Автореферат Анохиной Т.О.

На правах рукописи
АНОХИНА ТАТЬЯНА ОРЕСТОВНА
РИЗОСФЕРНЫЕ ПЛАЗМИДОСОДЕРЖАЩИЕ БАКТЕРИИ
РОДА PSEUDOMONAS, СТИМУЛИРУЮЩИЕ РОСТ РАСТЕНИЙ И
ДЕГРАДИРУЮЩИЕ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИЕ АРОМАТИЧЕСКИЕ
УГЛЕВОДОРОДЫ
03.01.06 − Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
Диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Пущино − 2011
Работа выполнена в лаборатории биологии плазмид Учреждения
Российской академии наук Институт биохимии и физиологии
микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН и в Пущинском государственном
университете, г. Пущино
Научный руководитель:
кандидат биологических наук,
Владимир Васильевич Кочетков
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук,
Нина Васильевна Доронина
кандидат биологических наук,
Илья Витальевич Евдокимов
Ведущая организация:
Филиал Учреждения Российской
академии
наук
Институт
биоорганической
химии
им.
академиков М.М. Шемякина и Ю.А.
Овчинникова РАН, Пущино
Защита диссертации состоится «
»
2011 г. В
часов
мин. на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 в
Учреждении Российской академии наук Институт биохимии и физиологии
микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, Московская
область, г. Пущино, проспект науки, 5.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения
Российской академии наук Институт биохимии и физиологии
микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино
Автореферат размещен на сайте http://www.ibpm.ru
Автореферат разослан «
»
2011 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета,
доктор биологических наук
Вагабов В.М.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
В настоящее время в биосфере циркулирует огромное число токсичных
соединений природного и техногенного происхождения. Полициклические
ароматические углеводороды (ПАУ) являются приоритетными загрязнителями
вследствие своего повсеместного распространения и отрицательного влияния
на живые организмы. Серьезную проблему представляют комплексно
загрязненные почвы, когда наряду с органическими поллютантами в почвах
присутствуют тяжелые металлы и/или металлоиды. Скорость деградации
органических соединений на таких территориях существенно замедляется
(Springael et al., 1993; Sokhin et al., 2001).
Одним из современных и многообещающих подходов для очистки
загрязненных почв является фиторемедиация – совместное применение
растений и ассоциированных с ними микроорганизмов (Lucy et al., 2004).
Получение экспериментальных данных, касающихся взаимодействия растений
и ризосферных бактерий на загрязненных почвах, является основой для
повышения эффективности фиторемедиационных технологий. Поскольку при
загрязнении ухудшаются физико-химические свойства почвы, и как следствие,
снижается накопление растительной биомассы, представляется актуальным
применение штаммов, способных не только утилизировать токсичные
соединения, но и стимулировать рост растений.
Было показано, что гибель и угнетение роста растений на загрязненной
почве может происходить не только из-за токсического действия на них
вещества-загрязнителя, но и вследствие сильного повреждения растений
фитопатогенными грибами и накоплением в почве грибных метаболитов
(Киреева с соавт., 2006). Таким образом, для очистки загрязненных почв
необходимо использование штаммов, способных деградировать органические
загрязнители и подавлять рост фитопатогенных грибов.
Известно, что некоторые представители ризосферных бактерий рода
Pseudomonas способны улучшать рост растений за счет различных механизмов
(Haas and Défago, 2005). Наиболее ярким примером положительного влияния
псевдомонад является синтез фитогормонов и защита растений от
фитопатогенов. Такие полезные для растений бактерии в настоящее время
объединяют в специфическую группу, которую принято обозначать как PGPR
Pseudomonas (PGPR – Plant Growth-Promoting Rhizobacteria – ризобактерии,
стимулирующие рост растений). В природных условиях численность PGPR
Pseudomonas не велика и составляет менее 1% от общего числа
культивируемых штаммов, изолированных из ризосферы (Raaijmakers et al.,
1999). Использование таких бактерий представляется весьма перспективным
подходом для оптимизации процессов очистки загрязненных почв.
Цель и задачи исследования
Цель настоящей работы – получение плазмидосодержащих вариантов
PGPR Pseudomonas, совмещающих фитостимулирующие и защитные свойства
со способностью к биодеградации ПАУ.
1
В соответствии с целью работы были определены следующие задачи:
1. Выделить и охарактеризовать новые ризосферные штаммы бактерий,
совмещающие способность утилизировать ПАУ, подавлять фитопатогенные
грибы и бактерии и стимулировать рост растений. Провести в выделенных
штаммах поиск плазмид биодеградации.
2. Выявить в ризосферных штаммах-антагонистах фитопатогенов наличие
генетических систем, вовлеченных в биосинтез антибиотически активных
соединений.
3. Сконструировать штаммы ризосферных бактерий рода Pseudomonas,
содержащие плазмиды биодеградации нафталина и устойчивости к тяжелым
металлам.
4. Изучить ростовые характеристики плазмидосодержащих штаммов при
культивировании на ПАУ, удельную активность ключевых ферментов
деградации нафталина и стабильность поддержания плазмид биодеградации и
резистентности к тяжелым металлам.
5. Оценить деградацию нафталина и фенантрена ризосферными штаммами в
модельных растительно-микробных ассоциациях.
Научная новизна работы
Выделены и сконструированы новые плазмидосодержащие штаммы
PGPR Pseudomonas, совмещающие способность деградировать ПАУ, подавлять
рост фитопатогенов и продуцировать индолил-3-уксусную кислоту. Впервые
выделен штамм P. aureofaciens OV17(pOV17), содержащий плазмиду
биодеградации нафталина.
Показано, что наиболее активные ризосферные штаммы-антагонисты
фитопатогенов содержат несколько генетических систем, необходимых для
биосинтеза антибиотиков. У четырех штаммов P. fluorescens обнаружены гены,
необходимые для биосинеза пиолютеорина, пирролнитрина и 2,4диацетилфлороглюцина. Шесть штаммов P. aureofaciens и один штамм P.
chlororaphis содержат гены, участвующие в биосинтезе пирролнитрина и
феназин-1-карбоновой кислоты.
Плазмиды биодеградации нафталина pOV17 и pBS216 могут
поддерживаться в различных видах PGPR Pseudomonas, включая P. fluorescens,
P. aureofaciens, P. chlororaphis и P. putida. Стабильность поддержания плазмид
биодеградации зависит от видовой принадлежности штамма. Наиболее
стабильно плазмиды поддерживаются в штаммах P. chlororaphis PCL1391 и P.
putida 53а.
Плазмидосодержацие штаммы PGPR Pseudomonas защищают растения от
токсичного действия ПАУ (нафталин или фенантрен), осуществляя деградацию
этих соединений в ризосфере растений. Эффективность деградации нафталина
(200 мкг/мг песка) полученными плазмидосодержащими штаммами в
стерильных условиях в ризосфере рапса составляет около 100%. В модельных
экспериментах с торфо-смесью, загрязненной фенантреном (5 мг/г)
максимальная (выше 50%) биодеградация осуществляется при инокуляции
семян ячменя штаммами P. fluorescens 38a(pBS216) и P. aureofaciens
OV17(pOV17). Однако, в результате рекомбинационных событий могут быть
2
получены плазмидосодержащие варианты, не способные к полной деградации
ПАУ, продуцирующие токсичные интермедиаты, приводящие к гибели
растений (штамм P. putida 53а(pBS216*)).
Получены новые штаммы ризосферных бактерий рода Pseudomonas,
способные к деградации нафталина в присутствии тяжелых металлов.
Показано, что устойчивый двуплазмидный штамм P. chlororaphis
PCL1391(pBS216,pBS501) способен к практически полной (> 90%) деградации
нафталина (1 г/л) в присутствии 100 мкМ никеля при периодическом
культивировании.
Научно-практическая значимость работы
Создана коллекция плазмидосодержащих штаммов PGPR Pseudomonas,
эффективно деградирующих ПАУ. Штаммы депонированы во Всероссийской
коллекции микроорганизмов и подтверждены патентами РФ на изобретение
№ 2352629, № 2396339, № 2396338.
Показано,
что
подбор
штаммов-деструкторов
ПАУ
для
фиторемедиационных технологий должен основываться как на изучении
степени колонизации ризосферы того или иного растения, так и на тщательном
выяснении взаимодействий плазмида-бактериальный хозяин и оценке
конкурентоспособности данной комбинации в определенных природных
условиях.
