИ СТАФИЛОКОККОВ И MALASSEZIA PACHYDERMATIS ПРИ МЕЖМИКРОБНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯХ Изучена модификация антилизоцимной активности и способности образовывать биопленки у стафилококков и Malassezia pachydermatis, выделенных от собак с отитами, в условиях их межмикробных взаимодействий. Установлено преимущественное обоюдное повышение эксп> рессии антилизоцимной активности и коэффициента биопленкообразования у изученных бакте> рий и грибов, а также приобретение ими способности образовывать биопленки. Полученные данные можно рассматривать как один из механизмов, способствующих образованию патобио> ценоза, на фоне которого возникает заболевание, и его хронизации. Ключевые слова: стафилококки, Malassezia pachydermatis, антилизоцимная активность, био> пленки. Введение В последнее десятилетие отмечается рост заболеваемости животных оппортунистически ми инфекциями, вызываемыми грибковой мик рофлорой [6]. Особый интерес представляют грибы рода Malassezia, являющиеся наиболее распространенными возбудителями отитов у собак. Грибы рода Malassezia, присутствуя в био ценозе, взаимодействуют с другими видами ус ловнопатогенных микроорганизмов (Staphy lococcus spp., Streptococcus spp., Enterobacteriaceae, Candida spp., Aspergillus spp.). В настоящее время накоплен фактический материал по взаимодей ствию Malassezia spp. с бактериями рода Staphylococcus [13]. Показано также, что рост Malassezia in vitro усиливается в присутствии стафилококков [15]. Однако, остается неизучен ным вопрос о влиянии данных микроорганиз мов на персистентные свойства в микробной ассоциации. Одним из распространенных и ча сто встречающихся персистентных признаков является антилизоцимная активность микро организмов [2]. Важнейшим механизмом дли тельного выживания в условиях макроорганиз ма, а также внутрипопуляционной коммуника ции микроорганизмов, является образование ими биопленок [9]. В связи с этим, целью данного исследова ния явилось изучение модификации антилизо цимной активности и способности образовы вать биопленки у стафилококков и M. pachyder matis, выделенных от собак с отитами, в услови ях их межмикробных взаимодействий. Материалы и методы Материалом для исследования послужи ли 14 штаммов рода Staphylococcus: Staphy lococcus intermedius (1 штамм), Staphylococcus xylosus (4 штамма), Staphylococcus hyicus (9 штаммов), а также 14 штаммов Malassezia pachydermatis, выделенных от 14 собак с хро ническими отитами. Исследуемый материал получали методом смывов с помощью тампона из наружного слу хового прохода собак [7], засевали на среду Ли мингаНотманна (посевы инкубировали при 37оС в течение 48 часов), а также на кровяной агар (посевы инкубировали при 37оС в тече ние 1824 часов). Идентификацию грибов осуществляли по морфологическим и культуральным ха рактеристикам [14], бактерии идентифици ровали по морфологическим и культураль ным свойствам, а также биохимическим ха рактеристикам с использованием тестсис тем «STAPHYtest». Способность микроорганизмов к образо ванию биопленок определяли по степени свя зывания ими кристаллического фиолетового в стерильных 96луночных полистироловых планшетах [16]. Коэффициент биопленкообра зования (КБ) рассчитывали как отношение оп тической плотности раствора кристалличес кого фиолетового, связавшегося с клетками микроорганизмов, к оптической плотности раствора в контроле. Положительными счита ли значения коэффициента более 1,1. ВЕСТНИК ОГУ №13 (174)/декабрь`2014 125 Естественные науки Антилизоцимную активность (АЛА) мик роорганизмов определяли фотометрическим методом [2]. Модификацию биологических свойств микроорганизмов исследовали при совместном культивировании в жидкой питательной