О клеточной локализации и потенциальных партнерах

ТРУДЫ МФТИ. — 2010. — Том 2, № 2
Молекулярная физика, биология, медицина
3
УДК 577.112.5
О.В. Богатова1 , Т.В. Ракитина2, И.А. Костанян2 , В.М. Липкин2
1
2
Московский физико-технический институт (Национальный исследовательский университет)
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
О клеточной локализации и потенциальных партнерах взаимодействия
нового белка гапонина
Ранее в клетках линии промиелоцитарного лейкоза человека HL-60 был обнаружен новый
белок гапонин (haponin, HLDF-alike protein), обладающий структурной гомологией с фактором инициации трансляции EIF1A. Транзиентная трансфекция зеленого флуоресцентного белка, слитого с гапонином, выявила эффект ядерного накопления продукта экспрессии
в клетках CHO-K1, что было подтверждено методами конфокальной микроскопии и вестернблоттинга. Стабильный клон, экспрессирующий слитый белок, пролиферировал значительно медленнее, чем исходная линия CHO-K1 или клетки, содержащие GFP. Продуцируемый
в бакуловирусной системе гапонин с 6-гистидиновым тагом на N -конце соосаждал из клеточных лизатов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAPDH) и фактор элонгации 2
(EF2), которые являются его предполагаемыми белковыми партнерами.
Ключевые слова: гапонин, EIF1A, ГАФД, GAPDH, EF2, ядро клетки, пролиферация.
I. Введение
II. Результаты и обсуждения
В 2007 году при исследовании фактора дифференцировки клеток линии промиелоцитарного
лейкоза человека HL-60 (HLDF) были получены пептиды и заклонирована кДНК, принадлежащая гипотетическому белку человека [1]. Оказалось, что аминокислотная последовательность
данного белка предсказана и в базе данных Национального центра биотехнологической информации США и называется EIF1AD (eukaryotic
translation initiation factor 1A domain containing
protein). Этот белок обладал структурной гомологией с трансляционным фактором EIF1A и,
как большинство белков семейства S1, содержал
PHK-связывающий домен. По данным [2] одним
из вероятных партнеров взаимодействия EIF1AD
в двугибридной системе является транскрипционный фактор STAT1 [3], который при проведении
сигнала транслоцируется в ядро клетки [4].
На первом этапе исследований была изучена
экспрессия эндогенного гапонина в разных типах
клеток млекопитающих. Для этого выделена тотальная PHK и приготовлены лизаты 6-ти клеточных линий человека: U87-MG (глиобластома),
Hek293 (эмбриональные клетки почки), Panc1
(рак поджелудочной железы), Mcf7 (рак молочной железы), Nci–H460 (рак лёгких), K562 (миелоидный лейкоз) и клеток яичника китайского хомячка CHO-K1. Количество специфической PHK
оценивалось методом ПЦР с обратной транскрипцией, а количество белка — вестерн-блоттингом
с антителами к полноразмерному гапонину, экспрессированному в бакуловирусной системе. Результаты свидетельствуют о том, что эндогенный
гапонин присутствует в большинстве эукариотических клеточных линий и его количество примерно одинаково (рис. 2). Также оказалось, что электрофоретическая подвижность природного белка
соответствует молекулярной массе около 30 кДа,
что указывает на наличие в исследуемом белке посттрансляционных модификаций.
Для исследования клеточной локализации гапонина на основе вектора pEGFP-C1 (Clontech,
США), позволяющего экспрессировать GFP в эукариотических клетках, была создана рекомбинантная конструкция, кодирующая слитый белок
GFP-Haponin, и проведена транзиентная трансфекция клеток линии CHO-K1. При этом обнаружено ядерное накопление белка GFP-Haponin, тогда как GFP не проявлял такого эффекта (рис. 3).
Известно, что GFP благодаря своим небольшим
размерам (27 кДа) может проникать сквозь ядерную пору и накапливаться в ядре [5], поэтому для
клеток, трансфицированных пустым вектором, характерно диффузное окрашивание ядер.