Полученные в работе плазмидосодержащие штаммы PGPR Pseudomonas
могут использоваться для разработки на их основе нового поколения
биопрепаратов для защиты и стимуляции роста растений, а также очистки почв
с комплексным загрязнением нефтепродуктами, ПАУ и тяжелыми металлами.
Апробация работы
Материалы диссертации докладывались на 13 конференциях: «Биология –
наука XXI века», 5-я, 8-я Пущинская школа-конференция молодых ученых,
2001, 2004, Пущино; «Экобиотехнология: Борьба с нефтяным загрязнением
окружающей среды», 2001, Пущино; «Сельскохозяйственная микробиология в
ХIХ-ХХI веках», Всероссийская конференция, 14-19 июня 2001, СанктПетербург; «Биотехнология-2003», научно-практическая конференция, 24-25
ноября 2003, Пущино; «Экология 2004: Эстафета поколений», 3-я Пущинская
международная школа-семинар по экологии, 27-29 апреля 2004, Пущино;
«Биотехнология-2005»,
8-й
международный
семинар-презентация
инновационных научно-технических проектов, 18-19 ноября 2005, Наукоград
Пущино; «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с
окружающей средой», 3-я межрегиональная конференция молодых ученых, 1012 октября 2006, Саратов; «Biochemical interactions of microorganisms and plants
with technogenic environmental pollutants», International symposium, 28-30 July
2003, Saratov; 11 International symposium on Microbial Ecology – ISME-11,
Vienna, Austria, August 20-25, 2006; 2nd International Conference «Rhizosphere»,
August 25-31, 2007, Montpellier, France; 4th International Phytoremediation
Conference, September, 2007, Denver, Colorado; International Symposium on
3
Applied Molecular Microbiology in Oil Systems (ISMOS), September 16-18, 2007,
Colchester, England.
Публикации по теме диссертации
По материалам диссертации опубликовано 23 работы, в том числе 5
статей, 15 тезисов и 3 патента РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы»,
«Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждения», «Выводы» и «Список
литературы». Работа изложена на 146 страницах машинописного текста,
включает 24 таблицы и 37 рисунков. Библиография насчитывает 235
наименований, из них 37 отечественных и 198 зарубежных работ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериальные штаммы. В работе использовали три группы
ризосферных бактерий рода Pseudomonas: 1) штаммы-деструкторы ПАУ,
изолированные из ризосферных образцов, 2) бесплазмидные штаммыантагонисты
фитопатогенов
и
3)
полученные
на
их
основе
плазмидосодержащие варианты, несущие плазмиды pBS216, pOV17 и pBS501.
Среды и условия культивирования. Культивирование бактерий
проводили при 30°С, используя среду М9, LB (Маниатис c соавт., 1984) и ТМС
(Мergeay et al., 1985) Для культивирования растений в стерильных модельных
системах использовали среду Мурашиге-Скуга (Murashige and Skoog, 1962).
Определение физиологических параметров роста штаммов проводили
в периодической культуре на нафталине (1 г/л) и фенантрене (0.2 г/л) как
единственных источниках углерода и энергии. Рост микроорганизмов
контролировали путем измерения оптической плотности (ОП) и подсчета КОЕ
в культуральной жидкости. Количество клеток определяли методом
стандартных серийных разведений с последующим высевом на чашки с
агаризованной средой LB. Удельную скорость роста () рассчитывали по
формуле =ln(x/x0)/t, где x0 – биомасса в начальный момент времени t0, x –
биомасса в конечный момент времени, t – время роста культуры. Время одной
генерации (g) рассчитывали как g=(t-t0)/n, где t – время культивирования
бактерий, n – число генераций (Перт, 1978).
Антагонистическую активность ризосферных штаммов определяли
при совместном культивировании фитопатогенных грибов (Gaeumannomyces
graminis var. tritici, Fusarium oxysporum, F. graminearum, Rhizoctonia solani) и
бактерий по наличию зоны подавления роста мицелия.
Конъюгационный перенос бактериальных плазмид осуществляли
согласно (Dunn and Gunsalus, 1973).
Стабильность
плазмид
биодеградации
определяли
после
последовательных пересевов бактерий в жидкой среде LB в течение 10 суток.
Удельную активность ферментов биодеградации нафталина определяли
в бесклеточных экстрактах. Культуры выращивались на минимальной среде с
4
нафталином в качестве единственного источника углерода и энергии. Клетки
осаждали центрифугированием, отмывали буфером и разрушали на ИБФМпрессе (Россия). Активность нафталин диоксигеназы определяли согласно (Dua
and Meera, 1981), активность салицилат гидроксилазы − согласно
(Shamsuzzaman and Barnsley, 1974), активность катехол-2,3-оксигеназы −
(Hegeman, 1966), активность катехол-1,2-оксигеназы − согласно (Feist and
Hegeman, 1969). Концентрацию белка определяли спектрофотометрически
(Kalb and Bernlohr, 1977).
Определение содержания нафталина, фенантрена и продуктов их
деградации проводили с помощью ТСХ и ВЭЖХ. Определение фенантрена
проводили на ВЭЖ хроматографе 2150 («LKB», Швеция) в следующих
условиях: обращенно-фазная колонка Nucleosil С-18 («Marcherey-Nagel»,
США); предколонка - HPLC Column («Serva», США); носитель − октадецил Si60 (20-40 мкм, 4.6 мм  75 мм); элюент − 83%-ный метанол, 17%-ная
деионизованная дистиллированная вода. Содержание нафталина определяли в
следующих условиях: колонка С18, Nova Pak Waters, система: 50% метанол –
50% вода, УФ детектор, 254 нм, скорость протока 1 мл/мин. Салициловую
кислоту и катехол определяли в тех же условиях, но в системе 100% вода.
Определение уровня продукции индолил-3-уксусной кислоты (ИУК)
проводили колориметрическим методом при добавлении реактива
Сальковского (Gordon and Weber, 1951).
Качественный и количественный анализ антибиотически активных
соединений проводили на ВЭЖ хроматографе LKB 2150. Была использована
колонка 15 см  4.6 мм I.D.; стационарная фаза − Sup-Rs Sperisorb ODS2.5 мкм
(Prolabo, Франция). Температура колонки − 25°С; мобильная фаза − метанол: 50
мM H3PO4 (66:34, v/v); УФ детектор, 210 нм, скорость протока – 1.3 мл/мин;
Масс-спектры метаболитов регистрировали на масс-спектрометре высокого
разрешения Финниган МАТ 8430 (Германия).
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли в амплификаторе
«HyBaid PCR Express» (Hybaid Limited, Ashford, Англия). Амплификацию
фрагмента phzCD (1150 п.н.) феназинового оперона проводили с
использованием праймеров PCA2a (5-TTGCCAAGCCTCGCTCCAAC-3) и
PCA3b (5-CCGCGTTGTTCCTCGTTCAT-3) (Raaijmakers et al., 1997).
Праймеры Phl2a (5-GAGGACGTCGAAGACCACCA-3) и Phl2b (5ACCGCAGCATCGTGTATGAG-3) (Raaijmakers et al., 1997) использовали для
амплификации фрагмента гена phlD (745 п.н). Амплификацию фрагмента гена
pltB (440 п.н.) проводили с использованием праймеров Plt1 (5ACTAAACACCCAGTCGAAGG-3) и Plt2 (5-AGGTATCCATGCCCAGC-3)
(Mavrodi et al., 2001). Праймеры PrnCf (5-CCACAAGCCCGGCCAGGAGC-3) и
PrnCr
(5-GAGAAGAGCGGGTCGATGAAGCG-3)
использовали
для
определения гена prnC (719 п.н.) (Mavrodi et al., 2001). Амплификацию nahAcгена
проводили
с
помощью
праймеров
Aс114F
(5CTGGC(T/A)(T/A)TT(T/C)CTCAC(T/C)CAT-3)
и
Ac596R
(5C(G/A)GGTG(C/T)CTTCCAGTTG-3) (482 п.н.) (Wilson et al., 1999).
Амплификацию фрагмента гена 16S рРНК проводили с праймерами 27fm (55
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)
и
1492r
(5TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3) (Weisburg et al., 1991).