среде LNA [5]. Статистическую обработку данных прово дили биометрическими методами [8]. Результаты В результате проведенных исследований было показано, что у больных животных в 60% случаев M. pachydermatis высеваются в ассоциа ции со стафилококками разных видов. Все изученные штаммы стафилококков об ладали антилизоцимной активностью. АЛА S. hyicus колебалась в пределах от 0,1±0,001 мкг/мл до 0,82±0,02 мкг/мл (среднее значение признака составило 0,39±0,04 мкг/мл); у штам мов S. xylosus значение признака колебалось от 0,1±0,003 мкг/мл до 0,7±0,03 мкг/мл (сред нее значение признака 0,45±0,2 мкг/мл); у S. intermedius АЛА была равна 0,5±0,01 мкг/мл. После совместного культивирования с M. pachydermatis у 88,9% штаммов S. hyicus спо собность к инактивации лизоцима увеличива лась на 1868,3%; АЛА 50% штаммов S. xylosus повышалась на 4278%. Снижение антилизоцим ного признака отмечено у 11,1% штаммов S. hyicus и 50% штаммов S. xylosus на 42,9% и 22%, соот ветственно. Способность к инактивации лизоци ма не изменялась у штамма S. intermedius. Антилизоцимная активность штаммов M. pachydermatis находилась в диапазоне от 0,8±0,01 мкг/мл до 2,0±0,05 мкг/мл, среднее зна чение признака составило 1,5±0,09 мкг/мл. Под влиянием стафилококков у 57,1% штаммов грибов способность к инактивации лизоцима увеличивалась на 1046%, у 35,7% штаммов – снижалась на 1853%, а у 7,2% штам мов антилизоцимный признак оставался на прежнем уровне. На следующем этапе работы было изучено взаимное влияние M. pachydermatis и стафилокок ков на способность образовывать биопленки. До эксперимента лишь S. intermedius и 11,1% штаммов S. hyicus обладали этой способностью, КБ составлял 1,1 усл. ед. После совместного культивирования с M. pachydermatis способность образовывать биопленки приобретали все изу 126 ВЕСТНИК ОГУ №13 (174)/декабрь`2014 ченные штаммы S. xylosus, а также 77,8% штам мов S. hyicus. Отмечена потеря признака у 11,1% штаммов S. hyicus. У штамма S. intermedius спо собность к образованию биопленок сохранялась на прежнем уровне. Среди M. pachydermatis 28,6% штаммов харак теризовались способностью формировать био пленки, КБ составлял 1,1 усл. ед. После совмест ного культивирования со стафилококками 35,7% штаммов M. pachydermatis приобретало способ ность образовывать биопленки, у 7,1% штаммов коэффициент биопленкообразования повышал ся и составлял 1,2 усл. ед. Потеря признака отме чена у 14,3% штаммов M. pachydermatis. Таким образом, проведенными исследова ниями показано, что при межмикробных взаи модействиях изученные микроорганизмы ока зывают разнонаправленное действие на фак торы персистенции (стимулирующее, снижаю щее, индифферентное) с их преимущественным повышением. Обсуждение В результате проведенной работы установ лено, что у больных животных в 60% случаев M. pachydermatis высеваются в ассоциации со стафилококками разных видов. Полученные данные подтверждаются исследованиями [12], показавшими, что в 50% случаев при отите у собак грибы рода Malassezia выделялись в ассо циации с бактериями рода Staphylococcus. В условиях микробных ассоциаций между бактериями и грибами могут возникать нео днозначные взаимоотношения, что оказывает влияние на течение инфекционного процесса [6]. В подобных ситуациях многими исследовате лями существенным признается определение у выделенных культур факторов патогенности и персистенции, а также оценка характера взаи моотношений [4, 10]. Рядом авторов показано, что для оценки межмикробных взаимодействий в качестве био мишеней можно использовать персистентные свойства микроорганизмов (антилизоцимную активность и способность образовывать био пленки) [3]. Известно, что микроорганизмы, обладаю щие высокими значениями данных факторов персистенции, выделяются при хроническом или затяжном течении инфекционновоспали тельных заболеваний [1]. Уткина Т.