Обнаруженный белок назвали гапонин
(haponin, HLDF-alike protein). Длина его аминокислотной цепи 165 а.о. (рис. 1), расчётная молекулярная масса 19,2 кДа. Примечательно также,
что аминокислотная последовательность гапонина содержит неканонические сигналы ядерной
локализации (рис. 1).
Целью данной работы является изучение распределения гапонина в клетке, а также определение партнеров взаимодействия белка.
Рис. 1. Аминокислотная последовательность гапонина. Выделены потенциальные сигналы ядерной
локализации
4
Молекулярная физика, биология, медицина
ТРУДЫ МФТИ. — 2010. — Том 2, № 2
Рис. 2. Экспрессия эндогенного гапонина в различных эукариотических линиях: U-87 MG, Hek293, CHO-K1,
Panc 1, Mcf7, Nci–H460, K562: а — ПЦР с обратной транскрипцией на матрице кДНК клеточных линий с
праймерами, синтезированными по нуклеотидной последовательности гапонина. Контроль — ген GAPDH;
б — вестерн-блоттинг тотальных клеточных лизатов с антителами к полноразмерному гапонину, синтезированному в бакуловирусной системе
Рис. 3. Транзиентная трансфекция клеток CHO-K1: а, б — плазмидной конструкцией, экспрессирующей
GFP-Haponin; в, г — вектором, экспрессирующим GFP; а, в — флуоресценция (488/507); б, г — светлое
поле. Фотографии сделаны через 24 ч после трансфекции, микроскоп OlympusCX 41, InfinityX DeltaPix
Camera
ТРУДЫ МФТИ. — 2010. — Том 2, № 2
Молекулярная физика, биология, медицина
5
Рис. 4. ПЦР с обратной транскрипцией CHO-K1 и её стабильных клонов: а — ПЦР с праймерами, синтезированными по нуклеотидной последовательности гапонина, б — контроль (ген GAPDH)
Рис. 5. Вестерн-блоттинг ядерных и цитоплазматических лизатов клеток линии CHO-K1 и её стабильных
клонов: а — гибридизация с моноклональными антителами к GFP, б — окрашивание мембраны Ponso–Red;
1--3 — ядерная фракция, 4--6 — цитоплазматическая фракция, 1, 6 — CHO-K1-GFP, 2, 5 — CHO-K1, 3, 4 —
CHO-K1-GFP–Haponin
Рис. 6. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия (Nikon TE-2000, Japan) клеток исходной линии
CHO-K1 (а, б) и её производных, стабильно экспрессирующих GFP-Haponin (в, г) и GFP (д, е); а, в, д —
флуоресценция, 543 нм; б, г, е — окрашивание ядерного хроматина DAPI, 488 нм. Сигнал исходной линии
CHO-K1 в зеленом канале отсутствует
На основе линии CHO-K1 мы вывели стабильные клоны, экспрессирующие GFP-Haponin, а
также клоны, экспрессирующие GFP. Появление
PHK, кодирующей слитый белок GFP-Haponin,
было подтверждено методом ПЦР с обратной
транскрипцией на матрице тотальной PHK, выделенной из клеток линий CHO-K1, CHO-GFP и
CHO-GFP-Haponin (рис. 4). В качестве эндогенного контроля использовали ген GAPDH. Усиление яркости полосы гапонина свидетельствует об
6
Молекулярная физика, биология, медицина
увеличении количества PHK гапонина в клетках
CHO-GFP-Haponin.
Экспрессия химерного белка также была подтверждена с помощью иммуноблоттинга ядерных
и цитоплазматических фракций клеток выведенных клонов и исходной линии c моноклональными антителами к GFP (рис. 5). Экспрессируемый
комплекс GFP-Haponin присутствует и в ядерной,
и в цитоплазматической клеточных фракциях и
имеет ожидаемый размер 55--60 кДа.
