1 Куриный эмбрион (КЭ) - куриный зародыш, находящийся на разных стадиях эмбрионального развития. В микробиологической практике КЭ используют для выделения, культивирования и идентификации вирусов, риккетсий и иногда бактерий. 2 Интерес к куриному эмбриону, как объекту исследования, появился еще у Аристотеля, который стоит у истоков эмбриологии и биологии развития. С XVII века ряд ученых сделали открытия, используя в качестве объекта исследований, куриный эмбрион. Поэтому невозможно переоценить значение куриного эмбриона не только на этапе становления, но и на дальнейших этапах развития учения об онтогенезе. 3 Использование куриного эмбриона имеет свои особенности: это доступная и управляемая система, благодаря чему можно получать результаты практически с помощью всех известных методов; работа с куриным эмбрионом, может быть реализована на любом этапе онтогенеза. Эмбрион является экологически чистым максимально изолированным от внешней среды объектом, что снижает вероятность спонтанного влияния внешних факторов в процессе эксперимента. 4 Куриный зародыш является объектом экспериментального изучения закономерностей эмбрионального развития. Наибольшее число исследований выполнено в условиях искусственной инкубации, что позволило испытать влияние различных внешних факторов на общие закономерности развития организма. При этом сам процесс инкубации, как основной способ получения экспериментальной эмбриональной ткани, сопровождается неизбежными потерями. В связи с этим эксперименты с куриными эмбрионами не противоречат принципам биоэтики. 5 Зародыши кур используют в микробиологии и вирусологии для определения патогенности и степени вирулентности изучаемого микроорганизма. Кроме того, на эмбрионах проводят различные опыты: постановка реакции нейтрализации, определение инфекционного титра, изучение виростатических веществ и т.д. 6 Иммунология - еще одна отрасль биологии, где используется куриный эмбрион в качестве экспериментального животного. Это позволило изучить такие явления, как толерантность, аллореактивность, онтогенез В- и Т-лимфоцитов. 7 Вышеописанные свойства обусловили использование куриного эмбриона, ставшего классическим, в биологической промышленности при производстве противовирусных вакцин и диагностикумов. Высокая пролиферативная способность клеток эмбриона, при создании оптимальных условий выращивания вируса, позволяет получить достаточное накопление вирусного материала. 8 При производстве бактериальных вакцин куриные эмбрионы используются в качестве компонента питательной среды, что существенно повышает прирост бактериальной массы культивируемых микроорганизмов 9 Известно, что наиболее эффективные и перспективные иммуностимуляторы и препараты c иммуномодулирующими свойствами (стволамин, ряд специфических цитаминов, плацентоль, экстракт плаценты и др.) получены из растущих эмбриональных и плацентарных тканей животных, а иногда и человека. 10 Но использование таких тканей ограничено эпизоотическими проблемами, сложностью получения достаточного количества эмбрионального материала с необходимыми параметрами, невозможностью управляемости развитием и соображениями биоэтики. Поэтому куриный эмбрион является наиболее доступным, рентабельным, высокоактивным сырьевым субстратом, не только не уступающим по своим качествам, но и превосходящий, по ряду показателей эмбрионально-плацентарные ткани других животных. 11 12 Наиболее благоприятная температура воздуха вблизи яиц для всех видов сельскохозяйственной птицы во все периоды инкубации находится в пределах 37,7-38,3 градуса цельсия. Опасная температура для развития эмбриона ниже 36,1 и выше 39,4 градуса. Нельзя укладывать яица острым концом вверх т.е. вниз воздушной камерой - это резко снижает вывод. 13 А - 6 суток развития. 1 – 1-я к., 2 – 2-я к., 3 – 3-я к., 4 - кровянное кольцо, 5 – неоплодотворенное яйцо. Б - 11 суток развития. 1 – 1-я к., 2 – 2-я к., 3 – 3я к., 4 - замерший зародыш. В - 18,5 суток развития. 