М. и др. Модификация факторов персистенции стафилококков... Проведенными нами исследованиями уста# новлено преимущественное обоюдное повыше# ние экспрессии АЛА и КБ у изученных бакте# рий и грибов, а также приобретение ими спо# собности образовывать биопленки при межмик# робных взаимодействиях. Взаимная стимуляция антилизоцимной активности и способности образовывать био# пленки может быть одним из механизмов, спо# собствующих формированию патологического микробиоценоза, на фоне которого возникает заболевание, и его хронизации. 2.10.2014 Список литературы: 1. Абрамзон О.М., Карташова О.Л., Валышев А.В. и др. Биологические свойства микроорганизмов как основа прогнозиро# вания тяжести гнойно#воспалительных заболеваний легких и плевры // Журнал микробиологии, эпидемиологии и имму# нобиологии. – 2004. – №3. – С. 7#9. 2. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. – М.: Медицина; Екатеринбург: УрО РАН, 1999. – 366 с. 3. Бухарин О.В., Лобакова Е.С., Перунова Н.Б. и др. Симбиоз и его роль в инфекции. Екатеринбург: УрО РАН, 2011. – 299 с. 4. Вахитов Т.Я. Регуляторные функции бактериальных экзометаболитов на внутрипопуляционном и межвидовом уровнях. Автореф. дис…. докт. биол. наук. Санкт#Петербург, 2007. 40 с. 5. Ермоленко Е.И., Ждан#Пушкина С.Х., Суворов А.Н. Взаимодействие Candida albicans и Lactobacillus plantarum in vitro // Проблемы медицинской микологии. – 2004. – Т.6. – № 2. – С. 49#54. 6. Ершов П.П. Этиологическая значимость дрожжевых грибов рода Malassezia при кожных заболеваниях животных. Дис…. канд. вет. наук. Москва, 2008. 165 с. 7. Ивченко О.В. Диагностика малассезиозов животных. Дис. … канд. вет. наук. Москва, 2010. 152 с. 8. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. – 352 с. 9. Рыбальченко О.В., Бондаренко В.М., Орлова О.Г. Структура и функция бактериальных биопленок симбиотических и условно#патогенных бактерий // Верхневолжский медицинский журнал. – Т.11. – Вып.4. – С. 37#42. 10. Семенов А.В. Характеристика антагонистической активности бактерий при межмикробных взаимодействиях: Автореф. дис…. канд. биол. наук. Оренбург, 2009. 22с. 11. Уткина Т.М., Акжигитов А.С., Нургалиева Р.М. Видовой состав и факторы персистенции микроорганизмов, выделен# ных от собак с отитами // Вестник ветеринарии. – 2014. – №2(69). – С.47#49. 12. Bornand V. Bacteriology and mycology of otitis externa in dogs // Schweizer Archiv fur Tierheilkunde. – 1992. – № 134(7). – P.341#348. 13. Faergemann J. Atopic Dermatitis and Fungi // Clinical Microbiology Reviews. – 2002. – Vol.1. – №4. – P.545–563. 14. Mason I.S. A review of the biology of canine skin with respect to the commensals Staphylococcus intermedius, Demodex canis and Malassezia pachydermatis // Vet. Derm. – 1996. – № 7. – P.119#132. 15. O`Toole G. Biofilm formation as microbial development // Annu Rev Microbiol. – 2000. – № 54. – P.49–79. Сведения об авторах: Уткина Татьяна Михайловна, старший научный сотрудник лаборатории по изучению механизмов и регуляции персистенции бактерий Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, кандидат биологических наук, е#mail: pashkova070782@mail.ru Попова Лидия Петровна, старший научный сотрудник лаборатории по изучению механизмов и регуляции персистенции бактерий Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, кандидат медицинских наук, е#mail: ploomy@list.ru Акжигитов Абай Сансергалиевич, аспирант кафедры кафедры микробиологии и заразных болезней Оренбургского государственного аграрного университета, е#mail: abaj_akz@mail.ru ВЕСТНИК ОГУ №13 (174)/декабрь`2014 127