Для
подтверждения
ядерной
локализации гапонина в клетках мы провели
окрашивание
ядерного
хроматина
DAPI
(4,6-диамидино-2-фенилиндол) фиксированных
препаратов клеток исходной линии CHO-K1 и ста-
ТРУДЫ МФТИ. — 2010. — Том 2, № 2
бильных клонов. В процессе проведения эксперимента были подобраны условия пермеабилизации
с использованием мягкого детергента дигитонина,
так как использование Тритон–X-100 приводило
к вымыванию GFP из цитоплазмы клеток. Полученные фотографии флуоресцирующих клеток
(рис. 6) анализировали с помощью программы
ImageJ, позволяющей сравнить среднюю интенсивность флуоресценции в области ядра и цитоплазмы клетки. Для каждой культуры обсчитывали не менее 50 клеток. Полученные данные подтверждают ядерную локализацию GFP-Haponin
(рис. 7) и, так как размер слитого белка превышает размер ядерной поры, указывают на наличие
механизмов активного ядерного транспорта.
Рис. 7. Отношение среднего сигнала в области ядра клетки к среднему сигналу в области цитоплазмы.
Усреднение по 50 клеткам. Подсчёт выполнен в программе ImageJ
Рис. 8. Кривые пролиферации CHO-K1 и её стабильных производных: а — флуоресценция прикрепившихся
клеток, б — измерение уровня АТФ с помощью люминисцентного тест-набора (Promega)
ТРУДЫ МФТИ. — 2010. — Том 2, № 2
При культивировании CHO-K1, CHO-GFP и
CHO-GFP-Haponin было замечено, что клетки,
экспрессирующие GFP-Haponin, пролиферируют
значительно медленнее других двух линий. Для
сравнения скорости пролиферации клеток мы
определяли количество живых клеток в культуре в разные временные точки двумя способами.
Во-первых, для флуоресцирующих линий CHOGFP-Haponin и CHO-GFP с помощью флуориметра измеряли флуоресценцию клеток, прикрепившихся ко дну плашки. Во-вторых, для всех трёх
линий производили измерения количества АТФ
в клеточных лизатах с помощью набора реагентов Cell Titer–Glo Luminescent Cell Viability Assay
(Promega). Оба метода подтвердили, что скорости
пролиферации клеток CHO-K1 и CHO-GFP практически совпадают, что говорит о том, что экспрессия GFP не оказывает существенного влияния на клетку, а клетки двух клонов, экспрессирующих GFP-Haponin, пролиферировали в 1.5 и
2 раза медленнее (рис. 8). Примечательно, что по
литературным данным активация STAT1, вероятного партнера гапонина, может ингибировать пролиферацию [6].
В процессе исследования белка была получена
экспрессия гапонина с полигистидиновым тагом
на N -конце в бакуловирусной системе. Экспрессированный гапонин использовали для получения
поликлональных антител на полноразмерный белок и для поиска белка-партнера гапонина методом соосаждения (pull-down). Для эксперимента использовали посаженный на Ni-NTA-сефарозу
гапонин, выделенный из клеток насекомых, и тотальный лизат клеток CHO-K1. Связавшиеся с
Ni-NTA-сефарозой и гапонин-содержащей смолой
белковые фракции разделялись на ПААГ, и продукты специфического связывания направлялись
на LC-MS. Было показано, что предполагаемыми партнерами гапонина являются глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) и фактор
элонгации 2 (EF2) (рис. 9). Кроме того, белки актин и белок теплового шока 90 кДа (Hsp-90) были
обнаружены как в специфической, так и неспецифической фракциях.
GAPDH в изобилии присутствует в клетке и
играет важнейшую роль в энергетических процессах, но, с другой стороны, обладает широким набором функций, не связанных с гликолизом: регуляция трансляции, ядерный экспорт PHK, репликация и репарация ДНК, апоптоз [7--9]. Разнообразие функций, показанных для GAPDH, в особенности наличие у него ядерных функций, указывает на возможность взаимодействия с гапонином.