1 - 1 – 1-я к., 2 – 2-я к., 3 – 3-я к., 4 - яйцо с погибшим эмбрионом. 14 Для лабораторных целей отбирают свежие, оплодотворенные, с хорошо просвечивающей и не имеющей трещин скорлупой КЭ. Инкубацию проводят в гнездах штатива тупым концом яйца вверх в хорошо вентилируемых инкубаторах или термостатах при 37 -37,5 °С, относительной влажности 63-70 %. 15 Для заражения отбирают 4- 13дневные эмбрионы с выраженными кровеносными сосудами, желточным мешком и подвижной тенью. Перед заражением скорлупу яиц обрабатывают спиртом, обжигают и в области введения (чаще над воздушной камерой) смазывают 2% йодной настойкой. 16 Материал вводят, вскрывая или не вскрывая скорлупу, в желточный мешок (риккетсий), в аллантоисную или амниотическую полости (большинство вирусов), наносят на хорион-аллантоисную оболочку. Реже материал вводят в тело эмбриона или в/в. 17 Зараженные КЭ помещают в термостат в условиях и на сроки, к-рые зависят от вида микроба и целей исследования. Некоторые данные о результатах заражения можно получить при внешнем осмотре КЭ под микроскопом (инъекция сосудов, потеря подвижности и др.). 18 Однако в большинстве случаев КЭ вскрывают. Для этого после обработки спиртом и йодной настойкой скорлупу срезают выше границы воздушного мешка, пастеровской пипеткой или шприцем отсасывают сначала аллантоисную, а затем амниотическую жидкость, избегая повреждения сосудов и желточного мешка. 19 Эмбрион и хорионаллантоисную оболочку извлекают из скорлупы, помещают в стерильные чашки, промывают стерильной дистил. водой и осматривают. Дальнейший ход исследования эмбриона и его жидкостей зависит от вида микроба или вируса и целей опыта. 20 21 Куриные эмбрионы 9—11дневной инкубации овоскопируют. Отбирают яйца с подвижными эмбрионами и хорошо выраженными сосудами. На скорлупе простым карандашом отмечают границы воздушной камеры и расположение зародыша. 22 Поверхность скорлупы протирают йодированным спиртом и обжигают. Стерильными ножницами срезают скорлупу на 2-3 мм выше границы воздушной камеры, разрывают подскорлупную и хорионаллантоисную оболочки и за шейку извлекают эмбрион, в стерильную чашку Петри у эмбриона удаляют голову, лапки, крылья и внутренние органы. Оставшийся кожномышечный мешок переносят в стерильную майонезную банку (250 мл) и измельчают ножницами на кусочки 3—4 мм. 23 Измельченную ткань 2—3 раза отмывают раствором Хенкса от слизи и кровяных элементов до получения прозрачных сливных вод и переносят в колбу для трипсинизации. В колбу наливают 0,15%-ный раствор трипсина, подогретого до 35-37 0С (соотношение ткани и трипсина 1:3), вносят стерильный магнитик и ставят на магнитную мешалку. 24 Трипсинизацию проводят дробно, т. е. через каждые 3—5 мин отделившиеся клетки вместе с трипсином сливают в центрифужные флаконы и помещают на лед или в холодильник для прекращения действия трипсина на клетки. К оставшемуся в колбе содержимому добавляют новую порцию трипсина. Скорость вращения на магнитной мешалке регулируют так, чтобы не было пены. Процесс повторяют несколько раз (3-5) до полного истощения ткани. 25 После трипсинизации суспензию клеток в растворе трипсина центрифугируют при 1000 мин-1 10 мин, надосадочную жидкость сливают (выбрасывают), а осадок клеток ресуспендируют в теплой (37 °С) питательной среде (в заведомо известном объеме) и фильтруют через 3слойный марлевый фильтр. После тщательного перемешивания клеток берут 1 мл для подсчета клеток. 26 Успех культивирования клеток в значительной степени зависит от посевной дозы. При малом количестве клеток не наблюдается образование монослоя даже при длительном культивировании. При слишком большой дозе клеток происходит интенсивная их пролиферация, и образованный слой клеток значительно раньше подвергается старению и неспецифической дегенерации. 