Скрининг микофильных грибов с лакказной и гидролазной активностью А. Д. Буракаева

Электронный журнал Cloud of Science. 2013. № 2
http://cloudofscience.ru
Скрининг микофильных грибов
с лакказной и гидролазной активностью
А. Д. Буракаева
Московский технологический институт «ВТУ», филиал в г. Оренбурге
Аннотация. Исследована лакказная и гидролитическая активность группы микофильных грибов, способных расти на лигноцеллюлозных растительных материалах. Выявлены культуры, одновременно продуцирующие внеклеточные лакказы и гидролазы.
Ключевые слова: микофильные грибы, грибные продуценты, скрининг,
ферменты, лакказная, еллюлазная, гидролитическая активность.
Наиболее распространенным органическим веществом в природе является
лигнифицированная целлюлоза. Проблема утилизации лигнин- и целлюлозосодержащих отходов, образующихся в результате переработки древесины, продукции
сельского хозяйства, пищевой, целлюлозно-бумажной и других отраслей промышленности, рассматривают теперь в глобальном масштабе и связывают с необходимостью защиты окружающей среды. Микофильные грибы, отличительной особенностью которых является способность образовывать и выделять в окружающую
среду гидролитические ферменты, в последние годы стали чаще привлекать внимание исследователей. Однако у этой группы микроорганизмов сравнительно мало
изучена способность к образованию целлюлаз и гемицеллюлаз, способных осуществлять деструкцию кристаллической целлюлозы, а также лакказ, окисляющих
лигнин.
Целью работы явился поиск наиболее активных продуцентов таких ферментов
среди видов 15 родов микофильных грибов, полученных с кафедры микробиологии
и микологии Биологического факультета МГУ им.М. В. Ломоносова.
Материалы и методы. В работе использовали Aeremonium chrysogenum
(Turum), Apiocrea chrysosperma Fr., Cladobotrium apicullatum (Tubaki) Gams et Hooz,
Hypomyces rosellus (Fr), Hypomyces aurantius (Fr), Hypomyces odoratus Arnold,
Mycogone cervina Ditm, Mycogone rosea (Fr), Harziella capitata Cost.et Matr.,
Trichoderma harzianum Rifai, Trichoderma viridi Fr., Verticillium niveostratosum Lind,
Cladobotrium verticillatum (Link) Hughes, Cladosporium arbuscuba, Corticium sp. Выращивание грибов проводили в пробирках со скошенным сусло-агаром при комнатной температуре в течение 7–10 суток. В качестве посевного материала использовали 2–3 суточный мицелий грибов, выращенный на жидкой среде с суслом 4◦ по
Баллингу, который вносили в количестве 5% по объему. Проверку способности
грибов образовывать внеклеточные ферменты проверяли при выращивании на двух
25
А. Д. Буракаева
Скрининг микофильных грибов
с лакказной и гидролазной активностью
жидких питательных средах: среда № 1 — Чапека-Докса (г/л): сахароза — 20,0;
NaNO3 — 2,0; K2HPO4 — 1,0; MgSO 4 × 7 H2O — 0,5; KCL — 0,5; FeSO4 х 7
H2O — 0,01; CaCO3 — 0,3; остальное — вода, рН исх. — 6,0-6,2; среда № 2 — минеральный фон среды Чапека Докса в присутствии 5-10% древесно-растительного
материала (свекловичный жом, кукурузные кочерыжки, отруби пшеничные, отруби
ржаные, картофельная мезга, древесные березовые опилки и хвойные опилки).
Культивирование вели глубинным способом в колбах Эрленмеера объемом 700 мл
со 100 мл среды, на качалках (200-220 об/мин.) в течение 48-96 часов. В культуральной жидкости определяли: активность лакказы — спектрофотометрическим
методом при 410 нм, используя в качестве хромогенного субстрата 10 мМ раствор
пирокатехина в 0,1 М Na-ацетатном буфере рН 5,0 [1]; целлюлазу разжижающую — эндо-1,4 — глюконазу — в вискозиметре Оствальда по снижению вязкости
0,6%-го раствора Na-КМЦ, активность выражали в % падения вязкости раствора
Na-КМЦ под действием фермента [2]; осахаривающую — экзо-1,4-глюконазу согласно [3]; активность гемицеллюлаз — согласно [3]. Ксиланазную активность 1 мл
культуральной жидкости выражали в мг ксилозы на 1 мл реакционной смеси. Количество белка оценивали методом Лоури [4].
Результаты и обсуждение. Первоначально установили, что все испытанные источники углерода способствовали росту грибов, однако накопление биомассы не
всегда сопровождалось синтезом исследуемых ферментов. Об интенсивности синтеза ферментов косвенно судили по количественному содержанию белка в культуральной жидкости. При исследовании ферментативной активности было обнаружено, что все исследуемые грибы синтезируют лакказы. Наибольшую активность оказали культуры грибов Trichoderma viridi Fr., Cladobotrium apicullatum (Tubaki) Gams
et Hooz , Hypomyces aurantius (Fr), Hypomyces odoratus Arnold и Hypomyces rosellus
(Fr). Все среды, содержащие в качестве единственного источника углерода древесно-растительный материал, способствовали синтезу исследуемых ферментов. Отобранные для исследований культуры микофильных грибов имели различный уровень биосинтеза изучаемых ферментов. Самыми активными продуцентами Схфермента, целлобиазы и ксиланазы оказались культуры, имеющие относительную
лакказную активность не менее 20–30%. Результаты активности целюлаз и ксиланаз наиболее активных штаммов представлены в табл. 1.