Микровегетационные эксперименты в присутствии нафталина
проводили в стерильных условиях согласно (Simons et al., 1996). Стерильные
проростки растений инокулировали суспензией штаммов плотностью около 108
КОЕ/мл в течение 15 мин. Выращивание растений проводили в закрытых
пластиковых сосудах в 150 г песка при влажности 10% в присутствии
нафталина (200 мкг/г песка). На 3, 7, 10 и 14 сутки определяли численность
внесенных штаммов, стабильность плазмид биодеградации, содержание
нафталина и биометрические показатели растений.
Микровегетационные эксперименты в присутствии фенантрена (5
мг/г торфо-смеси) проводили в нестерильных условиях. Определение
содержания фенантрена в ризосфере растений ячменя (Hordeum sativum),
инокулированных штаммами-деструкторами, проводили на 28 сутки
эксперимента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Скрининг ризосферных штаммов-антагонистов фитопатогенных грибов
на наличие генов, вовлеченных в биосинтез антибиотиков различных
групп
Ризосферные штаммы лабораторной коллекции, принадлежащие к видам
P. aureofaciens, P. chlororaphis, P. fluorescens и P. putida (табл. 1), проявляли
антагонистическую активность по отношению к широкому ряду
фитопатогенных грибов и бактерий. Данные штаммы были выбраны для
анализа на наличие генов, вовлеченных в биосинтез различных антибиотиков.
Скрининг штаммов проводили с помощью ПЦР с использованием
специфических праймеров, разработанных для детекции генов, вовлеченных в
биосинтез 2,4-диацетилфлороглюцина (phlD), пирролнитрина (prnC),
пиолютеорина (pltB) и феназин-1-карбоновой кислоты (phzCD), которые
проявляют антибиотичекую активность и являются фунгицидными и
бактерицидными соединениями. Результаты амплификации представлены в
таблице 1.
Исходя из таблицы, штаммы лабораторной коллекции можно разделить
на 2 группы. В первую входят представители вида P. fluorescens (штаммы 38a,
70a, 7H, 90H), которые содержат гены, необходимые для биосинтеза трех
антибиотиков: 2,4-диацетилфлороглюцина, пирролнитрина и пиолютеорина.
Данные изоляты сходны с использованным в работе штаммом P. fluorescens Pf5, который выступал как положительный контроль. Во второй группе
представлены штаммы P aureofaciens BS1393, H16, B1249, Kr31 и P.
chlororaphis SPB1217, содержащие гены, необходимые для биосинтеза
феназин-1-карбоновой кислоты и пирролнитрина. Штамм P. fluorescens р54
обладает
генами,
ответственными
только
за
биосинтез
2,4диацетилфлороглюцина. Штамм P. putida 53a не показал положительного
ответа ни с одной парой использованных праймеров.
6
Таблица 1. Амплификация генов, необходимых для биосинтеза различных
антибиотиков, у PGPR Pseudomonas
Штамм
phlD
phzCD
prnC
pltB
Описанные ранее PGPR Pseudomonas
P. fluorescens Pf-5
+
+
+
P. fluorescens Q2-87
+
P. fluorescens 2-79
+
P. chlororaphis PCL1391
+
Использованные в работе PGPR Pseudomonas
P. fluorescens 38a
+
+
+
P. fluorescens 70a
+
+
+
P. fluorescens 7H
+
+
+
P. fluorescens 90H
+
+
+
P. aureofaciens BS1393
+
+
P. aureofaciens H16
+
+
P. aureofaciens B1249
+
+
P. aureofaciens Kr31
+
+
P. chlororaphis SPB1217
+
+
P. fluorescens p54
+
P. putida 53a
(+) – хорошая эффективность амплификации, (-) – фрагмент предсказанного
размера не амплифицировался.
В экстрактах культуральной жидкости штамма P. aureofaciens BS1393
было обнаружено 3 мажорных метаболита: феназин-1-карбоновая кислота, 2оксифеназин и 2-оксифеназин-1-карбоновая кислота. Пирролнитрин при
данных условиях культивирования штамма не был обнаружен. Известно, что
синтез антибиотиков напрямую зависит от метаболического статуса клетки,
наличия питательных веществ, микро- и макро- элементов, температуры и pH.
Возможно, данные условия культивирования не являлись оптимальными для
синтеза пирролнитрина.
В экстрактах культуральной жидкости штамма P. fluorescens 38a был
обнаружен пиолютеорин. Из литературных данных известно, что в
контрольном штамме P. fluorescens Pf-5 2,4-диацетилфлороглюцин и
пиолютеорин взаимно репрессируют синтез друг друга. Возможно, именно по
этой причине в штамме P. fluorescens 38a также был обнаружен только один
антибиотик.
2. Выделение ризосферных бактерий-деструкторов полициклических
ароматических углеводородов
Поскольку штаммы-антагонисты лабораторной коллекции, не были
способны утилизировать ПАУ, был проведен поиск новых ризосферных
штаммов бактерий, совмещающих фитостимулирующие свойства со
способностью к биодеградации различных ароматических углеводородов.
Из ризосферы растений, растущих на почве, загрязненной
нефтепродуктами были выделены 22 штамма, способных к росту на ПАУ и
7
продуктах их деградации. Для дальнейшей работы были выбраны 12 штаммов,
способных к росту на фенантрене, антрацене, флюорене, аценафтене,
нафталине, 2-метилнафталине и салицилате. На основании определения
морфологических и физиолого-биохимических признаков, а также
рестрикционного анализа гена 16S рРНК данные штаммы могут быть отнесены
к P. fluorescens: IC7(pIC7), OV29(pOV29), VB1(pVB1), IID5(pIID5); P.
аureofaciens: OV17(pOV17), IG1; и Pseudomonas sp.: OV19(pOV19),
OV25(pOV25), OV26(pOV26), OV9(pOV9), OV27(pOV27) и As15(pAs15).
Выделенные штаммы несли плазмидную ДНК размером около 80 т.п.н.
Определение группы несовместимости плазмид с помощью ПЦР показало, что
плазмиды из 8-ми выделенных штаммов IC7(pIC7), OV29(pOV29), VB1(pVB1),
IID5(pIID5), OV17(pOV17), OV19(pOV19), OV25(pOV25), OV26(pOV26)
относятся к Р-9 группе несовместимости. Группа несовместимости плазмид у
трех штаммов OV9(pOV9), OV27(pOV27) и As15(pAs15) не была определена.
Положительный ответ не был получен с праймерами, разработанными для Р-1,
Р-7 и Р-9 групп. В штаммах, несущих плазмиды Р-9 группы несовместимости,
nah гены имели плазмидную локализацию, что было доказано либо с помощью
конъюгационного переноса, либо с помощью экспериментов по элиминации
плазмид. Выделенный плазмидосодержащий штамм P. aureofaciens
OV17(pOV17) представлял особый интерес, поскольку ранее плазмиды
биодеградации нафталина в штаммах, принадлежащих к виду P. aureofaciens не
были описаны.
Рестрикционный анализ плазмид P-9 группы несовместимости показал,
что плазмиды из неродственных штаммов были сходны, но не идентичны
между собой и плазмидой pBS216, и значительно отличались от
архитипической плазмиды NAH7 (рис. 1, эндонуклеаза рестрикции EcoR1).
Данный факт согласуется с литературными данными, говорящими о
преобладании определенного типа плазмид в микробной популяции (Stuart-Keil
et al., 1998).
10.0 т.п.н.
1 2
3 4 5
6
7
8
9 10 11 12 М
Рис. 1. Электрофореграмма плазмидной ДНК в ризосферных штаммахдеструкторах ПАУ, обработанной эндонуклеазами рестрикции EcoRI (1-6), XhoI
(7-12). 1, 7 – pBS216, 2, 8 – pIC7, 3, 9 – pOV17, 4, 10 – pOV25, 5, 11 – pOV29, 6,
12 – NAH7. М – 1 т.п.н. ДНК маркер (СибЭнзим, Россия).