Основной функцией EF2 является катализ
транслокационного перехода с участием ГТФ при
трансляции белка на рибосоме [10]. Наличие у гапонина PHK-связывающего домена и его структурная гомология с EIF1A позволяют предположить участие белка в рибосомальном синтезе, что
Молекулярная физика, биология, медицина
7
подразумевает взаимодействие с другими рибосомальными белками.
Рис. 9. Pull-down из тотальных лизатов клеток
культур CHO-K1 с использованием гапонина, экспрессированного в бакуловирусной системе, посаженного на Ni-NTA-сефарозу: а — специфическое связывание, б — неспецифическое связывание; 1 — гапонин (30 кДа), 2 — GAPDH (37 кДа),
3 — актин (42 кДа), 4 — Hsp-90 (90 кДа), 5 —
EF2 (95 кДа). Денатурирующий электрофорез в
13%-полиакриламидном геле
Таким образом, в данной работе было продолжено исследование недавно открытого белка гапонина [1]. Было показано, что эндогенный гапонин присутствует в разных типах эукариотических клеток. Стабильная экспрессия слитого белка GFP-Haponin в клетках CHO-K1 вызывает два
эффекта: во-первых, наблюдается ядерное накопление продукта экспрессии. Во-вторых, экспрес-
8
Молекулярная физика, биология, медицина
сия химерного белка вызывает замедление пролиферации клеток по сравнению с контрольными линиями CHO-K1 и CHO-GFP. Также были
идентифицированы вероятные партнеры гапонина — белки GAPDH и EF2, позволяющие предположить связь гапонина с рибосомой и процессом трансляции. Однако для подтверждения нашей гипотезы требуется проведение дальнейших
экспериментов по иммунопреципитации гапонина
антителами против GAPDH и EF2 и изучение его
PHK-связывающей способности. Также остаётся
открытым вопрос о взаимодействии гапонина со
STAT1.
III. Экспериментальная часть
III.1. Материалы
В работе использованы следующие реагенты: cреда сухая DMEM, пенициллин-стрептомицин, неомицин, раствор трипсин / ЭДТА
(Sigma, США), эмбриональная бычья сыворотка (ПанЭко, Россия), трансфекционный агент
Transfast, эндонуклеазы рестрикции BamHI,
EcoRI, Sal1, Taq-полимераза (Promega, США),
вектор pEGFP-C1 (Clontech, США), остальные реактивы — фирмы Sigma, США. Также использовали набор для выделения тотальной PHK «RNeasy
mini Kit» (Quiagen, США), набор для выделения
плазмидной ДНК и набор для люминесцентной детекции живых клеток «Cell Titer–Glo Luminescent
Cell Viability Assay» (Promega, США).
Для экспрессии гапонина в бакуловирусной системе Bac-to-Bac (Invitrogen) применяли вектор
pFastBacHT-B, клетки E. Coli DH10Bac, клетки
насекомых SF9 (Invitrogen)
Для иммунохимических исследований использовали сыворотку кролика, содержащую поликлональные антитела на экспрессированный в бакуловирусной системе гапонин. Моноклональные мышиные антитела против GFP были любезно предоставлены к.б.н. Т. Ерохиной, ИБХ РАН. Также
использовали козьи антитела к иммуноглобулинам кролика, овечьи антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (US BioLogical, USA).
III.2. Методы
ПЦР, электрофорез нуклеиновых кислот и белков, вестерн-блоттинг, трансформация бактериальных клеток, культивирование, транзиентная и
стабильная трансфекция эукариотических клеток
проводились, как описано, повсеместно.
III.3. Клонирование
Первоначально кДНК гапонина была заклонирована в вектор pGem-T-Easy (Promega, США),
затем по сайтам EcoR1 переклонирована в полилинкер экспрессирующего вектора pEGFP-C1
ТРУДЫ МФТИ. — 2010. — Том 2, № 2
(Clontech, США). Клоны, содержащие кДНК гапонина в правильной ориентации, отбирали с помощью ПЦР, а сохранение рамки считывания
при переходе от кДНК GFP к кДНК гапонина
подтверждали определением нуклеотидной последовательности. Полученный конструкт pEGFPHaponin далее использовали для изучения клеточной локализации гапонина.