В качестве продуцента бала выбрана культура гриба Hypomyces rosellus (Fr),
отличающаяся от других высокой ферментативной активностью, стабильностью
роста, что особенно важно для производственных условий. Культура гриба Hypomyces rosellus (Fr) известна как продуцент углеводородов на отходах зерноперерабатывающей промышленности [5].
26
ПРИКЛАДНЫЕ
ИССЛЕДОВАНИЯ
И ТЕХНОЛОГИИ
Cloud of Science. 2013. № 2
Таблица 1. Активность целлюлолитических ферментов
и ксиланазы в культуральной жидкости
Активность ферментов
Варианты
Cladobotrium apicullatum (Tubaki) Gams et Hooz
Hypomyces rosellus (Fr)
Hypomyces aurantius (Fr)
Hypomyces odoratus Arnold
Trichoderma viridi Fr.
Сх-фермент,
мг/мл
Целлобиаза,
мг/мл
Ксиланаза,
мг/мл
7,5
0,040
0,09
20,0
12,10
17,05
18,5
0,095
0,041
0,05
0,099
0,13
0,005
0,04
0,12
Рост и развитие микроорганизмов, а также образование ими ферментов находятся в тесной зависимости от состава питательной среды и условий культивирования.
В табл. 2 представлены результаты оценки активности целлюлаз у микофильного гриба Нуроmyces rosellus.
Таблица 2. Активность целлюлолитических и гемицеллюлолитических ферментов в культуральной жидкости гриба Н. rosellus
Источники углерода, в %
1. отруби пшеничные — 5
2. отруби ржаные — 5
3. березовые опилки — 5
4. мезга картофеля — 5
5. сахароза — 2
6. кукурузные кочерыжки —
5
7. свекловичный жом — 5
8. отруби пшеничные — 10
9. отруби ржаные — 10
10. березовые опилки — 10
11. мезга картофеля — 10
12. сахароза — 2 + кукурузные
кочерыжки — 8
13. кукурузные кочерыжки —
10
14. свекловичный жом — 10
Белок,
мг/мл
2,05
2,10
3,00
2,75
2,50
Сх-ферменты
мг/мл
9,56
10,56
9,30
4,4
0,00
Целлобиаза,
мг/мл
0,027
0,027
0,037
0,027
0,00
Ксиланаза,
мг/мл
0,10
0,12
0,13
0,07
0,00
3,65
9,6
0,027
0,13
3,75
3,62
1,91
2,40
2,41
14,80
15,81
15,19
13,14
14,89
0,027
0,027
0,047
0,047
0,047
0,12
0,13
0,12
0,13
0,11
3,0
16,39
0,037
0,13
2,00
18,57
0,057
0,14
3,20
17,30
0,057
0,14
Таким образом, проведенный скрининг культур микофильных грибов выявил
наиболее активные штаммы — продуценты лакказ и внеклеточных ферментов и
27
А. Д. Буракаева
Скрининг микофильных грибов
с лакказной и гидролазной активностью
было установлено, что на их образование влияют различные специфические субстраты в составе среды культивирования. Полученные данные могут представлять
практический интерес для создания способов утилизации отходов лигноцеллюлозной биомассы.
Литература
[1] Королева О. В., Явметдинов И. С., Шлеев С. В., Степанова Е. В., Гаврилова В. П. Выделение и изучение некоторых свойств лакказ из базидиомицета
Cerrena maxima // Биохимия. 2001. Т. 66. № 6. С. 762.
[2] Синицын А. П., Черноглазов В. М., Гусаков А. В. Методы изучения и свойства
целлюлитических ферментов // Итоги науки и техники. Серия: Биотехнология.
1990. Т. 25. С.152.
[3] Фениксова Р. В. и др. Определение активности целлюлазы / Р. В. Фениксова,
Н. А. Тиунова, Н. А. Родионова, Л. И. Мартинович, Т. И. Кудряшова // Методы
современной биохимии. — М. : Наука, 1975. С. 21.
[4] Филлипович Ю. Б., Егорова Т. А., Севастьянова Г. А. Практикум по общей биохимии. — М. : Просвещение, 1982. С. 75–77.
[5] Буракаева А.Д., Ахметова В.Р., Абдуллин М.И., Мухсинова Б.Х., Хусаинов А.Н. Способ получения смеси насыщенных углеводородов микробиологическим путем / патент РФ № 2439158. Опубл. 10.01.2012, Бюлл. №1.
Автор:
Буракаева А. Д., кандидат биологических наук, доцент, доцент кафедры «Технология продуктов питания и техносферная безопасность» Московского технологического института «ВТУ», филиал в г. Оренбурге
28