8
Выделенные штаммы обладали сходными ростовыми параметрами при
культивировании на ПАУ (табл. 2). Продолжительность лаг-фазы составляла 34 ч при культивировании на нафталине и не более 24 ч – на трех кольцевых
ПАУ. Максимальная удельная скорость роста (µmax, ч-1) варьировала от 0.3-0.41
ч-1 на нафталине до 0.01-0.05 ч-1 на трех кольцевых ПАУ. При использовании
фенантрена и антрацена как единственных источников углерода и энергии, в
культуральной жидкости штаммов накапливались, соответственно, 1-гидрокси2-нафтойная и 2-гидрокси-3-нафтойная кислоты.
Таблица 2. Ростовые характеристики ризосферных штаммов-деструкторов ПАУ
Штамм
Субстрат
P. аureofaciens
OV17(pOV17)
фенантрен
антрацен
нафталин
фенантрен
антрацен
нафталин
фенантрен
антрацен
нафталин
фенантрен
антрацен
нафталин
P. fluorescens
IC7(pIC7)
P. fluorescens
OV29(pOV29)
Pseudomonas spp.
OV25(pOV25)
Идентифицирован
ные метаболиты
1Г2Н
2Г3Н
1Г2Н
2Г3Н
1Г2Н
2Г3Н
1Г2Н
2Г3Н
-
Лаг-период,
ч
24
24
3
24
24
4
24
24
4
24
24
4
µmax, ч-1
0.03
0.03
0.41
0.03
0.05
0.32
0.02
0.02
0.30
0.01
0.01
0.31
Все выделенные штаммы обладали примерно одинаковым уровнем
синтеза нафталин диоксигеназы (2-15 нмоль/мин мг белка) и салицилат
гидроксилазы (4-18 нмоль/мин мг белка). Наиболее высокая удельная
активность катехол-1,2-диоксигеназы (орто-путь расщепления катехола) была
выявлена у штаммов P. fluorescens IC7(pIC7), IID5(pIID5), VB1(pVB1), а
катехол-2,3-диоксигеназы (мета-путь расщепления катехола) − у Pseudomonas
sp. OV9(pOV9) и As15(pAs15). Штамм P. aureofaciens OV17(pOV17) обладал
высокими удельными активностями как катехол-1,2-диоксигеназы, так и
катехол-2,3-диоксигеназы (57.8 и 305.3 нмоль/мин мг белка, соответственно).
Определение антагонистической активности показало, что 5 штаммов
(3 штамма P. fluorescens IC7(pIC7), VB1(pVB1), IID5(pIID5) и 2 штамма P.
aureofaciens OV17(pOV17) и IG1) подавляли рост фитопатогенных грибов
родов
Gaeumannomyces,
Fusarium
и
Rhizoctonia.
Наибольшую
антагонистическую активность, сходную с контрольным штаммом P.
aureofaciens BS1393, показали изоляты OV17(pOV17) и IG1.
С использованием специфических праймеров PCA2a и PCA3b,
комплементарных последовательности феназинового оперона phzCD, были
амплифицированы идентичные фрагменты ДНК у пяти вышеуказанных
9
штаммов и контрольного штамма P. fluorescens 2-79 (рис. 2,А). Положительный
ПЦР ответ был также получен у штаммов OV17 и IG1 для гена prnC,
необходимого для биосинтеза пирролнитрина (рис. 2, Б). Генов, необходимых
для синтеза пиолютеорина и флороглюцинов амплифицировано не было.
А
Б
1000 п.н.
700 п.н.
1000 п.н.
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента феназинового
оперона phzCD (А) и гена prnC, необходимого для синтеза пирролнитрина (Б) у
ризосферных бактерий-деструкторов ПАУ. М – ДНК маркер (СибЭнзим,
Россия).
А: 1 − P. fluorescens 2-79 (положительный контроль), 9 – P. fluorescens Q2-87
(отрицательный контроль); Б: 1 – P. fluorescens Pf-5 (положительный контроль),
9 – P. fluorescens 2-79 (отрицательный контроль); 2 – IC7(pIC7), 3 – IID5(pIID5),
4 – VB1(pVB1), 5 – OV9(pOV9), 6 – OV29(pOV29), 7 – OV17(pOV17), 8 – IG1.
Было показано, что штаммы P. fluorescens IC7(pIC7), VB1(pVB1),
IID5(pIID5) синтезируют только феназин-1-карбоновую кислоту, а P.
aureofaciens OV17(pOV17) и IG1 – феназин-1-карбоновую кислоту, 2оксифеназин и 2-оскифеназин-1-карбоновую кислоту.
Способность ризосферных бактерий к синтезу фитогормонов может
положительно влиять на эффективность фиторемедиации за счет увеличения
вегетативной массы растений. Все штаммы-деструкторы синтезировали
индолил-3-уксусную кислоту в количестве около 2-6 мкг/мг сухих клеток.
Таким образом, изолированы новые плазмидосодержащие штаммы,
принадлежащие к видам P. fluorescens и P. aureofaciens, совмещающие
способность деградировать ПАУ, подавлять рост фитопатогенов и
продуцировать индолил-3-уксусную кислоту. Впервые выделен штамм P.
aureofaciens OV17(pOV17), содержащий плазмиду биодеградации нафталина.
3. Взаимодействие ризосферных плазмидосодержащих PGPR Pseudomonas с
растениями
В работе использовали штаммы PGPR Pseudomonas, продуцирующие
различные антибиотики и фитогормоны. Штамм P. fluorescens 38a
синтезировал пиолютеорин, P. chlororaphis PCL1391 − феназин-1-карбоксамид,
P. aureofaciens BS1393 и P. aureofaciens OV17(pOV17) − окси-производные
феназин-1-карбоновой кислоты, P. putida 53а − индолил-3-уксусную кислоту. В
10
указанные штаммы были переданы две плазмиды биодеградации нафталина
pOV17 и pBS216. Плазмида pBS216 относится к P-9 группе несовместимости и
содержит полный набор генов, необходимых для биодеградации нафталина
(Кочетков с соавт., 1997). Все полученные комбинации «ризосферный штамм плазмида биодеградации», за исключением варианта P. putida 53a(pBS216),
были способны эффективно использовать нафталин в качестве единственного
источника углерода и энергии (табл. 3).
Таблица 3. Физиологические параметры роста плазмидосодержащих PGPR
Pseudomonas при выращивании на минеральной среде с нафталином (1 г/л)
g в логКОЕmax
периоде, ч
Штаммы, несущие плазмиду pOV17
P. aureofaciens OV17(pOV17)
0.41
1.7
7.4×108 ± 2.2×107
P. chlororaphis PCL1391(pOV17)
0.30
2.3
1.0×109 ± 6.0×105
P. aureofaciens BS1393(pOV17)
0.33
2.1
7.5×108 ± 5.8×106
P. putida 53а(рOV17)
0.31
2.2
1.5×109 ± 1.8×107
Штаммы, несущие плазмиду pBS216
0.45
1.5
2.0×109 ± 6.7×107
P. chlororaphis PCL1391(pBS216)
P. aureofaciens OV17(pBS216)
0.27
2.6
1.9×108 ± 1.3×107
P. aureofaciens BS1393(pBS216)
0.36
1.9
2.1×108 ± 2.0×107
P. putida 53a(рBS216)
0.13
5.3
2.9×106 ± 2.3×105
P. fluorescens 38a(pBS216)
0.39
1.8
1.3×109 ± 5.1×107
µmax – максимальная удельная скорость роста, ч-1, рассчитанная согласно
изменению КОЕ в культуральной жидкости.
g – время одной генерации, ч, в логарифмической фазе роста культуры.
Штамм
µmax, ч-1
Максимальная скорость роста была обнаружена у природного штамма P.
aureofaciens OV17(pOV17) − 0.41 ч-1 и полученного трансконъюганта P.
chlororaphis PCL1391(pBS216) − 0.45 ч-1. Штамм P. putida 53a(pBS216)
характеризовался самой низкой максимальной удельной скоростью роста (μmax
= 0.13 ч-1) и наименьшей максимально достижимой концентрацией бактерий
(КОЕ = 2.89 × 106). При культивировании P. putida 53a(pBS216) в жидкой среде
с нафталином в культуральной жидкости накапливался катехол и ряд
неидентифицированных соединений. Ни салицилат, ни катехол не
обнаруживались в культуральной жидкости остальных штаммов.