III.4. Конфокальная микроскопия
Подготовка клеточных препаратов для окрашивания DAPI проводилась по стандартной методике [11], в качестве пермеабилизующего агента использовали 0,2% дигитонин. После окрашивания регистрацию проводили на инвертированном микроскопе Nikon TE-2000 (Japan), снабженном конфокальной лазерной системой C1, лазерами Ar (488), G-NeHe (543), под объективом CF1
fluor 100x oil, violet corrected, фотографировали
и анализировали распределение интенсивности в
зеленом и синем каналах с помощью программы
ImageJ и встроенных плагинов.
III.5. Анализ пролиферации
Для сравнения уровней пролиферации клеточных линий клетки, достигшие 80% конфлюентности, рассеивали на 96-луночную плашку с
затемненными стенками по 1000 клеток в лунку, по 2 ряда на клеточную линию и культивировали в CO2 -инкубаторе при 37 ◦ C. Крайние ряды лунок заполняли средой. Для измерений использовали прибор Universal Microplate
Analyzer Fusion–Alpha FP HT (Perkin Elmer,
США) со встроенным люминометром и флуориметром. Ежедневно измеряли интенсивность флуоресценции клеток, прикрепившихся к пластику,
а также, используя набор «Promega Cell Titer–Glo
Luminescent Cell Viability Assay», определяли количество АТФ в клеточных лизатах по люминисценции. Ежедневно лизировали по 4 лунки, засеянные клетками каждой линии. Лунки со средой
выступали в качестве контрольных. Результаты
обрабатывались в программе MS Excel и представлялись в виде зависимости клеточного прироста
от времени культивации.
III.6. Выделение гапонина из клеток
насекомых. Pull-down
В бакуловирусной системе экспрессии «Bac-toBac» (Invitrogen, США) была получена экспрессия рекомбинантного гапонина, содержащего полигистидиновый таг на N -конце. Продукт экспрессии был очищен методом аффинной хроматографии на Ni2+ -сефарозе и использовался для
получения поликлональных антител на гапонин и
для поиска белка-партнера методом pull-down.
Осадки
(3--4
г)
клеток
насекомых
SF9, содержащие экспрессированный гапонин, лизировали в буфере А (0,5 МNaCl,
ТРУДЫ МФТИ. — 2010. — Том 2, № 2
Молекулярная физика, биология, медицина
20 мМT ris-HClpH8,2, 0,1%T riton-Х-100) с добавлением ДНКазы и ингибиторов протеаз. Детергент-растворимую фракцию лизатов инкубировали с 2 мл Ni2+ -сефарозы при +4 ◦ C в течение
часа. Связавшийся гапонин отмывали буфером
А, содержащим 30 мМ имидазола, до полного
исчезновения белка в отмывке, элюировали буфером (0,5 МNaCl, 20 мМT ris-HClpH8,2, 0,5 М
имидазол) и пропускали через гель-фильтрационную колонку для обессоливания. Полученный
гапонин иммобилизовали на небольшое количество Ni2+ -сефарозы (250 мкл) в течение ночи
при +4 ◦ C и отмывали. Конфлюэнтные клетки
CHO-K1 (50 млн) лизировали в буфере А, содержащим 0,5%T riton-X-100, ДНКазу, ингибиторы
протеаз. К детергент-растворимой фракции лизата добавляли раствор 3% октилглюкозида в
20 мМT ris-HCl, доводя концентрацию NaCl до
150 мМ. Подготовленный таким образом лизат
инкубировали с Ni2+ -сефарозой (1 мл) при +4 ◦ C
в течение 40 мин. Затем фракцию, не связавшуюся со смолой, наносили на колонку с иммобилизованным гапонином. Колонку промывали отмывочным буфером (0,5% октилглюкозид, 150 мМNaCl,
20 мМT ris-HCl, 0,3%T riton-X-100), затем элюировали гапонин в комплексе с возможными белкамипартнерами буфером для элюции. Полученные
фракции анализировались с помощью электрофореза в ПААГ. Гели окрашивались по методу
Кумасси, и интересующие полосы вырезались и
сдавались на жидкостную хроматомасс-спектромектрометрию.