27 К 1 мл взвеси клеток добавляют равный объем 0,1%-ного раствора кристаллвиолета, приготовленного на 0,1 н. растворе лимонной кислоты. После перемешивания камеру заполняют взвесью клеток и подсчитывают все клетки, имеющие ядро и неповрежденную цитоплазму; группу клеток с явными контурами считают за одну клетку. 28 На основании подсчета клеток в двух камерах высчитывают среднее арифметическое в одной из них. Число клеток в 1 мл суспензии (Х) определяют по формуле: Х= (А*2*1000):0,9, Где А — среднее число клеток в одной камере; 2 — коэффициент разведения суспензии добавленным объемом краски; 1000— число мм3 в 1 см3 0,9 объем камеры Горяева, мм3. 29 После подсчета суспензию клеток разводят питательной средой с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось от 700 тыс., до 1 млн. клеток (для куриных фибробластов). Затем суспензию разливают в матрасы или пробирки. В пробирки заливают по 1 мл, в матрасы вместимостью 1000, 250 и 100 мл вносят соответственно 100,40 и 15 мл взвеси клеток. Сосуды и пробирки плотно закрывают стерильными резиновыми пробками (для предупреждения защелачивания среды), делают надпись (вид культуры клеток и дату). 30 На пробирках восковым карандашом проводят продольную черту, укладывают их чертой вверх в лотки с наклонным углом 5° и помещают в термостат при 37 °С. Ежедневно, культуры просматривают под малым увеличением микроскопа для определения характера роста. Если клетки не пролиферируют, выглядят округлыми, зернистыми, темными и отслаиваются от стекла, это свидетельствует о плохой обработке посуды или токсичности сыворотки, питательной среды. 31 Пролиферирующие клетки светлые, связаны цитоплазматическими отростками, растут однослойным пластом. В процессе размножения клеток выделяются продукты обмена веществ, которые вызывают изменение рН питательной среды в кислую сторону (среда желтеет), что отрицательно влияет на клетки и может привести их к гибели. Такую среду заменяют свежей. Обычно сплошной монослой куриные фибробласты образуют через 36 - 48 ч. От одного куриного эмбриона получают 70— 120 млн. клеток. 32 33 Куриные эмбрионы чувствительны к большинству вирусов птиц и к некоторым вирусам млекопитающих (болезни Ньюкасла, гриппа, оспы птиц, ПГ-3 др.). Используют куриные эмбрионы от 5-го до 12-го дня инкубации. Вирусы в них могут репродуцироваться в клетках самого зародыша, хорионаллантоисной (ХАО) и амниотической оболочках, в стенках желточного мешка, накапливается в этих структурах и в жидкостях аллантоисной и амниотической полостей. В разных структурах могут репродуцироваться различные вирусы. 34 Разработано несколько методов заражения куриных эмбрионов, но в практике чаще используют следующие методы: на ХАО- например, вирусы оспы птиц и др.; в аллантоисную полость- вирусы гриппа, ПГ-3 крупного рогатого скота, вирус болезни Ньюкасла и др.; в амниотическую полость- вирусы риппа; в желточный мешок- вирус ринопневмании лошадей. 35 по гибели зародыша в определенные характерные для соответствующего вируса сроки инкубации; по патологоанатомическим изменениям в структурах куриного эмбриона, например, белые узелки (оспины) при оспе птиц, инфекционном ларинготрахеите кур и друих инфекциях или желто-зеленый цвет аллантоисной жидкости при гепатите утят и т.п.; 36 по реакции гемагглютинации (для обнаружения гемагглютинирующих вирусов, например, вируса болезни Ньюкасла, гриппа, ПГ-З и др.) При наличии вируса в эмбриональной жидкости куриного эмбриона через 3-7 мин после смешивания капли вируссодержащей жидкости и капли взвести эритроцитов соответствующего вида животного образуются хлопья эритроцитов (агглютинация) . Так, для выявления вируса ПГ3 КРС используют эритроциты морской свинки, вирусов гриппа- эритроциты кур и т.д. 37 Таким образом, куриный эмбрион является не только интересным экспериментальным объектом, позволившим получить сведения о практически всех закономерностях эмбрионального развития, но и важнейшим материалом для осуществления актуальных проблемных исследований в других областях биологии и медицины, а также ценнейшим сырьем для биотехнологической промышленности. 38