При использовании плазмидосодержащих штаммов в ремедиации почв
большое значение имеет стабильность поддержания плазмид и сохранение
фенотипа интродуцируемых микроорганизмов. Определение стабильности
исследуемых плазмид биодеградации нафталина выявило, что плазмида pOV17
более стабильно поддерживается в плазмидосодержащих штаммах, чем
pBS216. Лучшими штаммами хозяевами плазмид являлись P. chlororaphis
PCL1391 и P. putida 53а. После 7 суток культивирования стабильность обоих
плазмид в этих штаммах составляла около 100%. В штаммах P. aureofaciens
11
BS1393(pBS216) и OV17(pBS216) стабильность плазмиды pBS216 была очень
низкой. На 3 сутки культивирования плазмидосодержащие варианты
составляли не более 40%, практически полностью исчезая к 7 суткам.
Сравнение стабильности плазмид у одного и того же варианта штамма
показало, что на среде М9 стабильность, как правило выше, чем на LB. Это
может быть связано с более продолжительным временем генерации штаммов на
бедных средах. Например, для P. aureofaciens BS1393(pBS216) время одной
генерации в экспоненциальной фазе роста на среде LB составляло около 40
мин, а на М9 с глицерином – 1.5 ч.
Помимо стабильности поддержания, важной характеристикой плазмид
является их структурная стабильность. Низкая скорость роста и накопление
продуктов неполного окисления нафталина у штамма P. putida 53a(pBS216)
могло быть результатом неспособности плазмидных генов катаболизма
нафталина эффективно экспрессироваться в результате структурных изменений
плазмиды, происходящих при ее переносе в данный штамм.
На рис. 3 приведен пример рестрикционного анализа плазмидной ДНК из
штаммов P. putida BS394(pBS216) (донора плазмиды pBS216), полученного
трансконъюганта P. aureofaciens BS1393(pBS216) и P. putida 53а(pBS216).
Показано, что некоторые фрагменты плазмиды pBS216 из P. putida 53а(pBS216)
имели меньший молекулярный вес, чем фрагменты исходной плазмиды. (В
дальнейшем плазмида из штамма P. putida 53а(pBS216) будет обозначаться как
pBS216*).
Рис. 3. Электрофореграмма ДНК плазмид биодеградации, выделенных из
штаммов P. putida BS394(pBS216), P. aureofaciens BS1393(pBS216) и P. putida
53а(pBS216*) и обработанных эндонуклеазами рестрикции.
1 − 1 т.п.н. ДНК маркер; 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23 – плазмидная ДНК из
исходного штамма P. putida BS394(pBS216); 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21,24 −
плазмидная ДНК из штамма P. aureofaciens BS1393(pBS216); 4, 7, 10, 13, 16, 19,
22, 25 − плазмидная ДНК из штамма P. putida 53a(pBS216*). Плазмидная ДНК
была обработана следующими ферментами: 2-4 – EcoRI, 5-7 − Psp124BI, 8-10 –
BamHI, 11-13 – PstI, 14-16 – SalI, 17-19 – BglII, 20-22 – SmaI, 23-25 – HpaI.
12
Исходя из данных таблицы 4 видно, что произошедшие структурные
перестройки повлияли на экспрессию nah-оперона плазмиды pBS216*. У
штамма P. putida 53a(pBS216*) уровень удельных активностей нафталин
диоксигеназы и салицилат гидроксилазы был сравним с исходным штаммом P.
putida BS394(pBS216), в то время как удельные активности катехол
диоксигеназ вообще не регистрировались. Полученные результаты
подтверждают, что произошедшие структурные перестройки плазмиды
pBS216* инактивировали ген nahH (кодирует катехол-2,3-диоксигеназу),
который имеет плазмидную локализацию.
Таблица 4. Удельная активность ключевых ферментов деградации нафталина в
исходных и полученных штаммах на минеральной среде с нафталином
Штамм
Удельная активность ферментов, нмоль/мин мг белка
НО
СГ
К12О
К23O
BS394(pBS216)
1.99 ± 0.01
3.98 ± 0.01
14.64 ± 1.83 41.31 ± 3.22
PCL1391(pBS216) 2.76 ± 0.01
4.41 ± 0.02
34.31 ± 3.34 63.49 ± 3.62
53a(pBS216*)
3.79 ± 0.01
4.20 ± 0.01
0
0
OV17(pOV17)
8.83 ± 0.03
10.79 ± 0.08 57.77 ± 3.50 305.28 ± 11.33
PCL1391(pOV17) 3.55 ± 0.01
4.46 ± 0.01
30.97 ± 2.18 200.51 ± 8.45
53a(рOV17)
5.21 ± 0.01
5.20 ± 0.01
0
224 ± 6.45
НО − нафталин диоксигеназа, СГ − салицилат гидроксилаза, К12О − катехол1,2-диоксигеназа, К23О − катехол-2,3-диоксигеназа.
Изучение влияния плазмидосодержащих штаммов на рост растений
(двудольных: рапс, горчица, табак, однодольных: ячмень, пшеница) и
деградацию ПАУ проводили в стерильных микровегетационных экспериментах
в присутствии нафталина и фенантрена (рис. 4).
BS1393(pBS216)
BS1393
Рис. 4. Влияние различных вариантов штамма P. aureofaciens BS1393 на рост
растений пшеницы в присутствии нафталина (200 мкг/г).
13
Нафталин оказывал выраженное токсичное действие на растения. Длина
растений, выращенных без инокуляции, была в среднем на 80% меньше, чем у
контрольных растений, выращенных без добавления нафталина. Исходные
бесплазмидные варианты штаммов не оказывали защитного влияния на
развитие растений (рис. 4). Инокуляция проростков полученными
плазмидосодержащими ризосферными бактериями, за исключением штамма P.
putida 53a(pBS216*), оказывала защитный эффект во всех вариантах (рис. 5).
В случае P. putida 53a(pBS216*) прорастание отсутствовало, что явилось
худшим результатом даже по сравнению с небактеризованным контролем в
присутствии нафталина (рис. 5). У всех проростков, обработанных P. putida
53a(pBS216*) корневая система не развивалась и чернела. Такое отрицательное
влияние штамма на развитие растений было выявлено только в присутствии
нафталина. В модельных системах с песком без загрязнителя все варианты
штамма P. putida 53a не отличались между собой по влиянию на рост растений.
6,0
длина побега, см
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
ь
ь
6)
*) 17)
6) 17)
6) 17)
6) 17)
1
1
6
1
1
ол
ол
2
2
2
1
2
р
р
V
V
V
V
S O
2 O
S
S O
S O
т
т
он
pB 3(p
pB 1( p
он
pB
BS a(p
pB 7(p
(
(
(
(
к
к
p
a
3 9
1 9
( 3
.
17 V1
т.
38
39 13
3a 5
ат
39 13
и
V
1
5
1
ц
S
ж
O O
S
L CL
и
B B
ло
тр
о
PC P
о
п
Рис. 5. Влияние плазмидосодержащих штаммов на длину проростков рапса в
присутствии нафталина (200 мкг/г) в стерильном микровегетационном
эксперименте.
- положительный контроль, проростки выращивались без добавления
нафталина и без инокуляции;
- отрицательный контроль, проростки
выращивались в присутствии нафталина (200 мкг/г) и без инокуляции;
- штаммы, несущие плазмиду pBS216;
- штаммы, несущие плазмиду
pOV17.
14
Структурное изменение плазмиды pBS216* в этом штамме привело к
выключению гена катехол-2,3-диоксигеназы и накоплению продуктов
неполного окисления катехола, которые оказали токсичное действие на
растения.
Численность
бактерий,
колонизирующих
ризоплану
растений,
варьировала в зависимости от видовой принадлежности штамма, наличия
плазмид биодеградации и присутствия нафталина в модельной системе.
В модельных системах без добавления нафталина, все штаммы
колонизировали корни примерно одинаково. Численность увеличивалась на
порядок с 2-4108 (0 сут выращивания растений) до 8×108-1.5×109 КОЕ/г
корней (7-10 сут). Штамм P. chlororaphis PCL1391 колонизировал ризоплану
несколько лучше, чем исследуемые штаммы других видов.
9,0E+09
8,0E+09
КОЕ/г корней
7,0E+09
6,0E+09
5,0E+09
4,0E+09
3,0E+09
2,0E+09
1,0E+09
1,0E+07
0 сут
3 сут
PCL1391 контроль
PCL1391(pBS216) контроль
PCL1391(pOV17) контроль
7 сут
10 сут
14 сут
PCL1391 nah
PCL1391(pBS216) nah
PCL1391(pOV17) nah
Рис. 6. Динамика численности различных вариантов штамма P. chlororaphis
PCL1391 в ризосфере растений рапса.