IV. Статистика проведения
экспериментов
Эксперименты по определению уровня экспрессии гапонина в клеточных линиях, транзиентной трансфекции и соосаждению (pull-down)
повторялись трижды с аналогичными результатами. По 2 стабильных клона, экспрессирующих
GFP и GFP-Haponin, были получены и использованы для изучения локализации продукта экспрессии и скорости пролиферации клеток выведенных линий. Люциферазный и флуоресцентный
анализ на пролиферацию и конфокальная микроскопия повторялись по 2 раза для каждого клона
с аналогичными результатами. На фотографиях
представлен типичный эксперимент, на гистограммах и графиках приведены средние значения для
нескольких экспериментов и стандартные отклонения.
V. Благодарности
Авторы выражают благодарность И.М. Молотковской за проведение экспериментов по конфокальной микроскопии.
9
Данная работа выполнялась при поддержке
Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 08-04-01127-а) и гранта Российской
академии наук по молекулярной и клеточной биологии.
Литература
1. Вонаршенко А.В., Радченко В.В., Гапон М.В., Родионов И.Л., Бабиченко И.И., Какуев Д.Л., Артамонов И.Д., Гарковенко А.В., Дьячкова Л.Г., Липкин В.М., Костанян И.А. Идентификация и экспрессия нового белка гапонина из
клеток линии HL-60 // Биоорг. химия. — 2007. —
Т. 33, вып. 6. — С. 653--656.
2. Rual J.-F., Venkatesan K., Hao T.,
Hirozane–Kishikawa T., Dricot A., Li N.,
Berriz G.F. [et al.]. Towards a proteome-scale map
of the human protein–protein interaction network
// Nature. — 2005. — V. 437. — P. 1173--1178.
3. Gil M.P., Salomon R., Louten J., Biron C.A.
Modulation of STAT1 protein levels, a mechanism
shaping CD8 T cell responses in vivo // Blood. —
2006. — V. 107. — P. 987--993.
4. Reich N.C. STAT dynamics // Cytokine
& Growth Factor Reviews. — 2007. — V. 18. —
P. 511--518.
5. Seibel N.M., Eljouni J., Nalaskowski M.M.,
Hampe W. Nuclear localization of enhanced
green fluorescent protein homomultimers // Anal.
Biochem. — 2007. — V. 368(1). — P. 95--99.
6. Ju H., Jove R. The stats of cancer: new
molecular targets come of age // Nature rev.,
Cancer. — 2004. — V. 4. — P. 97--105.
7. Sirover M.A. New insights into an old
protein: the functional diversity of mammalian
glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrohenase
//
Biochimica et Biophysica Acta. — 1999. — V. 1432. —
P. 159--184.
8. Hara R.M., Snyder S.H. Nitric Oxid-GAPDHSiah: A novel cell death cascade // Cellular and
molecular neurobiology. — 2006. — V. 26. —
P. 527--538.
9. Mazzolla J.L., Sirover M.A. Subcellular
localization of human glyceraldehydes-3-phosphate
dehydrohenase is independent of its glycolitic
function // Biochimica et Biophysica Acta. —
2003. — V. 1622. — P. 50--56.
10. Спирин А.С. Принципы функционирования рибосом // Соросовский образовательный
журнал. — 1999. — Вып. 4. — С. 2--9.
11. Jin C., Ding P., Wang Y., Ma D. Regulation
of EGF receptor signaling by the MARVEL domaincontaining protein CKLFSF8 // FEBS Letters. —
2005. — V. 579(28). — P. 6375--6382.
Поступила в редакцию 15.01.2009.