контроль – растения выращивали без добавления нафталина, nah – растения
выращивали в присутствии нафталина.
В присутствии нафталина численность как бесплазмидных, так и
плазмидосодержащих штаммов увеличивалась в 3-5 раз по сравнению с теми
же вариантами без нафталина (рис. 6). Сравнение численности вариантов
одного и того же штамма, содержащих разные плазмиды биодеградации
показало, что штаммы, обладающие большей скоростью роста в периодической
культуре, колонизировали корни несколько лучше, чем медленно растущие
варианты.
15
Стабильность плазмид биодеградации нафталина pBS216 и pOV17 у
исследуемых штаммов, колонизирующих ризоплану, была значительно выше
по сравнению со стабильностью при периодическом культивировании. На 14
сутки плазмидосодержащие варианты составляли 75-100%. Как и в случае
периодического
культивирования,
наиболее
стабильно
плазмиды
поддерживались в штаммах P. chlororaphis PCL1391 и P. putida 53а.
Стабильное поддержание плазмид биодеградации в микровегетационном
эксперименте можно объяснить низкой скоростью роста штаммов, и,
следовательно, более продолжительным временем генерации. Например, время
одной генерации P. aureofaciens BS1393(pBS216) в модельных системах
составляло около 30 ч, а в среде LB – около 40 мин.
Все исследуемые плазмидосодержащие штаммы были способны к
деградации нафталина в модельных системах (табл. 5). Содержание нафталина
при внесении плазмидосодержащих штаммов уменьшалось в 10-30 раз (в
зависимости от штамма) по сравнению с контрольным вариантом без
инокуляции проростков. Наименьшее содержание нафталина было выявлено в
вариантах с инокуляцией штаммами OV17(pBS216), OV17(pOV17) и
38a(pBS216) – 2.83, 3.44 и 2.40 мкг/г песка соответственно.
Варианты одного и того же штамма, содержащие плазмиду pBS216 или
pOV17, не различались между собой по эффективности деградации. Штамм P.
putida 53а(pBS216*) деградировал нафталин наравне с остальными
плазмидосодержащими вариантами. Можно предположить, что его
ингибирующее влияние на растения связано с накоплением продуктов
неполного окисления катехола. В модельных системах с внесением
бесплазмидных штаммов содержание нафталина было сходно с контрольным
вариантом «нафталин + растение без инокуляции».
Таблица 5. Содержание нафталина (мкг/г) в песке в стерильных модельных
системах через 7 суток выращивания растений по результатам ВЭЖХ
Вариант
Растения без инокуляции
P. chlororaphis PCL1391(pBS216)
P. chlororaphis PCL1391(pOV17)
P. aureofaciens BS1393(pBS216)
P. aureofaciens BS1393(pOV17)
P. aureofaciens OV17(pBS216)
P. aureofaciens OV17(pOV17)
P. putida 53a(pBS216*)
P. putida 53a(pOV17)
P. fluorescens 38a(pBS216)
Содержание нафталина, мкг/г песка
95.66±3.19
7.13±0.62
7.95±0.58
9.85±0.85
8.25±1.13
2.83±0.43
3.44±0.30
4.85±0.21
4.53±0.23
2.40±0.10
Изучение деградации фенантрена показало, что инокуляция семян
ячменя плазмидосодержащими бактериями оказывала положительное влияние
на рост растений в торфо-смеси, содержащей фенантрен (5 мг/г). На всем
протяжении эксперимента (28 суток) небактеризованные растения отставали в
16
росте от контроля и от растений, обработанных штаммами-деструкторами.
Существенных различий между природными и трансконъюгантными
штаммами не наблюдалось. Численность штаммов составляла около 105 КОЕ/г
корней, незначительно уменьшаясь в пределах порядка. В конце эксперимента
в варианте, где семена бактеризовались штаммом P. aureofaciens OV17(pOV17),
содержание фенантрена было наименьшим и составляло около 0.4 мг/г,
эффективность деградации в этом случае достигала 67%. Штамм P. fluorescens
38a(pBS216) способствовал снижению содержания фенантрена на 50% (рис. 7).
мг/г
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Рис. 7. Содержание фенантрена (мг/г) в торфо-смеси через 28 суток по
результатам ВЭЖХ.
1 − контроль, торфо-смесь без ячменя, 2 − небактеризованный ячмень, 3 −
BS1393(pBS216), 4 − 38a(pBS216), 5 − IC7(pIC7), 6 − OV29(pOV29), 7 −
OV17(pOV17), 8 − OV25(pOV25).
4. Ризосферные штаммы PGPR Pseudomonas, способные к деградации ПАУ
в присутствии тяжелых металлов
На заключительном этапе работы были получены полифункциональные
штаммы ризосферных псевдомонад, способные деградировать ПАУ в
присутствии тяжелых металлов. Основным принципом конструирования
устойчивых штаммов являлось сочетание в одной клетке двух природных
плазмид – плазмиды биодеградации нафталина (pBS216 или pOV17) и
плазмиды резистентности к кобальту/никелю (pBS501). Плазмида pBS501,
изолированная из штамма Comamonas sp. BS501(pBS501), содержит cnrподобный оперон, детерминирующий индуцибельную устойчивость к никелю и
кобальту (Сиунова с соавт., 2009).
Для получения полифункциональных штаммов плазмидой pBS501 были
трансформированы полученные ранее штаммы-деструкторы ПАУ. Селекцию
клонов проводили на среде LВ с 2 мМ CoCl2. В устойчивых штаммах
обнаруживались две плазмиды (65 и 85 т.п.н.), по молекулярной массе
соответствующие плазмидам pBS216/pOV17 (85 т.п.н.) и рBS501 (65 т.п.н.).
17
В полученном варианте P. chlororaphis PCL1391(рBS216,рBS501) обе
плазмиды стабильно поддерживались и сохраняли детерминируемый фенотип
Nah+, Cor/Nir на уровне 100% после 10 суток культивирования в неселективных
условиях. Стабильность признака устойчивости к тяжелым металлам и
деградации нафталина в других двуплазмидных штаммах была значительно
ниже.
Уровень устойчивости к кобальту/никелю, в двуплазмидных вариантах
был в 4-5 раз выше по сравнению с чувствительными штаммами. Все
двуплазмидные штаммы были резистентны к 400 мкМ никеля и 200 мкМ
кобальта при культивировании в трис-минеральной среде с нафталином (1 г/л).
При выращивании двуплазмидных штаммов на нафталине в присутствии
100 мкМ Ni2+ или 50 мкм Co2+ штамм P. chlororaphis PCL1391(pBS216,pBS501)
показал лучшие ростовые параметры и был отобран для дальнейшей работы.
Из таблицы 6 видно, что никель не оказывал отрицательного влияния на
жизнеспособность устойчивого штамма PCL1391(pBS216,pBS501). Как в
контроле, так и в присутствии металла при одинаковой плотности культуры
число КОЕ совпадали и возрастали. В конце экспоненциального роста титр
клеток составил около 1.2 × 1010 КОЕ/мл по сравнению с начальным значением
1.5×107 КОЕ/мл.
Увеличение ОП чувствительного штамма PCL1391(pBS216) было связано
с накоплением окрашенных метаболитов и образованием бурого преципитата в
среде культивирования. Только через 36 часов роста чувствительный штамм
достигал ОП 0.2, количество жизнеспособных клеток при этом увеличивалось
незначительно. При дальнейшем нарастании ОП наблюдалась гибель бактерий,
КОЕ уменьшались на 2 и 4 порядка (КОЕОП 0.4= 1.4 × 105 и КОЕОП 0.6= 2.0 × 103).
Таблица 6. Динамика численности (КОЕ/мл) различных вариантов штамма P.
chlororaphis PCL1391 в ТМС с нафталином в присутствии 100 мкМ никеля
ОП540
1
0.03
PCL1391(pBS216)
PCL1391(pBS216,pBS501)
2+
нафталин
нафталин + Ni
нафталин
нафталин + Ni2+
1.6 × 107 (0)1
3.7 × 107 (0)
3.5 × 107 (0)
1.5 × 107 (0)
0.2
1.3 × 108 (9)
7.0 × 107 (36)
4.0 × 108 (9)
2.4 × 108 (7)
0.4
2.1 × 109 (12)
1.4 × 105 (54)
3.0 × 109 (15)
1.0 × 109 (11)
0.6
1.3 × 1010 (18)
2.0 × 103 (69)
8.2 × 1010 (21)
1.2 × 1010 (21)
В скобках указано время выращивания в часах.
Удельную активность ферментов деградации нафталина измеряли при
достижении бактериальными культурами ОП 0.2, что соответствовало
количеству клеток около 108 КОЕ/мл (табл. 7). При культивировании
чувствительного штамма P. chlororaphis PCL1391(pBS216) в присутствии
никеля удельная активность ферментов была сходна с чувствительным
штаммом, выращенным без металла. Снижение жизнеспособности штамма и
18
падение его титра в присутствии никеля было в большей степени связано с
общим токсичным действием металла на клеточный метаболизм, чем с
ингибированием исследуемых ферментов деградации. Поскольку даже через 54
ч культивирования чувствительного штамма в присутствии никеля, при
количестве жизнеспособных клеток около 1.4 × 105 КОЕ/мл регистрировалась
активность данных ферментов.
Таблица 7. Удельная активность ключевых ферментов биодеградации
нафталина (нмоль/мин мг белка) у различных вариантов штамма P. chlororaphis
PCL1391
Фермент
нафталин
диоксигеназа
салицилат
гидроксилаза
катехол-1,2диоксигеназа
катехол-2,3диоксигеназа
PCL1391(pBS216)
PCL1391(pBS216,pBS501)
2+
нафталин
нафталин + Ni нафталин
нафталин + Ni2+
4.6
4.6
4.0
3.4
32.0
32.8
26.8
44.6
97.7
84.4
56.5
87.1
8.5
4.1
1.8
0
Ингибирующее влияние никеля отразилось на эффективности
биодеградации нафталина. В присутствии 100 мкМ никеля штамм
PCL1391(pBS216) при плотности 7.0×107 КОЕ/мл за 36 часов окислял только
12% нафталина (табл. 8). При дальнейшем нарастании ОП культуры
наблюдалось уменьшение численности штамма, и убыль нафталина в среде
зависела только от его испарения.
Таблица 8. Биодеградация нафталина вариантами штамма P. chlororaphis
PCL1391 в различных условиях роста
Штаммы
PCL1391(pBS216,pBS501)
PCL1391(pBS216)
Условия роста
нафталин
нафталин + Ni
нафталин
нафталин + Ni
Время, ч
21
21
18
36
Нафталин, мг/л 59.0 ± 0.1
9.0 ± 0.1
9.0 ± 0.1
168.0 ± 17.0
1
Контроль
870.0 ± 22.0 870.0 ± 22.0
900.0 ± 15.0 191.0 ± 40.0
% деградации
93
98
99
12
1
Концентрация нафталина в среде без бактерий, мг/л.
Преимущество устойчивого штамма по сравнению с чувствительным
было
очевидным.
В
присутствии
никеля
устойчивый
штамм
10
PCL1391(pBS216,pBS501), достигший за 21 час плотности 1.2×10 клеток/мл,
окислял 98% нафталина, столько же, сколько чувствительный штамм
PCL1391(pBS216), выращенный без металла (табл. 8).
19
При получении плазмидосодержащих вариантов PGPR Pseudomonas
необходимо учитывать возможное отрицательное влияние плазмид на
фитостимулирующие и защитные свойства штаммов. В полученных штаммах
наличие плазмид биодеградации нафталина и устойчивости к тяжелым
металлам не уменьшало продукцию феназиновых антибиотиков и
пиолютеорина. Антагонистическая активность штаммов сохранялась на
прежнем уровне (рис. 8).
А
Б
Рис. 8. Антагонистическая активность плазмидосодержащих вариантов штамма
P. aureofaciens BS1393 in vitro.
А – подавление роста F. graminearum, Б – R. solani.
1 – P. aureofaciens BS1393, 2 – P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501), 3 – P.
aureofaciens BS1393(pOV17), 4 – P. aureofaciens BS1393(pBS216).
Количество ИУК у плазмидосодержащих вариантов было сходно с
родительскими бесплазмидными штаммами, а в некоторых случаях продукция
незначительно увеличивалась. Таким образом, плазмиды не влияли на
основные физиологические свойства штаммов, необходимые для подавления
фитопатогенов и улучшения роста растений.
Полученные нами результаты демонстрируют возможность совмещения
плазмид катаболизма ПАУ, плазмид резистентности к тяжелым металлам и
систем стимуляции роста/защиты растений. Такой подход может быть
использован при создании полифункциональных штаммов PGPR Pseudomonas,
эффективных для фиторемедиации почв, загрязненных нефтью в комплексе с
ПАУ и тяжелыми металлами.
Депонирование
штаммов.
Штаммы
микроорганизмов
были
депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов под следующими
номерами: P. aureofaciens OV17(pOV17) − ВКМ В-2391 Д, P. aureofaciens
BS1393(pBS216,pBS501) − ВКМ В-2501 Д.
20
ВЫВОДЫ
1. Выделены и охарактеризованы новые штаммы бактерий рода Pseudomonas,
совмещающие способность подавлять развитие фитопатогенов, стимулировать
рост растений и деградировать ПАУ. Впервые у бактерий P. aureofaciens
обнаружены плазмиды биодеградации нафталина.
2. Показано, что наиболее активные штаммы, являющиеся антагонистами
широкого круга фитопатогенов, содержат одновременно генетические системы
необходимые для биосинтеза пиолютеорина, пирролнитрина и 2,4диацетилфлороглюцина (4 штамма P. fluorescens), и пирролнитрина и феназин1-карбоновой кислоты (6 штаммов P. aureofaciens, 1 штамм P. chlororaphis).
3. Полученные плазмидосодержащие штаммы различаются по эффективности
деградации нафталина и стабильности поддержания плазмид биодеградации и
резистентности к тяжелым металлам. Плазмиды не влияют на основные
физиологические свойства штаммов, необходимые для подавления
фитопатогенов и улучшения роста растений.
4. Полученные плазмидосодержащие штаммы защищают растения от
токсичного воздействия ПАУ. Эффективность деградации нафталина (200
мкг/г) в стерильных условиях составляет около 100%. В торфо-смеси,
загрязненной фенантреном (5 мг/г) максимальная биодеградация (выше 50%)
осуществляется штаммами P. fluorescens 38a(pBS216) и P. aureofaciens
OV17(pOV17).
5. Сконструированы штаммы ризосферных бактерий рода Pseudomonas,
способные к деградации нафталина в присутствии тяжелых металлов.
Устойчивый к тяжелым металлам двуплазмидный штамм P. chlororaphis
PCL1391(pBS216,pBS501) способен к практически полной (> 90%) деградации
нафталина (1 г/л) в присутствии 100 мкМ никеля при периодическом
культивировании.
Благодарности.
Автор
искренне
признателен
сотрудникам,
способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: к.х.н. Н.Ф.
Зеленковой, к.б.н. В.М. Аданину, к.б.н. А.В. Лисову, к.б.н. С.Л. Соколову,
м.н.с. Т.В. Сиуновой, а также всем сотрудникам лаборатории биологии
плазмид.
Особую благодарность автор выражает своему руководителю к.б.н.
В.В. Кочеткову.
Работа была выполнена при поддержке гос. контрактов: РНП №
2.1.1/4341, ФЦП ГК № 02.512.11.2337, ФЦП ГК № 02.740.11.0682, ФЦП ГК №
02.740.11.0040, ФЦП ГК № 14.740.11.0414 и проекта МНТЦ № 4033.
Статьи
1. Анохина Т.О., Кочетков В.В., Зеленкова Н.Ф., Балакшина В.В., Боронин А.М.
2004. Биодеградация фенантрена ризосферными плазмидосодержащими
бактериями рода Pseudomonas в модельных растительно-микробных
ассоциациях // Прикладная биохимия и микробиология. Т. 40. № 6. С. 654-658.
21
2. Волкова О.В., Анохина Т.О., Пунтус И.Ф., Кочетков В.В., Филонов А.Е.,
Боронин А.М. 2005. Влияние плазмид биодеградации нафталина на
физиологические характеристики ризосферных бактерий рода Pseudomonas //
Прикладная биохимия и микробиология. Т. 41. № 5. С. 1-5.
3. Anokhina T.O., Volkova O.V., Puntus I.F., Filonov A.E., Kochetkov V.V.,
Boronin A.M. 2006. Plant growth-promoting Pseudomonas bearing catabolic
plasmids: naphthalene degradation and effect on plants. Process Biochemistry //
V. 41. P. 2417-2423.
4. Сиунова Т.В., Анохина Т.О., Машукова А.В., Кочетков В.В., Боронин А.М.
2007. Ризосферный штамм Pseudomonas chlororaphis, способный к деградации
нафталина в присутствии кобальта/никеля // Микробиология. Т. 76. № 2. С. 212218.
5. Боронин А.М., Кочетков В.В., Сиунова Т.В., Анохина Т.О., Сизова О.И.
«Изменение микробного сообщества ризосферных микроорганизмов под
влиянием антропогенного загрязнения окружающей среды и интродукции в
ризосферу плазмидосодержащих бактерий», стр. 113-124. Коллективная
монография «Изменение окружающей среды и климата» в 8-ми томах. Т. 4.
«Процессы в биосфере: изменения почвенно-растительного покрова и
территориальных вод РФ, круговорот веществ под влиянием глобальных
изменении климата и катастрофических процессов» Пред. ред. кол. Н.П.
Лаверов, РАН-М.: ИФЗ РАН, 2008.
Патенты
1. Анохина Т.О., Кочетков В.В., Боронин А.М. Штамм бактерий Pseudomonas
aureofaciens ВКМ В-2391 Д для защиты и улучшения роста растений, растущих
на почвах, загрязненных полициклическими ароматическими углеводородами.
Патент РФ на изобретение № 2352629. Приоритет изобретения 12.04.2006 г.
2. Анохина Т.О., Сиунова Т.В., Сизова О.И., Кочетков В.В., Боронин А.М.
Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2501 Д для биодеградации
полициклических ароматических углеводородов в условиях загрязнения почв
солями никеля. Патент РФ на изобретение № 2396339. Приоритет изобретения
02.07.2008 г.
3. Сизова О.И., Анохина Т.О., Сиунова Т.В., Кочетков В.В., Боронин А.М.
Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКМ B-2500 Д для биодеградации
полициклических ароматических углеводородов в условиях загрязнения почв
арсенитом натрия. Патент РФ на изобретение № 2396338. Приоритет
изобретения 02.07.2008 г.
Тезисы
1. Анохина Т.О., Кочетков В.В., Боронин А.М. Варианты ризосферного штамма
Pseudomonas aureofaciens BS1393, способные к биодеградации нафталина и
фенантрена. Сб. тезисов 5-й Пущинской конференции молодых ученых
«Биология – наука XXI века», Пущино, 2001, с. 196.
2. Кочетков В.В., Валидов Ш.З., Сиунова Т.В., Мордухова Е.А., Сизова О.И.,
Анохина Т.О., Балакшина В.В, Боронин А.М. Использование генетически
модифицированных
ризосферных
бактерий
рода
Pseudomonas
в
22
фиторемедиации. Сб. тезисов конференции «Экобиотехнология: Борьба с
нефтяным загрязнением окружающей среды». Пущино, 2001, с. 85-87.
3. Кочетков В.В., Валидов Ш.З., Сиунова Т.В., Сизова О.И., Анохина Т.О.,
Балакшина В.В., Боронин А.М. Микробиологические аспекты биоремедиации
техногенно-загрязненных
территорий.
Всероссийская
конференция
«Сельскохозяйственная микробиология в ХIХ-ХХI веках». Тезисы докладов.
14-19 июня 2001, Санкт-Петербург, с. 64-65.
4. Anokhina T.O., Validov Sh.Z., Kochetkov V.V., Boronin A.M. Characterization
and identification of polycyclic aromatic hydrocarbon–degrade bacteria from plant
rhizosphere. Abstract book International symposium «Biochemical interactions of
microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants». 28-30 July
2003, Saratov, Russia, p. 3.
5. Анохина Т.О., Волкова О.В., Пунтус И.Ф., Кочетков В.В., Филонов А.Е,
Боронин А.М. Взаимодействие ризосферных бактерий и штамма-деструктора
полициклических ароматических углеводородов в ризосфере рапса. Сб. тезисов
конференции «Биотехнология 2003». 24-25 ноября 2003, Пущино. С. 101-102.
6. Волкова О.В., Анохина Т.О., Пунтус И.Ф., Кочетков В.В., Филонов А.Е.
Влияние комбинаций «плазмида биодеградации–ризобактерия Pseudomonas» на
развитие растений в условиях загрязнения почвы ПАУ. Сб. тезисов III
Пущинской международной школы-семинара по экологии «Экология 2004:
Эстафета поколений». 27-29 апреля 2004, Пущино, с. 8-9.
7. Волкова О.В., Анохина Т.О., Пунтус И.Ф., Кочетков В.В., Филонов А.Е.
Исследование комбинаций «плазмида-бактериальный хозяин» в ризосферных
бактериях рода Pseudomonas. Сб. тезисов 8-й международной Пущинской
школы-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века». 17-21 мая
2004 г., Пущино, с. 254.
8. Пунтус И.Ф., Игнатова А.А., Анохина Т.О., Филонов А.Е., Кочетков В.В.,
Боронин А.М. Взаимодействие PGPR и микроорганизмов-деструкторов в
ризосфере и ризоплане растений в условиях загрязнения модельной почвы
полициклическими ароматическими углеводородами. Материалы 8-ого
международного семинара-презентации инновационных научно-технических
проектов «Биотехнология-2005». 18-19 ноября 2005, Наукоград Пущино.
9. Филонов А.Е., Ветрова А.А., Пунтус И.Ф., Гафаров А.Б., Волкова О.В.,
Анохина Т.О., Боронин А.М. Влияние плазмид биодеградации на ростовые
характеристики различных штаммов рода Pseudomonas и степень деструкции
нефти.
Материалы
8-ого
международного
семинара-презентации
инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2005». 18-19
ноября 2005, Наукоград Пущино.
10. Кочетков В.В., Сиунова Т.В., Сизова О.И., Анохина Т.О., Машукова А.В.,
Боронин А.М. Ризосферные штаммы бактерий рода Pseudomonas для
фиторемедиации почв с комплексным загрязнением. Материалы 8-го
международного семинара-презентации инновационных научно-технических
проектов «Биотехнология - 2005», 18-19 ноября 2005, Пущино, с. 143-145.
11. Kochetkov V.V., Siunova T.V., Anokhina T.O., Sizova O.I., Boronin A.M. Plantgrowth promotion rhizosphere Pseudomonas for phytoremediation of co23
contaminated soils. 11 International symposium on Microbial Ecology – ISME-11,
Vienna, Austria, August 20-25, 2006. Book of abstracts, P. 351.
12. Анохина Т.О., Кочетков В.В., Боронин А.М. Ризосферные бактерии рода
Pseudomonas – антагонисты фитопатогеных грибов и деструкторы
полициклических
ароматических
углеводородов.
Материалы
III
межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия
микроорганизмов и растений с окружающей средой», Саратов, 10-12 октября
2006, с. 21.
13. Negri M.C., Kochetkov V.V., Siunova T.V., Anokhina T.O., Sizova O.I., Zyakun
A.M., Boronin A.M. Plasmid-Bearing Rhizosphere Pseudomonas for Enhanced
Phytoremediation Performance. 4th International Phytoremediation Conference,
Denver, Colorado, September, 2007.
14. Kochetkov V.V., Siunova T.V., Anokhina T.O., Sizova O.I., Boronin A.M.
Beneficial rhizosphere bacteria for bioremediation of oil-contaminated soils. 2nd
International Conference «Rhizosphere», Montpellier, France, August 25-31, 2007.
15. Boronin A.M., Kochetkov V.V., Siunova T.V., Anokhina T.O., Sizova O.I.,
Vinogradova E.V., Sokolov S.L. Plasmid bearing rhizosphere bacteria Pseudomonas
for phytoremediation. International Symposium on Applied Molecular Microbiology
in Oil Systems (ISMOS), Colchester, England, September 16-18, 2007.
24